CN100429233C - 一种重组融合蛋白及其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可诱导共刺激分子的重组融合蛋白，是功能分子与可诱导共刺激分子融合形成的重组蛋白。本发明可采用基因工程方法、化学方法等常规方法按融合、表达、纯化等基本步骤，即可制备该重组融合蛋白。本发明能特异性地抑制记忆和活化T细胞的功能，对抑制哺乳动物的ICOS分子活性具有较明显且特异的抑制作用，使可诱导共刺激分子更加稳定，半衰期延长，并能够大规模制备，是用于制备高度生物安全性的特异性的免疫抑制产品及治疗、诊断、检测和研究自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品的安全原料，市场应用开发前景广阔。

Description

一种重组融合蛋白及其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及医药、生物、食品、饮料技术领域，具体地说是涉及生物技术产品及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种重组融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

(一)自身免疫性疾病的研究进展

1、概况

人体免疫***有分辨“自己”和“非己”的功能，它对自己的组织和细胞不会产生免疫反应。但是，人体免疫***出现异常时，也可能对自己的组织和细胞产生免疫反应，从而破坏或损伤自己的组织或细胞，即自身免疫病，其重要标志之一是形成抗自身组织成分的自身抗体，该自身抗体的检查和控制是自身免疫病的重要诊断手段和临床治疗的基础。

自身免疫性疾病是严重危害人类健康的一类重要疾病。自身免疫性疾病的典型疾病是***性自身免疫性疾病，包括***性红斑狼疮(简称SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，简称RA)、硬皮病(简称PSS)、皮肌炎、多动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、多发性肌炎、***(多发)性硬化、CREST综合征、强直性脊柱炎、骨关节炎、成人斯蒂尔病、白塞病、特赖综合征、银屑病、复发性多软骨炎、***性血管炎等。此外，自身免疫性疾病还包括器官特异性自身免疫性疾病，如内分泌***自身免疫病、血液***自身免疫病、心血管***自身免疫病、呼吸***自身免疫病、消化***自身免疫病、泌尿***自身免疫病、神经***自身免疫病、自身免疫性眼病、自身免疫性皮肤病等。

***性自身免疫性疾病中的***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎、多动脉炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、银屑病、复发性多软骨炎等疾病曾被命名为“***病”，后来国际和国内均将它们与风湿性疾病统一归为风湿病。

2、发病机理

自身免疫性疾病是严重危害人类健康的一类重要疾病，它是人体免疫***错误地把自身细胞当成外来入侵物质进行攻击而产生的疾病。

自身免疫病产生的原因非常复杂，主要是人体免疫识别功能和自身稳定功能发生紊乱；或是自身的组织和细胞因感染而发生结构或组分的改变，使免疫***误认为“非己”而加以攻击；或是原来隐蔽的或被包围的组织或细胞(如眼球内容物，男性睾丸中的***等)显现，被免疫***认为是“非己”；也可能是上述情况同时存在。

也就是说，自身免疫性疾病的发病机制在于自我耐受的破坏以致于自身抗体或/和致敏淋巴细胞损伤含有相应自身抗原的器官组织而引起临床症状；病理过程中，自身反应性T细胞的活化是免疫病理损伤的关键。

而探讨其中的重要一大类疾病——风湿病的复杂的发病机制、寻找早期诊断方法、确定疗效肯定而副作用小的治疗方法一直是整个风湿病学界的奋斗目标。

总之，发生自身免疫的更深层次原因及其对策研究仍是医学研究的难点和热点。

3、流行病学情况及临床表现

自身免疫性疾病患者遍及世界各地，患病率以10万分之几计算；以其中***性红斑狼疮病为例，在中国患病率为70.41/10万，女性患病率为113.33/10万(黄铭新等.***性红斑狼疮流行病学调查.中华内科杂志，1985，14：451.)。

该类疾病临床表现多为慢性病，任何年龄、性别、种族均可发病，一般发病年龄多在青壮年，女性见多。例如，RA是一种最常见的以慢性多关节炎症为主要表现的***性自身免疫性疾病，病程长，易反复，给患者造成很大痛苦；该病在中国的发病率约为0.36％。患者发病年龄多在20～50岁，女性多于男性，男女之比为1∶3；其突出的早期临床表现为对称性多关节红肿热痛，常见四肢小关节，指间近端关节肿胀，掌指(跖趾)、腕、肘、踝甚至颞颌等关节肿痛及活动困难，晨间关节僵硬，午后逐渐减轻，关节外症状约有20％患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状，则有不同程度的关节畸形和强直，关节功能丧失等，可损伤脏器、多组织器官，造成股骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。

4、诊断与治疗的现状和前景

目前，对自身免疫性疾病尚无根治方法，治疗均是应用非特异性免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、中药等，其疗效不肯定且常同时影响机体正常的免疫应答，长期应用后可抑制骨髓，造成贫血，白细胞下降，降低机体抗感染能力，诱发条件致病性微生物和寄生虫感染，并且由于免疫监视能力的抑制，易患肿瘤。

自身免疫性疾病防治的最佳选择就是诱导机体对自身抗原重新产生特异性免疫耐受，因此，人们一直探索具抗原特异性的免疫抑制剂。

而风湿病学是一门年轻的、多学科交叉的边缘学科，近年来发展非常迅速。风湿病患者的体内都存在自身抗体，其中的“标志性抗体”可用于检测、诊断和治疗，对于风湿性疾病的诊断、治疗及预后判断意义重大；其检查、治疗方法几经改进，价值越来越大，因此生物制剂在风湿病中的应用有着良好的发展前景。

以类风湿性关节炎(RA)的诊断为例。

由于RA的病因至今不十分清楚，而且早期临床表现不典型，加之缺乏特异性的诊断方法，给疾病早期诊断及治疗带来一定困难。现已证明RA患者关节病变在发病后第一年发展最快，发病第二年即可出现不可逆的骨关节破坏，早期使用改变病情的药物可控制疾病的迸展。因此，RA的治疗关键在于早期治疗，而早期治疗的前提是早期诊断，所以早期诊断就成为大家所关注的热点问题。

关于早期RA的定义一直是风湿病学界争论的问题，2003年EULAR会议提出了非常早期RA和早期RA的定义，将病程少于12周的RA定义为非常早期RA，病程在12周和2年之间的RA定义为早期RA，并强调无论非常早期还是早期RA均需一经诊断即给予缓解病情的抗风湿药(简称：DMARD)治疗。

美国关节炎基金会***和CEO Klippel认为，抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，简称：CCP)抗体对RA的意义，与***特异性抗原(简称：PSA)对筛查***癌的意义相当，该基金会2003年首次对关节炎研究领域的年度重大进展进行总结，RA新标志物抗CCP抗体就被评为关节炎研究十大进展之一。欧洲等风湿病学界也肯定了抗CCP抗体在RA早期诊断中的价值，研究结果显示预测RA的独立参数是抗CCP抗体、关节肿胀数、握力和AKA阳性，最好的预测指标为抗CCP抗体，有助于在临床症状出现前数年准确检出RA，并已将此抗体列入常规检测。

近年来，国际上许多风湿病学家致力于RA早期诊断的研究，包括建立早期关节炎门诊、重视早期临床表现，提出早期RA的大体诊断标准、建立RA早期诊断的自身抗体检测方法，及将CT、MRI和B超等敏感的影像学检查手段应用于RA的早期诊断等，这是指导早期开始有效治疗RA、改善预后的重要环节。

(二)器官移植的研究进展

器官移植是指通过外科手段，将他人的具有活力的器官移植给病人以代替其病损的器官的手术。器官移植是现代临床医学科学发展最快的学科之一，其产生、应用和发展带动和促进了免疫学、药理学、遗传学和分子生物学等一系列基础学科的研究发展。而这些基础学科的研究进展反过来又促进了器官移植的更深入全面和有效地应用于临床治疗患各种器官终末性疾病病人。可以说，现今除了头颅和脊髓不能移植外，全身各器官组织均可移植置换，甚至多个器官可同时联合移植，使许多以往认为的“不治之症”得以根治。据统计到1989年全球肾移植已超过16万人次，心、肝移植均超过4000人次，骨髓移植每年以2500～3000例次的速度前进，胰移植已达1500例次。可以预见，不久的将来器官移植术会逐渐成为越来越多的致命性疾病的常规治疗手段。

但是，移植手术技术方法的提高和完善并未能保证术后移植器官的长期有功能存活，除非是孪生子间的移植。原因在于人不同个体间存在着血型和组织配型的差异，这种差异导致受体对移植入体内的供器官不接受，即免疫排斥反应。

移植物长期存活的关键在于选择与受者组织相容性抗原及其他相关抗原有高度一致性的供者，但是在临床实际应用中却极难达到，因为主要组织相容性抗原及其他相关抗原***的复杂性及多样性，而且目前用于移植的器官、组织和细胞主要来源于同种尸体或活亲属供者，所以移植术后必然会发生免疫排斥反应。因此排斥反应成为器官移植获得成功的主要障碍。为了预防和治疗排斥反应，使移植物长期存活，必须采用免疫抑制的措施。

(三)免疫抑制剂的研究进展

1、分类

目前，临床使用的免疫抑制措施包括使用免疫抑制剂和使用其他免疫抑制措施。其中，以免疫抑制剂的应用最为广泛，免疫抑制剂包括化学药物免疫抑制剂、生物免疫抑制剂即抗淋巴细胞抗体。

免疫抑制剂的应用为上述器官移植获得长期良好疗效创造了条件，如肾移植一年存活率达95％以上，心、肝移植存活率分达90％和80％以上。因而，免疫抑制剂被公认为是现代临床器官移植成功的一项有力保证(夏穗生.临床移植医学.浙江科学技术出版社.1999，8～9.)。

2、发展历史

免疫抑制剂治疗的发展经历了四个阶段：

第一阶段(1908年～1967年)：长达70年，采用放射线或化学药物不加选择地破坏所有分化的细胞，这种免疫抑制剂导致严重感染死亡的发生率高，故未广泛应用于临床。

第二个阶段(1967年～1976年)：主要着重于对T细胞的抑制研究，采用对T细胞免疫抑制作用的多克隆血清制剂，虽然这种免疫抑制剂能使多种T细胞活性减低，改进移植物存活效果，但却增加了受者抵抗力的副作用。

第三个阶段(1976年～至今)：是研究药物抑制参与免疫反应的细胞，采用化学免疫抑制剂，其代表是环孢素A。环孢素A的出现为近20年来器官移植的发展起到了巨大的推动作用。迄今，环孢素A仍是主要的免疫抑制剂。

环孢素A为代表的第三代免疫抑制剂导致的感染发病率减少、肿瘤发生率不高于其他免疫抑制剂，其缺点是药物引起的器官毒性和并发症，例如，肝毒性、肾毒性、消化道并发症、内分泌并发症、神经***并发症。

***免疫抑制剂，也就是正在准备研究的更理想的免疫抑制剂的时期。

3、临床应用效果及研发前景

免疫抑制剂在临床器官移植中使用经历了近50年的历史，每一个新的进展都推动了临床器官移植的发展；然而，并没有达到满意的效果。虽然移植物一年存活率如肾移植已达95％，但急性排斥反应的发生率仍高达50％，慢性排斥反应的发生率达10％，且现有免疫抑制剂无法防治；一旦发生，只能再次移植，但再次移植的成功率仅50％(陈实.移植免疫学.湖北科学技术出版社.1998)。

迄今，应用于临床的每一种防治排斥反应的免疫抑制剂都是非特异的，它们会降低受者全身免疫功能，从而减低了受体对感染和肿瘤的抵抗能力且还有药物的毒副作用；如果不能耐受，常被迫停药，影响移植物长期存活。排斥反应防治的最佳选择就是诱导宿主对供体抗原重新产生特异性免疫耐受，因此，具有抗原特异性免疫抑制剂是最理想的选择。

