KR100729830B1 - 페너트라틴을 이용하여 단백질의 세포투과를 증진시키는대장균용발현벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초파리 전사인자의 호메오도메인(homeodomain)으로부터 유래된 페너트라틴(penetratin)을 융합파트너로 이용하는 융합단백질의 발현벡터 및 그를 이용한 목적단백질을 제조하여, 세포투과효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현벡터에 다양한 크기의 목적 단백질 유전자를 삽입하여 목적 단백질을 제조할 때, 목적 단백질의 크기에 상관없이 대량으로 발현되었고 이들 각각은 높은 세포투과도를 나타내었다. 따라서 본 발명의 융합파트너로 페너트라틴(penetratin)을 삽입하여 제조한 융합단백질의 발현벡터들은 다양한 크기의 목적단백질들을 대량으로 제조, 세포투과도를 높이는 데, 효율적으로 이용될 수 있을 것이다. 특히 인체호르몬, 각종 싸이토카인 및 항원 등과 같이 생물학적 활성을 갖는 다양한 단백질의 생산 및 임상적인 응용에 이용될 수 있을 것이다.

페너트라틴(Penetratin), 인터페론 감마(interferon gamma), EGF

Description

페너트라틴을 이용하여 단백질의 세포투과를 증진시키는 대장균용발현벡터{Expression vector with Penetratin as a fusion partner to enhance transdermal delivery of recombinant proteins}

제 1도는발현벡터 pET17b의 유전자 지도를 나타낸다.

제 2도는 본 발명의 융합파트너인 페너트라틴의 재조합 발현벡터인 pET-Pen N의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

제 3도는 재조합 발현벡터인 pET-Pen C의 구축과정을 나타낸다.

제 4도는 페너트라틴을 융합파트너로 하는 재조합 인간 인터페론 감마의 발현벡터의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

제 5도는 pPenIFNg/pIFNgPen로 각각 형질 전환된 미생물로부터 발현되는 단백질의 양상을 나타내는 전기영동사진이다.

제 6도는 페너트라틴을 융합파트너로 하는 재조합 인간 EGF의 발현벡터의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

제 7도는 pPenEGF/pEGFPen로 각각 형질 전환된 대장균의 IPTG 유도에 의한 EGF융합단백질 발현 양상을 나타내는 전기 영동사진이다.

제 8도는 본 발명의 재조합 사람 인터페론 감마의 활성을 나타내는 도식이다.

제 9도는 본 발명의 재조합 사람 EGF의 활성을 나타내는 도식이다.

제 10도는 본 발명의 재조합 사람 인터페론 감마의 세포내로의 이동을 나타내는 그림이다(왼쪽패널:COS-7세포, 오른쪽패널:NIH3T3 세포).

제 11도는 본 발명의 재조합 사람 인터페론 감마의 마우스 피부조직내로의 이동을 나타내는 그림이다.

본 발명은 초파리 전사인자의 한 부분인 페너트라틴(penetratin)을 융합파트너로 이용하는 대장균용 융합단백질 발현벡터에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 진핵생물인 초파리에서 발현되어 세포투과에 관여하는 것으로 보고된, 전사인자 유전자의 특정부위인 페너트라틴을 융합파트너로 이용하는 융합단백질의 발현벡터 및 그를 이용한 목적단백질의 생산 및 세포투과도 증진에 관한 것이다.

유전공학 기법을 이용하여 미생물로부터 유용한 단백질을 생산하는 발현체계는 다양하게 개발되어 왔다. 이러한 발현체계중에 목적 단백질을 융합형태로 발현시키는 방법은 다음과 같은 장점을 가지고 있다: 첫째, 펩타이드와 같이 작은 분자량을 가지고 있어, 숙주효소에 의해 쉽게 분해되는 외래 단백질을 숙주내에서 안정화 시킨다. 둘째, 발현된 생산물의 정제를 용이하게 하므로, 생산물을 효과적으로 얻을 수 있다. 셋째, 발현된 생산물을 숙주 내의 특정부위, 즉 세포질(cytoplasm)이나 세포벽(cell wall) 혹은 배양액(culture medium)으로 분비케한다. 넷째, 목적 단백질의 활성유지를 위하여, 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 목적 단백질을 제공할 수 있는 장점이 있다.

