CN100485027C - 一种生产d-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用菌株，特别涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌。本发明所提供的芽孢乳杆菌为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD，其保藏编号为CGMCC № 2185。本发明提供的生产D-乳酸的方法为利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC№ 2185半连续发酵生产D-乳酸。本发明方法获得的D-乳酸的浓度最高可达162克/升、转化率94.7～96.0%、D-乳酸光学纯度98.0%以上，而且多次发酵循环后D-乳酸的光学纯度仍能保持98%以上，还能避免杂菌的污染。因此利用本发明方法生产D-乳酸，能节约成本、提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用菌株，特别是涉及一种生产D-乳酸的方法及其专用芽孢乳杆菌。
背景技术
乳酸(Lactic Acid)是一种结构简单的有机酸，作为代谢中间体及代谢产物广泛存在于自然界。由乳酸聚合生成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可用于生产手术缝合线、生物植片、生物可降解纤维、包装材料和农用薄膜等。乳酸分子中存在一个手性中心，具有旋光性，是一种手性分子。根据旋光性的不同，乳酸可分为L-乳酸、D-乳酸和消旋乳酸。其中，高纯度D-乳酸主要应用于生物可降解塑料、农药除草剂和医药中间体等方面。德国HOECHST公司以光学纯D-乳酸为原料生产的“威霸除草剂”，能防除农田中的禾本科杂草，杀草谱广，使用灵活，能与多种其它除草剂混配，也可与杀虫剂(如敌杀死等)混用，能在甜菜、油菜、亚麻、大豆等作物上施用。德国BASF公司生产的除草剂S-2-氯丙酸是以D-乳酸异丙酯为原料。此外，钙拮抗剂降低药物、皮考啉酸衍生物、二甲基四氯丙酸及氟系除草剂等都需要高纯度D-乳酸作为原料。
生产乳酸的方法主要有化学合成法、酶催化法和发酵法三种。其中，化学法直接合成的乳酸为DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸则需进行光学拆分，而且合成所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，所以合成出的乳酸应用于食品不能被广泛接受，此外其生产成本也较高。酶催化法可以专一性地得到光学纯乳酸，但其反应过程的研究难度较大，尚未被应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料，通过菌种和培养条件的选择发酵生产乳酸，能获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，其生产成本低，产品安全性高，是大规模生产乳酸的主要方法。
丁子建等在2004年报道采用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp)从葡萄糖发酵制备D-乳酸，可产40.7g/L的D-乳酸。中国专利CN 200610097453.6公开了一种组合发酵生产D-乳酸的工艺，产酸7.5％～13.1％。
目前微生物发酵法生产D-乳酸的方法中，D-乳酸的产量还有待进一步提高。在微生物发酵生产D-乳酸的过程中，与分批发酵相比，半连续发酵能够缩短发酵周期，提高设备利用率，提高劳动生产率，降低劳动强度，简化操作过程，有利于控制发酵法生产D-乳酸的成本。但是半连续发酵法生产D-乳酸存在着菌株退化、污染杂菌、D-乳酸光学纯度下降等问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株能生产D-乳酸的芽孢乳杆菌。
本发明所提供的芽孢乳杆菌为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD，是从北京平谷某果园的土壤中分离得到的，已于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC № 2185。它具有以下生物学特征：
1)形态特征：细胞直杆。单个或成对。形成内生孢子。少量周生鞭毛、运动。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成细小的针尖状菌落。
2)生理生化特征：革兰氏阳性。微好氧。不含有血红素化合物。不形成吲哚。不液化明胶。不还原硝酸盐。石蕊牛奶不变。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇产酸，不能利用木糖、半乳糖、***糖产酸。10℃以下和50℃以上不生长，最适生长温度40～42℃。
本发明的另一个目的是提供一种生产D-乳酸的方法。
本发明所提供的生产D-乳酸的方法，是发酵菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC № 2185得到D-乳酸。发酵培养的方式具体可为半连续发酵。
其中，发酵培养基每升中含有：葡萄糖150～180克，玉米浆10～40克，豆粕水解液100～200克，用于调控培养基pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。
所述用于调控培养基pH的中和剂具体为碳酸钙，每升所述发酵培养基中含碳酸钙75～90克。
所述豆粕水解液可从商业途径获得，也可自己制作。本发明中是按照下述方法制作的：将豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)和2％(体积百分含量)的硫酸溶液，以1g豆粕粉：5ml硫酸溶液的比例进行充分混匀，90℃水浴15小时，得到豆粕水解液。
发酵条件为35℃～45℃培养48～75小时，如37～42℃培养48～65小时。
在发酵培养过程中还可进行搅拌，搅拌的转速为30～100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间为20～40分钟；其中，搅拌转速优选为50转/分钟，搅拌时间优选为30分钟。
本发明方法中，在发酵前先将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185接入种子培养基中，37～42℃培养10～24小时，然后再接入所述发酵培养基。
其中，种子培养基是由如下物质组成的水溶液：葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升；所述种子培养基的pH为6～7。
本发明所提供的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185生产D-乳酸的能力强，以葡萄糖为底物发酵生产D-乳酸，D-乳酸最高产量162克/升，转化率94.7～96.0％，D-乳酸光学纯度98.0％以上，而且经过多次循环发酵后菌株不退化，仍能保持较高的活力；利用其发酵生产D-乳酸，可以进行多次循环发酵，发酵获得的D-乳酸的浓度高、转化率高，而且D-乳酸的纯度也能保持原来较高的水平，还能避免杂菌的污染。因此，利用本发明方法生产D-乳酸，能节约成本、提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。
附图说明
图1为高效液相色谱图。
A为L-乳酸标准品高效液相色谱图
B为D-乳酸标准品高效液相色谱图
C为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185发酵生产D-乳酸的发酵液的高效液相色谱图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