尽管免疫抑制剂的研究有了很大进展，但是，理想的免疫抑制剂应该是只抑制由供体抗原引起的特异免疫反应的T淋巴细胞克隆和B淋巴细胞克隆，然而目前的所有免疫抑制剂均未达到这个要求。

今后长期的目标是长期使用免疫抑制剂，要达到既能治疗疾病，又不造成患者的免疫缺陷和引起其它的并发症。所以，寻找新型、有特异性抑制功能且毒副作用小的免疫抑制剂是十分必要的。从经济学角度来说，由于免疫抑制剂的应用范围广阔，且价格昂贵；仅在器官移植方面的应用每年的产值就以数十亿美元计，因而研制新型免疫抑制剂的经济效益也是十分可观的。

(四)共刺激分子免疫抑制剂的研究进展

共刺激分子是一类参与免疫反应的辅助性分子，存在于T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗原提呈细胞(简称：APC)和靶细胞的表面。共刺激分子与其受体结合所产生的共刺激信号在T细胞活化、辅助T细胞分化、信号转导及效应性细胞因子分泌中起着非常重要的作用。如果没有共刺激分子的参与，识别了抗原的T淋巴细胞通常无法活化或是活化后很快凋亡而表现出克隆无能或免疫耐受。

初始T细胞的活化需要B7-CD28、CTLA-4和CD40-CD154的共刺激信号，但是效应T细胞功能的发挥在很大程度上是不依赖于这些共刺激途径。

最近发现，在记忆T细胞的活化过程中，存在着一种新的共刺激分子——可诱导共刺激分子(Inducible costimulator，简称：ICOS)。ICOS基因位于人染色体2q33上，与CD28和CTLA-4的基因紧密相连，排列在一个长度为252000个碱基(简称：bp)的区域内，以CD28的起始密码子开始，ICOS的终止密码子结束，彼此分离；ICOS基因含5个外显子、4个内含子(Hutloff A，Dittrich A M，Beier K C et al.ICOS is an inducible T-cell co-stimulatorstructurally and functionally related to CD28.Nature，1999，397：263-266.)。

ICOS是B7/CD28超家族成员，优势表达在激活的T细胞上，可以促进激活T细胞的增殖和分化、增强细胞因子分泌和杀伤活性、调节抗T辅助淋巴细胞亚群(简称：TH1/Th2)的极化，促进T细胞依赖的抗体产生(Hutloff，A.(1999)Nature 397：263-266)。CD28-CTLA 4-ICOS基因区与许多疾病的自身免疫型相连并且相关，如I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病、多发性硬化症、腹腔疾病等，这使它们对于自身免疫病的研究十分重要。

目前的研究已证实：T效应细胞的激活和功能发挥必需ICOS的共刺激(参见例如Tafurl，A.(2001)Nature，409(6816)：105-109.)，ICOS可以促进激活T细胞的增殖和分泌，调节Th1/Th2细胞的极化、增强依赖T细胞的B细胞功能等。ICOS为已激活记忆T细胞提供共刺激信号，阻断ICOS共刺激途径可以增加记忆、活化T细胞的凋亡。体内外实验均报道，阻断ICOS共刺激信号，导致IL-4、IL-10、IFN-γ、CC和CXC趋化因子等细胞因子表达减少、免疫球蛋白类型转换受损；ICOS能够减轻实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(简称：EAE)的临床症状；ICOS能够延长同种异体移植心脏、肝脏的存活期；ICOS能够减轻利什曼原虫感染的炎性(参见例如Rottman，JB.(2001)Nature Immunology(2)；605-611.；Guo，L.(2002)Transplantation，73；1027-1032.；Greenwald，RJ.(2002)J Immunol 168(3)：991-995.)。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现以ICOS共刺激途径为靶点的重组融合蛋白作为免疫抑制物及其制备方法和用途方面的有关报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种重组融合蛋白及其制备方法和用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明意在研究一种重组融合蛋白及其制备方法和用途，进而将其作为新的免疫抑制物、诊断试剂、检测试剂等，用于制备相应的产品如药物、试剂等。即发明目的之一是提供该重组融合蛋白，即用ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段，与功能分子进行融合形成的重组蛋白；目的之二是提供该重组融合蛋白的制备方法；目的之三是提供该重组融合蛋白的用途，以提供科学研究、疾病治疗、疾病诊断、疾病检测等方面的使用和应用。

(一)技术构思

本发明的技术构思是这样的：

1、概述

中国药物研发具有悠久的历史，在预防、诊断、治疗等各方面都积累了丰富的经验，自主开发创新药物是中国医药界目前的一项紧迫任务，而抓紧寻找有效的活性成分或者产品是一条有效的途径。因此，本发明通过对共刺激分子免疫抑制剂以及相关内容的***研究，并筛选和证明该相关产品的活性和用途。

从共刺激分子免疫抑制剂的理论研究和科学实验结果上均反映出，阻断ICOS共刺激途径可望成为治疗、诊断、检测和研究自身免疫性疾病和移植排异的一种有效的途径。存在于活化或记忆T细胞表面的ICOS，与其配体表达细胞表面的配体分子结合形成复合物后，才能发挥其生物学功能。如果，阻断ICOS与其配体的结合，则可以抑制活化了的T细胞的功能，而不影响其他淋巴细胞的功能，不会导致机体免疫功能缺陷，因而是特异性免疫抑制剂的理想选择。因此，以ICOS活性抑制为靶点的免疫抑制剂，有可能成为自身免疫性疾病和移植排异免疫调控等疾病治疗、诊断、检测和研究的理想免疫抑制药物。

所述的阻断ICOS与其配体的结合的方法，本发明人认为有四种途径；通过这四种基本途径，研究人员能够得到具有特异性针对ICOS的免疫抑制剂，也就是说发明人研究开发的具有特异性针对ICOS的免疫抑制剂可以有四种基本类型。所述的四种基本途径如下：一是摧毁或破坏ICOS，二是遮蔽ICOS上与配体结合的位点或区域或者是功能活性位点或区域，三是摧毁或破坏ICOS的配体，四是遮蔽ICOS的配体上对应的结合位点或区域或者是功能活性位点或区域；这四种基本途径均能够成功阻碍ICOS与其配体结合，不能够形成预期的复合物。这种研究开发的思路对生物技术领域内其他类似的抗体或抑制剂研究开发也具有普遍的指导作用，当然对生命科学研究领域特别是医药领域中其他涉及到如抗体等类似的研究开发，也是具有重要指导意义的，如抗体化学药物的研究。

2、研究开发的手段

目前，如果要得到能特异性针对ICOS的免疫抑制剂的最常见方法是，寻找或制备具有ICOS特异性抑制作用的治疗性抗体。

至今为止，用于治疗作用的抗体共三大类：最早的第一类治疗用抗体，是由用相应抗原免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体，这类抗体与相应抗原有很高的亲和力能够结合相应抗原达到治疗目的，但它们给与人类体内使用，会导致人体内产生抗小鼠抗体并且引起一系列相关问题，例如血清半衰期短、不能产生人体效应物的功能和引起有害的人体内抗该小鼠抗体的免疫应答。第二类治疗性抗体，是利用基因工程方法对鼠抗体进行人源化改造，以克服在人体内使用圈鼠抗体引起的各种问题，但由于这些人源化抗体仍然保留了一些鼠序列，因此它们仍然会引起一些不想要的免疫反应，例如人抗人源化抗体反应。第三类治疗性抗体是完全人类抗体，这类抗体是利用人类外周血中自然存在的产生抗原特异性自身抗体的淋巴细胞通过人杂交瘤技术生产而成，但目前认为这些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对相应抗原的亲和性太低无法达到治疗作用。

除寻找或制备具有ICOS特异性抑制作用的治疗性抗体以外，还可以采用基因工程的手段或技术来制备具有ICOS特异性抑制作用的重组融合蛋白。

重组融合蛋白(又称：重组蛋白)是指用某功能分子对某种蛋白质(又称：目的蛋白)进行修饰，然后得到的一种新的具有上述两部分结构域的蛋白质；例如，在基因水平上进行的修饰方法之一是，通过将目的蛋白的基因同修饰蛋白的基因相连得到的重组融合蛋白。得到的这类重组融合蛋白，能够有效用于疾病的治疗、诊断、检测和科学研究等方面。因此，通过蛋白质修饰以增强或改善目的蛋白作为实用的产品包括药物、试剂等的特性，是研究开发新产品的一种捷径。描述蛋白质修饰的综述文章包括Francis，Focus on GrowthFactors，3：4-10，1992年5月，由Mediscript，London，UK出版。

蛋白质修饰的方法之一是，通过目的蛋白同免疫球蛋白的某部分或某几个部分的结构域相融合，例如，应用功能分子如免疫球蛋白(又称：抗体，简称：Ig)的恒定片段(又称：Fc区，简称：Fc)，可使重组融合蛋白获得新的特性。抗体包含两个功能独立的部分，即称为“Fab”的可变结构域和称为“Fc”的恒定结构域。可变结构域结合抗原，而恒定结构域连接效应子功能物，所述的效应子功能物包括补体、Fc受体、吞噬细胞等。免疫球蛋白的Fc片段具有长的血浆半衰期，而Fab却存在时间短(Capon等，Nature，1989，337：525-531)。其中，人IgG1 Fc的核苷酸序列见序列表1，其氨基酸序列见序列表2。

这种蛋白质修饰，其优点很多：①保留有抗原或配体/受体的结合能力。②通过以抗免疫球蛋白恒定片段的抗体进行亲和层析，葡萄球菌A蛋白或葡萄球菌G蛋白可方便地纯化Ig的Fc片段，使制备成本和使用成本明显减低。③利用抗Fc段抗体，可使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。④Fc段可穿过胎盘、结合补体介导补体依赖的细胞毒作用，介导抗体依赖的细胞毒作用(简称：ADCC)效应等，可用于某些疾病的靶向治疗。⑤IgG、IgM、IgA的Fc可形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。⑥通过还原或消除蛋白酶解，以增强该蛋白质的保护并减少其降解，使其具有更长的半衰期；此外，在某些情况下，还能够进一步增加该蛋白质的稳定性、循环时间和生物活性等，更适合于体内的应用。⑦直接用哺乳动物工程细胞生产，不仅更接近天然分子的状况适合机体吸收，而且避免了艾滋病(简称：AIDS)、肝炎病毒及其它病源微生物的污染。

采用Fc区已经制备出治疗性的蛋白质产品，以使半衰期延长或掺入以下功能：例如，免疫球蛋白的Fc蛋白具有的Fc受体结合、A蛋白结合、补体结合和胎盘转移功能；再例如，已经将IgG1抗体的Fc区融合到CD30配体(简称：CD30-L)的N-末端，所述的CD30-L是结合在以下细胞上表达的CD30受体的分子：何杰金氏病肿瘤细胞、退行性发育淋巴瘤(anaplastic lymphoma)细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性肿瘤细胞类型(见：美国专利第5,480,981号)；例如，已经将一种消炎药和抗排斥剂IL-10融合到鼠Fcγ2a中以增加循环半衰期短的细胞因子的半衰期(Zheng等，The Journal of Immunology，1995，154：5590-5600)。也已经评价了应用和人IgG1的Fc蛋白连接的肿瘤坏死因子受体治疗败血症性休克患者的研究(Fisher等，N.Engl.J.Med.，1996，334：1697-1702；Van Zee等，The Journalof Immunology，1996，156：2221-2230)。也已经将Fc和CD4受体融合以生产治疗性蛋白用于治疗AIDS(Capon等，Nature，1989，337：525-531)。另外，也已经将白介素-2(简称：IL-2)的N末端融合到IgG1或IgG3的Fc片段，以克服IL-2短的半衰期及其***毒性(Harvill等，Immunotechnology，1995，1：95-105)。

