CN100341526C - 一种含有抱茎苦荬菜提取物的制剂及其制备方法 - Google Patents

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CN100341526C CNB2004100781680A CN200410078168A CN100341526C CN 100341526 C CN100341526 C CN 100341526C CN B2004100781680 A CNB2004100781680 A CN B2004100781680A CN 200410078168 A CN200410078168 A CN 200410078168A CN 100341526 C CN100341526 C CN 100341526C
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Abstract

本发明涉及一种含有中药抱茎苦荬菜提取物的制剂及其制备方法，本发明的抱茎苦荬菜提取物，其特征是，总黄酮成分不少于80%，其中黄酮木犀草素7-O-葡萄糖醛酸不少于24%，腺苷不少于0.18%，本发明的抱茎苦荬菜提取物可制成注射用或口服的药物制剂。

Description

一种含有抱茎苦荬菜提取物的制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种含有中药抱茎苦荬菜提取物的制剂及其制备方法。
背景技术：
抱茎苦荬菜是菊科抱茎苦荬菜[Ixeris sonchifia(Bge.)Hance]一年生草本植物的全草，又名苦碟子。盛产于我国东北、华北等地。《现代中药学大辞典》记载，抱茎苦荬菜味苦、辛，具清热解毒、排毒、止痛之功效。民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症。
全世界苦荬菜属植物共有50余种，主要分布于中国、日本、朝鲜越南以及前苏联等地。我国共有苦荬菜属植物20余种。
苦荬菜属植物在我国有悠久的药用历史，主要药理作用有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静及心血管等方面的活性，冯玉书[中草药通讯1979(3)：31、沈阳药学院学报。1981，13：23等]人证明，抱茎苦荬菜的提取物具有增加冠脉流量，增加心肌营养性血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌循环等作用；对血液***能显著抑制血小板聚集功能，明显增加纤溶酶的活性，而这些作用是防治血栓闭塞性疾病的基础。抱茎苦荬菜的提取物无论在有氧、不同程度缺氧以及无氧条件下，均能使心肌乳酸含量显著降低，减轻或防止心肌细胞酸中毒，有利于心肌细胞功能的恢复[]沈阳药学院学报1982，16：30]；同时降低心肌代谢，增加侧枝循环，改善心肌缺氧，使心肌供血有明显改善。
中国专利[申请号：01114136.0]公开了碟荬灵注射液及其制备方法；中国专利[申请号：02109228.1]公开了一种治疗心脑血管疾病的提取物；中国专利[申请号：03133969.7]公开了苦碟子药物制剂及其制备方法；中国专利[申请号：02109532.9]公开了一种治疗心脑血管和眼底病的中药针剂及其制备方法；中国专利[申请号：03110991.6]公开了苦碟子液体药物制剂及其制备方法；中国专利[申请号：03110992.6]公开了苦碟子固体药物制剂及其制备方法；中国专利[申请号：03133846.1]公开了抱茎苦荬菜内酯及其衍生物组合物和它的制备方法及其应用。
本发明的抱茎苦荬菜提取物具有区别于上述专利涉及到提取物或制剂的显著特点，如：有效成分木犀草素7-O-葡萄糖醛酸含量高达25％，纯度高，产品质量高，质量容易控制，制备方法先进，疗效优越，经药理实验证明具有突出的预防和治疗脑血管疾病的作用。
发明内容：
本发明提供一种含有抱茎苦荬菜提取物，它的制剂及其制备方法。
本发明提供一种用中药抱茎苦荬菜经过提取加工制备的中药提取物，该提取物含有有效成分：黄酮和腺苷，提取物中黄酮成分的重量占提取物重量的百分比不少于80％，其中黄酮类有效成分木犀草素7-O-葡萄糖醛酸的含量不少于提取物重量的24％，提取物中腺苷的含量不少于提取物重量的0.18％。该提取物可通过采用选自粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、水沉、醇沉、酯提、酮提、层析、过滤等方法得到、以该提取物为活性物质可制成药物制剂，所述提取物可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，可以是粉末状物质，根据制剂的不同需要制成不同的状态。
