CN109370985A - 一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，主要成分包括氨基酸，无机盐成分，生长因子及白蛋白成分。本发明的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。采用本发明的无血清培养基可体外大规模培养人脐带间充质干细胞，可获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。

Description

一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基
技术领域
本发明涉及一种人脐带间充质干细胞大规模培养的无血清培养基，属于细胞工程技术领域。
背景技术
间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源于中胚层，也称多能间充质基质细胞（multipotent mesenchymal stromal cells），为多能干细胞的一种，它最早发现于骨髓中，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能，具有低免疫原性、不刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤，以及免疫调节作用。MSCs在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型细胞。脐带间充质干细胞是一类存在于人脐带中，具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞群。它取材方便，来源广泛，其使用属“废物利用”，不受伦理、道德限制，可以为实验和临床提供充足的细胞来源，特别能为神经***疾病的治疗带来新的希望。已经证明其能被诱导分化为成骨细胞、胰岛分泌细胞和类肝细胞等,并在免疫抑制治疗方面具有积极的临床应用前景，然而其临床应用必须以在体外获得高数量和高纯度的脐带间充质干细胞为基础。
细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。同时，我国对血制品管理严格，成人AB血清不易获得且价格昂贵。动物血清如胎牛血清，对人类而言，存在异种蛋白抗原和携带在人类致病的未知病毒等危险，从而限制了脐带MSCs在临床的应用。
细胞的微载体培养（microcarrier culture）是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术，其培养体积从数毫升到6000升以上。应用微载体培养技术，在普通细胞悬浮培养***中，每毫升培养液可培养数百万细胞。
根据***的设计，培养液通常含有1-5克/升微载体，接种5×104－2×105细胞/毫升，按20－60rpm速度搅拌。灌注微载体培养液（Perfused microcarrier cultures）可含高达20g/升。在首次进行悬浮微载体培养时，可参考以下介绍的一种方法。培养液的体积和接种量的大小应根据培养量的不同做相应的调整。配制100毫升的培养液，应将0.3克的微载体溶于30ml培养基中，加入到旋转式容器。再接种107细胞于该培养液中，轻轻混匀，37℃孵育。一旦细胞牢固地粘附在微载体的表面，即开始连续搅动。细胞粘附所需要的时间主要取决于该类细胞的粘附效率（attachment efficiency）。如果细胞粘附的时间过长，需要间断性（每30分钟搅动2分钟）搅动培养液以保证细胞和微载体的均匀分布。然后，将培养液的容积增加到50毫升。搅拌的速度取决于培养容器，而且要足够快以防止微载体沉淀。1至2天后，培养液体积增加至100毫升，3至5天后，部分培养基需要更换,7天左右收获细胞。
现有技术中，尚未见到有关于人脐带间充质干细胞大规模培养用的无血清培养基的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞大规模培养用的无血清培养基，其不含动物源成分，可以完全实现无血清培养干细胞。采用本发明的无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺25～75；
L-天门冬氨酸10～30；
L-谷氨酸 10～30；
Ni（NO3）2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸 5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸 25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸20～60；
SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸10～30；
葡萄糖 1000～4000；
L-丝氨酸15～45；
维生素C 0.176～0.704；
L-苏氨酸10～30；
对羟基苯甲酸0.5～1.5；
L-色氨酸5～15；
丙酮酸钠 55～550；
L-缬氨酸10～30；
亚油酸 0.01～0.05；
L-亮氨酸 25～75；
β-巯基乙醇 0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；
乙醇胺 1～5；
L-胱氨酸二盐酸25～75；
*** 0.001～0.005；
人转铁蛋白 5～50；
人血清白蛋白 1000～5000；
纤粘连蛋白 0.5～5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；
重组人转化因子β 0.1～10；
重组人表皮生长因子0.1～10；
胰岛素：8～20；
胆固醇：20～60；
过氧化氢酶：20～50；
***钠：17.3～35.0；
1％（质量百分数）二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；
余量为水。
所述重组人成纤维细胞生长因子、重组人转化因子、重组人表皮生长因子均可市场购买得到，本发明所用为进口产品，均购自peprotech，商品名称为：EGF(重组人表皮生长因子)，商品号为AF-100-15-50；商品名称为TGF-b（重组人转化因子），货号：100-21-100；商品名为（FGF）成纤维细胞生长因子，商品货号：100-18B-50。
本发明的无血清培养基的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
本发明的人脐带间充质干细胞大规模培养用无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。
采用本发明的无血清培养基可用于大规模培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。
附图说明
图1：微载体培养装置。
图2：微载体培养细胞显微照片100×。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 制备人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 200；