本发明就是通过制备一种能够遮蔽ICOS的配体上对应的结合位点或区域或者是功能活性位点或区域的重组融合蛋白，以达到预期的免疫抑制效果。本发明研发的产品以及实验结果也进一步证实了发明人在产品研究开发思路的正确性。

3、设计过程

发明人在该重组融合蛋白产品研发的具体设计上，以人源的ICOS为例，思考的内容如下：

来源于人的ICOS(即人源的ICOS，简称：hICOS)如来源于人活化的外周血淋巴细胞的hICOS，其mRNA序列编码为NM-012092，全长2610bp，编码区为26～625，可翻译产生长度为199aa的多肽链。ICOS是由二硫键连接的同源二聚体蛋白，相对分子量为55,000～60,000。ICOS的27千道尔顿(简称：kDa)和29kDa两条肽链的序列一致，仅在转录后修饰过程的糖基化中产生了一些差别。ICOS与CD28分子有24％的序列完全相同，有39％的序列相似；ICOS与CTLA-4分子有17％的序列完全相同，有39％的序列相似。

ICOS的氨基酸序列分析显示，人源的ICOS(氨基酸序列号：S78540)多肽链全长199个氨基酸，其中1～21为其信号序列，22～199为ICOS的多肽序列，其中22～138为胞外区，26～132免疫球蛋白样区域，139～164为其穿膜区，165～199为其胞内区。这种结构说明，成熟的ICOS是I型转膜分子，即在胞质部分有ICOS的肽链；ICOS在表达细胞表面有一条免疫球蛋白样的单链，该结构由42和109位上的保守半胱氨酸而得以稳定；穿膜区由26个氨基酸组成；胞质区是一条35个氨基酸残基的肽尾；这种结构与CD28和CTLA-4很相似。定位于ICOS第136位的半胱氨酸残基是参与同源二聚体间二硫键形成的位置(同样的结构在CD28是141位；在CTLA-4上也有)。ICOS上没有CD28和CTLA-4的配体结合基序MYPPY；ICOS的配体结合基序是FDPPPF。

我们知道，理想的免疫抑制剂应只抑制特定的抗原引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的克隆，如移植抗原引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的克隆。ICOS在幼稚T细胞上不表达，而仅在记忆或活化的T细胞上特异性表达，因而阻断ICOS共刺激途径，可以达到特异性抑制记忆T细胞和活化T细胞功能的作用，而不会影响到其他淋巴细胞的功能，这是免疫抑制剂作用的理想靶点，可以起到特异性免疫抑制的作用。

天然的ICOS是一个全长为199个氨基酸的膜蛋白分子，T淋巴细胞活化后将ICOS表达在细胞膜上。利用基因工程技术对ICOS进行计算机模建技术和缺失突变研究发现，ICOS的N端21～140个氨基酸片段(其核苷酸序列见序列表3，其氨基酸序列见序列表4)，具有其配体结合功能域，具有完全的天然ICOS配体结合生物活性；如果应用基因工程技术合成该片段，则可以竞争结合ICOS的天然配体，达到抑制ICOS生物学活性的作用。应用基因工程技术，在哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞中均可以表达制备ICOS的N端21～140个氨基酸片段，但存在表达量不高、后续纯化困难、体内外容易降解、半衰期短的困难。而如果利用重组融合蛋白作为这种特异性免疫抑制剂，则不仅使其具有免疫抑制的功能，还可以使其具有其他功能分子如免疫球蛋白恒定片段的特征，可以增加药物在体内的半衰期、避免了药物在生产过程中由病原微生物引起的污染，而且还可以简化制备的过程达到降低成本的效果等优点。

所以，以此为依据，发明人设计了一种针对ICOS共刺激途径阻断的新型的免疫抑制物——ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段，与功能分子融合的重组蛋白，在本文中统一简称为：重组融合蛋白，又称：ICOS重组融合蛋白。在此基础上，研究开发ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段，与免疫球蛋白的恒定片段、或其变体或片段融合的重组蛋白(Inducible costimulatorimmunoglobulin fusion protein)；当该重组融合蛋白具有R₂-R₁类型时，在本文中统一简称为：ICOS-Ig。并进一步研究开发人ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段，与人免疫球蛋白G1的恒定片段、或其变体或片段融合的重组蛋白，在本文中统一简称为：ICOS-IgG1，其中优选ICOS多肽与人免疫球蛋白G1的恒定片段融合的重组蛋白，在本文中统一简称为：hICOS-IgG1；以及小鼠ICOS的全部氨基酸分子或者是小鼠ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段，与小鼠免疫球蛋白G2a的恒定片段、或其变体或片段融合的重组蛋白，在本文中统一简称为：mICOS-IgG2a。也就是说，本发明从多方面、多角度证明与核实了本构思的正确性。

为便于叙述，将其中所述的人ICOS的N端第21～140位片段的氨基酸(其核苷酸序列见序列表3，其氨基酸序列见序列表4)，在本文中统一简称为：ICOS多肽，亦称：ICOS配体结合区。也就是说，对于人ICOS而言，其中ICOS多肽是人ICOS的配体结合区，可以竞争结合ICOS的天然配体，抑制ICOS的活性。

(二)重组融合蛋白

本发明提供的重组融合蛋白如ICOS-Ig、hICOS-IgG1等，是一种用基因工程方法(包括基因工程的手段或技术)、化学方法等方法制备的一种新型免疫抑制物。

本发明所述的重组融合蛋白是对ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段进行修饰所得到的重组蛋白，即功能分子(用代码R₁表示)与ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段(用代码R₂表示)进行融合形成的重组蛋白，也就是本文所谓的ICOS重组融合蛋白。

所述的ICOS重组融合蛋白，其结构如下：

该重组融合蛋白是具有选自以下组成形式中的一种或多种重组蛋白：R₁-R₂、R₂-R₁、R₁-L-R₂和R₂-L-R₁；优选R₂-L-R₁、R₂-R₁，进一步优选R₂-R₁。其中所述的L为连接片段。

所述的R₁为任一功能分子，是包括多肽、蛋白等中的一种或多种；优选Fc蛋白、或其变体或片段，抗生蛋白链菌素，多组氨酸或绿色荧光蛋白(简称：GFP)等中的一种或多种；继续优选Fc蛋白、或其变体或片段等中的一种或多种；再继续优选IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD等中的Fc蛋白、或其变体或片段等的一种或多种；进一步优选IgG1、IgG2、IgG4、IgA或IgM等中的Fc蛋白、或其变体或片段等的一种或多种，继续进一步优选IgG1、IgG2或IgM等中的Fc蛋白、或其变体或片段等的一种或多种，再进一步优选的是IgG1或IgG2等中的Fc蛋白、或其变体或片段等的一种或多种，最优选的是IgG1中的Fc蛋白、或其变体或片段等的一种或多种。

其中，所述的Fc蛋白、或其变体或片段，选自以下的一种或多种：

(1)Fc氨基酸序列，优选序列表1所示的Fc氨基酸序列，即人IgG1的Fc氨基酸序列，或人IgM的Fc氨基酸序列，或小鼠IgG2的Fc氨基酸序列等中的一种，进一步优选人IgG1的Fc氨基酸序列；

(2)Fc氨基酸序列，优选序列表1所示的Fc氨基酸序列，即人IgG1的Fc氨基酸序列，或人IgM的Fc氨基酸序列，或小鼠IgG2的Fc氨基酸序列等中的一种，进一步优选人IgG1的Fc氨基酸序列；在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸：

①一个或多个半胱氨酸残基；

②一个或多个酪氨酸残基；

③缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；

④缺失或用谷氨酸取代位置20的亮氨酸；

⑤缺失或用丙氨酸取代位103的谷氨酸；

⑥缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；

⑦缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；

⑧缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；

⑨取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；

⑩取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(C1q)结合位点的；和

(11)上文亚部分①～⑩的组合；

(3)上文亚部分(1)或(2)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；

(4)上文亚部分(1)或(3)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；

(5)上文亚部分(4)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；

(6)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和

(7)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。

所述的R₂有多种来源，主要是来源于哺乳动物；

其中，所述的哺乳动物，是包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、黑猩猩、羊、猴、牛或猪等中的一种或多种，进一步优选人、小鼠、大鼠或黑猩猩等中的一种或多种，最优选人。

所述的R₂是包括ICOS的全部氨基酸分子，或者是ICOS的部分氨基酸片段等中的一种或多种；

其中，所述的ICOS的部分氨基酸片段，是包括所有哺乳动物的ICOS的部分氨基酸片段中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、黑猩猩、羊、猴、牛或猪等的ICOS的部分氨基酸片段中的一种或多种，进一步优选人、小鼠、大鼠或黑猩猩等中的ICOS的部分氨基酸片段的一种或多种，再进一步优选ICOS多肽、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种，最优选ICOS多肽。

所述的ICOS多肽、或其变体、片段或衍生物，优选自以下：

(a)ICOS多肽的氨基酸序列(见：序列表3)所示的第42位氨基酸置换所得的任何残基；

(b)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第83位氨基酸置换所得的任何残基；

(c)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第63位氨基酸置换所得的任何残基；

(d)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第109位氨基酸置换所得的任何残基；

(e)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第52位氨基酸置换所得的任何残基；

(f)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第115～121位氨基酸置换所得的任何残基；

(g)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第136位氨基酸置换所得的任何残基；

(h)ICOS多肽的氨基酸序列所示的第137位氨基酸置换所得的任何残基；

(i)上文亚部分(a)至(h)中任何一个所述的ICOS蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；

(j)上文亚部分(i)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；

(k)上文亚部分(j)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；

(l)上文亚部分(j)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚氨基酸部分；和

(m)上文亚部分(j)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。

所述的连接片段是包括甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸等中的一个或多个氨基酸。优选如下中的一种或多种：

(a)ala-ala-ala；

(b)ala-ala-ala-ala；

(c)ala-ala-ala-ala-ala；

(d)gly-gly；

(e)gly-gly-gly；

(f)gly-gly-gly-gly-gly；

(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；

(h)gly-pro-gly；

(i)gly-gly-pro-gly-gly；

(j)val；

(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；

(l)gly-gly-ser-gly-ser-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；

(m)化学部分；和

(n)上文亚部分(a)～(m)的任何组合。

当R₁为Fc蛋白、或其变体或片段，R₂为ICOS的全部氨基酸分子或者是ICOS的部分氨基酸片段、或其变体或片段时，R₂-R₁类型的重组融合蛋白，简称：ICOS-Ig。

当R₁为人源的IgG1的Fc蛋白、或其变体或片段，R₂为ICOS多肽、或其变体或片段时，R₂-R₁类型的重组融合蛋白，简称：hICOS-IgG1，其核苷酸序列见序列表5，其氨基酸序列见序列表6；也就是说，其结构具体是：N端为可诱导共刺激分子全长199个氨基酸中的第21～140位片段的氨基酸，其C端是人免疫球蛋白G1恒定片段的氨基酸。

