CN105779353A - 一种芽孢乳杆菌及其应用 - Google Patents

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黄建飞
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Abstract

本发明提供一种芽孢乳杆菌及其应用，所述菌株为Sporolactobacillus shenzhenensis GD201205，其保藏号为：CICC 23867。本发明从胀气果冻中分离筛选出一种新的芽胞乳杆菌并对该菌乳酸生产进行了研究，这为下一步发酵生产乳酸的研究奠定了基础。并且本发明芽孢乳杆菌具有乳酸生产能力，具有较大的研究价值。

Description

一种芽孢乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种能发酵生产乳酸的新的细菌及其应用，具体涉及芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)及其应用。
背景技术
乳酸是一种重要的有机酸，在医药、食品、化工、饲料以及现代农药等领域有广泛的前景应用。根据旋光性可以分为D-乳酸、L-乳酸和D/L-乳酸。世界乳酸产量的90％是由微生物发酵法生产的。应用于工业生产的微生物主要是霉菌中的根霉菌类和细菌中的乳酸菌类，根霉主要生产L-乳酸，乳酸菌中大部分也是生产L-乳酸，而产纯D-乳酸的乳酸菌主要分布在乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属和明串珠菌属。
目前，乳酸生产的研究主要集中在如何选育高产乳酸菌种，优化产乳酸菌种的培养基以及培养条件和改善发酵技术等方面，同时，利用基因工程的理论方法对乳酸生产菌株进行改造也对提高菌株乳酸生产能力也有一定的理论意义。
发明内容
为此，本发明提供一种芽孢乳杆菌，所述菌株为SporolactobacillusshenzhenensisGD201205，其保藏号为：CICC23867。
本发明所述的芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)分子分类地位的确定：该菌株的16SrRNA序列登录号为KP340805，其16SrRNA序列如SEQIDNO:1所示。测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与本发明菌株亲缘关系最近的种属，从数据库获得相关种属的16SrRNA序列，构建***发育树。
经16SrRNABLAST比较，本发明所述芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)与芽孢乳杆菌属亲缘性最高，其中本发明所述芽孢乳杆菌的16SrRNA基因序列与菌株芽孢乳杆菌(SporolactobacillusvineaeJCM14637T)同源性为97.46％，与芽孢乳杆菌属其它种16SrRNA同源性都低于97％。将本发明芽孢乳杆菌和SporolactobacillusvineaeJCM14637T进行DNA-DNA杂交实验，杂交同源性为29.2％。16SrRNA同源性低于97％的细菌其DNA-DNA杂交率小于70％(StackebrandtE&GoebelBM.Taxonomicnote:aplaceforDNA-DNAreassociationand16SrRNAsequenceanalysisinthepresentspeciesdefinitioninbacteriology[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,1994,44(4):846-849)，根据1987年国际***微生物委员会ICSB规定，16SrRNA同源性小于97％或者DNA-DNA杂交率低于70％为细菌菌种的界限，因此本发明的细菌为一种新的芽孢乳杆菌，命名为芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)。
本发明还提供了一种所述芽孢乳杆菌在乳酸发酵生产的应用，包括以下步骤：
步骤A：芽孢乳杆菌的分离
从胀气果冻中取果冻放入装有无菌水的三角瓶中，振荡，取10倍稀释液均匀涂布在葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基平板上，翻转平板置于培养箱中厌氧培养，既可以获得芽孢乳杆菌。
步骤B：产乳酸能力测定
挑取步骤A所得到的芽孢乳杆菌单菌落接种至葡萄糖酵母膏蛋白胨液体培养基中，厌氧培养，取发酵液，离心，取上清，水浴加热，再离心后取上清液检测发酵液中D-乳酸和L-乳酸浓度。
其中，步骤A中，葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基：葡萄糖10g，蛋白胨3g，酵母粉7g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O0.5g，琼脂15g，水1000mL，pH5.5-6。
本发明的芽孢乳杆菌具有以下有益效果：本发明从胀气果冻中分离筛选出一种新的芽胞乳杆菌并对该菌乳酸生产进行了研究，这为下一步发酵生产乳酸的研究奠定了基础。并且本发明芽孢乳杆菌具有乳酸生产能力，具有较大的研究价值。
附图说明
图1为芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)及相关属菌株依据16SrRNA序列构建***进化树。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1：
芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)的分离
从胀气果冻中取10g果冻放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，在220rpm转速下振荡30min，取0.1mL稀释液均匀涂布在葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基平板上，翻转平板置于37℃培养箱中厌氧培养5天，既可以获得本实施例所述的芽孢乳杆菌。
葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基：
