CN100415105C - 用具有细菌源的酶生产发酵乳制品的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产发酵乳产品的新方法，通过具有细菌源的奶凝固酶水解奶的至少一种酪蛋白即至少一种κ酪蛋白，然后在发酵之后搅拌产物。本发明方法尤其适合生产发酵乳产品，如酸奶和发酵型奶，其中，所述产品具有改良的质地，尤其是改良的粘度，且不会引起脱水收缩或产生坏味道。

Description

用具有细菌源的酶生产发酵乳制品的新方法
本专利申请涉及使用具有细菌源的酶，尤其是来自迄今为止认为是牛奶污染物的细菌的酶生产发酵乳制品的新方法，也涉及由此制得的新乳制品。这种新方法更特别适用于生产酸奶和发酵乳。
本发明的方法的确具有在不引起脱水收缩(乳清渗出)现象的情况下，改进这些乳制品的质地，特别是增强粘度的优点，对于酸奶或发酵乳类型的乳制品，脱水收缩的现象是不能接受的。本发明人进行的感官分析也没有发现在本发明生产的酸奶和发酵乳中有坏味道。依照本发明得到的这个不寻常的制品，是通过使至少一种牛乳酪蛋白，即至少κ酪蛋白发生蛋白质水解，并在发酵后对产品进行搅拌而得到的。更具体的是，在本发明中，通过细菌源的κ酪蛋白水解酶，尤其是来自至今仍认为是牛奶污染物的细菌(如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌)的κ酪蛋白水解酶(优选来自这种细菌的抗热性酶)来进行这种酪蛋白水解。
在本申请中，术语“嗜冷菌”或者更一般地说“嗜冷微生物”是指能在7℃或以下生长的微生物，与其最佳生长温度无关。这一定义是国际乳品联合会(International Dairy Federation，IDF)的定义。
在本申请中，术语“抗热性酶”是指κ酪蛋白水解活性保持不变的酶，它在巴氏杀菌的热处理(95℃下至少5分钟)之后仍可检测到。
为了改进酸奶或发酵乳类型的发酵乳制品的质地，目前采用以下的步骤：对奶基质进行浓缩，或加入从奶中得到的制品，以及特别是加入例如酪蛋白酸盐、乳清蛋白质等蛋白质，或加入例如淀粉、果胶或明胶等组织改良剂(增稠剂、胶凝剂)。
在先有技术中，在酸奶和发酵乳类型的发酵乳制品的生产期间通常不希望出现酪蛋白，特别是κ酪蛋白的蛋白质水解。实际上，由于酪蛋白水解酶具有引起大量的脱水收缩现象的凝结作用，已知酪蛋白水解酶例如在凝乳酶中含有的酪蛋白水解酶，用于生产干酪和新鲜干酪。然而，尽管人们在寻找乳清形成方法，并且乳清的形成对生产干酪和新鲜干酪(回收凝乳)是必需的。另一方面，人们不希望在生产酸奶和发酵乳期间形成乳清，因为这会导致这种类型的乳制品的质地不合格(粒状结构，有大量的乳清渗出)。因此，迄今为止，在酸奶和发酵乳的生产期间不使用酪蛋白水解酶，甚至注意避免在奶基质中出现或产生这种酶。
而且，污染微生物如嗜冷菌和乳酸菌的产生并不是乳制品，尤其是酸奶和发酵乳生产过程中寻求的现象。
乳酸菌(即所有能由糖，尤其是乳糖产生乳酸的细菌)是普遍存在的细菌，在收集牛奶时会污染牛奶，若它们繁殖的话会导致牛奶凝结。因此，多年来，为了避免牛奶在成为食品级乳制品前凝结，已经建立了在收集时立即冷藏牛奶(在农场中通常储存在4℃)并在其送达工厂时立即进行预巴氏杀菌处理的体系。
嗜冷菌也是普遍存在的细菌。它们尤其是在***的表面找到，占总菌群的95％(其中3％为假单胞菌)。当牛奶和这种菌源接触时会导致牛奶被嗜冷菌污染。因此，当进行自动化挤奶时，最常出现的是牛奶污染的临界期。现在，在冷藏储存以避免乳酸菌产生的过程中，嗜冷菌部分处在有利于它们产生的条件下。例如，对假单胞菌而言(4℃的牛奶中)，其产生时间为6-8小时。在其生长期间，这些细菌合成抗热脂肪酶和蛋白酶，已知它们会导致牛奶和乳制品发生变化。因此，认为这些微生物是牛奶中常见的微生物污染，需避免这种污染。
因此，Gassem和Franck 1991(“用蛋白酶处理由牛奶制成的酸奶的物理性质”，J.Dairy Sci.74：1503-1511)描述了在来自嗜冷菌的部分纯化蛋白酶(剂量为200mg/l)存在下进行的试验，并报道了所产生的酸奶具有表观粘度和坚硬度均大于对照酸奶的表观粘度和坚硬度，但是它们呈现了较大的脱水收缩性。作者总结得出，在生产酸奶过程中应尽可能地限制蛋白酶活性。
Cousin和Marth 1977(“Cottage Cheese and Yoghurt Mannfactured from MilksPrecultured with Psychotrophic Bacteria”，Cultured Dairy Products Journal，1977年5月，15-18页和30页)描述了在牛奶中接种嗜冷菌的试验(假单孢菌或黄杆菌属的嗜冷菌的1％培养液接种在21℃的脱脂乳中24小时)。这时，当牛奶储存在4℃时，凝乳的张力增大，这不取决于它们是否接种了嗜冷菌。此外，感官分析显示用接种牛奶制得的酸奶更酸和更苦。因此，作者总结得出，为了生产发酵乳制品，推荐避免在鲜牛奶中产生嗜冷菌。