이러한 장점들로 인하여, 목적 단백질을 융합단백질로 발현시키는 체계가 다양하게 개발되어 왔으며, 이들 발현체계의 융합파트너로서는 다음과 같은 것들이 이용되어 왔다. 베타-갈락토시데이즈(b-galactosidase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase), GST(glutathione S-transferase) , 및 MBP(maltose binding protein) 등의 단백질과, 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리시스테인 (polycysteine) 및 Flag 펩타이드 등의 합성 펩타이드들이 여기에 해당된다.

그러나, 융합파트너로 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidse), CAT, GST 및 MBP 등의 단백질들을 이용하는 발현벡터들은 융합파트너의 크기가 너무 커서, 융합단백질의 발현양이 많다고 하더라도, 실제로 얻어지는 목적 단백질의 양이 상대적으로 적어지는 단점을 가지고 있다. 폴리히스티딘, 폴리시스테인 및 Flag 펩타이드 등의 합성 펩타이드를 이용하는 발현벡터들은 목적 단백질이 펩타이드나 작은 분자량의 단백질인 경우, 발현된 융합 단백질의 크기가 작아, 숙주세포내에서 쉽게 분해되는 단점들이 있을 수 있다.

이러한 융합벡터를 이용한 목적단백질의 대량생산에도 불구하고 이들의 세포투과도는 현저히 낮아, 실질적으로 융합단백질의 효과를 나타내지 못하는 단점을 가지고 있었다.

이에 본 발명의 발명자들은 페너트라틴을 이용한 벡터시스템을 통해 목적단백질의 대량생산과 더불어 이들의 세포투과도를 증가시켜, 목적단백질의 효과를 극대화시킬 수 있는 시스템을 개발하였다.

본 발명자들은 목적단백질의세포내로의 투과성을 증가시키는 방법으로 다양한 핵성 단백질들을 연구한 결과, 초파리 전사인자내의 16개 아미노산으로 이루어진 특정부위인 페너트라틴이 적합한 융합파트너로 이용될 수 있음을 알게 되었다

결국, 본 발명의 주된 목적은 초파리 전사인자의 특정부위인 페너트라틴(penetratin)을 융합파트너로 이용하는 융합단백질의 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 발현벡터를 이용하여 목적단백질의 세포투과도를 증가시티는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

융합 파트너로 이용될 페너트라틴 유전자의 제조를 위하여, 16개의 아미노산을 코딩(coding)하는 염기 서열(base sequence)을 확인한 후,이에 대한 올리고머(oligomer)를 합성하였다. 이 올리고머를 linking하여 pET17b의 NdeI/XhoI 절단부위에 삽입하여 발현벡터 pET-Pen N, PET-Pen C를 제조하였다.

페너트라틴융합파트너로 이용할 경우, 그 효용성을 조사하기 위하여, 인터페론 감마와 EGF를 각각 모델 단백질로 하여, 그 발현양상을 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과 페너트라틴과 융합된 목적단백질이 IPTG에 의해 정확하게 발현 유도되며, 또한 대량으로 발현됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 융합 파트너로 페너트라틴을 삽입하여 제조한 융합단백질의 발현벡터는 목적 단백질을 대량으로 제조하고자 하는 경우에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다. 특히 인체호르몬, 각종 싸이토카인(cytokine), 및 항원 등과 같이 생물학적 활성을 갖는 다양한 목적 단백질의 생산에 널리 이용될 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명에서는 IPTG 유도성 벡터에 융합 파트너로 페너트라틴을 삽입하여 제조한 융합단백질의 발현벡터 뿐만 아니라, IPTG 외의 기타 다른 유도성 벡터에 페너트라틴이 삽입되어 그가 융합 파트너로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것이지, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.

실시예 1: 발현벡터 pET-Pen N의 제조.

