CN100418983C - 人胰高血糖素相关肽-2类似物 - Google Patents

Abstract

本发明是人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)。采用本室构建的新的长度30-70aa的活性多肽的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内高效融合表达Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)的基因工程菌，融合蛋白表达量占细菌总蛋白的40%以上。在Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2的N端设计一个酸敏感位点(Asp-Pro)，用酸切割融合蛋白可获得Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)在体内被二肽酶IV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly²]GLP-2(1-33)。重组菌经裂解→洗涤→尿素溶解→乙醇分级沉淀分离融合蛋白，60mmol/L盐酸水解融合蛋白，DEAE-52柱层析分离→HPLC分离获得Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)，用电喷雾质谱法测得其相对分子质量为3948Da。Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2冻干后溶于PBS缓冲液中，对正常雄性SD大鼠(160g-200g)皮下给药14天，0.1，0.25，0.5mg/kg/day，与对照组相比，小肠重量显著增加，小肠绒毛增高。有可能用于改善短肠综合症，吸收障碍和吸收功能改变的胃肠疾病，放、化疗病人的营养吸收状况，具有很好的临床应用前景。

Description

人胰高血糖素相关肽-2类似物

技术领域

本发明的技术是一种人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽。用本研究室构建的新的长度30-70aa的活性多肽的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内高效融合表达人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)的基因工程菌，人胰高血糖素相关肽-2类似物的N端位置2的丙氨酸(²Ala)残基被Gly取代，同时N端接加2个脯氨酸残基。在Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的N端设计一个酸敏感位点(Asp-Pro)，用酸切割融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2获得目的肽Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽在体内被二肽酶IV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly²]GLP-2。重组菌经裂解→洗涤→再溶解→乙醇分级沉淀分离融合蛋白→60mmol/L盐酸水解融合蛋白→DEAE-52柱层析分离→HPLC分离，用电喷雾质谱法测得Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽相对分子质量为3948Da。Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽无需复性，冻干后溶于PBS中，对正常雄性SD大鼠(160g-200g)皮下给药14天，0.1，0.25，0.5mg/kg/day，小肠重量与对照组相比，有明显体内促肠生长的生物学活性。有可能用于改善短肠综合症，吸收障碍和吸收功能改变的胃肠疾病，放、化疗病人的营养吸收状况，增强病人体质，促进病人康复，具有很好的临床应用前景。

背景技术

人胰高血糖素相关肽-2(或胰高血糖素样肽-2，human Glucagon-like peptide-2，hGLP-2，)又称为人肠生长激素，是由33个氨基酸构成的多肽，主要是由肠分泌的(在小肠远端和邻近结、直肠大量存在，回肠远端L细胞处浓度最高)，具有刺激肠生长的作用。临床前研究已经证实GLP-2的作用是通过GLP-2受体介导的，对各种胃肠疾病(主要表现为吸收障碍和吸收功能改变)具有作用专一性强，效果明显，稳定性高，治疗面广，有可能用于改善放、化疗病人的营养吸收状况，增强病人体质，促进病人康复。因而具有很好的临床应用前景。

国外有文献报道：改变GLP-2的氨基酸组成，能改变GLP-2的促肠生长活性，如由Gly取代N-端第2个氨基酸Ala，将2个Arg加到GLP-2的N-端或将GLP-2的C-端氨基化等[US05789379]。

哺乳动物细胞中的二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)是一种丝氨酸外肽酶，存在于脊椎动物的许多细胞和组织中，能从肽的氨基末端释放二肽。其水解专-底物为NH₂-X-Pro-(肽或蛋白质链N端第2个氨基酸残基为Pro)，是典型的X-脯氨酰-二肽氨肽酶，PPCE为水解-Pro-X-的内肽酶，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽应归为DPPIV及PPCE酶的推测底物，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽可能是在体内被DPPIV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly²]GLP-2(1-33)肽而发挥作用。GLP-1中含有的N末端X-Ala-可被DPPIV切掉，其体内半衰期少于2min。而DPPIV外切-Ala-X-键的速度仅为外切-Pro-X-速度的1％～5％，PPCE内切-Ala-X-键的速度仅为内切-Pro-X-速度的0.1％～1％。因此，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的N末端X-Pro-应在2min内被体内的DPPIV及PPCE联合切掉。