本发明的利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185发酵生产D-乳酸方法中涉及的步骤如下：
(1)斜面培养：将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC№ 2185菌种接种于含有1.5g/100ml琼脂的固体斜面培养基上，37～42℃条件下，培养24～48小时。
(2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，37～42℃条件下，静止培养10～24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。
(3)发酵培养：以10％体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，35～45℃条件下培养48～75小时，其中，三角瓶中发酵采用手动振动，每隔12小时振动一次，发酵罐采用间歇搅拌培养，每隔12小时搅拌一次，搅拌速度30～100转/分钟，旋转半径为33或42mm，搅拌时间20～40分钟，加入中和剂控制发酵液pH，制得含有D-乳酸的发酵培养液(第一次循环发酵)；然后将其中60～90％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，35～45℃条件下培养48～75小时，其中振荡方式同第一次循环发酵中所述一致(第二次循环发酵)；再将其中60～90％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，35～45℃条件下培养48～75小时，其中振荡方式同第一次发酵循环中所述的一致(第三次循环发酵)；如此循环发酵。
(4)处理样品：取发酵液以6,000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液。
(5)样品检测：取上清液稀释，检测葡萄糖含量、D-乳酸含量、L-乳酸含量。
其中，步骤(1)中所述的菌体培养温度具体可为40～42℃。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养温度具体可为40～42℃。
其中，步骤(3)中所述的菌体培养温度具体可为37～42℃。
其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间具体可为24～36小时。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间具体可为18～20小时。
其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间具体可为48～65小时。
其中，步骤(2)、(3)所述的培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH为5.5～7。
其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液离心后稀释，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。
生物传感分析仪SBA-40C是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和双氧水。反应放出的双氧水与白金—银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。
L-乳酸和D-乳酸含量采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10 W(3μ)4.6 ID×50mm，光学异体分离用)，0.002mol/L硫酸铜为流动相，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625，L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。以初始发酵培养基作为对照。
在以上色谱条件下，标准品的高效液相色谱检测结果见附图1。其中，A为L-乳酸标准品高效液相色谱图，B为D-乳酸标准品高效液相色谱图。在该色谱条件下，L-乳酸标准品的保留时间为11.566分钟，D-乳酸标准品的保留时间为9.724分钟。
D-乳酸光学纯度计算方法：D-乳酸光学纯度(％)＝[D-乳酸浓度(克/升)—L-乳酸浓度(克/升)]÷[D-乳酸浓度(克/升)+L-乳酸浓度(克/升)]×100％
转化率计算方法：转化率(％)＝D-乳酸浓度(克/升)÷葡萄糖消耗量(克/升)×100％
下面通过实施例进一步阐述本发明。
实施例1、菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185的分离、诱变筛选和鉴定
一、菌株菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185的分离、诱变筛选
菌株分离筛选：采集北京市平谷某果园土壤，称取5克溶于100ml生理盐水，充分混匀后用无菌水稀释100,000倍涂布于MRS固体培养基上，37℃培养；菌落长出后，部分单菌落由于产酸将菌落周围培养基中的碳酸钙溶解，产生透明圈，挑取透明圈明显的单菌落，接种于10ml发酵培养基中，37℃静止培养72小时后，根据上述具体实施方式中所述的检测方法，检测发酵液中D-乳酸含量。经过多次筛选，挑取一株D-乳酸产量最高的菌株。
离子束诱变筛选：将上述获得的D-乳酸产量最高的菌株接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养至对数中期，离心，将菌体用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸取100μL菌悬液涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1.5cm，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为1×1014ions/cm2、5×1014ions/cm2、10×1014ions/cm2、50×1014ions/cm2、100×1014ions/cm2。离子注入后的平皿用1mL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，稀释后涂布在MRS固体培养基上，待长出单菌落后，挑选透明圈较大的菌落，接种于10ml发酵培养基中，37℃静止培养48小时；然后将其中90％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，37℃静止培养48小时；再将其中90％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基，37℃静止培养48小时；如此循环发酵10次。根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测第1次和第10次循环发酵发酵液中葡萄糖浓度、D-乳酸浓度和L-乳酸浓度，计算D-乳酸光学纯度和葡萄糖转化率。结果发现，经过10次循环发酵，多数单菌落的产酸能力和D-乳酸光学纯度都有不同程度的下降，只有少数单菌落能够在多次循环发酵后基本保持原有的产酸能力和D-乳酸光学纯度。经过多次筛选，获得一株高活性的，D-乳酸产量比离子束诱变前有明显提高的、经过多次循环发酵后保持D-乳酸产量高、D-乳酸光学纯度98％以上、转化率95％以上的菌株。
将此菌株多次传代培养，然后再进行10个循环的半连续发酵测试，其第10次循环发酵产生的D-乳酸产量、D-乳酸光学纯度和转化率基本保持原有水平，证明此菌株即是目的菌株，名称为CASD。