16개의 아미노산을 코딩하는 penetratin에 대한 5‘ 말단 프라이머와 3’말단 프라이머를 각각 제작하여, 두 프라이머를 결합시킨다. 결합된 프라이머쌍은 5‘말단에 NdeI 제한효소자리와, 3’말단에 XhoI 제한효소자리를 가지게 된다. pET17b 벡터를 NdeI/XhoI로 절단한 후, 결합된 프라이머쌍을 삽입한다. 그 결과 도면 2와 같은 융합단백질 벡터가 형성된다. 이 벡터는 목적단백질의 N-말단에 페너트라틴이 융합된 단백질을 생산하다. 벡터 완성여부는 StuI 제한효소로 절단시, single cut이 발생함과 더불어, sequencing을 통해서 최종 확인하였다. (5‘-말단 프라이머: 5'-TAT gCg CCA gAT AAA gAT TTg gTT CCC gAA TCg gCg CAT gAA gTg gAA gAA gAg gCC. 3’-말단 프라이머:5'-TAT gCg CCA gAT AAA gAT TTg gTT CCC gAA TCg gCg CAT gAA gTg gAA gAA gAg gCC)

실시예 2: 발현벡터 pET-Pen C의 제조

penetratin에 대한 인산화된 5‘말단과 3’말단 프라이머를 각각 제작하여, 이를 서로 결합시킨다. pET17b 벡터를 NdeI/XhoI으로 절단하고 탈인산화시킨다. NdeI/XhoI절단부위에 결합된 프라이머쌍을 삽입한다. 그 결과 도면 3와 같은 융합단백질 벡터가 형성된다. 목적단백질의 C-말단에 페너트라틴이 융합된 단백질이 생성되어진다. 벡터 완성여부는 Nru I제한효소 절단과 풀 시퀀싱(full sequencing)을 통해서 최종 확인하였다. (5‘-말단 프라이머: 5'-TAT gTC gCg ACA gAT AAA gAT TTg gTT CCC gAA TCg gCg CAT gAA gTg gAA gAA gTg AC. 3’-말단 프라이머:5'-TCg AgT CAC TTC TTC CAC TTC ATg CgC CgA TTC ggg AAC CAA ATC TTT ATCTgT CgC gAC A).

실시예 3: pPen-IFN gamma/pIFN gamma-Pen의 제조 및 발현

IFNg에 대한 인산화된 5‘-말단/3’-말단 프라이머를 각각 제조하였다. pPen-IFN gamma제조에 사용되는 3‘-말단프라이머는 stop codon이 있고, 반면에 pIFN gamma-Pen의 제조에 사용되는 3’-말단 프라이머는 IFN gamma의 stop codon이 제거된 염 기서열을 가지도록 제작되었다. 각각의 5‘-말단/3’-말단 프라이머를 이용해서 사람세포주(human cell line)인 HaCat 세포주에서 RT-PCR하여 IFN gamma DNA단편을 획득하였다. 이 DNA단편을 pPen-IFN gamma제조시는 pPen N을 Stu I으로, pIFN gamma-Pen제조시는 pPen C를 NruI으로 절단한 후, 탈인산화시킨 벡터에 RT-PCR로부터 획득된 IFN gamma DNA단편을 삽입하였다. T7 primer와 IFN gamma의 3‘-말단 프라이머를 이용한 PCR과 sequencing을 통해서 최종 융합벡터의 완성을 확인하였다(도면4). (pPen-IFN gamma의 5’-말단 프라이머:5'-P tgt tac tgc cag gac cca tat gta aaa g -3' pPen-IFN gamma의 3’-말단 프라이머: 5'-P tta ctg gga tgc tct tcg acc tcg aaa c -3', /pIFN gamma-Pen의 5‘-말단 프라이머: 5'-PATg TgT TAC TgC CAg gAC CCA TAT gTA CAA g-3' pIFN gamma-Pen의 3‘-말단 프라이머:5'-PCTg ggT TgC TCT TCg ACC TCg AAA CAg-3'). 쿠쉬너(Kushner)의 방법(참조: Kushner, Genetic engineering, p17, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1978)을 이용하여 실시예 3에서 제조된 발현벡터 pPen-IFN gamma/pIFN gamma-Pen을 BL21(DE3)에 도입하였다. 형질전환된 미생물(균주기탁번호: KCCM 10523)을 앰피실린이 포함된 LB 액 체 배양액(배양액 1L당 5g의 NaCl, 5g의 효모 추출물, 10g의 박토 트립톤, 50mg의 앰피실린이 포함)에

접종하고, 37도에서 250rpm으로 하루 동안 진탕배양하였다. 포화된 배양액을 다시 앰피실린이 포함된 신선한 배양액에 최종 1% 농도가 되게 접종하여 진탕 배양한 다음, 배양세포의 농도가 600nm에서 0.6의 흡광도를 나타낼 때, 최종 0.4mM IPTG를 배양액에 첨가하여 단백질을 유도한 후, 일정시간동안 진탕배양을 계속하였다.

