CN103397015B - 一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，先制备铁磁性纳米粒子，将无水乙醇、去离子水、硅烷偶联剂混合，水解后加入铁磁性纳米粒子，氮气保护下搅拌反应1-2小时，用磁铁吸附沉降，将沉降后固体洗涤干燥获得表面修饰的铁磁性纳米粒子，然后滴加交联剂交联活化，量取生物酶制剂恒温振荡得到。本发明磁性材料与生物酶中的α-淀粉酶、纤维素酶的高效催化特性相结合，使两者协同作用，从而制备可磁力再生的固载化生物酶，便于生物酶使用后的高效回收与再生，对两种酶进行的初步试验发现可以将此方法加以拓展应用到整个生物酶领域的固载化。

Description

一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，采用水热法制备纳米四氧化三铁或微乳液法制备纳米零价铁，用硅烷偶联剂修饰，再用交联剂活化，引入生物酶制得新型固载生物酶，属于生物酶催化技术领域。

背景技术

生物酶作为一种天然的生物催化剂，因其在温和的条件下非常优异的选择性和无法比拟的高效率受到科技工作者越来越多的关注，并且已经在生物医药、化工、食品和纺织行业得到广泛的应用。然而，在应用生物酶做催化剂的过程中，首先遇到的一个挑战就是生物酶“失活”问题。由于其活性条件太过苛刻，必须在特定的温度、特定的微环境（溶剂体系）、特定的酸碱度下工作。在其在使用过程中，任何导致生物酶催化剂所处环境的微小的变化都可能导致催化性能的下降，甚至失去活性；另外一个难题就是生物酶催化剂的回收、循环利用问题。在反应溶剂里再生自由酶几乎是不可能的，常常要经过一系列的提纯步骤，随之而来的是高昂的再生成本。于是生物酶的负载、固定化就成为解决回收难题的一种途径。但是，固载化的生物酶催化剂的回收利用仍然面临如何从反应体系中分离的问题，常常是伴随着过滤或离心等单元操作，导致生物酶的损失甚至失活，再生效果堪忧。因此，寻找一种可以高效率、大容量、易回收的生物酶载体成为本领域研究的热点。

纳米磁性材料由于其产生的特殊磁效应,因而具有常规材料所不具备的性能,使得其在各个方面的潜在应用极为广泛，对于纳米磁性材料及其应用前景的研究工作已经不再局限于单一学科与单一研究方法,而是多学科和多种研究方法的综合利用，目前在生物、催化、涂料、储存、医学等领域研究广泛。虽然磁性纳米粒子已达到纳米尺寸，但通常其粒径分布较宽，而且表面裸露，化学性质活泼，在空气中极易氧化，又由于磁性吸引和范德华力的作用，极易发生团聚及聚沉现象，使磁性材料失去单畴磁极、可分散性或者失去纳米材料特有的性质。所以，对其进行表面包覆改性，以改善粒子的分散性与稳定性，并使之得到更广泛的应用显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，使生物酶使用后得以高效回收与再生。

本发明采取的技术方案为：

一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，包括步骤如下：

（1）制备铁磁性纳米粒子：制备纳米级Fe₃O₄磁性粒子或纳米零价铁磁性粒子；

（2）将无水乙醇、去离子水、硅烷偶联剂混合，水解后加入铁磁性纳米粒子，氮气保护下搅拌反应1-2小时，用磁铁吸附沉降，将沉降后固体洗涤干燥获得表面修饰的铁磁性纳米粒子；

（3）将上述步骤中制备的表面修饰的铁磁性纳米粒子，加入缓冲溶液，滴加交联剂，交联活化10-20min，量取生物酶制剂，加入活化后的混合物中，在30-40℃恒温振荡器中反应1-3小时，用去离子水洗涤，制备出固载化生物酶的纳米磁性材料。

上述制备方法中步骤（1）所述纳米级Fe₃O₄磁性粒子优选下述方法制备：将NaOH水溶液和Na₂S₂O₃水溶液混合于反应瓶中，然后再将FeSO₄水溶液滴加入反应瓶中，滴加完毕后，打开电动搅拌器搅拌1-2h，之后将三口烧瓶中的反应物全部转入水热釜中，在160-170℃条件下反应12-16小时，反应结束后，将产物全部转入表面皿中，用磁铁沉降后吸出上清液，用去离子水洗涤3～4次，常温常压下干燥，得到纳米级Fe₃O₄磁性粒子。摩尔比NaOH:Na₂S₂O₃:FeSO₄=4:2:3。

所述的纳米零价铁磁性粒子优选下述方法制备：将十六烷基四丁基溴化铵、正丁醇和异辛醇加入反应瓶中搅拌成均匀混合物，将三氯化铁溶液加入混合物中，强力搅拌至橙黄透明，并且通入N₂保护，再缓慢加入硼氢化钠粉末，继续搅拌并通N₂保护，待体系颜色变黑且不再放出气体后，再继续搅拌0.5-1小时，静置待体系中黑色粉末全部沉至瓶底，吸出上层液体，加入甲醇和三氯甲烷的混合洗液洗涤，再用无水乙醇洗涤，得到纳米零价铁磁性粒子。十六烷基四丁基溴化铵和正丁醇作为表面活性剂的用量（十六烷基四丁基溴化铵和正丁醇可任意比例）是异辛醇质量的20%、三氯化铁溶液浓度为0.1-0.2mol/L、硼氢化钠粉末与三氯化铁的物质的量之比为3:1，三氯化铁溶液与异辛醇的体积比为1:5-7。