其中，MRS固体培养基的组成为：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升，溶剂为水；所述MRS固体培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，溶剂为水；所述MRS液体培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
发酵培养基的组成为：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙75克/升，溶剂为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
其中，豆粕水解液制备方法：将豆粕粉(北京康明威培养基技术有限责任公司)和2％(体积百分含量)的硫酸溶液，以1g豆粕粉：5ml硫酸溶液的比例进行充分混匀，90℃水浴15小时，得到豆粕水解液。
二、菌株菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185的鉴定
按照“常见细菌***鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)和“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对该菌株进行形态特征观察和生理生化特性鉴定。
鉴定结果如下：
1)形态特征：细胞直杆。单个或成对。形成内生孢子。少量周生鞭毛、运动。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成细小的针尖状菌落。
2)生理生化特征：革兰氏阳性。微好氧。不含有血红素化合物。不形成吲哚。不液化明胶。不还原硝酸盐。石蕊牛奶不变。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇产酸，不能利用木糖、半乳糖、***糖产酸。10℃以下和50℃以上不生长，最适生长温度40～42℃。
基于以上特征，将本株D-乳酸生产菌鉴定为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD，并将其保藏，保藏号为CGMCC № 2185。
“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中菊糖芽孢乳杆菌与菊糖芽孢乳杆菌CASD形态和生理生化特征比较如表1所示。
表1
| “伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中菊糖芽孢乳杆菌形态和生理生化特征 | 本发明中菊糖芽孢乳杆菌CASD形态和生理生化特征 |
| 直杆，单个、成对 | 杆状，单个，少量成对 |
| 借为数不多的周生鞭毛运动 | 少量周生鞭毛、运动 |
| 菌落针尖状 | 琼脂平板上形成细小的针尖状菌落 |
| 内生孢子 | 内生孢子 |
| 革兰氏阳性 | 革兰氏阳性 |
| 不含有血红素化合物 | 不含血红素化合物 |
| 不形成吲哚 | 不形成吲哚 |
| 明胶不液化 | 不液化明胶 |
| 不还原硝酸盐 | 不还原硝酸盐 |
| 石蕊牛奶不变 | 石蕊牛奶不变 |
| 微好氧 | 微好氧 |
| 10℃以下和45℃以上不生长 | 10℃以下和50℃以上不生长 |
| 最适生长温度35℃ | 最适生长温度40～42℃ |
| 严格同型发酵产生D-乳酸 | D-乳酸光学纯度98％以上 |
| 从果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇等产酸 | 能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇产酸 |
| 从木糖、半乳糖、***糖等微产酸或不产酸 | 不能利用木糖、半乳糖、***糖产酸 |
实施例2、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵2次，每次发酵培养48小时，发酵温度35℃，将其中90％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升，溶剂为水；所述斜面培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，溶剂为水；所述种子培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙75克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC№ 2185接种于斜面培养基上，40℃培养24小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，35℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；然后从中取出90ml发酵液，再向其中补充加入90ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，35℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为136±3克/升，转化率为95.0±0.4％，D-乳酸光学纯度为98.3±0.2％。
实施例3、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵2次，每次发酵培养65小时，发酵温度40℃，将其中70％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)150克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)40克/升，碳酸钙80克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2。
(2)种子培养：同实施例2。
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，40℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养65小时；然后从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，40℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养65小时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为146±5克/升，转化率为94.7±0.4％，D-乳酸光学纯度为98.0±0.3％。
实施例4、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵4次，每次发酵培养75小时，发酵温度45℃，将其中60％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)100克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸钙75克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，45℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；然后从中取出60ml发酵液，再向其中补充加入60ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，45℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；从中取出60ml发酵液，再向其中补充加入60ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为150克/升，45℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养75小时；再如此循环发酵1次，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率和D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为140±3克/升，转化率为95.3±0.3％，D-乳酸光学纯度为98.5±0.2％。
