CN100445377C - 仿生制备用于固定化β—葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅—海藻酸微囊的方法 - Google Patents

仿生制备用于固定化β—葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅—海藻酸微囊的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅—海藻酸微囊的方法。该方法过程为：将β-葡萄糖醛酸苷酶溶液、氯化钙溶液和羧甲基纤维素钠溶液按一定比例混合后滴加到海藻酸钠溶液中，得到海藻酸微囊；将微囊浸入氯化钙溶液中固化；将固化后的海藻酸微囊浸入硫酸鱼精蛋白或鱼精蛋白溶液中一段时间，得到鱼精蛋白包覆的海藻酸微囊；将包覆有鱼精蛋白的海藻酸微囊浸入硅酸钠溶液中，合成二氧化硅壳层，得到二氧化硅—海藻酸微囊。本发明提供的微囊制备方法简便易行，有效抑制了海藻酸微囊的溶胀，所得的固定化酶活性高，重复使用性好。

Description

仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊的方法
技术领域
本发明涉及一种仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊的方法，属于酶的固定化技术。
背景技术
海藻酸微囊是一种常用的固定化酶载体，它由含酶的高分子溶液液芯和海藻酸囊壁构成，类似自然界中游离酶的存在状态，具有酶活力维持率高，包埋量大，传质性能好等优点。但由于所采用的海藻酸高分子材料在水溶液中易溶胀，机械强度差，大大限制了此类固定化酶的重复使用性能。在海藻酸囊壁外包覆二氧化硅外壳可有效解决海藻酸微囊的溶胀问题。
目前普遍采用溶胶-凝胶法，利用有机硅烷前驱体的水解和缩聚制备二氧化硅外壳。该溶胶-凝胶过程需要在酸或碱的催化下进行，同时会产生醇类副产物，这些物质的存在对生物酶活力的维持大多有不利影响，导致酶活力降低甚至失活。此外，溶胶-凝胶法形成的二氧化硅壳层的形态和结构均很难控制。在制备条件下，凝胶化过程产生的二氧化硅低聚物荷负电，与海藻酸微囊表面的电性相同，二者之间存在静电排斥作用，因此在海藻酸微囊表面直接沉积的二氧化硅壳层与海藻酸囊壁的结合作用并不理想。
自然界中的硅藻是单细胞藻类植物，其柔软的原生质体被坚硬的硅质细胞壁支持和保护，并长成具有一定形状的个体。研究表明，这类硅藻植物都是通过有机质参与下的生物硅化作用来构建细胞壁的，即由一定的有机模板通过静电吸引作用促进和调控二氧化硅的沉积，而模板本身最终被包裹在所形成的二氧化硅网络内部，形成有机-无机杂化结构。已有的仿生硅化研究表明，利用天然的或有机合成的模板，如silaffins、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等，可在室温和中性条件下调控二氧化硅的快速聚合，形成兼备有机材料和无机材料优点的仿生杂化材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊的方法。该方法所制得的微囊用于固定化酶，其酶活力高，重复使用性好。
本发明是通过如下技术方案实现的，一种仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)海藻酸微囊的制备：将浓度为0.5mg/ml的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，浓度为0.6mol/L的氯化钙溶液和浓度为3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液按10∶8∶32的体积比混合均匀，滴加到1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，搅拌30～60min，去离子水稀释后过滤，再浸入0.1mol/L的氯化钙溶液中固化10min，得到直径2.5～3.5mm左右的海藻酸微囊。
(2)鱼精蛋白在海藻酸微囊外表面的包覆：将步骤(1)得到的海藻酸微囊浸入2～20mg/ml的硫酸鱼精蛋白或鱼精蛋白溶液中，浸泡30～120min后过滤，得到鱼精蛋白包覆的海藻酸微囊。
(3)鱼精蛋白调控下的二氧化硅壳层的仿生合成：将步骤(2)得到的微囊浸入30～80mmol/L，pH为5～7的硅酸钠溶液中，浸泡60～120min，过滤，得到二氧化硅-海藻酸微囊。
本发明提出的制备方法的优点在于：制备条件温和，所得胶囊具有很好的抗溶胀性能，所含的β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力维持率高，重复使用稳定性好。
附图说明
图1为实施例三制备的二氧化硅-海藻酸微囊表面的能量分散光谱(EDS)谱图。
图2为实施例三制备的二氧化硅-海藻酸微囊的扫描电镜(SEM)照片。
图3为实施例三制备的二氧化硅-海藻酸微囊表面的扫描电镜(SEM)照片。
图4为实施例三制备的二氧化硅-海藻酸微囊断面的扫描电镜(SEM)照片。
具体实施方式
实施例一
准确称取β-葡萄糖醛酸苷酶1.0mg，溶解于30mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液中，定容至10ml，得到0.5mg/ml酶液。称取160mg硫酸鱼精蛋白，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至80ml，得到2mg/ml硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，并用2mol/L HCl调节溶液的pH至7.0，制备50mmol/L硅酸钠溶液。
吸取0.40ml酶液，加入0.6mol/L的氯化钙溶液0.32ml，再加入3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液1.28ml，用磁力搅拌器混合至形成均一溶液，然后将溶液吸入注射器内，通过内径0.45mm的针头滴加入40ml搅拌着的浓度为1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，继续搅拌30min，加入160ml去离子水稀释，滤出微囊，去离子水洗涤。用滤纸吸干微囊表面的水分，加入10ml浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液，磁力搅拌10min，过滤，水洗。
用滤纸吸干微囊表面的水分并投入到35ml浓度为2mg/ml的硫酸鱼精蛋白溶液中，静置60min，滤出，再投入70ml浓度为50mmol/L的硅酸钠溶液中，静置120min，滤出，水洗，即得二氧化硅-海藻酸微囊(1)。经EDS分析，微囊表面硅元素的质量百分比为13.6％，微囊在水中的溶胀度为55％。
实施例二
准确称取β-葡萄糖醛酸苷酶1.0mg，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至10ml，得到0.5mg/ml酶液。称取400mg硫酸鱼精蛋白，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至80ml，得到5mg/ml硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，2mol/LHCl调节pH至7.0，制备50mmol/L硅酸钠溶液。