当R₁为小鼠源的IgG2a的Fc蛋白、或其变体或片段，R₂为小鼠源的ICOS、或其变体或片段时，R₂-R₁类型的重组融合蛋白，简称：mICOS-IgG2a。

在序列表1、序列表2、序列表3、序列表4、序列表5、序列表6中：

A代表Ala，英文全名：Alanine，中文全名：丙氨酸；

M代表Met，英文全名：Methionine，中文全名：甲硫氨酸(或称：蛋氨酸)；

B代表Asx，英文全名：Asparagine，中文全名：天冬酰胺；或英文全名：Aspartic acid，中文全名：天冬氨酸；

N代表Asn，英文全名：Asparagine，中文全名：天冬酰胺；

C代表Cys，英文全名：Cysteine，中文全名：半胱氨酸；

P代表Pro，英文全名：Proline，中文全名：脯氨酸；

D代表Asp，英文全名：Aspartic，中文全名：天冬氨酸：

Q代表Gin，英文全名：Glutamine，中文全名：谷氨酰胺；

E代表Glu，英文全名：Glutamic acid，中文全名：谷氨酸；

F代表Phe，英文全名：Phenylalanine，中文全名：苯丙氨酸；

R代表Arg，英文全名：Arginine，中文全名：精氨酸；

S代表Ser，英文全名：Serine，中文全名：丝氨酸；

G代表Gly，英文全名：Glycine，中文全名：苷氨酸；

T代表Thr，英文全名：Threonine，中文全名：苏氨酸；

H代表His，英文全名：Histidine，中文全名：组氨酸；

V代表Val，英文全名：Valine，中文全名：缬氨酸；

I代表Ile，英文全名：Isoleucine，中文全名：异亮氨酸；

W代表Trp，英文全名：Tryptophan，中文全名：色氨酸：

K代表Lys，英文全名：Lysine，中文全名：赖氨酸；

Y代表Tyr，英文全名：Tyrosine，中文全名：脯氨酸；

L代表Leu，英文全名：Leucme，中文全名：亮氨酸；

Z代表Glz，英文全名：Glutamine，中文全名：谷氨酰胺；或英文全名：Glutamic acid，中文全名：谷氨酸。

所述的融合方法是指通过本领域公知的现有技术，将ICOS与功能分子进行结合的方法，包括基因工程的手段或技术、化学方法等中的一种或多种，优选基因工程的手段或技术直接或通过连接物间接进行连接，进一步优选基因工程的手段或技术直接连接。

例如，以各种不同的方法可将ICOS多肽与功能分子诸如Fc结构域融合，以使产生的ICOS融合蛋白具有作为治疗、诊断、检测和研究产品如药物、试剂等的可变生物特性和潜在的可变功效。再例如，可将Fc结构域与ICOS多肽的氨基端(简称：N端)或羧基端(简称：C端)融合，可直接融合或通过连接片段融合，和/或根据其天然形式可修饰的Fc或ICOS多肽部分之一或之二者。这些不同的ICOS融合蛋白构成物可以在表达水平、易于分离和/或纯化、生物活性等方面的各不相同。

本发明提供的重组融合蛋白，如ICOS-Ig包含的ICOS配体结合区，该区域在重组融合蛋白的特异性/亲和性方面起重要作用。在保持该重组融合蛋白的高抑制活性和配体高亲和性时，在其配体结合区的其它氨基酸置换也是可能的，特别是用保守氨基酸置换。本文使用的“保守氨基酸置换”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、中性侧链(例如甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

可以将本发明重组融合蛋白衍生为或连接至另一功能分子例如另一多肽或蛋白。因此，本发明重组融合蛋白包括本文描述的重组融合蛋白衍生的和其它修饰的形式。例如，本发明重组融合蛋白可以功能性地连接(包括通过化学偶连、遗传融合、非共价结合或其它)至一个或多个其它分子实体，例如另一抗体(包括双特意性抗体或双抗体等)、可检测剂、细胞毒药剂、药用药剂和/或可以介导该重组融合蛋白与另一分子结合的蛋白或肽(例如，抗生蛋白链菌素核心区或多组氨酸标记等)。

可以用于衍生本发明重组融合蛋白的可检测剂，包括荧光化合物等；典型的荧光可检测剂，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等等。亦可以用可检测酶衍生重组融合蛋白，所述酶为包括碱性磷酸酶(简称：AKP或者ALP)、辣根过氧化物酶(简称：HRP)、葡糖氧化酶(简称：GOD)等等：当用可检测酶衍生重组融合蛋白时，通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外的试剂检测该抗体。例如，当有可检测剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。亦可以用生物素衍生重组融合蛋白，并通过间接测定抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合检测。

一种类型的衍生重组融合蛋白是通过交联两个或多个抗体(同一类型或不同类型，例如创造双特异性抗体等)制备。适当的交联剂，包括那些杂双官能的、具有两个有适当隔离物分隔的独特反应基团，例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯等。

(三)重组融合蛋白的制备方法

重组融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

①融合：合成能转录并能翻译成重组融合蛋白的重组DNA片段；

②表达：将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；

③纯化：分离纯化，即可得到所述的重组融合蛋白。

所述的术语“表达载体”是指有能力运送与其连接的另一核酸的核酸分子，并能够指导上述另一核酸分子的基因表达。表达载体的一种类型是“质粒”，是指其中可以连接其它DNA片段的环状双链DNA环。表达载体的另一种类型是病毒载体，其中在病毒基因组中可以连接其它DNA片段。某些表达载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制，例如，具有细菌复制起点的细菌表达载体和附加体哺乳动物载体。其它表达载体如非附加体哺乳动物载体，可以在导入该宿主细胞时被整合入宿主细胞的基因组，由此可以与该宿主基因组一起复制。另外，某些表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这种表达载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体的常见形式为质粒。在本说明包括具有相同的功能的其它形式的表达载体，例如哺乳动物真核表达载体(例如pSEC Tag2/Hygro A、pcDNA4/His Max或pcDNA3等)、病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒)、细菌表达载体、酵母表达载体或昆虫表达载体等中的一种或多种。

所述的术语“宿主细胞”是指用于表达目的蛋白的细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(简称：CHO细胞)、二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞(简称：dhfr-CHO细胞)、非洲绿猴肾成纤维样细胞(简称：COS细胞)或人胚肾细胞(简称：293细胞)等中的一种或多种。应理解这种术语不仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为在后续世代中，由于突变或者环境影响等可能发生某些修饰，事实上这种后代可以与亲本细胞不同，但却仍然包含于本文所使用的术语“宿主细胞”的范围之内。优选CHO细胞或dhfr-CHO细胞及其后代细胞等中的一种或多种，进一步优选CHO细胞及其后代细胞。

以ICOS-Ig为例，其制备方法，包括如下步骤：

①融合：合成能转录并能翻译成ICOS-Ig的重组DNA片段；

②表达：将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；

③纯化：分离纯化，即可得到所述的ICOS-Ig。

以hICOS-IgG1为例，其制备方法，包括如下步骤：

①融合：合成能转录并能翻译成hICOS-IgG1的重组DNA片段：

②表达：将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；

③纯化：分离纯化，即可得到所述的hICOS-IgG1。

可以通过在宿主细胞中重组表达以制备本发明的ICOS-Ig或hICOS-IgG1。为制备ICOS-Ig或hICOS-IgG1，用携带编码该重组融合蛋白的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使所述重组融合蛋白在该宿主细胞中表达并最好分泌至培养所述宿主细胞的培养基中，可以从该培养基回收所述重组融合蛋白。使用了诸如萨姆布鲁克的《分子克隆：实验室手册》(第三版，冷泉港，纽约，2001年)所描述的标准重组DNA方法，以获得重组融合蛋白基因、将这些基因加入重组表达载体并将所述载体导入宿主细胞。

为表达ICOS-Ig或hICOS-IgG1，首先获得编码所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1的DNA片段。可以通过使用聚合酶链式反应(简称：PCR)扩增和修饰ICOS基因序列及免疫球蛋白恒定区(IgGFc)序列制备重组DNA。为获得编码ICOS-Ig或hICOS-IgG1的特异性配体结合区的DNA片段，通过计算机模建技术与缺失突变技术确定ICOS分子的特异性配体结合区域，并用标准PCR扩增ICOS基因的特异性配体结合区域。为获得编码ICOS-Ig或hICOS-IgG1的免疫球蛋白恒定区的DNA片段，通过标准PCR扩增免疫球蛋白恒定区域。

一旦得到所述ICOS基因的特异性配体结合区域和免疫球蛋白恒定区的DNA片段后，可以修饰这些序列以得到编码本文公开的所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1氨基酸序列。首先将由ICOS的DNA序列编码的氨基酸序列运用同源模建方法分别模拟ICOS分子的空间构象，并搭建ICOS分子与其配体相互作用的复合物模型，据此模型推测ICOS分子配体结合域，以得到编码ICOS分子配体结合域的氨基酸序列或其衍生物的氨基酸序列。通过标准方法例如PCR介导的诱变(其中将所述突变核甘酸加入所述PCR引物，使得所述PCR产物含有所述突变)或定点诱变。

一旦得到所述人免疫球蛋白恒定区的DNA片段后，可以通过标准重组DNA技术连接这些DNA片段，得到重组融合蛋白的DNA片段。首先将由ICOS基因的特异性配体结合区域可操作地连接至编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。免疫球蛋白恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区等中的一种或多种，优选是IgG1、IgG4、IgA或IgM恒定区等中的一种或多种，进一步优选是IgG1恒定区。本文使用的术语“可操作地连接”，是指连接这两个DNA片段，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在蛋白质翻译的框架中。

为表达ICOS-Ig或hICOS-IgG1，将上述得到的ICOS-Ig的基因片段DNA***表达载体，使得所述基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作地连接”是指ICOS-Ig或hICOS-IgG1等的基因片连接至载体中，使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节该ICOS-Ig或hICOS-IgG1等基因转录和翻译的即定功能。选择该表达载体和表达控制序列使之与所用的表达宿主细胞相容。通过标准方法(例如连接该ICOS-Ig或hICOS-IgG1的基因和载体上的互补限制位点、或如果没有限制位点就进行平端连接)将所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1的基因***该表达载体。另外，该ICOS-Ig或hICOS-IgG1的基因可以***使该重组融合蛋白从宿主细胞分泌的信号肽基因或将ICOS-Ig或hICOS-IgG1克隆入能编码上述信号肽的重组表达载体中，使得该信号肽在转录翻译框架内连接至该重组融合蛋白基因的氨基末端。该信号肽可以是ICOS分子自身的信号肽或免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1基因之外，本发明的重组表达载体还携带控制所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制所述ICOS-Ig基因转录或翻译的其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这种调节序列，例如描述于Michale Carey等Transcriptional Regulation in Eukaryotes：Concepts，Strategies andTechniques355，Cole Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA(2000)。该表达载体的选择可以取决于种种因素，例如选择欲转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等。优选的哺乳动物细胞表达调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(简称：CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(简称：SV40)(例如SV40启动子/增强子)或腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(简称：AdMLP)和多形瘤的启动子和/或增强子)等中的一种或多种。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，例如Schaffner等的美国专利4,968,615号。

除所述重组融合蛋白基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带其它序列，例如在宿主细胞中调节该载体复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。该选择标记基因便于选择已导入该载体的宿主细胞。例如，一般该选择标记基因赋予已导入该载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(简称：DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

为表达所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1，将编码所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1的重组表达载体通过标准技术转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式涵盖了众多的各种用于将外源基因导入原核或真核宿主细胞的常用技术。例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质体等。尽管理论上可以在原核宿主细胞或者真核宿主细胞中表达本发明的ICOS-Ig或hICOS-IgG1，但最优选在真核细胞中、最优选在哺乳动物细胞中表达ICOS-Ig或hICOS-IgG1，因为这种真核细胞、特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配和分泌正确折叠和具免疫抑制活性的ICOS-Ig或hICOS-IgG1。优选的表达本发明重组融合蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(简称：CHO)、二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞(简称：dhfr-CHO细胞)、非洲绿猴肾成纤维样细胞(简称：COS细胞)或人胚肾细胞(简称：293细胞)等中的一种或多种。将编码ICOS-Ig或hICOS-IgG1基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养所述宿主细胞足够时间以在所述宿主细胞中表达该重组融合蛋白，或更优选地将该重组融合蛋白分泌到所述宿主细胞生长的培养基中生产所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1。使用标准蛋白纯化方法可以从该培养基中回收ICOS-Ig或hICOS-IgG1。