步骤（2）所述的无水乙醇、去离子水、硅烷偶联剂、铁磁性纳米粒子的质量比为18:1:0.6-0.8：0.1-0.2，所述的水解时间为1-10min。所述的硅烷偶联剂优选KH550。

步骤（3）所述的缓冲溶液为乙酸-乙酸钠溶液，pH=4-6；表面修饰的铁磁性纳米粒子、缓冲溶液、交联剂、生物酶制剂的质量比为1:400:10:10。所述的生物酶制剂优选α-淀粉酶或纤维素酶。

本发明采用水热法制备纳米磁性粒子，用硅烷偶联剂（KH550）修饰，以改善粒子的分散性与稳定性，再用交联剂活化，引入生物酶制得新型固载生物酶。例如将Fe₃O₄的磁性与生物酶中的α-淀粉酶、纤维素酶的高效催化特性相结合，使两者协同作用，从而制备可磁力再生的固载化生物酶，便于生物酶使用后的高效回收与再生，对两种酶进行的初步试验发现可以将此方法加以拓展应用到整个生物酶领域的固载化。

本发明制得的产品解决了生物酶在实际应用方面不能多次重复利用的瓶颈。制备的固载化生物酶重复使用5次后酶的活性仍能保持50-65%。且本发明能够将生物酶采用磁力方便地回收、多次利用，这样就大大降低了自由酶的使用量，降低了使用成本。假设同样活性的自由酶和固载酶价格相同，每1批次使用生物酶活性保持10%价值1000元，自由酶在使用1次后需要重新加入10000元，而固载化后的酶使用1批次只需要加入3500-5000元。以使用5次为比较基准，转化率假设最低至55%，那么自由酶和固载酶使用5批次产生的生产成本对比见表1。

表1固载化生物酶与自由酶使用成本对比（纤维素酶）

由表1可见，5个批次的生产成本，固载酶比自由酶降低一半左右。且重复使用次数越多，生产成本降低越多。

附图说明

图1本发明制得的可磁力再生的固载化生物酶红外光谱图；

图2本发明制得的可磁力再生的固载化生物酶的TEM照片；

图3本发明可磁力再生的固载化生物酶使用次数效果图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1

用电子天平准确称取13.104gFeSO₄·7H₂O于小烧杯中，加入50ml去离子水搅拌后溶解；13.886gNa₂S₂O₃·5H₂O于小烧杯中，加入25ml去离子水搅拌后溶解；4.480g粉粒状NaOH于小烧杯中，加入25ml去离子水搅拌后溶解；待溶解完毕后，将NaOH水溶液和Na₂S₂O₃水溶液转入250ml三口烧瓶中。然后再将FeSO₄水溶液转入恒压漏斗中，控制流速让水溶液滴加入三口烧瓶中。滴加完毕后，打开电动搅拌器搅拌1h,之后将三口烧瓶中的反应物全部转入水热釜中，在160℃条件下反应16小时。反应结束后，将产物全部转入表面皿中，用磁铁沉降后吸出上清液，用去离子水洗涤3～4次，常温常压下干燥，得到纳米级Fe₃O₄磁性粒子。

用100ml小烧杯称取54g无水乙醇，加入3g去离子水（质量比：无水乙醇水=18:1），再用小烧杯加入2.38gKH550（占体系总质量分数为4%），在小烧杯中水解10min左右，加入0.5g已制备的纳米Fe₃O₄中，强力搅拌并通氮气N₂保护，反应2h。停止搅拌，烧瓶下方放置磁铁，待修饰后的纳米Fe₃O₄全部沉于瓶底，用注射器吸出上层清澈液体，用去离子水洗涤3次转移至表面皿中干燥，获得表面修饰后的Fe₃O₄的颗粒，装入带磨口塞的三角瓶中密封保存。

将上述步骤中制备的纳米粒子约0.1g放于250ml的三口烧瓶中，加入100ml缓冲溶液，滴加（占总体积的）1%的交联剂戊二醛，交联活化20min,量取0.5ml的纤维素酶制剂，加入活化后的溶液中，在恒温振荡器中反应2小时，用去离子水洗涤3-4次，制备出固载化纤维素酶的纳米磁性材料。经检测，固载后的纤维素酶活性达到游离酶的85%，而且在使用5次之后酶的活性仍然在50%以上。

实施例2

表面修饰后的Fe₃O₄的颗粒的制备同实施例1。

称取1.0g的α-淀粉酶溶解于有缓冲溶液的100ml烧杯中，用玻璃棒搅拌一段时间直至固体淀粉酶溶解，用滤纸过滤除去不溶的杂质，得到的澄清液体转移到100ml容量瓶中，定容待用。