CuSO4·5H2O 0.002；
L-天门冬酰胺50；
L-天门冬氨酸20；
L-谷氨酸 20；
Ni（NO3）2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺300；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸 10；
CoCl2·6H2O 0.005；
L-组氨酸20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸 50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸40；
SnCl2·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸20；
Na2SeO3 0.005；
L-苯丙氨酸20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸20；
葡萄糖 3000；
L-丝氨酸30；
维生素C 0.500；
L-苏氨酸20；
对羟基苯甲酸1.0；
L-色氨酸10；
丙酮酸钠 300；
L-缬氨酸20；
亚油酸 0.03；
L-亮氨酸 50；
β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；
乙醇胺 3；
L-胱氨酸二盐酸50；
*** 0.003；
人转铁蛋白 30；
人血清白蛋白 2500；
纤粘连蛋白 3；
重组人成纤维细胞生长因子 5；
重组人转化因子β 5；
重组人表皮生长因子5；
胰岛素：10；
胆固醇：40；
过氧化氢酶：30 ；
***钠：25.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.8ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实施例2 制备人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺75；
L-天门冬氨酸30；
L-谷氨酸 10；
Ni（NO3）2·6H2O 0.00002；
L-谷氨酰胺500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸 5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸 25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸60；
SnCl2·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸30；
FeSO4·7H2O 1.6；
L-脯氨酸10；
葡萄糖 1000；
L-丝氨酸45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；
L-色氨酸15；
丙酮酸钠 550；
L-缬氨酸10；
亚油酸 0.01；
L-亮氨酸 75；
β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；
乙醇胺 1；
L-胱氨酸二盐酸75；
*** 0.005；
人转铁蛋白 5；
人血清白蛋白 1000；
纤粘连蛋白 5；
重组人成纤维细胞生长因子 10；
重组人转化因子β 0.1；
重组人表皮生长因子0.1；
胰岛素： 20；
胆固醇：20 ；
过氧化氢酶：20；
***钠：35.0；
1％二巯基乙醇溶液：1.0ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实施例3 制备人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基
各原料浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 300；
CuSO4·5H2O 0.005；
L-天门冬酰胺25；
L-天门冬氨酸10；
L-谷氨酸 30；
Ni（NO3）2·6H2O 0.0002；
L-谷氨酰胺0；
ZnSO4·7H2O 0.06；
甘氨酸 15；
CoCl2·6H2O 0.008；
L-组氨酸10；
NaSiO3·9H2O 0.001；
L-异亮氨酸 75；
Na3VO4·12H2O 0.005；
L-赖氨酸盐酸20；
SnCl2·2H2O 0.00001；
L-蛋氨酸30；
Na2SeO3 0.01；
L-苯丙氨酸10；
FeSO4·7H2O 0.2；
L-脯氨酸30；
葡萄糖 4000；
L-丝氨酸15；
维生素C 0.176；
L-苏氨酸30；
对羟基苯甲酸1.5；
L-色氨酸5；
丙酮酸钠 55；
L-缬氨酸30；
亚油酸 0.05；
L-亮氨酸 25；
β-巯基乙醇 0.8；
二水L-酪氨酸二钠432；
乙醇胺 5；
L-胱氨酸二盐酸25；
*** 0.001；
人转铁蛋白 50；
人血清白蛋白 5000；
纤粘连蛋白 0.5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1；
重组人转化因子β10；
重组人表皮生长因子10；
胰岛素：8；
胆固醇： 60；
过氧化氢酶： 50；
***钠：17.3；
1％二巯基乙醇溶液：0.35ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实验
1、将实施例2制备的培养基置于T25细胞培养瓶中，将脐带间充质干细胞以1.0×104cells/cm2接种，在温度37℃下培养，统计原代细胞的爬出时间，每代的生长时间。
2、将实施例2制备的培养基置于微载体细胞培养转瓶中，将脐带间充质干细胞以2.0×105cells/mL接种，使用某品牌的磁力搅拌器,在温度37℃下培养，45 rpm速度搅拌。
同时，以lonza无血清培养基（市场购买得到）为对照培养脐带间充质干细胞。
结论：
原代细胞爬出时间：通常的细胞培养基进行脐带植块法爬细胞，8～10天可见细胞爬出，而本发明的无血清培养基，爬出细胞时间缩短至5～7天,提高了细胞分离效率。
细胞每代生长时间，经过连续10代监测，平均每代生长时间在2～3天，比lonza无血清培养基提高了一天，节约了培养时间，提高了工作效率。
连续传代次数：传统的MSC无血清培养基传代至6代以后，细胞生长变缓慢，本发明的培养基可连续传代至10代，细胞仍保持其分化潜能，而lonza培养基传代至第8代，细胞生长明显变缓，且会出现贴壁困难,细胞易发生脱落等,导致后期无法传代。
应用本发明能在体外应用生物反应器进行大规模人脐带间充质干细胞的培养,培养7天时间,细胞数量能扩增15-20倍,获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时提高细胞存活率,维持干细胞的特性,而lonza培养基培养7天,仅能扩增10倍, 使用本发明的无血清培养基相同时间可获得更多的细胞。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (5)