因此，在先有技术中认为奶的蛋白质水解作用是技术问题的根源，并且是奶和乳制品中的缺陷，例如在酸奶的生产过程中伴随着脱水收缩作用形成易碎的凝乳(Tamine和Robinson于1985年著“酸奶-科学和技术”，Woodhead Publishing Ltd于1999年出版，与第17页比较)，以及在UHT热处理期间使奶形成凝胶(Stephaniak和Sorhaug于1995年发表的文章“奶中细菌酶的热变性”，国际乳品联合会公报“奶中热引起的变化”1，第349-363页)。
通过完全反对先有技术中的技术偏见，发明者们为了生产酸奶和发酵乳类型的发酵乳制品，不仅提出了使奶中天然存在的这些酪蛋白中的至少一种，即至少使κ酪蛋白发生蛋白质水解，并在发酵之后对得到的产品进行搅拌，而且还通过细菌源的κ酪蛋白水解酶，尤其是来自至今仍认为是污染牛奶的细菌(如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌)的κ酪蛋白水解酶来进行酪蛋白水解。本发明人已证实，使用κ酪蛋白水解酶生产发酵乳和酸奶实际上是有利的，较好是使用细菌源的κ酪蛋白水解酶，且所述“污染牛奶”的细菌如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌构成了其有利的来源。在本发明优选实施方式中，使用细菌源的抗热性κ酪蛋白水解酶(即在经受巴氏杀菌热处理(95℃下至少5分钟)之后仍可检测到κ酪蛋白水解活性的酶)。
本发明者证实了这些方法能令人惊奇地和出乎意外地改进酸奶和发酵乳的质地，特别是改进酸奶和发酵乳的粘度，而不会引起在这类制品中不能接受的脱水收缩现象(没有渗出或沉积)。本发明人进行的感官分析也没有发现在本发明生产的酸奶和发酵乳中有坏味道。
因此，本专利申请涉及生产发酵乳制品，特别是酸奶和发酵乳的新方法，该方法的特点在于它包括以下步骤：
-对蛋白质含量不等于零，但小于或等于6％的牛奶基质进行乳酸发酵，并进行κ酪蛋白水解，以便在乳酸发酵的末期获得等于或大于20％的κ酪蛋白水解程度，κ酪蛋白的水解程度等于或大于30％较好，等于或大于40％更好，等于或大于50％最好，并且
-在乳酸发酵和κ酪蛋白水解处理之后，对上述基质进行搅拌。
在本申请中，术语“酸奶”和“发酵乳”具有它们惯用的含义。更具体地，这些名称与法国在1988年12月30日的88-1203号法令(在1988年12月31日的法兰西共和国官方刊物中公布)中定义的那些名称相符合。此法令的正文复制在下文中实施例之后，说明书的末尾。
为了获得在上述法国法令中定义的“酸奶或发酵乳”，即在本专利申请中所指的“酸奶或发酵乳”，尤其要提到的是不应该除去乳清，并且必须进行至少相当于巴氏灭菌法的热处理。标准的巴氏灭菌法处理是例如在92-95℃处理5-10分钟。由于采用至少相当于标准巴氏灭菌法的热处理，奶基质中的乳清蛋白质完全变性(约使25-99％的乳清蛋白质变性)。
术语“κ酪蛋白水解”或“κ酪蛋白水解处理”在这里指κ酪蛋白的蛋白质水解作用。类似地，术语“κ酪蛋白水解酶”是指能够使κ酪蛋白发生水解的酶。
有利的是，上述κ酪蛋白水解至少部分地与上述乳酸发酵相伴发生。如下文更详细的说明所示，在所述热处理之后(例如，在乳酸发酵的开始或在乳酸发酵期间)，或选择在所述热处理之前或开始时，加入或补充所述κ酪蛋白水解酶，但在后者的情况下，应该注意不要在该热处理期间引起沉淀。
因为奶天然含有κ酪蛋白，并且天然的蛋白质含量不等于零，所以任何类型的奶基质一开始都适合用于实施本发明。尽管如此，依据要生产酸奶和发酵乳的目的，当然需要选择蛋白质含量(在发酵之前)小于或等于6％的奶基质。选用的奶基质的蛋白质含量优选3-5％之间(包括极限)，更优选3.4-5％之间，最优选3.6-4.8％之间。测定奶基质中蛋白质含量的常规方法包含测定总氮含量，并减去采用在C.Alais于1984年出版(出版商SEPAIC)的《乳科学：乳品技术的原理》“Sciencedu lait-Principes des techniques laitières”第四版中第195-196页所述的凯氏定氮法测量的非蛋白质氮含量。
术语“奶基质”在这里指用于生产酸奶和发酵乳类型的发酵乳制品的其惯用的含义，也就是指其组成适用于进行乳酸发酵的任何类型的基质，其中所述的乳酸发酵是为了生产适合于人消耗的酸奶和发酵乳。通常，实际中使用的奶基质就是任选地采用巴氏灭菌和/或脱脂而收集的奶(例如牛奶、绵羊奶和山羊奶)。更为普遍的，特别是在工业中，是通过加入来源于奶的产品，例如脱脂奶粉、和/或乳制品蛋白粉(酪蛋白酸盐或WPC)、和/或脂肪(例如奶油)使奶的组成“标准化”。因此，本发明所指的奶基质实际上最通常地具有符合收集到的牛奶的组成，或具有符合标准化的奶的组成，并且该奶基质可以预先巴氏灭菌(在75℃保持10-30秒)和/或脱脂。
本发明的新方法可以进行任何乳酸发酵。乳酸发酵法的步骤可以常规地用示意图表述如下：
-收集之后，通常将奶在75℃预巴氏灭菌10-30秒，脱脂，并用冷藏的方式储存直到使用时，