吸取0.40ml酶液，加入0.6mol/L的氯化钙溶液0.32ml，再加入3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液1.28ml，用磁力搅拌器混合至形成均一溶液，然后将溶液吸入注射器内，通过内径0.45mm的针头滴加入40ml搅拌着的浓度为1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，继续搅拌30min，加入160ml去离子水稀释，滤出微囊，去离子水洗涤。用滤纸吸干微囊表面的水分，加入10ml浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液，磁力搅拌10min，过滤，水洗。
用滤纸吸干微囊表面的水分并投入35ml浓度为5mg/ml的硫酸鱼精蛋白溶液中，静置30min，滤出，再投入70ml浓度为50mmol/L的硅酸钠溶液中，静置120min，滤出，水洗，即得二氧化硅-海藻酸微囊(2)。经EDS分析，微囊表面硅元素的质量百分比为28.2％，微囊在水中的溶胀度为11％。
实施例三
准确称取β-葡萄糖醛酸苷酶1.0mg，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至10ml，得到0.5mg/ml酶液。称取400mg硫酸鱼精蛋白，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至80ml，得到5mg/ml硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，2mol/LHCl调节pH至7.0，制备50mmol/L硅酸钠溶液。
吸取0.40ml酶液，加入0.6mol/L的氯化钙溶液0.32ml，再加入3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液1.28ml，用磁力搅拌器混合至形成均一溶液，然后将溶液吸入注射器内，通过内径0.45mm的针头滴加入40ml搅拌着的浓度为1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，继续搅拌30min，加入160ml去离子水稀释，滤出微囊，去离子水洗涤。用滤纸吸干微囊表面的水分，加入10ml浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液，磁力搅拌10min，过滤，水洗。
用滤纸吸干胶囊表面的水分并投入35ml浓度为5mg/ml的硫酸鱼精蛋白溶液中，静置60min，滤出，再投入70ml浓度为50mmol/L的硅酸钠溶液中，静置120min，滤出，水洗，即得二氧化硅-海藻酸微囊(3)。经EDS分析，胶囊表面硅元素的质量百分比为34.2％，微囊在水中基本不溶胀。
实施例四
将黄芩苷和无水亚硫酸钠溶解到30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，配成黄芩苷浓度为0.09mol/L，无水亚硫酸钠浓度为0.1％w/v的溶液，加入实施例三制备的含β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊，在37℃，搅拌条件下进行黄芩苷的转化反应，在一定的时间间隔内，取出100μl反应液，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，得到固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力。
对比例一
准确称取β-葡萄糖醛酸苷酶1.0mg，溶解于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，定容至10ml，得到0.5mg/ml酶液。吸取0.40ml酶液，加入0.6mol/L的氯化钙溶液0.32ml，再加入3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液1.28ml，用磁力搅拌器混合至形成均一溶液，然后将溶液吸入注射器内，通过内径0.45mm的针头滴加入40ml搅拌着的浓度为1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，继续搅拌30min，加入160ml去离子水稀释，滤出胶囊，去离子水洗涤。用滤纸吸干胶囊表面的水分，加入10ml浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液，磁力搅拌10min，过滤，水洗，既得海藻酸微囊。经测定，微囊在水中的溶胀度为114％。
对比例二
将黄芩苷和无水亚硫酸钠溶解到30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，配成黄芩苷浓度为0.09mol/L，无水亚硫酸钠浓度为0.1％w/v的溶液，加入对比例一制备的含β-葡萄糖醛酸苷酶的海藻酸微囊，在37℃，搅拌的条件下进行黄芩苷的转化反应，在一定的时间间隔内，取出100μl反应液，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，得到固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力。
表1所示为实施例四和对比例二测定的含β-葡萄糖醛酸苷酶的微囊进行黄芩苷转化反应的酶活力和酶活力未见降低的重复使用次数。
表1
Figure C20061013049400061

Claims (1)

1.一种仿生制备用于固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的二氧化硅-海藻酸微囊的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)海藻酸微囊的制备：将浓度为0.5mg/ml的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，浓度为0.6mol/L的氯化钙溶液和浓度为3.0％w/v的羧甲基纤维素钠溶液按10∶8∶32的体积比混合均匀，滴加到1.0％w/v的海藻酸钠溶液中，搅拌30～60min，去离子水稀释后过滤，再浸入0.1mol/L的氯化钙溶液中固化10min，得到直径2.5～3.5mm的海藻酸微囊；
(2)鱼精蛋白在海藻酸微囊外表面的包覆：将步骤(1)得到的海藻酸微囊浸入2mg/ml或5mg/ml的硫酸鱼精蛋白溶液中，浸泡30～120min后过滤，得到鱼精蛋白包覆的海藻酸微囊；
(3)鱼精蛋白调控下的二氧化硅壳层的仿生合成：将步骤(2)得到的微囊浸入30～80mmol/L，pH为5～7的硅酸钠溶液中，浸泡60～120min，过滤，得到二氧化硅-海藻酸微囊。
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