在一重组表达本发明ICOS-Ig或hICOS-IgG1的推荐***中，通过脂质体介导的转染将既编码该重组融合蛋白的重组表达载体导入CHO细胞。在该重组表达载体中，所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1基因可操作地连接至增强子/启动子调节元件(例如来自SV40、CMV等以驱动所述基因的高水平转录，该重组表达载体亦携带二氢叶酸还原酶基因(简称：DHFR基因)，可以用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用该载体转染的CHO细胞，培养该选出的转化体宿主细胞以表达所述ICOS-Ig或hICOS-IgG1，并从该培养基中回收ICOS-Ig或hICOS-IgG1。使用标准分子生物学方法制备该重组表达载体、转染所述宿主细胞、选择转化体、培养所述宿主细胞并从该培养基中回收该ICOS-Ig或hICOS-IgG1。

鉴于前述，本发明的另一方面涉及可以用于重组表达本发明ICOS-Ig或hICOS-IgG1的核酸、载体和宿主细胞组合。

(四)重组融合蛋白的用途

1、概述

本发明的进一步目的是提供一种具有免疫抑制作用以及治疗自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的产品，包括药物、检测试剂、诊断试剂等，尤其是一种药物。

本发明重组融合蛋白可用于动物尤其是哺乳动物预防和治疗“其中ICOS活性是有害的紊乱”。这种“其中ICOS活性是有害的紊乱”可因ICOS的存在而发展和恶化，抑制ICOS活性就可以治疗这种紊乱。所述哺乳动物包括人与非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物包括小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。可以将本发明重组融合蛋白以治疗目的给与人受治疗者。将本发明重组融合蛋白给与非人类哺乳动物，以达到兽医目的或做为人类疾病的动物模型。有关后者，这种动物模型可以用于评价本发明重组融合蛋白的治疗效力(例如测试药效、给药剂量和时间过程)。

本文使用的术语“其中ICOS活性是有害的紊乱”包括疾病和其它紊乱。其中，在患该紊乱的受治疗者中，ICOS的存在已显示出或被怀疑或者对该病的病理生理学负责或足以造成该病加重的因子。因此，其中ICOS是有害的紊乱就是这样一种紊乱，其中ICOS活性的抑制预期将减轻该紊乱的症状和/或进程。这种紊乱可以通过例如患该病的受治疗者的生物体中ICOS表达的增加(例如，细胞、脾脏细胞上表达增加)而证实。有许多其中ICOS是有害的紊乱的例子。

以下进一步讨论本发明ICOS120重组融合蛋白在预防、检测、诊断、治疗和研究具体紊孔中的用途。

本文所述的紊乱包括：

自身免疫性疾病：包括***性自身免疫性疾病及其相关病症(如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、强直性脊柱炎、骨关节炎、成人斯蒂尔病、白塞病、特赖综合征、银屑病、复发性多软骨炎、***性血管炎、多动脉炎或自身免疫性溶血性贫血及其相关病症等)；器官特异性自身免疫病及其相关病症(如内分泌***自身免疫病、血液***自身免疫病、心血管***自身免疫病、呼吸***自身免疫病、消化***自身免疫病自身免疫病、泌尿***自身免疫病、神经***自身免疫病、自身免疫性眼病或自身免疫性皮肤病及其相关病症等)等；移植排斥及其相关病症等；经皮冠状动脉成形术后血管肥大或闭合、PTCA/斯滕特氏印模/旁路外科术后血管再闭合/再狭窄、介入后血管肥大或闭合、植入移植所引起的血管障碍和排斥及其相关病症等；变应性疾病：包括哮喘、变应性鼻炎、结膜炎、消化道***反应、花粉病或过敏反应及其相关病症等中的一种或多种；炎性疾病：包括咽喉炎、膀胱炎、肺炎、心肌炎、心肌病、脑膜炎、炎性眼病、肺炎、矽肺结核、肺结节病、肺结核、关节炎及其相关病症(如骨关节炎、类风湿脊髓炎和骨膜瘤形成及其相关病症等)、术后/外伤后炎症或特应性皮炎及其相关病症等中的一种或多种；糖尿病及其并发症：包括视网膜病、肾病、神经病和大血管疾病、糖尿病肾病或异常葡糖耐量症及其相关病症等中的一种或多种；炎性肠内疾病：包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎及其相关病症等中的一种或多种；循环疾病：包括慢性心衰、心率失常、心绞痛、心肌梗塞、心功能不全和充血性心衰、动脉硬化、动脉粥样硬化、高血压、深部静脉血栓形成、闭塞性周围循环衰竭、局部缺血性循环衰竭、弥散性血管内凝血综合征、雷诺氏病、伯格氏病、门脉高压症、肺性高血压或透析性高血压及其相关病症等中的一种或多种；牛皮癣及其相关病症等；肝病：包括肝炎、慢性肝病或肝硬化及其相关病症等中的一种或多种；胰腺疾病：包括胰腺炎及其相关病症等；神经变性疾病：包括早老性痴呆(Alzheimei)、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化或AIDS脑病及其相关病症等中的一种或多种；中枢神经***障碍：包括脑血管障碍、脑出血、脑梗塞及其后遗症、颅外伤、脊柱损伤、脑水肿、痴呆、记忆障碍、意识障碍或多发性硬化及其相关病症等中的一种或多种；毒血症：包括败血症、脓毒性休克、革兰氏阴性浓度症或毒素休克综合征及其相关病症等中的一种或多种；妊娠中毒及其相关病症；肥胖症及其相关病症；高脂血症：包括高血脂症或高胆甾醇症及其相关病症等中的一种或多种；肿瘤：包括恶性淋巴瘤、胃和肠癌症、癌症和伴随的恶病质或实体瘤及其相关病症等中的一种或多种；内分泌疾病：包括阿狄森氏病、库兴氏综合征、黑素细胞瘤或原发性醛固酮增多症及其相关病症等中的一种或多种；Creutzfeldt-Jacob病及其相关病症；病毒性感染：包括巨细胞病毒感染或流行性感冒病毒及其相关病症等中的一种或多种；眼病：包括青光眼或高眼压及其相关病症等中的一种或多种；肌无力及其相关病症等；慢性疲劳及其相关病症等；骨疾病：包括骨折、再骨折、骨质疏松症、骨质软化症、骨Behet病、强直性脊柱炎或骨关节炎以及相关疾病中的关节组织破坏及其相关病症等中的一种或多种。另外，本发明重组融合蛋白可以单独或与其他活性组分联合用于治疗。

已知本发明重组融合蛋白结合ICOS配体的能力，可以将其用于在诸如酶联兔疫吸附检测(简称：ELISA)方法、放射免疫检测(简称：RIA)方法或组织免疫组织化学方法等常规免疫检测方法中，从诸如血清或血浆的生物样品中检测出ICOS配体。本发明提供在生物样品中检测ICOS活性的方法，该方法包括用本发明重组融合蛋白接触生物样品并检测或者结合至ICOS配体由此检测生物样品中ICOS的活性及ICOS配体的含量。为了便于检测配体结合的重组融合蛋白，用可检测物质直接或间接标记该重组融合蛋白。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质等。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶等；合适的辅基复合体例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素等；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等；发光物质的例子包括鲁米诺等；而合适的放射性物质的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H等。

亦可以用本发明重组融合蛋白检测来自除人类之外的其它物种的ICOS配体，例如小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种的ICOS配体，因为重组融合蛋白可以与这些ICOS配体的每一种结合。

本发明重组融合蛋白在体外和在体内均能抑制ICOS活性；另外，还可以抑制其它物种的ICOS活性。因此，本发明重组融合蛋白可以用于例如在含有ICOS配体的细胞培养物、在人类受治疗者或在其它具有本发明重组融合蛋白可以交叉反应的ICOS配体的哺乳动物受治疗者中抑制ICOS活性，所述的哺乳动物受治疗者包括小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。

2、重组融合蛋白的联合用药

本发明重组融合蛋白可以单独或与其它活性组分联合用于科学研究、疾病治疗或疾病诊断等领域。

可以与本发明重组融合蛋白联用的自身免疫性疾病治疗药物的非限制性例子包括以下：非类固醇抗炎药(如NSAID)、细胞因子抑制抗炎药(如CSAID)、CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗体：Celltech/Bayer公司产品)、抗Tac(人化抗IL-2Rα：Protein DesignLabs/Roche公司产品)、IL-4(是一种抗炎细胞因子)、布洛芬(属于非类因醇抗炎药)、毗罗昔康(属于非类因醇抗炎药)、双氦芬酸、环磷酰胺、环孢菌素、氨甲蝶呤、保泰松、静脉注射免疫球蛋白、干扰素-阝la(商品名：Avonex7M；Biogen公司产品)、干扰素-阝、甲基强的松龙、强的松龙、硫唑嘌呤、皮质类固醇或雷公藤等中的一种或多种。

可以与本发明重组融合蛋白联用的器官移植排斥和/或移植物抗宿主病治疗药物的非限制性例子包括以下：硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、肾上腺糖皮质激素、Prograf(如Tacrolimus，FK506)、霉酚酸酯、雷帕霉素、15-脱氧精胍素、雷公藤多甙、Brequinar Sodium(简称：BQR)、Mizoribine(简称：MZ)、抗淋巴细胞抗体、基因工程共刺激分子抑制剂或各类抗菌药等中的一种或多种。

可以与本发明重组融合蛋白联用其它疾病治疗药物的非限制性例子包括以下：炎性肠病治疗药物，包括表皮生长因子、皮质类固醇、环袍菌素、柳氮磺胺吡啶、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、甲硝唑、氨基水杨酸、抗氧化剂、强的松龙、***、缓释氨水杨酸、氨甲蝶吟、环丙沙星或利多卡因等中的一种或多种；心血管疾病的治疗剂，包括强心剂、利尿剂、钙拮抗剂、β受体阻断剂等等；糖尿病治疗剂，包括胰岛素、Actos、Rosigilidazone、Kinedak、BENFIL、Humulin、Euglucon、Glimicron、Daonil、Nobolin、Monotard、Glucobay、Dimelin、Rastinon、BASILCON、Deamelin S或Iszilin等中的一种或多种；肾病治疗剂，包括***龙(Predonine)、琥钠甲强龙(Solu-medrol)、倍他米松(Rinderon)、盐酸地拉卓(Comelian)或tyropidine Fxa抑制剂等中的一种或多种；骨疾病治疗剂，包括钙制剂例如碳酸钙等；降钙素制剂；活性维生素D3制剂；激素制剂；性激素包括***等；***素A1；成骨蛋白(简称：BMP)；细胞生长因子；转化生长因子；甲状旁腺激素(简称：PTH)等等；以及其它疾病治疗剂。

3、重组融合蛋白及其组合物的使用方法与要求

本发明重组融合蛋白可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于治疗、诊断、检测和研究相关疾病的产品，包括药物、检测试剂、诊断试剂等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的重组融合蛋白能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解重组融合蛋白的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物、兽用药或人类用药等中的一种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种；进一步优选医药学上可接受的载体。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合物。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇、或氯化钠。药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它们增强了该重组融合蛋白的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如甘油、硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉、乳糖等；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇等；稀释剂，如水等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土和皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。

例如，将活性组分重组融合蛋白溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水和格林溶液等)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油和玉米油、丙二醇等)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇、苯酚等)或渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇、葡萄糖等)等中的一种或多种。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠、醋酸钠等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)或止痛剂(例如，苯甲醇等)等中的一种或多种。

本发明所述及的重组融合蛋白还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明重组融合蛋白加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明重组融合蛋白和药学上可接受的载体。