-通过采用该领域熟练技术人员已知的方法，具体是通过添加脱脂奶粉、乳制品蛋白粉(酪蛋白酸盐或WPC)和任选地加入脂肪(例如奶油)，以获得所需的组成，从而使脱脂乳中蛋白质标准化。
-在粉末的再水合边搅拌30分钟至1小时之后，对由此得到的奶混合物在92-95℃进行5-10分钟的巴氏杀菌热处理，然后对该牛奶混合物在称为“下行相”压力下进行均质化，或者可以在热处理之前进行均质化，即称为“上行相”，
-然后将奶混合物冷却至比发酵温度高1℃或2℃温度，并用乳酸菌接种；依照传统方法进行发酵，pH值为4-5之间，优选pH值为4.5-4.7之间时停止发酵。当奶混合物用由保加利亚乳酸酐菌菌株和嗜热性链球菌菌株组成的酶接种时，产物是酸奶。除了前述菌株外，当向该奶混合物中接种其他种类的乳酸菌，特别是双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌或瑞士乳杆菌时，最终的产物是发酵乳。
κ酪蛋白水解应以控制方式进行，即主要蛋白质水解反应应不在于将酪蛋白水解成其不同组成的氨基酸，而应该将酪蛋白水解成肽、多肽或蛋白质大小的片段。这当然不排除那些一旦通过控制的κ酪蛋白水解作用产生，然后能够在该过程期间进一步修饰和/或水解的片段。然而，最初依照本发明进行的酪蛋白水解导致释放至少一个肽、多肽或蛋白质片段，而不是一组各种氨基酸。为此，将依照本发明使用κ酪蛋白水解剂，该κ酪蛋白水解剂具有凝结奶的特性，即具有使胶束去稳定的性质，因此引起奶的凝结。词句“奶的凝结”这里指絮凝或沉淀。测定一种试剂是否具有凝结奶的性质的常规方法是Berridge试验(国际乳品联合金标准176：1996，41，square Vergote，B-1040，布鲁塞尔)，或修改的Berridge试验(不向待测的奶中加入CaCl2)。
作为说明，这种试剂通常从κ酪蛋白上释放至少一个片段，该片段的尺寸小于或等于10kDa，优选小于或等于8kDa。
为了在食物介质中进行κ酪蛋白水解，有利地使用κ酪蛋白水解酶。为了进行如上文所述的受控的κ酪蛋白水解，最好选择具有凝结奶的性质的κ酪蛋白水解酶(凝结κ酪蛋白水解酶)。
在本发明中，可以选择至少一种细菌源的凝结κ酪蛋白水解酶。对生产这种酶有利的细菌尤其包括迄今为止认为是牛奶污染物且其产生和代谢受限制的细菌。
这种细菌尤其包括污染奶的蛋白水解嗜冷菌，在Robin C.MC Kelar，1989《粗食物中嗜冷生物的酶》(Enzymes of Psychrotrophs in raw food)，出版商CRC Press中可以找到许多实施例：所有嗜冷菌的蛋白酶(已经标注日期)是凝结κ酪蛋白水解酶，因此适合进行本发明。在静止期开始时，所述蛋白水解嗜冷菌通常在指数生长的末期产生这些酶。通过这些细菌实施例，尤其要注意如下几点：
-需氧/微需氧的革兰氏阴性细菌，如假单孢菌科的那些(例如，假单胞菌属，如绿针假单孢菌(例如ATCC 13985)、荧光假单孢菌、莓实假单胞菌(例如，ATCC 4973))，如醋杆菌属、黄杆菌属、噬纤维菌属、产碱菌属和无色杆菌属的那些；
-兼性厌氧革兰氏阴性细菌，如肠杆菌科(例如，肠杆菌属和沙雷氏菌属)以及气单胞菌属；
-非形成孢子的***(例如，链球菌属、乳杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属、微杆菌属)；
-内生形成孢子的***(杆菌属、梭菌属)。
在蛋白水解乳酸菌如链球菌或乳杆菌属中，实际上找到的是产生凝结κ酪蛋白水解酶的细菌。
在本申请中，术语“蛋白水解细菌”应理解为在牛奶中产生时会水解蛋白质，尤其是酪蛋白的细菌，在此牛奶中，它释放肽(和对照牛奶相比较)。
本领域的那些技术人员可以逐个核实指定的菌株是否产生了凝结κ酪蛋白水解酶。将候选菌株置于包含κ酪蛋白的底物上，然后核实这种酪蛋白是否水解，由这种菌株(从生物量或从这种菌株的培养物提取)产生的酶是否确实具有凝结牛奶的性质(上述Berridge试验)。
如上所述，较好的是选择切割至少一个κ酪蛋白及最普通的其它酪蛋白的细菌源的凝结κ酪蛋白水解酶。
甚至更好的是选择抗热性(即在95℃经受至少5分钟之后还具有可检测的κ酪蛋白水解活性)的细菌源的凝结κ酪蛋白水解酶。
本发明中，以纯或部分纯的形式、或者生物提取物的形式或者包含这种酶的微生物培养液的提取物(如微生物培养基的蛋白质提取物)的形式提供所述κ酪蛋白水解酶。所述κ酪蛋白水解酶也可以以酶源的形式提供，如产生这种酶的微生物，它可以直接加入奶基质中，并置于有利于其代谢的条件下，使这种微生物合成所述凝结κ酪蛋白水解酶。
细菌源的凝结κ酪蛋白水解酶可以是市售的，例如，酶EC 3.4.24.33(RocheDiagnostics GmbH销售，参考号内切蛋白酶Asp-N“测序级”目录号：1054589)，酶EC3.4.21.62(carlsberg，由Sigma销售，名称：枯草杆菌蛋白酶；参考号：P5380)。