本发明还提供用本发明的抱茎苦荬菜提取物经过加工制备的适合服用的任何单位剂量形式的药物制剂，这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，需要时可以制成缓释制剂、肠溶制剂。本发明的制剂，优选的是注射剂型，如：水针、小输液、大输液和粉针剂，更优选的是注射用粉针剂。
本发明的含有抱茎苦荬菜提取物药物制剂，在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、润滑剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、PH调节剂、矫味剂、色素等，常用的载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的含有抱茎苦荬菜提取物药物制剂，是通过将抱茎苦荬菜原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该活性物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成药物制剂。
本发明的制剂是单位剂量形式，每一制剂单位中可含有抱茎苦荬菜提取物8-600mg，其余为药物可接受的载体，所述每一制剂单位，是指每粒胶囊，或每片片剂、每袋颗粒、每丸丸剂、每一安瓶口服液，每瓶注射剂等。也可指每次服用剂量。
本发明还提供本发明的抱茎苦荬菜提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a.将干燥的抱茎苦荬菜全草切成段，碾碎；
b.用水或有机溶剂回流提取，提取液减压浓缩，调节pH，加入絮凝剂，静置；
c.上清液浓缩，加入乙醇，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得流浸膏；
d.加水溶解流浸膏，通过柱色谱，用水和有机溶剂洗脱，收集有机溶剂洗脱液，浓缩；
e.浓缩液加入有机溶剂溶解，减压浓缩、干燥。
本发明的制备方法优选的包括以下步骤：
a.将干燥的抱茎苦荬菜全草切成3-5cm段，碾碎，用原生药重量5-30倍量的水或有机溶剂加热回流提取2-3次，每次1-3小时，得提取液；
b.提取液减压浓缩至1ml中相当于原生药0.3-0.5g浓度，调节pH到5，加入絮凝剂，静置12h，上清液浓缩至比重为1.12-1.18，得浓缩液；
c.浓缩液加入4倍量95％的乙醇，静置18h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得流浸膏；
d.加水溶解流浸膏，通过选择性吸附黄酮的柱色谱，用水和不同浓度的有机溶剂洗脱，收集有机溶剂洗脱液，浓缩至稠浸膏；
e.稠浸膏加入有机溶剂溶解，溶液于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥后得本发明所述的抱茎苦荬菜提取物。
以上步骤中：所述的有机溶剂选自脂肪族低级醇或脂肪族低级酮如乙醇、丙酮。所述的絮凝剂选自明胶、海藻酸钠、琼脂、甲壳素及其衍生物，ZTCl+1等，优选壳聚糖。所述的选择性吸附黄酮的柱色谱选自聚酰胺柱色谱或大孔树脂柱色谱，优选聚酰胺柱色谱。在步骤b中的有机溶剂为乙醇，优选的为60-95％的乙醇，步骤e中所述的有机溶剂为丙酮，优选为80-100％丙酮。步骤e具有重要作用，是抱茎苦荬菜提取物总黄酮成分含量不低于80％的重要保证。
本发明抱茎苦荬菜提取物的制备方法操作简便，无苛刻的设备要求，宜于工业化生产。
对本发明进行了以下药效学实验以证明其有益效果。
实验一、抱茎苦荬菜提取物对犬脑血流量及脑血管阻力的影响
1试验材料
1.1实验药物
1、：自制，批号：020501。人用量为60mg/日。使用时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。
2、阳性对照药：碟脉灵注射液，通化华夏药业有限责任公司生产，规格10ml/支，2.5mg/10ml，静脉给药，一次10-50ml，用5％葡萄糖或0.9％氯化钠注射液稀释后应用。批号：020918。
1.2主要仪器及试剂
1、Maclab/8e多导生理分析***：澳大利亚ADI公司生产。
2、MFV-1200型电磁流量计：日本光电公司生产。
3、FR-025T流量计探头：日本光电公司生产。
4、戊巴比妥钠，丹麦进口分装，由中国医药公司上海化学试剂采购供应站分装，批号970213。
5、肝素钠注射液，由上海生物化学制药厂生产，2ml/瓶，12500U/2ml，批号：021118-24。
6、0.9％氯化钠注射液，四川科大药厂生产，批号：021218-24。
1.3实验动物
健康杂种犬：雌雄不限，购自湖南益阳实验动物养殖场。购买后分笼饲养，自由摄食饮水，室温控制在18-22℃，室内通风良好。