目前国外主要采用化学合成法制备短肽，成本仍较高，本室采用基因工程分泌表达Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2，尚没有成功。

发明内容

本发明的一个目的就是提供新的人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽及其制备方法，该方法可制备人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽。

本发明的另一个目的是提供相应的编码序列，载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的是Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽有显著的体内促肠生长的生物学活性。

在本发明的第一方面，提供了一种人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽，它包含有在人胰高血糖素相关肽-2类似物1-35肽前的二肽酶IV及PPCE酶切位点，以及在N端²Ala被Gly取代，同时N端接加2个脯氨酸残基。

在本发明的第二方面，提供了一种人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权力要求6所述的质粒载体及其转化菌。

(b)从培养物中分离出权利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)(1-35)肽。

(c)纯化出Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽。

(d)利用体内二肽酶IV酶切Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽，形成h[Gly²]GLP-2(1-33)肽。

在一优选例中，在本发明的方法中，所述的步骤(b)包括

通过溶菌，洗涤，乙醇沉淀等方法分离出Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽与门冬酰胺酶C末端组成的融合蛋白；用酸水解方法从所述融合蛋白中切下门冬酰胺酶C末端，形成Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽；

在另一优选例中，所述的步骤(c)包括通过DEAE-52离子交换柱分离出Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽。

在另一优选例中，所述的步骤(c)还包括HPLC分离和冻干。

在本发明的第二方面，Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽对正常雄性SD大鼠(160g-200g)皮下给药14天，取小肠，用生理盐水清洗，去除污物和过多液体，称重。

附图说明

图1A为Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的融合表达质粒PED-PPGLP-2的质粒结构图。

图1B为含Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的融合基因的融合表达及在诱导后表达产物占全菌蛋白的百分含量随时间变化的情况.泳道1-6为PED-PPGLP-2/BL21在乳糖诱导0h，2h，4h，6h，8h，10h，后的融合蛋白表达情况，泳道7为溶菌酶蛋白对照。

图1C为PED-PPGLP-2融合表达质粒的DNA测序图谱。

图2融合蛋白加工及目的肽纯化图谱。

其中图2A：为含Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的融合蛋白的纯化图谱。泳道1为溶菌酶蛋白对照；泳道2为胰岛素蛋白对照；泳道3为PED-PPGLP-2/BL21在乳糖诱导4h后的融合蛋白表达；泳道4为酸水解前的融合蛋白；泳道5为融合蛋白在60mmol/L盐酸水解后的水解液。

图2B目的肽Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的纯化图谱。泳道1为中分子量蛋白标准和胰岛素蛋白对照；泳道2及3为Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽。

图3质谱法(ESI-MS)测定分子量。Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的ESI-MS图谱。

图4生物活性测定图(促肠生长法)。用体内生物活性测定法进行促肠生长活性的研究。SD大鼠(160g-200g)，随机分成4组，6只/组，1组为PBS对照组；另3组为Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)给药组，剂量分别为0.1，0.25，0.5mg/kg/day，1天2次(上午8:00和下午6:00)，腹部皮下注射给药14天，晚上禁食，第二天处死，取小肠，用生理盐水清洗，去除污物和过多液体，称重。示Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的剂量活力关系。

图5生物活性测定，示促小肠绒毛生长。其中图5A为PBS对照组，图5B为，0.5mg/kg/dayPro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的给药组，腹部皮下注射给药14天。

实施例

材料：

(1)菌株与质粒：

宿主菌E.coli BL21(DE3)LysS是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

质粒pET28a购自Novagen公司。

质粒pED由本实验室构建并保存。PED是本实验室刘景晶，陈正兰构建的适合于短肽高效表达与加工的重组质粒，该重组质粒系将消去了唯一酸水解位点的L-天门冬酰胺酶C末端127肽基因以及一组多克隆位点引入质粒PET28a的NcoI和BamHI位点之间构建而成。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。