或者，可以从细菌培养基中按照Robert K.Scopes所述的方法(Robert K.Scopes，1987，Springer-Verlag出版，《蛋白质纯化、原理和实践》(Proteinpurification.Principles and Practice)第二版)纯化所述凝结κ酪蛋白水解酶。也可以选择不完全地纯化所述酶，并使用细菌的生物提取物或者细菌培养基的蛋白质提取物。
也可以选择为奶基质提供产生酶的细菌本身。
当然，也可以选择遗传转化宿主细胞，例如，细菌如大肠杆菌，或酵母如酿酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母，使它们产生(较好是超产)这种酶(见《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，J.Wiley and Sons，1994，Frederick M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，Kevin Struhl编)。然后可以选择将这些克隆的生物提取物或其培养基的蛋白质提取物加入奶基质中；或者预先纯化所述克隆的蛋白质，以纯形式将它们加入奶基质中。
所述κ酪蛋白水解步骤不一定是和乳酸发酵不同的步骤：所述κ酪蛋白水解步骤也可以通过乳酸发酵来产生。或者，除了加入合适的酶或合适的酶源以外，实际上可以选择使用乳酸菌进行κ酪蛋白水解，所述乳酸菌产生(自然地或遗传转化之后)这种酶，同时发挥其乳酸发酵的功能。
较好的是，选择加入抗热性酶或者抗热性酶源(它可以在进行95℃至少5分钟之后仍保持κ酪蛋白水解活性)，如莓实假单胞菌ATCC 4973的蛋白酶。
κ酪蛋白水解酶加入形式以及加入奶基质时机的选择取决于这种基质的温度和pH条件。事实上，可以选择在收集牛奶和乳酸发酵结束之间的生产工艺的任何时刻加入酶或触发其产生，例如在撇去泡沫和预巴氏杀菌步骤(通常对收集的牛奶进行的)之后、在冷藏步骤期间、在牛奶标准化期间或者在巴氏杀菌之后，例如在冷却、乳酸酶的接种期间或乳酸发酵期间。因此，必需选择在工艺过程中所述基质的pH范围和温度范围内有活性的酶。为了使产率更好，本领域技术人员较好选择与酶的最佳活性的pH和温度值相符合的pH和温度值。
在本发明中，所述酶选自具有凝结奶特性的细菌源κ酪蛋白水解酶，是由选自蛋白水解乳酸菌和蛋白水解嗜冷菌的细菌产生的；在冷藏储存奶之前或期间，以产生这种酶的细菌形式在奶基质中加入所述酶。
在本发明另一实施方式中，所述酶选自具有凝结奶特性的细菌源κ酪蛋白水解酶，是由选自蛋白水解乳酸菌和蛋白水解嗜冷菌的细菌产生的；在牛奶标准化步骤时以纯酶或者生物提取物或者微生物培养基的蛋白质提取物的形式在奶基质中加入所述酶。
附图1图解性地显示了生产发酵乳和酸奶的方法，并举例说明了本发明中选自加入蛋白酶和/或蛋白水解微生物期间的一些步骤。当使用抗热性的酶时，可以在巴氏杀菌之前加入，例如在称为牛奶标准化的步骤中(附图1中的“工艺1”)或者在冷藏环境中牛奶储存过程中(附图1中的“工艺3”)。
当所述酶以能产生酶的微生物的形式提供时，当然较好是在有利于其代谢，尤其有利于产生蛋白酶的条件(具体是温度和pH条件)下加入牛奶之前或期间加入这些微生物。
所加入或产生(适当时候)合适量的酶部分取决于酪蛋白含量，尤其取决于基质的κ酪蛋白含量，也取决于在所选pH和温度时酶的活性。
在本发明中，必需获得κ酪蛋白水解度至少为20％。这种20％值是最小阈值，但是优选较高的值(高达100％)。然而应注意到，当在巴氏杀菌之前进行κ酪蛋白水解时，较好在巴氏杀菌前将κ酪蛋白水解度限制在小于或等于70％，以避免巴氏杀菌过程中的沉淀现象。
使用细菌源的κ酪蛋白水解酶时，本发明人注意到除了预期的κ酪蛋白水解以外，还存在其它酪蛋白的蛋白水解，尤其β-和α-酪蛋白的蛋白水解。因此，将细菌源的κ酪蛋白水解酶加入奶基质中会κ酪蛋白水解，它通常伴随着β-和/或α-酪蛋白水解。在这些情况下，在巴氏杀期间为了避免沉淀现象，所述酶加入牛奶底物时较好在巴氏杀菌前将伴随的酪蛋白水解(α-和/或β-酪蛋白水解)限制在小于或等于70％。
为了测定奶基质中的κ酪蛋白水解度，本领域熟练技术人员掌握了可用的标准技术，例如Recio等1997年提出的电泳法(“电泳在研究酪蛋白的蛋白质水解中的应用”，J.Dairy Res.64：221-230)。这样，通过测量与酶处理之后观察到的κ酪蛋白峰的表面积相比较在酶处理之前观察到的κ酪蛋白峰的表面积的减少量，可计算出κ酪蛋白的水解度。应注意的是，在依据本发明所进行的方法的末期，这种电泳方法通常不会观察到κ酪蛋白水解所产生的全部κ酪蛋白片段(这些片段可能用作乳酸菌生长的酶)。因此，建议监测κ酪蛋白峰的减小，而不是监测κ酪蛋白水解片段的峰的出现。
本领域技术人员能根据各具体情况所需进行调整，以获得所需的酪蛋白水解度。
当它是在巴氏杀菌前加入奶中的分泌蛋白质水解的嗜冷菌时，可以例如往其中加入104-106细菌/ml，并将由此接种的奶保存在有利于这些微生物代谢的条件下(约4-15℃的温度)足够长时间使κ酪蛋白水解酶释放到此奶中，这通常发生在细菌群为106-1010细菌/ml之间，较好为107-109细菌/ml之间。