1.一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺25～75；
L-天门冬氨酸10～30；
L-谷氨酸 10～30；
Ni（NO3）2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸 5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸 25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸20～60；
SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸10～30；
葡萄糖 1000～4000；
L-丝氨酸15～45；
维生素C 0.176～0.704；
L-苏氨酸10～30；
对羟基苯甲酸0.5～1.5；
L-色氨酸5～15；
丙酮酸钠 55～550；
L-缬氨酸10～30；
亚油酸 0.01～0.05；
L-亮氨酸 25～75；
β-巯基乙醇 0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；
乙醇胺 1～5；
L-胱氨酸二盐酸25～75；
*** 0.001～0.005；
人转铁蛋白 5～50；
人血清白蛋白 1000～5000；
纤粘连蛋白 0.5～5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；
重组人转化因子β 0.1～10；
重组人表皮生长因子0.1～10；
胰岛素：8～20；
胆固醇：20～60；
过氧化氢酶：20～50；
***钠：17.3～35.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
L-精氨酸 200；
CuSO4·5H2O 0.002；
L-天门冬酰胺50；
L-天门冬氨酸20；
L-谷氨酸 20；
Ni（NO3）2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺300；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸 10；
CoCl2·6H2O 0.005；
L-组氨酸20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸 50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸40；
SnCl2·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸20；
Na2SeO3 0.005；
L-苯丙氨酸20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸20；
葡萄糖 3000；
L-丝氨酸30；
维生素C 0.500；
L-苏氨酸20；
对羟基苯甲酸1.0；
L-色氨酸10；
丙酮酸钠 300；
L-缬氨酸20；
亚油酸 0.03；
L-亮氨酸 50；
β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；
乙醇胺 3；
L-胱氨酸二盐酸50；
*** 0.003；
人转铁蛋白 30；
人血清白蛋白 2500；
纤粘连蛋白 3；
重组人成纤维细胞生长因子 5；
重组人转化因子β 5；
重组人表皮生长因子5；
胰岛素：10；
胆固醇：40；
过氧化氢酶：30 ；
***钠：25.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.8；
余量为水。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
L-精氨酸 100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺75；
L-天门冬氨酸30；
L-谷氨酸 10；
Ni（NO3）2·6H2O 0.00002；
L-谷氨酰胺500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸 5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸 25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸60；
SnCl2·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸30；
FeSO4·7H2O 1.6；
L-脯氨酸10；
葡萄糖 1000；
L-丝氨酸45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；
L-色氨酸15；
丙酮酸钠 550；
L-缬氨酸10；
亚油酸 0.01；
L-亮氨酸 75；
β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；
乙醇胺 1；
L-胱氨酸二盐酸75；
*** 0.005；
人转铁蛋白 5；
人血清白蛋白 1000；
纤粘连蛋白 5；
重组人成纤维细胞生长因子 10；
重组人转化因子β 0.1；
重组人表皮生长因子0.1；
胰岛素： 20；
胆固醇：20 ；
过氧化氢酶：20；
***钠：35.0；
1％二巯基乙醇溶液：1.0；
余量为水。
4.权利要求1～3中任一项所述的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1～3中任一项所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得。
5.权利要求1～3中任一项所述的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基在培养人脐带间充质干细胞中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111440764A (zh) * 2020-02-21 2020-07-24 广东国科细胞科技有限公司 间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法
CN112159795A (zh) * 2020-10-13 2021-01-01 肖利霞 一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法
WO2021120613A1 (zh) * 2019-12-16 2021-06-24 江苏艾洛特医药研究院有限公司 一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途
CN114480272A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 张国锋 一种用于脐带间充质干细胞培养的添加剂、培养基及其制备方法
WO2023065384A1 (zh) * 2021-10-22 2023-04-27 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种人间充质干细胞培养基

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886464A (zh) * 2016-06-07 2016-08-24 广东万海细胞生物科技有限公司 一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基
CN106635978A (zh) * 2016-12-21 2017-05-10 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN107043747A (zh) * 2017-06-23 2017-08-15 王晓柯 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基
CN108251359A (zh) * 2017-12-20 2018-07-06 上海华新生物高技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886464A (zh) * 2016-06-07 2016-08-24 广东万海细胞生物科技有限公司 一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基
CN106635978A (zh) * 2016-12-21 2017-05-10 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN107043747A (zh) * 2017-06-23 2017-08-15 王晓柯 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基
CN108251359A (zh) * 2017-12-20 2018-07-06 上海华新生物高技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021120613A1 (zh) * 2019-12-16 2021-06-24 江苏艾洛特医药研究院有限公司 一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途
CN111440764A (zh) * 2020-02-21 2020-07-24 广东国科细胞科技有限公司 间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法
CN112159795A (zh) * 2020-10-13 2021-01-01 肖利霞 一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法
WO2023065384A1 (zh) * 2021-10-22 2023-04-27 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种人间充质干细胞培养基
CN114480272A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 张国锋 一种用于脐带间充质干细胞培养的添加剂、培养基及其制备方法

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