玉米浆培养基含有：玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。

方法

分子生物学操作方法。

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)多肽基因的设计、合成和克隆

按照大肠杆菌的密码子及设计要求将N端位置2的丙氨酸(²Ala)残基被Gly取代同时N端延伸2个脯氨酸的人胰高血糖素相关肽-2的35个氨基酸序列转化成核甘酸序列，其结构框架见图2。在其5’端增设BamH I酶切位点，3’端增设终止密码子TAA和HindIII酶切位点，在计算机辅助分析后，确定基因全长124bp，分为53、54、53碱基的三个寡核苷酸片段，同时，为用PCR方法初筛阳性克隆，设计了下游引物M4。

合成4条序列如下：

M1(5’GCGGG GAT CCG CCG CAC GGT GAC GGT TCT TTC TCT GAC GAA ATG AAC ACC ATC 3’，含BamH I酶切位点)

M2(5’GAC GAA ATG AAC ACC ATC CTG GAC AAC CTG GCT GCT CGT GAC TTC ATC AAC TGG 3’)

M3(5’ GGCC  AAGC TTA ATC AGT GAT TTT GGT CTG GAT CAG CCA GTT GAT GAA GTC ACG 3’，含HindIII酶切位点)

M4(5’GGCC AAGC TTA ATC AGT GAT TTT GGT CTG 3’，含HindIII酶切位点)

由上海博亚生物技术有限公司于Beckman oligo-1000DNA合成仪上合成。PCR反应在GTC-2型扩增仪上进行。其中M1、M2、M3按10∶1∶10浓度比例混合，于94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30个循环。1.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，将目的片段用凝胶回收试剂盒回收后保存于-20℃。

经凝胶回收的PCR目的片段和克隆质粒pUC18经BamH I和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，于T4DNA连接酶反应体系中16℃连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞。将细胞涂布到含100μg/ml Amp、40μg/ml X-gal和0.1mmol/LITPG的LB平板上37℃培养过夜，挑取白色菌落，抽提纯化重组克隆质粒pUCGLP-2。各取与Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2的基因上、下游核苷酸序列分别互补的两条特异引物M1、M4，各100pmol/L，以纯化的重组质粒分别作模板在10μl体系中进行PCR，初筛阳性克隆，再将阳性克隆在大连宝生物工程公司ABI 377DNA自动测序仪上进行测序。

用M1、M4作为特异引物，以测序正确的纯化的pUCGLP-2为模板，PCR反应条件：94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30个循环，进行PCR扩增，所扩增的PCR产物于1.8％Argarose上电泳检测并回收目的片段。所得PCR目的片段经BamH I和HindIII双酶消化后，***pED的相应酶切位点，并保持原有阅读框架。转化E.coli BL21(DE3)LysS感受态细胞。将细胞涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑选阳性重组表达菌PED-PPGLP-2/BL21。经PCR初筛重组表达质粒pED-PPGLP-2(见图1A)后进行测序。DNA序列分析也与预期的相符(基因测序结果见图1C)。

实施例2Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)多肽基因在大肠杆菌中的表达

重组表达菌PED-PPGLP-2/BL21在液体LB培养基中37℃振荡过夜，以2％接种量转接于玉米浆发酵培养基中，37℃培养4h，加终浓度5mmol/l乳糖诱导表达，4h后收集发酵菌体。留样进行15％SDS-PAGE分析和薄层扫描。在分子量约17700Da处出现明显的蛋白条带(图1B)，与融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2理论推算值一致。融合蛋白在诱导后8小时达到稳定的最大表达量，Densitometric analysis分析显示融合蛋白占细菌总蛋白的40％以上，并且在胞内形成了包涵体。

实施例3融合蛋白分高纯化

诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在破壁液(pH8.0磷酸缓冲盐，0.02％溶菌酶)，菌体裂解后得到包涵体，包涵体经洗涤，尿素溶解及乙醇分级沉淀后获得较纯的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(图2A)。