除了κ酪蛋白水解之外，依照本发明的方法还包括对发酵产品进行搅拌。可以依照常规技术进行这种搅拌，例如采用通过过滤器的方式光滑化(由A.Y.Tamine和R.K.Robinson著的“酸奶的科学与技术”，出版商Woodhead Publishing Ltd.1999)。
依照本发明的方法的优点是：与用κ酪蛋白的水解度不至少为20％和/或不需要搅拌的类似方法产生的酸奶和发酵乳相比，它能使产生的酸奶和发酵乳类型的发酵乳制品具有改良的质地。它特别可生产与对照的酸奶和发酵乳相比，表观粘度(在64s-1、10s和10℃的条件下，用同轴圆筒式粘度计进行测量)增加20％到70％的酸奶和发酵乳。
因此，该方法会限制、甚至避免加入组织改良剂(例如明胶、淀粉或果胶)，组织改良目前是用来使发酵乳和酸奶类型的制品具有适宜的质地。该方法也会限制蛋白质在使用的奶基质中的含量：奶基质具有较低浓度的蛋白质，同时保持令人满意的表观粘度效果。例如，发明者已经能够证明，为了获得表观粘度值(通过将本发明的方法应用在含有4.1％的蛋白质的奶混合物中获得)，在不进行κ酪蛋白水解处理的情况下，需要将奶基质中的蛋白质含量增加到4.6％。使用本发明的方法，在质地方面获得同等结果的条件下，可使酸奶和发酵乳类型的乳制品的生产需要较少量的组织改良剂和蛋白质。
在一特别显著的方式中，依照本发明的方法不会引起脱水收缩现象，而脱水收缩现象对于发酵乳或酸奶类型的制品是不可接受的。这样，发明者就能观察到不会出现任何的沉积或渗出现象，即使在10℃储存28天之后。该制得的产品也具有并保持完全光滑和均匀的质地，且没有坏味道。
本申请也涉及采用本发明的方法获得发酵乳和酸奶。具体地，采用本发明的方法获得的发酵乳和酸奶的特点在于，其κ酪蛋白的含量显著小于在先有技术的类似产品中通常观测到的κ酪蛋白含量。当发酵乳和酸乳酪的成品是由经过至少等同于标准巴氏灭菌的热处理(例如在92-95℃加热5-10分钟)的奶或奶基质制得的，那么该成品的乳清蛋白会完全变性(约有25-99％的乳清蛋白变性)。更具体地，本发明的酸奶和发酵乳的特征在于，其κ酪蛋白水解度至少为20％，其水解度至少为30％较佳，至少为40％更佳，至少为50％最佳。依照Recio等1997年提出的方法(“电泳在研究酪蛋白的蛋白质水解中的应用”，J.Dairy Res.64：221-230)，采用毛细管电泳能够测定上述κ酪蛋白水解的百分率。该方法的测定原理是，在本发明方法生产的酸奶和发酵乳的过程中，κ酪蛋白峰的表面积减小，并以标准峰(例如，在该方法的过程中，含量不发生明显变化的一种参考化合物的峰)为基准。例如，β-乳球蛋白峰可以用作标准峰。因此，以下计算可以评估本发明方法制备的发酵乳的κ酪蛋白水解度：
κ酪蛋白水解度(％)＝1-((ake*aβlgc/aβlge)/akc)*100
其中：ake＝酸奶样品的κ酪蛋白峰的面积
akc＝对照奶的κ酪蛋白峰的面积
aβlge＝酸奶样品的参考化合物的峰(β-乳球蛋白峰)的面积
aβlgc＝对照奶的参考化合物(β-乳球蛋白S1峰)的面积
术语“对照奶”是指已经过脱脂和巴氏灭菌(在92-95℃加热10分钟)的整体混合的奶。
这种酸奶或发酵乳也通常包含已经用于κ酪蛋白水解的细菌源的κ酪蛋白水解酶。
或者，如果在酸奶或发酵乳中检测到明显存在的κ酪蛋白水解酶，那就可以由此推测出这种酸奶或发酵乳是遵照本发明制得的。明显存在的这种酶可以通过C.E.Fajardo-Lira和S.S.Nielsen，1998(“嗜冷微生物对奶中纤溶酶***的影响”，J.Dairy Sci..81：901-908)所述的酪蛋白SDS-Page型(直接施加到除纤溶酶以外的蛋白酶上)的酶谱进行确定。为了识别任何并非源自乳酸酶的蛋白酶，不得不将这种酶谱和所述产品的乳酸酶在新鲜牛奶培养物的样品进行比较。
本领域技术人员会发现，在由A.Y.Tamine和R.K.Robinson著的第二版《酸奶一科学与技术》(Yoghurt-Science and Technology)Woodhead Publishing Ltd)中的内容作为参考已纳入本申请中。这本书为实施本发明的实施方式提供了重要的技术信息。
以下实施例纯粹是用于说明的目的。
实施例1
对从生产者直接收集得到的整体混合的奶预先巴氏灭菌和脱脂，然后接种各剂量的蛋白水解提取物。这种蛋白水解提取物通过沉淀来自绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)ATCC 13985的培养基中的蛋白质获得。所述蛋白水解活性为200单位/ml。这种活性通过偶氮酪蛋白(azocasein)试验来得(Kohlmann，K.L.，Nielesen，S.S.，Steenson.L.R.和Ladisch，M.R.1991，“由嗜冷微生物生产蛋白酶”，J.Dairy Sci.74：3275-3283)。1单位代表每小时接种在366nm处吸光度增加0.01。