实施例5、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养72小时，发酵温度37℃，将其中75％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)200克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)40克/升，碳酸钙80克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，37℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；从中取出75ml发酵液，再向其中补充加入75ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，37℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；从中取出75ml发酵液，再向其中补充加入75ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为160克/升，37℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养72小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为145±4克/升，转化率为95.7±0.5％，D-乳酸光学纯度为98.1±0.2％。
实施例6、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养60小时，发酵温度40℃，将其中80％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)160克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙90克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，40℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；从中取出80ml发酵液，再向其中补充加入80ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，40℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；从中取出80ml发酵液，再向其中补充加入80ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，40℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为160±2克/升，转化率为95.7±0.4％，D-乳酸光学纯度为98.3±0.2％。
实施例7、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在三角瓶中发酵生产D-乳酸，循环发酵10次，每次发酵培养48小时，发酵温度42℃，将其中70％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)200克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为7。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，42℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；从中取出70ml发酵液，再向其中补充加入70ml新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时；如此再循环发酵7次，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测最后一次循环发酵发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。结果表明：D-乳酸浓度为150±2克/升，转化率为95.2±0.2％，D-乳酸光学纯度为98.5±0.2％。
实施例8、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在5升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵3次，每次发酵培养60小时，发酵温度40℃，将其中80％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)180克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸钙90克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液1；将30ml种子培养液1在无菌条件下接入装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液2；
(3)发酵培养：将300ml步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.7升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第1次循环)；从中取出3.2升发酵液，再向其中补充加入3.2升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第2次循环)；从中取出3.2升发酵液，再向其中补充加入3.2升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为180克/升，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以30转/分的转速搅拌20分钟，旋转半径为33mm，培养60小时(第3次循环)，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，分别检测第1、2、3次循环发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。3次发酵结果见表2。
表2
| 发酵批次 | D-乳酸浓度(克/升) | 转化率(％) | D-乳酸光学纯度(％) |
| 第1次循环发酵 | 152±6 | 95.6±0.3 | 98.2±0.1 |
| 第2次循环发酵 | 161±4 | 95.0±0.3 | 98.0±0.3 |
| 第3次循环发酵 | 160±4 | 96.0±0.2 | 98.0±0.2 |
实施例9、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在5升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵7次，每次发酵培养55小时，发酵温度40℃，将其中75％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)170克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)25克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例8；