2试验方法与结果
2.1实验方法
取健康杂种犬30条，♀、♂兼用，体重9-12kg，随机分为五组，1.生理盐水对照组：静脉给予等体积生理盐水(2ml/kg)。2.抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予1.6mg/kg药物，用药量相当于人临床用药的等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，犬用药的等效剂量为60×0.32/12＝1.6mg/kg)。3.抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予3.2mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。4.抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予6.4mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。5.碟脉灵注射液阳性对照组：给予0.67mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，则犬用药的等效剂量为12.5×0.32/12＝0.33mg/kg)。
动物自小隐静脉按30mg/kg静脉注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于手术台上。分离一侧股静脉，结扎远侧端，插输液管备用。分离一侧股动脉，***充满肝素生理盐水溶液的动脉插管，经压力换能器记录平均动脉压(MAP)。将针状电极***四肢皮下，记录标准II导心电图(ECG)。沿颈正中线切开皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎进入颅内之前的颈外动脉及椎动脉，保留颈内动脉，颈总动脉挂2.5mm电磁流量计探头测量颈内动脉流量，以此代表脑血流量。脑血流量以100g脑组织每分钟血流毫升数表示。脑血流量(ml/100g·min)＝颈内动脉流量×100/一侧脑重。脑血管阻力(kPa.ml/100g·min)＝平均血压(MAP)/脑血流量。手术10min待动物各项观察指标稳定后，股静脉缓慢注射给药，给药体积2ml/kg，生理盐水对照组给予等容积生理盐水，记录药前及药后1、5、30、60、120min的血压、颈内动脉流量、心电图。实验结束时处死动物，取脑组织称重。
2.2实验结果
2.2.1抱茎苦荬菜提取物对犬脑血流量的影响
由表1可见，对照组给予生理盐水后脑血流量变化不明显，与给药前比较无显著性差异。抱茎苦荬菜提取物三个剂量组动物给药后1min、5min、30min时均可见脑血流量增加，与生理盐水对照组及给药前比较差异有显著性，P＜0.01。抱茎苦荬菜提取物大剂量组(6.4mg/kg)动物于给药后60min仍有作用，与生理盐水对照组及给药前比较P＜0.05。阳性对照组于给药后1min、5min、30min时亦可见动物脑血流量增加，与对照组及给药前比较P＜0.01。
表1抱茎苦荬菜提取物对犬脑血流量的影响(ml/100g.min)( x±SD n＝6)
组别  给药剂量(mg/kg)   给药前                                 给药后
  1min  5min  30min   60min   120min
生理盐水对照组注射用抱茎苦荬菜提取物注射用抱茎苦荬菜提取物注射用抱茎苦荬菜提取物碟脉灵注射液 1.63.26.40.67   50.21±7.6848.86±9.2451.79±8.3749.71±7.8149.60±9.71   49.36±7.7875.12±8.58##**78.22±7.24##**81.74±9.47##**77.47±7.32##**  48.24±8.1678.38±6.08##**80.47±8.01##**83.19±7.21##**79.55±8.11##**  51.12±7.4164.87±7.40#*68.51±9.20#*73.30±8.88##**68.47±9.23#*   48.10±8.1456.68±7.3357.25±8.2462.58±9.23#*56.41±7.41   49.87±9.8151.37±9.9453.22±7.2556.77±9.4854.36±8.74
与给前比较#P＜0.05 ##P＜0.01    与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
2.2.2抱茎苦荬菜提取物对犬脑血管阻力的影响