这些接种的奶可以在4℃下储存几小时，在所述条件下，都不会超过酪蛋白水解极限、热处理的临界点(对κ酪蛋白的最大极限为70％，对β酪蛋白的极限为50％)。
制备具有这些接种奶的搅拌酸奶以及没有接种的相同奶。对于各试验来说，根据蛋白质和脂肪，借助脱脂奶粉和奶油使奶标准化，以制得包含4.5％蛋白质和3.2％脂肪的奶基质。然后通过测量蛋白质含量和脂肪含量来控制这种奶基质的组成(Determination de la teneur en matieres grasses：methode d′extractionethero-chlorhydrique[脂肪含量的测定：乙氢氯酸提取的方法]NF V04215-OfficialJournal of Sept.1969)。
将由此制得的奶基质进行巴氏杀菌(95℃-8分钟)，然后进行均质化(250巴，2次)。在冷却到44℃之后，用乳酸酶接种奶基质，然后在43℃发酵。在四次试验中，在4小时30分钟(±15分钟)之后达到“脱乳凝结”pH(4.65)。然后，使所述产品光滑，并在包括进料泵、过滤器(350微米目)和平板冷却器的平台上冷却到20℃。然后包装在125ml罐中。
在冷藏储存过程中，对4个产品进行粘度和渗出测量。结果归纳在下表1中。给出具有相应标准偏差的4次测量的平均值。
表1：在冷藏储存过程中对不同试验对应的酸奶进行粘度和渗出测量
  蛋白水解提取物的剂量(ml/1L)   储存时间(小时)   粘度D+1(mPa.s)   粘度D+14(mPa.s)   粘度D+28(mPa.s)   渗出物(g乳清)/100g产品
  0   0   1125±17   1160±33   1173±23   0
  10   20   1285±12   1297±9   1268±11   0
  10   0   1248±5   1237±6   1270±10   0
  20   0   1430±14   1393±23   1430±17   0
这些结果证实，粘度随着牛奶中加入蛋白水解提取物的剂量显著增大。在加入酶提取物剂量之后短时间冷藏储存的奶似乎不会显著影响产品。所述产品没有出现沉积和渗出。
实施例2
将整体混合的奶预先巴氏杀菌和脱脂，然后用Pseudomonas fragi ATCC 4973接种，然后储存在4℃7天。在储存7天后，所述奶(用2×104细菌/ml接种)具有6×109嗜冷菌/ml的细菌负载。通过毛细管电泳测量这些奶的β-和κ-酪蛋白水解的形成。κ-酪蛋白峰的表面积降低25％，β-酪蛋白峰的表面积总数降低35％。β-酪蛋白的蛋白水解部分可能是由于纤溶酶所造成的。
按照实施例1所述的相同方法，由储存7天的这种接种奶、储存7天的未接种奶以及接种但未储存的对照奶制备搅拌的酸奶(Veloute型)。对于由所述对照奶制备的产品，在43℃接种5小时之后达到“脱乳凝结”pH(pH4.7)；对于由蛋白水解奶制备的产品，在4小时30分钟之后达到“脱乳凝结”pH(pH4.7)。
在表2中列出了四次粘度测量的平均值，均具有相应标准偏差，并进行沉积和渗出测量。
表2：在冷藏储存过程中对在4℃用莓实假单胞菌接种0和7天的产品进行粘度和渗出测量
  储存时间(天)   粘度D+1(mPa.s)   粘度D+14(mPa.s)   粘度D+28(mPa.s)   渗出物(g乳清)/100g产品
  0   1100±20   1088±25   1073±26   0±0
  7未接种   1124±20   1033±22   1104±24   0±0
  7   1510±22   1498±22   1600±22   0±0
这些结果证实，粘度显著增大(40％数量级)与储存牛奶的物理化学效果无关。所述产品没有出现沉积和渗出。
实施例3
在此实施例中，所述预先巴氏杀菌和脱脂处理的整体混合奶不进行储存，并且没有加入蛋白水解嗜冷菌菌株。按照实施例1所述的相同方法制备所述搅拌的酸奶。在接种乳酸酶时，所述奶基质中加入少量来自嗜冷菌的蛋白酶(见下表3)。其它制备步骤没有变化。
从几种蛋白水解嗜冷菌(实施例1的ATCC 13985和实施例2的ATCC 4973)的培养液纯化所述蛋白酶。此实施例中所用的蛋白水解提取物是其蛋白水解活性为600单位/ml的蛋白酶混合物。这种活性通过偶氮酪蛋白试验获得(见实施例1)。
下表3中列出了对产品进行的粘度、沉积和渗出测量的平均值。
表3：在冷藏储存过程中对搅拌的酸奶进行粘度和渗出测量
  蛋白水解提取物(mL/1L)   粘度D+1(mPa.s)   粘度D+14(mPa.s)   粘度D+28(mPa.s)   渗出物(g牛奶浆液)/100g产品
  0   1078±10   1067±38   1095±40   0
  1   1388±15   1368±28   1395±62   0
  2.5   1568±26   1493±21   1525±24   0
  5.0   1598±7   1625±24   1560±18   0