本发明重组融合蛋白的组合物特别是药物组合物可以有各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂量形式；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的重组融合蛋白为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。所述的本发明重组融合蛋白的组合物的各种形式，例如液体溶液(例如注射液和输注液)、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。推荐的形式取决于给药方式和治疗用途。典型的推荐组合物是注射液或输注液的形式，例如与用其它基因工程药物对人进行治疗所用的组合物类似的组合物。推荐的给药方式是非肠道的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。最优选通过肌肉内注射或皮下注射给与该重组融合蛋白。

重组融合蛋白的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该重组融合蛋白与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该重组融合蛋白加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

4、重组融合蛋白及其组合物的药物剂型和给药途径

本发明所述的重组融合蛋白及其组合物制备的用于免疫抑制以及自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究的产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够进行免疫抑制以及治疗或诊断自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、诊断、检测或保健，既能够单独直接用于制备治疗、诊断、检测或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗、诊断、检测或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

重组融合蛋白的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂等，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射等)、粘膜透析等给药途径进行免疫抑制作用的治疗、诊断、检测或科学研究以及治疗自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究。

本发明重组融合蛋白可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是静脉内注射或输液。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些实施方案中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物、透皮贴和微囊传递***。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸等。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978)。

在某些实施方案中，本发明重组融合蛋白可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该化合物(和其他成分，如果需要的话)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述化合物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等等形式使用。为了以非肠道给药之外给与本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料对该化合物包衣或与该化合物一同给与。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在某些实施方案中，将本发明重组融合蛋白与一种或多种可以用于治疗、诊断、检测ICOS活性为有害的疾病的其它治疗药物共配制和/或共给与。例如，本发明重组融合蛋白可以与一种或多种结合其它靶的治疗、诊断、检测产品如药物或试剂(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的重组融合蛋白或抗体等)、一种或多种细胞因子、抗ICOS抑制性抗体和/或多种抑制药剂化学抑制ICOS产生或活性的药物共配制和/或共给与。另外，可以将一种或多种本发明重组融合蛋白与二种或多种前述治疗药物联用。这种联合使用可以优越地利用较低剂量的该给与的治疗、诊断、检测产品如药物或试剂，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等。

以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂或注射剂等中的一种或多种，特别优选混悬剂、乳剂、溶液剂或注射剂等中的一种或多种。

根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明重组融合蛋白的每日剂量。例如，经静脉给予哺乳动物、尤其是成年人(60kg体重)，所述重组融合蛋白的单剂量约为10～1200mg，优选约100mg，优选每周给药1～3次。可以调整剂量单位以提供最佳所需反应(例如治疗或预防应答等)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给与几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下确定并直接取决于以下(a)该活性化合物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性活性化合物的技术中的内在限制。

本发明的药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明重组融合蛋白。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。重组融合蛋白的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该重组融合蛋白在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该重组融合蛋白的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明重组融合蛋白的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0～20mg/kg，更优选为1～10mg/kg。应注意剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的重组融合蛋白的剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

综上所述，本发明重组融合蛋白及其组合物可用于制备免疫抑制以及自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究的产品，优选药物、试剂和食品，进一步优选药物和试剂，最优选药物。

(五)技术特长

本发明的研究结果，可深入开发为具有临床应用前景的防治自身免疫性疾病及移植排斥等方面的产品如新药、试剂等，具有疗效确切、有效剂量低、无毒副作用的优点，与国内外同类产品相比具有显著的优势。自身免疫性疾病及移植排斥为临床常见病、多发病，随着人民生活水平的提高，预计自身免疫性疾病及移植排斥疾病的发病率将不断攀升。因此，本发明可以为后续的新药等产品研究打下良好的基础，并进一步产生较大的经济效益和社会效益。

本发明提供抑制哺乳动物的ICOS分子活性的重组融合蛋白，而非抑制其它共刺激分子活性的重组融合蛋白。所述的哺乳动物，与上文相同。

重组融合蛋白特别是ICOS-Ig，具有以下优点：①能特异性地抑制记忆和活化T细胞的功能，免疫抑制功能强而且特异；②能大规模制备，通过以抗Fc段抗体进行亲和层析，葡萄球菌A蛋白可方便地纯化，且融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感，使制备成本和使用成本明显减低。③直接用哺乳动物工程细胞生产，不仅更接近天然分子的状况适合机体吸收，而且避免了AIDS、肝炎病毒及其它病源微生物的污染；④根据人源基因设计，不会导致体内抗体产生，安全可靠；⑤融合了免疫球蛋白的Fc段后，使融合蛋白不仅具备与ICOS配体分子结合的所有位点，且能形成二聚体分子，与配体结合能力强，半衰期更长，更适合于体内的应用，甚至可穿过胎盘发挥药效。

目前，临床上使用的免疫抑制剂均为非特异性抑制剂毒副作用强，本发明人所制备的重组融合蛋白可以起特异性地免疫抑制作用，毒副作用小，安全可靠，而且可以在体外进行大规模制备，生产成本较低，有利于推广应用，具有良好的临床应用和科学研究的价值及良好的社会效益和经济效益。

综上所述，经过长期的药理学试验，该重组融合蛋白具有免疫抑制作用以及治疗自身免疫性疾病及移植排斥及其相关病症的活性，直接使用该重组融合蛋白，无须经过胃肠道细菌的代谢，使作用更直接，避免个体之间的胃肠道菌群活性有差异造成代谢产物的差异而产生药效上的差异，从而克服了给药剂量难以控制的问题，并提高了生物利用度。

此外，该重组融合蛋白化学性质稳定，制备的免疫抑制产品如药物以及治疗自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症的效果明显，故其更适于制备免疫抑制产品尤其是药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品如药物的工业化生产。

该重组融合蛋白在胃肠道生物转化中的活性形式，直接使用该重组融合蛋白，药物的生物利用度高，可以准确控制用药剂量。重组融合蛋白性质稳定，使用重组融合蛋白制备的制剂质量稳定。

本发明重组融合蛋白药理作用较强，其原料来源丰富，制备工艺简单，得率高。

本发明有针对性地研究重组融合蛋白，该原料使用安全，互为兼顾，一物多用，最大限度地发挥了作用，而且使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

总之，本发明积极适应了现代医疗、食品、饮料和科研等领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于制备免疫抑制产品如药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品尤其是药物的安全原料。

附图说明

图1说明hICOS-IgG1与配体表达细胞上的配体分子的结合；

图2说明hICOS-IgG1对活化淋巴细胞增殖的抑制；

图3说明hICOS-IgG1对活化淋巴细胞的细胞因子分泌功能的抑制。

具体实施方式

本发明研究和公开一种新的重组融合蛋白及其制备方法和用途，提供了一种能够用于制备能够用于免疫抑制的产品尤其是药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症药物的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。

也就是说，本发明重点提供一种基因工程能生产的、表达量高、易于纯化、具有抑制ICOS的生物学活性和具有高度生物安全性的重组融合蛋白，这是一种新的生物免疫抑制物。并公布其主要的制备方法，以及该产品的用途。

(一)下面以hICOS-IgG1为例，详细阐述重组融合蛋白的具体制备方法。

1、本发明hICOS-IgG1的具体制备方法：

①根据人源ICOS的N端21～140氨基酸的DNA序列，设计引物，用标准PCR方法从人外周血单个核细胞的DNA中克隆出所需的ICOS片段；用同样的标准PCR方法从含人IgG Fc的质粒(pIgplus)中克隆出免疫球蛋白恒定片段；用SOC-PCR法将所需的ICOS片段与免疫球蛋白恒定片段连接成hICOS-IgG1重组基因片段，并用sfiI和NotI双酶消化上述重组基因片段和哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A，利用sfiI和NotI双酶的粘性末端将所需的ICOS片段***pSecTag2/Hygro A中，构成pSecTag2/Hygro A-hICOS-IgG1重组表达载体。

②将pSecTag2/Hygro A-hICOS-IgG1重组表达载体用脂质体法用脂质体(或磷酸钙或电转化法)转入中国仓鼠卵巢细胞(简称：CHO)宿主细胞(或其它哺乳动物宿主细胞)中，用药物抗生素潮霉素筛选单个表达本发明hICOS-IgG1的CHO宿主细胞，用无血清培养基大量培养筛选出的上述细胞，收集细胞培养上清液，用亲和层析法从上述细胞培养上清液中纯化出hICOS-IgG1。

③用高压液相检测仪器(简称：HPLC)检测hICOS-IgG1纯度，用聚丙稀酰胺凝胶电泳(简称：SDS-PAGE)检测hICOS-IgG1分子量，用Western-blot法检测hICOS-IgG1的表达。

④生物学活性检测发现hICOS-IgG1可以抑制异基因人混合淋巴细胞的增殖反应，还可以抑制抗CD3抗体对人淋巴细胞的刺激反应。

2、hICOS-IgG1与ICOS配体结合活性：

原理：hICOS-IgG1可与其配体表达细胞表面的ICOS配体特异性结合，在配体数量一定的情况下，随着hICOS-IgG1含量的增加，与其配体结合量也增加。荧光标记的抗IgGFc抗体可以与配体结合的hICOS-IgG1相结合，通过流式细胞仪检测结合抗IgGFc抗体发出的荧光可以反应hICOS-IgG1与其配体的结合。

操作步骤：取一定浓度如1％～50％的动物血清如猴血清、牛血清、兔血清、羊血清等，封闭配体表达细胞如Daudi细胞的IgG恒定片段的受体(简称：FcR)后，取一定量的配体表达细胞如1×10⁴～1×10⁸个Daudi细胞，洗涤后加入不同浓度的hICOS-IgG1及空白对照，如用磷酸盐缓冲液(简称：PBS)洗涤1～5次后分别加入1～50ug/ml的hICOS-IgG1及空白对照，一定温度下孵育数小时如0℃～50℃孵育1～6小时，用HRP标记的抗人IgG等检测试剂作为检测抗体，用流式细胞仪等检测设备分析配体结合活性。

结果：计数一定数量的细胞发出的荧光强度，随hICOS-IgG1浓度增加，检测的荧光强度增加，提示hICOS-IgG1与其配体有结合。

3、hICOS-IgG1的生物学活性：

原理：淋巴细胞受到抗原刺激后，在共刺激分子的参与下，淋巴细胞活化并表现出增生、分泌细胞因子等生物学活性。如果没有ICOS共刺激分子的参与，活化的淋巴细胞很快失活，甚至凋亡。在异基因淋巴细胞相互作用的过程中加入hICOS-IgG1，如果淋巴细胞增生受到抑制或细胞因子分泌受到抑制，反映了ICOS的共刺激通路受到阻断，说明hICOS-IgG1具有阻断ICOS共刺激通路的作用并可以抑制异基因淋巴细胞间的增殖反应。

操作步骤：任取两个健康献血员或其他哺乳动物如两个不同性别健康献血员的外周血单个核细胞，加入细胞培养液如含小牛血清的1640培养液稀释的hICOS-IgG1，混合培养数小时，终止培养前数小时，加入检测试剂包括同位素检测试剂如³H-TdR，计数结果如每分钟闪烁次数(简称：cpm值)。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其细胞因子含量。

结果：hICOS-IgG1可以抑制人或小鼠异基因混合淋巴细胞的增殖反应，亦可抑制细胞因子的分泌。

4、hICOS-IgG1的药效学活性：

原理：致敏性T辅助细胞亚群Th2/Th1失衡是卵蛋白过敏性哮喘小鼠模型主要的致病机理。ICOS共刺激通路参与调节T辅助细胞亚群Th2/Th1平衡。用hICOS-IgG1治疗卵蛋白(OVA)过敏性哮喘小鼠是通过体内试验研究hICOS-IgG1对ICOS共刺激通路的抑制作用。