대장균 배양체의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도면 5에서 보는 바와 같이 IPTG유도에 의하여, 대장균내에서 약 16kDa의 단백질이 효율적으로 발현됨을 알 수 있었다. 도면 5의 1번 lane은 IPTG를 처리하지 않은 것이고 2번, 3번, 4번은 각각 2시간, 4시간, 7시간 동안 IPTG로 유도하였다.

실시예 4: pPen-EGF/pEGF-Pen의 제조 및 발현

EGF에 대한 인산화된 5‘-말단/3’-말단 프라이머를 각각 제조하였다. pPen-EGF제조에 사용되는 3‘-말단프라이머는 stop codon이 있고, 반면에 pEGF-Pen의 제조에 사용되는 3’-말단 프라이머는 EGF의 stop codon이 제거된 염기서열을 가지도록 제작되었다. 각각의 5‘-말단/3’-말단 프라이머를 이용해서 사람세포주(human cell line)인 HaCat 세포주에서 RT-PCR하여 EGF DNA단편을 획득하였다. 이 DNA단편을 pPen-EGF제조시는 pPen N을 Stu I으로, pEGF-Pen제조시는 pPen C를 NruI으로 절단한 후, 탈인산화시킨 벡터에 RT-PCR로부터 획득된 EGF DNA단편을 삽입하였다. T7 primer와 EGF의 3‘-말단 프라이머를 이용한 PCR과 sequencing을 통해서 최종 융합벡터의 완성을 확인하였다(도면6)(pPen-EGF의 5’-말단 프라이머: 5'-Paat agt gac tct gaa tgt ccc ctg-3' pPen-EGF의 3’-말단 프라이머:5'-Ptta gcg cag ttc cca cca ctt cag g-3' /pEGF-Pen의 5‘-말단 프라이머: 5'-Patg aat agt gac tct gaa tgt ccc ctg-3', pEGF-Pen의 5‘-말단 프라이머:5'-Pgcg cag ttc cca cca ctt cag g-3'). 위에서 제조된 발현벡터를 실시예 3에서 언급된 방법으로 미생물을 형질전환시켰다. 형질전환되 미생물(균주기탁번호: KCCM 10524)을 앰피실린이 포함된 LB배양액에서 진탕배양한후 IPTG로 단백질 발현을 일정시간 동안 유도하였다. 발현벡터의 최종산물을 SDS-PAGE로 확인하였다. 도면 7에서처럼 2시간, 4시간 IPTG로 유도했을 경우, 단백질이 발현되었으나 7시간 유도했을 경우 단백질이 발현되지 않았다.

실시예 5: Pen-IFN gamma/IFN gamma-Pen의 활성 측정

실시예 3에서 기술된 방법으로 발현된 융합단백질을 정제한 후, 이 단백질의 활성을 세포를 이용하여 측정하였다. HeLa cell line을 배양기에 배양한 후, 20ng/ml의 농도로 세포에 처리하였다. 처리한 후 16시간동안 계속 배양한 다음 배양세포를 하비스트(harvest)한다. 이 세포를 lysis buffer를 이용해 용해시킨후 SDS-PAGE에 전기영동한다. 전기영동이 끝난 후 니트로셀룰로오스 막에 단백질을 옮긴다음, 인터페론 감마에 의해 세포내 발현이 유도되는 IRF-1에 대한 항체를 이용하여 western 분석을 하였다. 이 분석을 통해 발현된 융합단백질인 인터페론 감마가 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다(도면 8). 정량 컨트롤로 세포내에 발현되는 베타 액틴을 사용하였다. 도면 8의 1번은 인터페론 감마를 처리하지 않은 샘플, 2번은 양성 컨트롤로서 인터페론 감마를 , 3번은 페너트라틴-인터레론 감마 융합단백질, 4번은 인터페론 감마-페너트라틴 융합단백질을 각각 처리한 샘플들이다.