在所有试验的蛋白水解提取物的剂量下均观察到粘度显著增大。
实施例4
用接种了莓实假单胞菌ATCc 4973的蛋白水解提取物的整体混合并预先巴氏杀菌和脱脂奶制备低脂搅拌的酸奶，并制备没有接种的相同奶。这种莓实假单胞菌的蛋白水解提取物以和实施例1中绿针假单胞菌提取物的相同方法获得，并具有400单位/ml的蛋白水解活性。
为了得到包含4.95蛋白质的奶基质，使用脱脂奶粉按照蛋白质将所述奶标准化。然后通过测量蛋白质含量来控制这种基质的组成(NF V04215，参见实施例1)。
将由此制备的基质进行巴氏杀菌(95℃，8分钟)，然后进行均质化(150巴，2次)。在冷却到42℃之后，用乳酸酶接种基质，然后在40℃发酵。在2次试验中，在5小时(±15分钟)之后达到“脱乳凝结”pH(4.70)。然后，使所述产品光滑，并在包括进料泵、过滤器(350微米目)和平板冷却器的平台上冷却到20℃。然后包装在125ml罐中。
在冷藏储存过程中对所述产品进行粘度和渗出测量。结果列于下表4中。列出了4次测量的具相应标准偏差的平均值。
表4：在冷藏储存过程中对不同试验对应的酸奶进行粘度和渗出测量
  蛋白水解提取物的剂量(ml/1L)   储存时间(小时)   粘度D+1(mPa.s)   粘度D+14(mPa.s)   粘度D+28(mPa.s)   渗出物(g乳清)/100g产品
  0   0   980±19   1040±23   1063±26   0.5
  30   0   1230±14   1285±20   1291±15   0
此实施例显示，对不含脂肪的产品，粘度显著增大。所述产品没有出现沉积，但在D+28时出现少量的渗出。
1988年12月30日的88-1203号法令
关于发酵乳和酸奶的法令
NOR：ECOC8800150D
在国务部长、经济事务、财政和预算部长、大法官、司法部长、农林业部长和联合、健康和社会福利部长、政府发言人的报告上，在1905年8月1日关于产品或服务的欺诈和歪曲事实方面的法律，特别是该项法律的第11条，与1919年1月22日制定的使用所述法律的修改法令方面；在1934年6月29日关于保护乳制品的法律方面；在1935年7月2日制定的组织和改善奶市场的法律方面；在1912年4月15日的使用上述1905年8月1日关于食品方面的法律的修改法令方面；在1924年3月25日的使用1905年8月1日有关奶和乳制品的法律的修改法令方面；在1984年12月7日的使用上述1905年8月1日有关食品的商标和说明的法律的第88-1147号法令方面，总理已经听取了政府(财政部)的意见。
第1条
名称“发酵乳”专用于用脱脂乳或未脱脂乳或炼乳或脱脂奶粉或未脱脂奶粉等富含或不富含奶成分的物质制备得的乳制品，该乳制品须经过至少等同于巴氏灭菌法的热处理，以及用属于各制品特性的物种的微生物接种。
应该由使用的微生物的活性来产生发酵乳的凝结，而不应该用其他方法获得发酵乳的凝结。
在销售时，乳制品中含有的游离乳酸的数量不应该小于0.6克/100克。相对于含奶部分所表示的蛋白质含量不应该小于正常奶中蛋白质含量。
截止销售给消费者之时为止，应将发酵乳放置在能够防止其变质的温度下保存，负责农业、健康和消费者事务的部长们将制定联合命令。
条款2
名称“酸奶”专用于依照合理和传统的惯例，通过只有特定的嗜热乳酸菌的生长而获得的发酵乳，上述特定的嗜热乳酸菌被称为保加利亚乳酐菌和嗜热链球菌，这两种菌必须同时接种，并在成品中有活性。相对于含奶部分所表示的上述特定的嗜热乳酸菌的比率为至少1千万个乳酸菌/克。
销售时，酸奶中游离乳酸的含量不应该小于0.7克/100克。
第3条
可以将以下制品补加到发酵乳中：香料提取物、天然食用香料和限度为成品的30重量％内的糖和其它赋予特殊香味的食品。
禁止加入非奶来源的脂肪和蛋白质作为替代品。
禁止对发酵乳进行除去所用奶中的组成成分，特别是凝块沥干的任何处理。
以在上述1912年4月15日法令的第一条中规定的形式发布的命令陈述了在本法令所述的制品的生产和制备过程中准许使用的其他物质和其它种类食用香料的清单和使用条件。
第4条
对1997年4月3日颁布的法令97-298 1997-03-27第2条的修正
除了在上述消费者法规的第R.112-6到R.112-31的条款中提供的信息外，发酵乳的贴标还包括：
-除商品名称外，只要发酵乳不是牛奶，要注明该奶来源的动物种类的信息；
-注释“在……下保存”注明要观测的温度的信息；
-如果以含奶部分计算制品中的脂肪含量小于1重量％，在商品名称后面要注明“低脂肪”；
-根据情况，如果要给发酵乳加糖或调味，要注明“加糖”或使用的调味物质的名称；
-在加入一种或多种在第3条中规定的成分情况下，必须在商品名称上加上这种或这些成分的注释。
如果以含奶部分计算脂肪含量至少等于3重量％，该发酵乳的贴标上可以在商品名称旁附加“脂肪”的注释。
第5条
如果制品含有的“酸奶”符合以上第2条中规定的定义，那么名称“酸奶”可以只出现在该食品的贴标上。
第6条