由表2可见，对照组给予生理盐水后脑血管阻力变化不明显，与给药前比较无显著性差异。抱茎苦荬菜提取物三个剂量组动物给药后1min、5min、30min时均可见脑血管阻力降低，与生理盐水对照组及给药前比较差异有显著性，P＜0.05或P＜0.01。阳性对照组于给药后1min、5min、30min时亦可见脑血管阻力降低，与对照组及给药前比较P＜0.01或P＜0.05。
表2抱茎苦荬菜提取物对犬脑血管阻力的影响(kPa.ml/100g·min)( x±SD n＝6)
组别  给药剂量(mg/kg)   给药前                                     给药后
  1min   5min   30min   60min   120min
生理盐水对照组注射用抱茎苦荬菜提取物注射用抱茎苦荬菜提取物注射用抱茎苦荬菜提取物碟脉灵注射液 1.63.26.40.67   0.058±0.0100.055±0.0110.057±0.0120.055±0.0070.056±0.013   0.059±0.0090.045±0.012##**0.044±0.010##**0.042±0.013##**0.044±0.011##**   0.059±0.0080.043±0.012##**0.042±0.013##**0.0041±0.011##**0.044±0.008##**   0.058±0.0110.051±0.0090.047±0.010#*0.045±0.014##**0.048±0.013#*   0.057±0.0100.052±0.0120.050±0.0070.049±0.0180.051±0.008   0.058±0.0090.055±0.0090.056±0.0080.051±0.0140.053±0.009
与给药前比较#P＜0.05 ##P＜0.01    与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
3实验结论
抱茎苦荬菜提取物能使犬脑血流量增加、脑血管阻力降低，具有增加脑血流量的作用。
实验二、抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑含水量、脑指数及脑组织过氧化脂质含量的影响
1试验材料
1.1实验药物
1、抱茎苦荬菜提取物：自制，批号：020501。人用量为60mg/日。使用时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。
2、阳性对照药：碟脉灵注射液，通化华夏药业有限责任公司生产，规格10ml/支，2.5mg/10ml，静滴，一次10-50ml，用5％葡萄糖或0.9％氯化钠注射液稀释后应用。批号：020918。
1.2主要仪器及试剂
1、7230型分光光度计：上海分析仪器厂生产。
2、戊巴比妥钠，丹麦进口分装，由中国医药公司上海化学试剂采购供应站分装，批号970213。
3、0.9％氯化钠注射液，四川科大药厂生产，批号：021218-24。
4、四乙氧基丙烷：Fluck产品。批号：001101。
1.3实验动物
SD大鼠，清洁级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：沪动合证字153号。购买后置于清洁级动物室分笼饲养，室温控制在18-22℃，自由摄食饮水。
2试验方法与结果
2.1实验方法
取大鼠70只，体重275±25g，随机分为7组：1、假手术对照组。2、脑缺血模型组。3、抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予5.4mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为60×0.018×5＝5.4mg/kg)。4、抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予10.8mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。5、抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予21.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。6、抱茎苦荬菜提取物灌胃给药对照组：给予10.8mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。7、碟脉灵注射液阳性对照组：给予2.25mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为12.5×0.018×5＝1.125mg/kg)。灌胃组灌胃给药，1日1次，连续7天；其余各组静脉注射给药，假手术对照组及脑缺血模型组给予生理盐水。末次给药后30分钟，参照有关文献方法结扎大鼠双侧颈总动脉，形成急性实验性不完全性脑缺血模型。假手术组对照组(以下简称对照组)不结扎动脉。双侧颈总动脉结扎3小时后断头，开颅取脑。取一侧脑组织称湿重，计算脑指数(脑指数＝脑重×100/体重)然后在110℃烤箱烤至恒重，称干重，计算脑含水量(脑含水量％＝(湿重-干重)/湿重×100％)。另一侧脑组织取部分脑组织称重后在冰水浴中匀浆，用硫代巴比妥酸法测丙二醛(MDA)含量，以此作为脑组织中过氧化脂质含量。另取部分脑组织10％***固定，常规脱水，石蜡包埋制片，HE染色，光镜下组织形态学观察。