操作步骤：取体重约为10～40g、约4～10周龄的雌性或雄性健康小鼠作为试验动物(每组6～90只)。腹腔注射OVA以致敏小鼠。疾病组如哮喘疾病组小鼠体内注射一定量的对照抗体，治疗组同样方法在小鼠体内注射等量的hICOS-IgG1后，气雾激发OVA或鼻腔点滴OVA；对照组以同样的方法在小鼠体内给予等量的对照抗体或hICOS-IgG1，气雾激发生理盐水或鼻腔点滴生理盐水。末次气雾激发生理盐水或鼻腔点滴生理盐水数小时后，检测各组小鼠的评价指标包括肺灌洗液(简称：BALF)、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群等。

结果：治疗组小鼠的血清IgE水平、BALF的炎性细胞数和IL-4水平、外周血Th2比例均较疾病组明显减低，说明hICOS-IgG1可以通过阻断小鼠体内ICOS共刺激通路来治疗疾病如哮喘病等。

(二)hICOS-IgG1制剂的几个具体应用

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取重组融合蛋白，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含重组融合蛋白10～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取重组融合蛋白，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含重组融合蛋白10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每支含重组融合蛋白10～100mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每瓶含重组融合蛋白10～100mg。

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

实施例1、hICOS-IgG1的制备方法

主要试剂的来源：

Lipofectamine2000、TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；各种工具酶购自Takara公司；潮霉素购自上海普飞生物技术公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自维特洁公司；IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒购自晶美生物技术公司。pMD-18T克隆载体购自TAKARA公司、pSecTag2/Hygro A表达载体购自Invitrogen公司、pGL-3-Basic克隆载体、携带免疫球蛋白Fc段基因的质粒pMD-18T-Ig由本实验室保存；无血清培养基EX302购自美国JRH公司；protein A亲和纯化试剂盒购自美国sigma公司；293细胞购自中国科学院细胞所。

(1)ICOS胞外段基因的克隆：

根据人源ICOS胞外区序列，设计带酶切位点的引物。

用终浓度为20ng/ml的PMA和200ng/ml的ionomycin刺激人外周血单个核细胞72h，收集细胞，Trizol提取总RNA，RT-PCR法扩增ICOS胞外段基因360bp，装入pMD-18T克隆载体。

(2)Ig的Fc段基因的克隆：

设计带酶切位点的引物，以装有Ig基因的质粒为摸板，扩增出其Fc段，装入pMD-18T克隆载体。

(3)hICOS-IgG1融合基因表达载体的构建：

sfiI、XbalI双酶切pMD-18T-ICOS质粒，将切下的ICOS胞外段定向克隆入pSecTag2/Hygro A表达载体(可以是任何高效哺乳动物真核表达如pSecTag2/Hygro A、pcDNA4 His MAX等。XbalI、NotI双酶切、质粒，将切下的Fc片段定向上述表达载体，完成ICOS胞外段与Fc段的融合，获得携带融合基因的分泌型哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A-ICOSIg。

(4)hICOS-IgG1的核苷酸序列测定：

对携带融合基因的重组分泌型哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A-ICOS-Ig进行测序，检查融合基因开放阅读框的正确性。

(5)融合基因表达载体转染宿主细胞并建立稳定表达株：

用脂质体(或磷酸钙或电转化法)将重组融合基因表达载体pSecTag2/HygroA-hICOS-IgG1(如pSecTag2/Hygro A-hICOS-IgG1等)转染CHO细胞，或其他的宿主细胞(如各种衍生型CHO细胞、293细胞、各种衍生型293细胞等)。含800ug/ml抗生素潮霉素的选择培养基筛选受染细胞14～20天，ELISA检测hICOS-IgG1的表达水平，挑选表达水平高的单克隆细胞培养，部分液氮冻存保种；其余细胞经过驯化后，进入无血清培养基中悬浮培养。

(6)ELISA双抗体夹心法鉴定hICOS-IgG1分泌表达量：

以pH9.6碳酸缓冲液稀释羊抗人IgG抗体至3ug/ml，包被96孔ELISA板，4℃过夜孵育；以1％牛血清白蛋白封闭，37℃孵育1小时；加入阳性克隆细胞培养72～96小时的上清液及500ng/ml倍比稀释成6个浓度的人IgG纯品及空白对照，37℃孵育1小时；加入HRP标记马抗人IgG抗体，37℃孵育1小时；加入TMB底物缓冲液，室温放置5～20分钟显色；终止反应后用酶标仪以450nm读取每孔吸光度，根据人IgG标准品对应的OD值制备标准曲线，以估测分泌蛋白的表达水平。

(7)hICOS-IgG1的大量制备：

将挑选出的hICOS-IgG1高表达CHO细胞，进行无血清悬浮培养，具体步骤是，取5×10⁵个细胞加入含5％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基中用常规组织细胞培养法培养，待细胞长到80％～90％满度时；将细胞传代，用含2％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基培养到细胞长到80％～90％满度时；将细胞传代，继续用含1％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基培养到细胞长到80％～90％满度时将细胞传代，将细胞转入摇瓶(或生物反应器、滚瓶)中用EX302培养基培养，摇瓶置于摇床上以60～120转/分钟转速进行细胞悬浮细胞培养，其余培养条件同常规组织细胞培养法。每一次细胞传代及悬浮培养过程中每一天都要用台盼蓝染色法监测细胞活力，发现死亡或活力差的细胞丢弃。收集EX302培养基中培养的细胞上清，4℃短期保存。

(8)hICOS-IgG1的纯化：

将4℃短期保存的上清液，及时用截留分子量为50,00～10,000Da的超滤器浓缩，浓缩液流经protein A亲和纯化柱纯化(或硫酸胺沉淀法)，收集洗脱液，280nm紫外吸光光度计检测蛋白含量，分装后-20℃保存纯化的hICOS-IgG1。

(9)hICOS-IgG1配体结合活性的检测：

1×10⁶个Daudi细胞用PBS洗涤二次后，加上PE标记的抗B7RP-1抗体，室温作用30分钟，PBS洗涤二次后，用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞并进行Daudi细胞ICOS配体分子表型分析。用20％兔血清封闭Daudi细胞的FcR后，分别加入经ELISA法检测的阳性克隆细胞分泌上清(2ug/ml、10ug/ml)及空白对照，37℃孵育1小时，用HRP标记的抗人IgG为检测抗体，用流式细胞仪分析配体结合活性。

结果显示，hICOS-IgG1具有配体结合活性。

(10)hICOS-IgG1生物活性测定：

10.1取两个健康献血员外周血的单个核细胞(2×10⁶/ml)各50ul，加入含10％小牛血清的1640培养液稀释的纯化hICOS-IgG1 100ul(终浓度为209、105、53、27、14、7、0ug/ml)，每个浓度重复三次，在96孔板中混合培养96小时，终止培养前16～18小时，加入³H-TdR，计数cpm值。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其IL-2、IFN-γ含量。

10.2于第0、7、14天腹腔注射20ug鸡卵蛋白(简称：OVA)与200ul 1.36％Al(OH)₃的混悬液以致敏SPF级健康BALB/c小鼠；后按不同分组给予不同处理：第21天起连续3天，hIgG/OVA组尾静脉注射200ug对照抗体人IgG(hIgG)，ICOS/OVA组尾静脉注射200ug的hICOS-IgG1，10分钟后2mg/ml OVA气雾激发；hIgG/Saline组和ICOS/Saline组分别同样给予hIgG或hICOS-IgG1尾静脉注射和生理盐水气雾激发。末次气雾激发24小时后检测各组小鼠的肺灌洗液、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群。用预温至37℃的1mL生理盐水灌洗鼠肺，反复3次，4℃暂存；收集的BALF液以1200rpm4℃离心10分钟，分离上清液，-70℃保存待测；双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。小鼠眼球取抗凝血，取血浆检测总IgE含量；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调节细胞浓度至106/ml，37℃5％CO2与100ng/ml的PMA、1ug/ml的ionomycin和0.7ul的Golgistop共孵育6小时，收集细胞，加入5ul的CYC-antiCD4室温放置20分钟、裂解红细胞、分离出细胞加入Cytofix/Cytoperm液，4℃放置20分钟，加入Perm/Wash液1ml，离心分离出细胞，加入FITC-antiIFN-γ、PE-antiIL-4，4℃避光放置20分钟，Perm/Wash液洗涤两次，PBS重悬细胞。以同型对照抗体为对照样品。用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞，分析CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IFN-γ+(Th1)阳性细胞百分率。

结果：hICOS-IgG1可以抑制OVA过敏性哮喘小鼠的细胞因子的分泌、血清IgE的含量和Th2亚群的数量，说明hICOS-IgG1可以体内抑制ICOS共刺激通路。

实施例2、hICOS-IgG1与ICOS配体结合试验

(1)原理

hICOS-IgG1可与其配体表达细胞表面的ICOS配体特异性结合，在配体数量一定的情况下，随着hICOS-IgG1含量的增加，与其配体结合量也增加。荧光标记的抗IgGFc抗体可以与配体结合的hICOS-IgG1相结合，通过流式细胞仪检测结合抗IgGFc抗体发出的荧光可以反应hICOS-IgG1与其配体的结合。

(2)操作步骤

用20％兔血清封闭Daudi细胞的FcR后，取Daudi细胞1×10⁶个，用PBS洗涤二次后分别加入2ug/ml、10ug/ml两个浓度的hICOS-IgG1及空白对照，37℃孵育1小时，用HRP标记的抗人IgG为检测抗体，用流式细胞仪分析配体结合活性。

(3)结果

计数1×10⁴个细胞发出的荧光强度，随hICOS-IgG1浓度增加(2ug/ml，10ug/ml)，检测的荧光强度增加(见图1)，提示hICOS-IgG1与其配体有结合。

实施例3、hICOS-IgG1生物学活性测定

(1)原理

淋巴细胞受到抗原刺激后，在共刺激分子的参与下，淋巴细胞活化并表现出增生、分泌细胞因子等生物学活性。如果没有ICOS共刺激分子的参与，活化的淋巴细胞很快失活，甚至凋亡。在异基因淋巴细胞相互作用的过程中加入hICOS-IgG1，如果淋巴细胞增生受到抑制或细胞因子分泌受到抑制，反映了ICOS的共刺激通路受到阻断，说明hICOS-IgG1具有阻断ICOS共刺激通路的作用并可以抑制异基因淋巴细胞间的增殖反应。

(2)操作步骤

取两个不同性别健康献血员的外周血单个核细胞(2×10⁶/ml)各50ul，加入含10％小牛血清的1640培养液稀释的hICOS-IgG1 100ul(终浓度为209、105、53、27、14、7、0ug/ml)，每个浓度重复三次，在96孔板中混合培养96小时，终止培养前16～18小时，加入³H-TdR，计数cpm值。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其IL-2、IFN-γ含量。

(3)结果

hICOS-IgG1可以抑制人异基因混合淋巴细胞的增殖反应，亦可抑制IL-2、IFN-γ细胞因子水平(见图2、图3)。

实施例4、hICOS-IgG1药效学活性测定

(1)原理

致敏性T辅助细胞亚群Th2/Th1失衡是卵蛋白过敏性哮喘小鼠模型主要的致病机理。ICOS共刺激通路参与调节T辅助细胞亚群Th2/Th1平衡。用hICOS-IgG1治疗卵蛋白(OVA)过敏性哮喘小鼠是通过体内试验研究hICOS-IgG1对ICOS共刺激通路的抑制作用。

(2)操作步骤

取体重约为20g、约6周龄的雌性健康BALB/c小鼠作为试验动物(每组6只)。于第0、7、14天腹腔注射20ug的OVA与200ul 1.36％Al(OH)₃的混悬液以致敏BALB/c小鼠。