负责农业、健康和消费者事务的部长们的联合命令在适当时候规定在本法令中定义的制品保持其特性的时间。
第7条
对1997年4月3日JORF(法兰西共和国官方杂志)颁布的法令97-298 1997- 03-27第2条的修正
与采用消费者法规的第R.215-1至R.215-15条调查并可能确定欺诈罪的量度无关，负责农业、健康和消费者事务的部长们以联合命令的方式规定发酵乳的微生物特性和检查这些特性的方式。
第8条
[本条款正在修正]
第9条
国务部长、经济事务财政和预算部长、大法官、司法部长、农林业部长、联合、健康和社会福利部长、政府发言人，以及国务部分的国务秘书、负责消费者事务的经济事务、财政和预算部长各自都按照赋予他们的责任贯彻执行本法令。该法令将公布在法兰西共和国的官方杂志上。

Claims (20)

1. 一种生产选自发酵乳的乳制品的方法，该方法的特征在于：
-对蛋白质含量不等于零，但小于或等于6％的奶基质通过巴氏杀菌进行热处理，借助于选自具有凝结奶特性的细菌源κ酪蛋白水解酶的酶进行乳酸发酵和κ酪蛋白水解，所述细菌源κ酪蛋白水解酶是由选自蛋白水解乳酸菌和蛋白水解嗜冷菌的细菌产生的；以便在乳酸发酵的末期获得等于或大于20％的κ酪蛋白水解度，在收集奶和乳酸发酵的末期之间引发所述κ酪蛋白水解；条件是若在所述热处理之前引发κ酪蛋白水解，则须注意不要在该热处理期间产生沉淀，
并且：
-在乳酸发酵和κ酪蛋白水解处理之后，对所述基质搅拌。
2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳制品是酸奶。
3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，奶基质中的蛋白质含量在3-5％之间，3％和5％也包括在内。
4. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，κ酪蛋白水解度等于或大于30％。
5. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，κ酪蛋白水解度等于或大于40％。
6. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，κ酪蛋白水解度等于或大于50％。
7. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶以纯或部分纯的形式，或以生物提取物的形式，或以微生物培养基的蛋白质提取物的形式，或以产生这种酶的微生物的形式提供。
8. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶是由选自假单胞菌属的蛋白水解嗜冷菌产生的。
9. 权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶是由选自绿针假单胞菌、荧光假单胞菌和莓实假单胞菌的蛋白水解嗜冷菌产生的。
10. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶是由选自链球菌和乳杆菌属的蛋白水解乳酸菌产生的。
11. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶具有在95℃热处理至少5分钟之后仍旧保持可检测κ酪蛋白水解活性的性质。
12. 权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酶是在所述热处理前加入的。
13. 权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述热处理前，κ酪蛋白水解度小于70％，α-和β-酪蛋白的水解度各自小于或等于70％。
14. 权利要求11所述的方法，其特征在于，在冷藏储存奶之前或期间，以产生这种酶的细菌形式在奶基质中加入所述酶。
15. 权利要求11所述的方法，其特征在于，在牛奶标准化步骤时以纯酶或者生物提取物或者微生物培养基的蛋白质提取物的形式在奶基质中加入所述酶。
16. 一种酶的用途，该酶选自具有凝结奶特性的κ酪蛋白水解酶，所述酶是由选自蛋白水解乳酸菌和蛋白水解嗜冷菌的细菌产生的；通过巴氏灭菌进行热处理，通过乳酸发酵和通过κ酪蛋白水解，以生产选自发酵乳的搅拌乳制品，在收集奶和乳酸发酵的末期之间引发所述κ酪蛋白水解；条件是若在上述热处理之前引发κ酪蛋白水解，则须注意不要在该热处理期间产生沉淀。
17. 权利要求16所述的用途，它用于生产酸奶。
18. 一种搅拌的乳制品，其选自发酵乳，其特征在于，在乳酸发酵的末期，κ酪蛋白水解度等于或大于20％，它包含细菌源的κ酪蛋白水解酶。
19. 权利要求18所述的搅拌的乳制品，所述乳制品是酸奶。
20. 权利要求18-19任一项所述的搅拌的乳制品，它由权利要求1-2中任一项所述的方法制得。
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