实施例4融合蛋白酸切割条件的研究

将乙醇沉淀获得的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成为溶液，分别于45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE电泳结果显示：低于55℃切割融合蛋白，可以获得较为清晰的目的肽条带。将融合蛋白按照6％比例分别用30mmol/L、60mmol/L，120mmol/L，180mmol/L，240mmol/L HCl等不同浓度HCl配置成为溶液，于50℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE电泳结果显示：用60mmol/L HCl切割融合蛋白，可以获得较为清晰和较多的目的肽条带。用60mmol/LHCl将融合蛋白分别配置成为1％，2％，4％，6％，8％(w/v)的溶液，于50℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE电泳结果显示：对6％或8％的融合蛋白溶液进行酸切割，可以获得较为清晰的目的肽条带。将融合蛋白按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成为溶液，于50℃分别切割0h，24h，36h，48h，72h，96h，Tricin-SDS-PAGE电泳结果显示：将融合蛋白酸切割48h至72h，可以获得较清晰和较多的目的肽条带，因48h和72h获得的目的肽条带相差不大，为保证目的肽不被破坏，故选用48h。用优化的酸切割工艺(融合蛋白按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成为溶液，于50℃切割48h(图2A)。

实施例5Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的分离纯化

将含Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2的酸水解液调节至与平衡缓冲液基本一致的pH值，稀释至原水解液体积的10倍左右，流动上样于用0.02mol/L乙酸铵平衡好的0.02mol/L DEAE-52离子交换柱，将0.02mol/L乙酸铵对0.25mol/L乙酸铵进行梯度洗脱，收集样品峰，冻干；HPLC分离纯化获得人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)肽(C₁₈柱，室温，样品用0.1％三氟乙酸溶解，溶媒A：0.1％三氟乙酸水溶液，B：99％乙睛/0.1％三氟乙酸，，乙睛梯度30％-60％洗脱45min，流速0.7ml/min，检测波长215nm，HPLC样品真空干燥)(图2B)。

实施例6质谱分析

由上海吉尔公司完成。

方法为：电喷雾质谱。

测得重组制备的Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)的相对分子质量为3948Da(图3)，与理论推算值一致。

实施例7Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)多肽的体内生物学活性研究

用体内生物活性测定法进行促肠生长活性的研究。正常雄性SD大鼠(160g-200g)，随机分成4组，6只/组，1组为PBS对照组；另3组为Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)给药组，剂量分别为0.1，0.25，0.5mg/kg/day，1天2次(上午8:00和下午6:00)，腹部皮下注射给药14天，晚上禁食，第二天处死，取小肠，用生理盐水清洗，去除污物和过多液体，称重。结果显示：给药组的小肠重量与PBS对照相比，显示有明显体内促肠生长的生物学活性并有剂量相关性(图4)。同时与PBS对照组(图5A)相比，0.5mg/kg/day剂量组显著促进小肠绒毛生长(图5B)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

<110>中国药科大学

<120>人胰高血糖素相关肽-2类似物

<130>ppglp-2

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>105

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(105)

<400>1

ccg ccg cac ggt gac ggt tct ttc tct gac gaa atg aac acc atc ctg    48

Pro Pro His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu

1               5                   10                  15

gac aac ctg gct gct cgt gac ttc atc aac tgg ctg atc cag acc aaa    96

Asp Ash Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys

            20                  25                  30

atc act gat                                                        105

Ile Thr Asp

        35

<210>2

<211>35

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>2

Pro Pro His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu

1               5                   10                  15

Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys

            20                  25                  30

Ile Thr Asp

        35

Claims (3)

1. 一种人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)即Pro-Pro-h[Gly.sup.2]GLP-2(1-35)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，为Pro Pro His GlyAsp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile AsnTrp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp，其特征在于：其由35个氨基酸构成，在N端有2个脯氨酸残基，N端有二肽酶IV及PPCE酶切位点。

2. 权利要求1所述的人胰高血糖素相关肽-2类似物Pro-Pro-h[Gly²]GLP-2(1-35)在制备增加大鼠的肠重量和增加肠绒毛高度的制剂中的用途。

3. 一种设计合成的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相关肽-2类似物。

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