실시예 6: PenEGF/EGFPen의 활성 측정

실시예 3에서 기술된 방법으로 발현된 융합단백질을 정제한 후, 이 단백질의 활성을 세포를 이용하여 측정하였다. HeLa cell line을 배양기에 배양한 후, AP-Luciferase 유전자를 superfect을 이용하여 세포내에 도입하였다. 24시간 동안 계속배양후, 융합단백질로 생산된 EGF를 20ng/ml의 농도로 세포에 처리하였다. 처리한 후 16시간동안 계속 배양한 다음 배양세포를 하비스트(harvest)한다. 이 세포를 lysis buffer를 이용해 용해시킨후 Luminometer를 이용해 루시퍼레이즈의 활성을 측정하였다. 이 분석을 통해 발현된 융합단백질인 EGF가 단백질자체의 활성을 그대로 보유하고 있음을 알 수 있었다. (도면 9).

실시예 7: 페너트라틴 융합 사람 인터페론 감마의 세포내로의 이동.

실시예 3에서 기술된 방법으로 생산된 융합단백질의 세포내로의 이동을 IFA(Immunofluorescence assay)를 통해 확인하였다. NIH3T3 세포주와 HeLa 세포주를 배양용기에 키운 후, 페너트라틴 융합 인터페론 감마를 처리하였다. 16시간이 경과된후, PBS로 세척한 다음, 인터페론 감마에 대한 항체로 30분간 처리한다. 세척과정과 더불어 FITC가 붙은 2차 항체를 처리한 후, 형관현미경을 통해 세포내로의 이동을 관찰한다(도면 10).도면 10의 A는 HeLa 세포주에서, B는 NIH3T3 세포주에서 IFA를 수행한 결과이다.

실시예 8: 페너트라틴 융합 사람 인터페론 감마의 사람 피부조직내로의 이동

실시예 3에서 기술된 방법으로 생산된 융합단백질이 세포내로 이동되는 현상을 Immunohistochemistry를 통해 확인하였다. 페너트라틴 융합 사람 인터페론 감마를 마우스 피부( mouse skin)에 뿌린 후, 1시간 또는 2시간 경과된 조직을 채취해 인터페론 감마에 대한 항체를 이용, 조직면역학 (immunohistochemistry)을 수행하여 피부투과도를 측정하였다. 도면 11에 제시된 것과 같이, 페너트라틴이 융합된 인터페론 감마의 경우, 페너트라틴이 없는 인터페론감마에 비해 현저하게 피부진피내로 이동된 것을 관찰할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 초파리전사인자의 한부분인 페너트라틴을 융합파트너로 이용하는 융합단백질의 발현벡터 및 그를 이용하여 목적단백질을 대량으로 제조 및 그 단백질의 활성을 최대화하기위해 세포투과성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 발현벡터에 다양한 크기의 목적단백질 유전자를 삽입하여 목적단백질을 제조할 때, 페너트라틴에 융합된 목적단백질은 IPTG에 의해 정확하게 유도되며, 또한 대량으로 발현됨을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 융합파트너로 페너트라틴을 삽입하여 제조한 융합단백질의 발현벡터는 다양한 목적단백질을 대량생산 및 그 단백질의 세포투과성을 증가시켜 그 효과를 증진시키고자 할 때, 매우 효율적으로 이용될 수 있을 것이다. 특히 인체 호르몬, 각종 싸이토카인 및 항원 등과 같은 생물학적 활성을 갖는 다양한 단백질의 생산 및 이용에 효과적일 것이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 페너트라틴을 암호화하는 염기서열 및 인간 인터페론 감마를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 인간 인터페론 감마 융합단백질의 발현벡터.
4. 삭제
5. 제3항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
6. 삭제
7. 제5항의 형질전환된 대장균을 배양하여 IPTG로 인간 인터페론 감마 융합단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 인간 인터페론 감마 융합 단백질의 제조방법.
8. 제7항의 방법에 의하여 제조된 재조합 인간 인터페론 감마 융합단백질.

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