称取0.1g表面修饰后的Fe₃O₄的颗粒放在250ml的锥形瓶中，加入100ml的缓冲溶液，加入（占总体积的）1%的交联剂戊二醛，交联活化20min，量取已配置好的α-淀粉酶溶液10ml，加入活化后的溶液中，在恒温振荡器中反应2小时，用去离子水洗涤多次，制备出固载α-淀粉酶的纳米磁性材料。经检测，固载后的淀粉酶活性达到游离酶的87%，而且在使用5次之后酶的活性仍然在60%以上。

实施例3

把5.50g十六烷基四丁基溴化铵(CTAB)、16.50g正丁醇和68.00g异辛醇加入250ml三口烧瓶中搅拌成均匀混合物，将0.1M的三氯化铁溶液10ml加入混合物中，强力搅拌至橙黄透明，并且通入N₂保护，再缓慢加入0.12g硼氢化钠粉末，继续搅拌并通N₂保护，待体系颜色变黑且不再放出气体后，再继续搅拌半小时。静置待体系中黑色粉末全部沉至瓶底，吸出上层液体，加入50ml甲醇和三氯甲烷的混合洗液洗涤，并且用同样方法吸出洗涤液，再用50ml无水乙醇，也用同样样方法洗涤，得到纳米零价铁磁性粒子。

称取54g无水乙醇，加入3g去离子水，再加入2.38gKH570，水解10min左右，加入0.3g上述制备的纳米零价铁粒子中，强力搅拌并通N₂保护，反应3h。吸出上层清澈液体，用KH570包裹的纳米零价铁可用抽滤方法分离，获得KH570修饰的纳米零价铁粒子。

将上述步骤中制备的纳米零价铁粒子约0.1g放于250ml的三口烧瓶中，加入100ml缓冲溶液，滴加（占总体积）1%的交联剂乙二醛，交联活化20min,量取0.5ml的纤维素酶制剂，加入活化后的溶液中，在恒温振荡器中反应2小时，用去离子水洗涤3-4次，制备出固载化纤维素酶的纳米磁性材料。经检测，固载后的纤维素酶活性达到游离酶的80%，而且在使用5次之后酶的活性仍然在55%以上。

实施例4

KH570修饰的纳米零价铁粒子的制备同实施例3。

称取0.1gKH570修饰的纳米零价铁粒子放在250ml的锥形瓶中，加入100ml的缓冲溶液，加入（占总体积）1%的交联剂乙二醛，交联活化20min，量取配置好的α-淀粉酶溶液（同实施例2）10ml，加入活化后的溶液中，在恒温振荡器中反应2小时，用去离子水洗涤多次，制备出固载α-淀粉酶的纳米磁性材料。经检测，固载后的淀粉酶活性达到游离酶的85%，而且在使用5次之后酶的活性仍然在65%以上。

Claims (3)

1.一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，其特征是，包括步骤如下：

（1）制备铁磁性纳米粒子：制备纳米零价铁磁性粒子；

（2）将无水乙醇、去离子水、硅烷偶联剂混合，水解后加入铁磁性纳米粒子，氮气保护下搅拌反应1-2小时，用磁铁吸附沉降，将沉降后固体洗涤干燥获得表面修饰的铁磁性纳米粒子；无水乙醇、去离子水、硅烷偶联剂、铁磁性纳米粒子的质量比为18:1:0.6-0.8：0.1-0.2，所述的硅烷偶联剂选KH550或KH570；

（3）将上述步骤中制备的表面修饰的铁磁性纳米粒子，加入缓冲溶液，步骤（3）所述的缓冲溶液为乙酸-乙酸钠溶液，pH=4-6，滴加交联剂，交联活化10-20min，量取生物酶制剂，所述的生物酶制剂α-淀粉酶或纤维素酶，加入活化后的混合物中，在30-40℃恒温振荡器中反应1-3小时，用去离子水洗涤，制备出固载化生物酶的纳米磁性材料；所述表面修饰的铁磁性纳米粒子、缓冲溶液、交联剂、生物酶制剂的质量比1：400：10：10，所述的交联剂为戊二醛或乙二醛。

2.根据权利要求1所述的一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法，其特征是，所述的纳米零价铁磁性粒子选下述方法制备：将十六烷基四丁基溴化铵、正丁醇和异辛醇加入反应瓶中搅拌成均匀混合物，将三氯化铁溶液加入混合物中，强力搅拌至橙黄透明，并且通入N₂保护，再缓慢加入硼氢化钠粉末，继续搅拌并通N₂保护，待体系颜色变黑且不再放出气体后，再继续搅拌0.5-1小时，静置待体系中黑色粉末全部沉至瓶底，吸出上层液体，加入甲醇和三氯甲烷的混合洗液洗涤，再用无水乙醇洗涤，得到纳米零价铁磁性粒子。

3.权利要求1所述的方法制备的固载化生物酶，其特征是，重复使用5次后酶的活性仍保持50-65%。