(3)发酵培养：将300ml步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.7升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第一次循环)；从中取出3.0升发酵液，再向其中补充加入3.0升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第二次循环)；从中取出3.0升发酵液，再向其中补充加入3.0升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，40℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以50转/分的转速搅拌30分钟，旋转半径为33mm，培养55小时(第三次循环)；再如此循环发酵4次，结束发酵。
检测第1至第7次循环发酵发酵液的D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，并计算葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。7次发酵结果见表3。第6次循环发酵发酵液高效液相色谱检测结果见附图1。其中，C为发酵液高效液相色谱图。
表3
| 发酵批次 | D-乳酸浓度(克/升) | 转化率(％) | D-乳酸光学纯度(％) |
| 第1次循环发酵 | 145±2 | 95.2±0.3 | 98.3±0.3 |
| 第2次循环发酵 | 150±4 | 95.4±0.4 | 98.0±0.4 |
| 第3次循环发酵 | 158±6 | 95.5±0.1 | 98.5±0.4 |
| 第4次循环发酵 | 156±2 | 95.0±0.3 | 99.0±0.2 |
| 第5次循环发酵 | 160±5 | 95.0±0.5 | 98.8±0.5 |
| 第6次循环发酵 | 162±3 | 95.3±0.4 | 98.0±0.1 |
| 第7次循环发酵 | 157±2 | 95.6±0.4 | 98.3±0.1 |
实施例10、利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC №2185在30升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，循环发酵4次，每次发酵培养48小时，发酵温度42℃，将其中85％的发酵液替换为同体积的新鲜发酵培养基
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例2。
发酵培养基：工业葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制备方法同实施例1)150克/升，玉米浆(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸钙85克/升，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例2；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液1；将30ml种子培养液1在无菌条件下接种于装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液2；将300ml种子培养液2，在无菌条件下接种于装有2升种子培养基的5升三角瓶中，40℃静止培养20小时，制得种子培养液3；
(3)发酵培养：将2升步骤(2)制得的种子培养液3，在无菌条件下接入装有18升发酵培养基的30升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，42℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌40分钟，旋转半径为42mm，培养48小时(第1次循环)；从中取出17升发酵液，再向其中补充加入17升新鲜发酵培养基，同时补加葡萄糖至其终浓度为170克/升，42℃静止培养，每隔12小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌40分钟，旋转半径为42mm，培养48小时(第2次循环)；再如此循环发酵2次，分别记作第3次循环、第4次循环，结束发酵。
分别检测第1、2、3、4次循环发酵液中D-乳酸浓度、L-乳酸浓度、葡萄糖浓度，并计算每次的葡萄糖转化率及D-乳酸光学纯度。
该实验共设3次重复。4次发酵结果见表4。
表4
| 发酵批次 | D-乳酸浓度(克/升) | 转化率(％) | D-乳酸光学纯度(％) |
| 第1次循环发酵 | 143±4 | 95.2±0.3 | 98.0±0.1 |
| 第2次循环发酵 | 150±2 | 95.0±0.2 | 98.3±0.3 |
| 第3次循环发酵 | 158±3 | 95.5±0.4 | 98.0±0.1 |
| 第4次循环发酵 | 156±2 | 96.0±0.3 | 98.1±0.2 |
Claims (11)
1、菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD，其保藏编号为CGMCC№ 2185。
2、一种生产D-乳酸的方法，是发酵菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185得到D-乳酸。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的方式为半连续发酵。
4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185的发酵培养基每升中含有：葡萄糖150～180克，玉米浆10～40克，豆粕水解液100～200克，用于调控培养基pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述中和剂为碳酸钙，每升所述发酵培养基中含碳酸钙75～90克。
6、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185的发酵条件为35℃～45℃培养48～75小时。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养温度为37℃～42℃。
8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养时间为48～65小时。
9、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中进行搅拌，所述搅拌的转速为30～100转/分钟，旋转半径为33mm或42mm，搅拌时间为20～40分钟。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述搅拌转速为50转/分钟，搅拌时间为30分钟。
11、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC № 2185先接入种子培养基中，在37～42℃培养10～24小时，再接入所述发酵培养基；
所述种子培养基是由如下物质组成的水溶液：葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸二铵2克/升，乙酸钠5克/升，吐温801毫升/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升；所述种子培养基的pH为6～7。
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