第21天起连续3天，IgG/OVA组(疾病组)尾静脉注射200ug对照抗体人IgG(IgG)，ICOS/OVA组(治疗组)尾静脉注射200ug hICOS-IgG1，10分钟后2mg/ml OVA气雾激发；IgG/Saline组(对照组)和ICOS/Saline组(对照组)分别同样给予IgG或hICOS-IgG1尾静脉注射和生理盐水气雾激发。末次气雾激发24小时后检测各组小鼠的肺灌洗液(BALF)、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群。用预温至37℃的1mL生理盐水灌洗鼠肺；收集的BALF液进行离心，分离上清液，-70℃保存待测；双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。小鼠眼球取抗凝血，取血浆检测总IgE含量；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调节细胞浓度至106/ml，37℃ 5％CO₂与100ng/ml PMA、1ug/ml ionomycin和0.7ul Golgistop共孵育6小时，收集细胞，加入5ul CYC-antiCD4室温放置20分钟、裂解红细胞、分离出细胞加入Cytofix/Cytoperm液，4℃放置20分钟，加入Perm/Wash液1ml，离心分离出细胞，加入FITC-antiIFN-γ、PE-antiIL-4，4℃避光放置20分钟，Perm/Wash液洗涤两次，PBS重悬细胞。以同型对照抗体为对照样品。用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞，分析CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IFN-γ+(Th1)阳性细胞百分率。

(3)结果

hICOS-IgG1治疗组的血清IgE水平、BALF的炎性细胞数和IL-4水平、外周血Th2比例均较疾病组明显减低(见图3)。

实施例5至11，用以进一步说明本发明hICOS-IgG1的制剂制备方法。

实施例5、粉针剂的制备1

取100g的hICOS-IgG1，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；冷冻干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例6、粉针剂的制备2

取100g的hICOS-IgG1，加入乳糖50g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；喷雾干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例7、小针剂的制备1

取10g的hICOS-IgG1，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml，灭菌即可。

实施例8、小针剂的制备2

取20g的hICOS-IgG1，加入丙二醇30g，加200ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml，灭菌即可。

实施例9、葡萄糖输液的制备1

取5g的hICOS-IgG1，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加2000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶100ml，灭菌即可。

实施例10、葡萄糖输液的制备2

取2g的hICOS-IgG1，加入葡萄糖250g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例11、氯化钠输液的制备

取4g的hICOS-IgG1，加入氯化钠90g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例12、一种mICOS-IgG2a的制备方法

主要试剂的来源：

Lipofectamine2000、TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；各种工具酶购自Takara公司；潮霉素购自上海普飞生物技术公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自维特洁公司；IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒购自晶美生物技术公司。pMD-18T克隆载体购自TAKARA公司、pSecTag2/Hygro A表达载体购自Invitrogen公司、pGL-3-Basic克隆载体、携带免疫球蛋白Fc段基因的质粒pMD-18T-Ig由本实验室保存；无血清培养基EX302购自美国JRH公司；proteinA亲和纯化试剂盒购自美国sigma公司；293细胞购自中国科学院细胞所。

(1)ICOS胞外段基因的克隆：

根据小鼠来源的ICOS胞外区序列，设计带酶切位点的引物。

用终浓度为20ng/ml的PMA和200ng/ml的ionomycin刺激小鼠外周血单个核细胞72h，收集细胞，Trizol提取总RNA，RT-PCR法扩增ICOS胞外段基因360bp，装入pMD-18T克隆载体。

(2)Ig的Fc段基因的克隆：

设计带酶切位点的引物，以装有Ig基因的质粒为摸板，扩增出其Fc段，装入pMD-18T克隆载体。

(3)mICOS-IgG2a融合基因表达载体的构建：

sfiI、XbalI双酶切pMD-18T-ICOS质粒，将切下的ICOS胞外段定向克隆入pSecTag2/Hygro A表达载体(可以是任何高效哺乳动物真核表达如pSecTag2/Hygro A、pcDNA4 His MAX等。XbalI、NotI双酶切、质粒，将切下的Fc片段定向上述表达载体，完成ICOS胞外段与Fc段的融合，获得携带融合基因的分泌型哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A-ICOSIg。

(4)mICOS-IgG2a的核苷酸序列测定：

对携带融合基因的重组分泌型哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A-ICOS-Ig进行测序，检查融合基因开放阅读框的正确性。

(5)融合基因表达载体转染宿主细胞并建立稳定表达株：

用脂质体(或磷酸钙或电转化法)将重组融合基因表达载体pSecTag2/HygroA-mICOS-IgG2a(如pSecTag2/Hygro A-mICOS-IgG2a等)转染CHO细胞，或其他宿主细胞(如各种衍生型CHO细胞、293细胞、各种衍生型293细胞等)。含800ug/ml抗生素潮霉素的选择培养基筛选受染细胞14～20天，ELISA检测mICOS-IgG2a的表达水平，挑选表达水平高的单克隆细胞培养，部分液氮冻存保种；其余细胞经过驯化后，进入无血清培养基中悬浮培养。

(6)ELISA双抗体夹心法鉴定融合蛋白分泌表达量：

以pH9.6碳酸缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体至3ug/ml，包被96孔ELISA板，4℃过夜孵育；以1％牛血清白蛋白封闭，37℃孵育1小时；加入阳性克隆细胞培养72～96小时的上清液及500ng/ml倍比稀释成6个浓度的小鼠IgG纯品及空白对照，37℃孵育1小时；加入HRP标记马抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1小时；加入TMB底物缓冲液，室温放置5～20分钟显色；终止反应后用酶标仪以450nm读取每孔吸光度，根据小鼠IgG标准品对应的OD值制备标准曲线，以估测分泌蛋白的表达水平。

(7)mICOS-IgG2a的大量制备：

将挑选出的mICOS-IgG2a高表达CHO细胞，进行无血清悬浮培养，具体步骤是，取5×10⁵个细胞加入含5％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基中用常规组织细胞培养法培养，待细胞长到80％～90％满度时；将细胞传代，用含2％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基培养到细胞长到80％～90％满度时；将细胞传代，继续用含1％小牛血清和500ug/ml潮霉素的EX302培养基培养到细胞长到80％～90％满度时将细胞传代，将细胞转入摇瓶(或生物反应器、滚瓶)中用EX302培养基培养，摇瓶置于摇床上以60～120转/分钟转速进行细胞悬浮细胞培养，其余培养条件同常规组织细胞培养法。每一次细胞传代及悬浮培养过程中每一天都要用台盼蓝染色法监测细胞活力，发现死亡或活力差的细胞丢弃。收集EX302培养基中培养的细胞上清，4℃短期保存。

(8)mICOS-IgG2a的纯化：

将4℃短期保存的上清液，及时用截留分子量为50,00～10,000Da的超滤器浓缩，浓缩液流经protein A亲和纯化柱纯化(或硫酸胺沉淀法)，收集洗脱液，280nm紫外吸光光度计检测蛋白含量，分装后-20℃保存纯化的mICOS-IgG2a。

(9)mICOS-IgG2a配体结合活性的检测：

1×10⁶个Daudi细胞用PBS洗涤二次后，加上PE标记的抗B7RP-1抗体，室温作用30分钟，PBS洗涤二次后，用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞并进行Daudi细胞ICOS配体分子表型分析。用20％兔血清封闭Daudi细胞的FcR后，分别加入经ELISA法检测的阳性克隆细胞分泌上清(2ug/ml、10ug/ml)及空白对照，37℃孵育1小时，用HRP标记的抗小鼠IgG为检测抗体，用流式细胞仪分析配体结合活性。

结果显示，mICOS-IgG2a具有配体结合活性。

(10)mICOS-IgG2a生物活性测定：

10.1取C57/BL小鼠和BALB/C脾单个核细胞(2×10⁶/ml)各50ul，加入含10％小牛血清的1640培养液稀释的纯化mICOS-IgG2a 100ul(终浓度为209、105、53、27、14、7、0ug/ml)，每个浓度重复三次，在96孔板中混合培养96小时，终止培养前16～18小时，加入³H-TdR，计数cpm值。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其IL-2、IFN-γ含量。

10.2于第0、7、14天腹腔注射20ug鸡卵蛋白(简称：OVA)与200ul 1.36％Al(OH)₃的混悬液以致敏SPF级健康BALB/c小鼠；后按不同分组给予不同处理：第21天起连续3天，mIgG/OVA组尾静脉注射200ug对照抗体小鼠IgG(mIgG)，ICOS/OVA组尾静脉注射200ug的mICOS-IgG2a，10分钟后2mg/ml OVA气雾激发；mIgG/Saline组和ICOS/Saline组分别同样给予mIgG或mICOS-IgG2a尾静脉注射和生理盐水气雾激发。末次气雾激发24小时后检测各组小鼠的肺灌洗液、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群。用预温至37℃的1mL生理盐水灌洗鼠肺，反复3次，4℃暂存；收集的BALF液以1200rpm4℃离心10分钟，分离上清液，-70℃保存待测；双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。小鼠眼球取抗凝血，取血浆检测总IgE含量；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调节细胞浓度至106/ml，37℃5％CO2与100ng/ml的PMA、1ug/ml的ionomycin和0.7ul的Golgistop共孵育6小时，收集细胞，加入5ul的CYC-antiCD4室温放置20分钟、裂解红细胞、分离出细胞加入Cytofix/Cytoperm液，4℃放置20分钟，加入Perm/Wash液1ml，离心分离出细胞，加入FITC-antiIFN-γ、PE-antiIL-4，4℃避光放置20分钟，Perm/Wash液洗涤两次，PBS重悬细胞。以同型对照抗体为对照样品。用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞，分析CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IFN-γ+(Th1)阳性细胞百分率。

结果：mICOS-IgG2a可以抑制OVA过敏性哮喘小鼠的细胞因子的分泌、血清IgE的含量和Th2亚群的数量。

序列表1 ：本发明所述的人IgG1的Fc的核苷酸序列如下：

GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT

GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC

ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG

AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG

GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC

CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG

GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA

ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG

CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG

GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG

CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC

TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG

GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC

ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

序列表2：本发明所述的人IgG1的Fc的氨基酸序列如下：

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV

VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL

TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK

序列表3：本发明所述的ICOS多肽的第21～140位的核苷酸序列如下：

GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT

GTA CAA ATT TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA TTT AAA ATG CAG

TTG CTG AAA GGG GGG CAA ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA AGT

GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC

AAC AAC AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC CAT TCT CAT GCC AAC TAT

TAC TTC TGC AAC CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA GTA ACT CTT ACA

GGA GGA TAT TTG CAT ATT TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG

序列表4：本发明所述的ICOS多肽的第21～140位的氨基酸序列如下：

EINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQTLCD

LTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFC

NLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLK

序列表5：本发明所述的重组融合蛋白中的一种：hICOS-IgG1的核苷酸序列如下：

GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT

GTA CAA ATT TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA TTT AAA ATG CAG

TTG CTG AAA GGG GGG CAA ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA AGT

GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC

AAC AAC AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC CAT TCT CAT GCC AAC TAT

TAC TTC TGC AAC CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA GTA ACT CTT ACA

GGA GGA TAT TTG CAT ATT TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG GAG

CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA

CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC

CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC

CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG

CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT

GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG

TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC

ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC

CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC

AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG

CCG GAG AAC A AC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC

TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG

AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC  CAC TAC ACG

CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

序列表6：本发明所述的重组融合蛋白中的一种：hICOS-IgG1的氨基酸序列如下：

EINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQTLCD

LTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFC

NLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKEPKSCDKTHTCPPCP

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK

CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (1)

1.一种重组融合蛋白在制备治疗、诊断、检测或研究过敏性哮喘疾病及其相关病症产品中的应用，

所述的该重组融合蛋白是功能分子与可诱导共刺激分子进行融合形成的重组蛋白；

所述的功能分子是不结合ICOS的配体且不干扰ICOS与其靶分子结合的一种多肽或蛋白，所述的多肽或蛋白是Fc蛋白中的IgG恒定区；

所述的可诱导共刺激分子的序列是人ICOS的N端第21～140位的氨基酸片段。

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