葡萄糖10g，蛋白胨3g，酵母粉7g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O0.5g，琼脂15g，水1000mL，pH5.5-6。
本发明的芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)具有下述性质：
1.形态特征
芽孢乳杆菌在葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基平板上培养5天后的菌落呈乳白色，圆形，表面光滑凸起，不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性，菌体呈细杆状，(0.8～1.0)×(1.2～1.6)μm，单个或者成对排列，端生芽胞。
2.生理生化特征
从胀气果冻中分离的芽孢乳杆菌进行生长温度(15℃、20℃、25℃、35℃、40℃、45℃)、生长pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和糖利用能力等生理生化实验。芽孢乳杆菌过氧化氢酶阴性，氧化酶为阴性，在pH3.5～8.0和20～40℃条件下皆可以生长，糖利用能力见表1。
3.其它性质
芽孢乳杆菌脂肪酸主要成分：anteiso-C17:0，anteiso-C15:0，细胞壁氨基酸主要成分为meso-DAP，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，全细胞水解液糖组分主要为：半乳糖(Gal)和木糖(Xyl)。
表1芽孢乳杆菌(SporolactobacillusshenzhenensisGD201205)生理生化特性
底物 结果 底物 结果
对照 七叶灵 -
甘油 - 柳醇 -
赤藓糖醇 - D-纤维二糖 -
D-***糖 - D-麦芽糖 -
L-***糖 - D-乳糖 -
D-核糖 - D-蜜二糖 -
D-木糖 - D-蔗糖 +
L-木糖 - D-海藻糖 -
阿东醇 - 菊糖 -
β-甲基-D-木糖甙 - D-松三糖 -
D-半乳糖 - D-棉子糖 +
D-葡萄糖 + 淀粉 -
D-果糖 + 糖原 -
D-甘露糖 + 木糖醇 -
L-山梨糖 - 龙胆二糖 -
L-鼠李糖 - D-松二糖 +
卫茅醇 - D-来苏糖 -
肌醇 - D-塔格糖 -
甘露醇 - D-岩藻糖 -
山梨醇 - L-岩藻糖 -
α-甲基-D-甘露糖甙 - D-***糖醇 -
α-甲基-D-葡萄糖甙 - L-***糖醇 -
N-乙酰-葡糖胺 - 葡萄糖酸盐 -
苦杏仁甙 - 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
熊果甙 - 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
实施例2：芽孢乳杆菌16SrRNA的序列测定
1.PCR模板的制备
将芽孢乳杆菌接种到GYP液体培养基上，37℃培养箱中厌氧培养5天，采用Takara细菌基因组提取试剂盒提取，提取的基因组作为PCR模板。
2.16SrRNA基因扩增和测序
16SrRNA引物由Takara公司合成，上游引物：5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′下游引物：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最终72℃延伸10min。将PCR产物胶回收送Takara公司测序。
3.芽孢乳杆菌分子分类地位的确定。
图1是基于16SrRNA序列的GD201205***发育树，其中，Bootstrap验证次数为1000，树枝上的数值为验证可信度，图左下端标尺表示碱基置换频率。
测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与本发明菌株亲缘关系最近的种属，从数据库获得相关种属的16SrRNA序列，构建***发育树，与同源性最高芽孢乳杆菌SporolactobacillusvineaeJCM14637T进行DNA-DNA杂交实验，杂交结果同源性为29.2％。
实施例3：芽胞乳杆菌的产乳酸能力实验测定
挑取本发明的芽孢乳杆菌单菌落接种至葡萄糖酵母膏蛋白胨液体培养基中，37℃厌氧培养5天，取发酵液，8000rmp/min离心10min，取上清，80℃水浴15min，再8000r/min离心10min取上清液检测发酵液中D-乳酸和L-乳酸浓度。D/L-乳酸浓度测定方法采用D-乳酸/L-乳酸检测试剂盒(酶法分析试剂盒，德国制造)。检测结果表明，本发明的芽孢乳杆菌产D-乳酸和L-乳酸，产量分别为1.03g/L和0.72g/L，总乳酸产量为1.75g/L，可通过培养基改善达到大量生产乳酸效果。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.芽孢乳杆菌，所述菌株为SporolactobacillusshenzhenensisGD201205，其保藏号为：CICC23867。
2.权利要求1所述芽孢乳杆菌在乳酸发酵生产的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：芽孢乳杆菌的分离
从胀气果冻中取果冻放入装有无菌水的三角瓶中，振荡，取稀释液均匀涂布在葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基平板上，翻转平板置于培养箱中厌氧培养，既可以获得芽孢乳杆菌；
步骤B：产乳酸能力测定
挑取步骤A所得到的芽孢乳杆菌单菌落接种至葡萄糖酵母膏蛋白胨液体培养基中，厌氧培养，取发酵液，离心，取上清，水浴加热，再离心后取上清液检测发酵液中D-乳酸和L-乳酸浓度。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤A中，葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基：葡萄糖10g，蛋白胨3g，酵母粉7g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O0.5g，琼脂15g，水1000mL，pH5.5-6。
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