2.2实验结果
2.2.1抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑含水量及脑指数的影响
由表3可见，脑缺血模型组大鼠脑含水量及脑指数明显增高，与对照组比较P＜0.01。抱茎苦荬菜提取物组三个剂量组可显著降低脑缺血大鼠脑含水量及脑指数，与脑缺血模型组大鼠比较P＜0.05或P＜0.01。同剂量的抱茎苦荬菜提取物注射给药作用优于灌胃给药。碟脉灵注射液阳性对照组亦可显著降低脑缺血大鼠脑含水量及脑指数，与脑缺血模型组大鼠比较P＜0.05或P＜0.01。
表3抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑含水量及脑指数的影响( x±SDn＝10)
组别  给药剂量(mg/kg)  给药途径     脑含水量％     脑指数％
对照组模型组抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物碟脉灵注射液 5.410.821.610.82.25     ivivivivivigiv     75.6±2.584.8±2.1##80.9±3.8*79.6±3.4**77.8±2.2**80.4±2.9*78.6±2.7**     0.65±0.030.74±0.04##0.70±0.03*0.68±0.03*0.66±0.02**0.71±0.02*0.68±0.03*
与对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01    与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
2.2.2抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑组织过氧化脂质含量的影响
由表4可见，脑缺血模型组大鼠脑组织过氧化脂质含量明显增高，与对照组比较P＜0.01。抱茎苦荬菜提取物组三个剂量组可显著降低脑缺血大鼠过氧化脂质含量，与脑缺血模型组大鼠比较P＜0.01。同剂量的抱茎苦荬菜提取物注射给药作用优于灌胃给药。阳性对照组碟脉灵注射液亦可显著降低脑缺血大鼠过氧化脂质含量，与脑缺血模型组大鼠比较或P＜0.01。
表4抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠过氧化脂质含量的影响( x±SDn＝10)
组别   给药剂量(mg/kg)   给药途径     MDA(mmol/g组织湿重)
对照组模型组抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物碟脉灵注射液 5.410.821.610.82.25     ivivivivivigiv     401.4±36.7502.7±41.8##443.7±27.9**438.5±26.9**422.0±31.7**441.8±28.6**437.7±33.4**
与对照组比较##P＜0.01    与模型组比较**P＜0.01
2.2.3抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑组织形态学影响观察
镜下见对照组大鼠脑组织神经细胞正常，核膜清楚，核仁明显。神经胶质细胞核仁清楚，胞浆透亮，细胞膜及核膜清楚。毛细血管和小血管腔较窄。脑缺血模型组的大鼠组织发生明显的病理性改变，神经细胞胞浆和核仁浓缩，染色深，整个胞体变小，小血管周围的空隙增宽，神经胶质细胞肿胀。抱茎苦荬菜提取物三个剂量组的脑组织神经细胞浓缩及深染较脑缺血模型组明显减轻，神经胶质细胞肿胀及间质疏松程度均明显轻于模型组对照组。碟脉灵注射液阳性对照组亦有同样作用。表明抱茎苦荬菜提取物能使脑组织病理改变减轻，对大鼠缺血性脑组织的病理变化有一定的保护作用。(见病理报告单及附图)
3实验结论
抱茎苦荬菜提取物能改善脑缺血模型大鼠脑由于脑缺血缺氧所致的脑水肿改变，能降低脑缺血大鼠的脑含水量及脑指数。能降低由于脑缺血缺氧导致的脑组织过氧化脂质含量升高。能减轻脑缺血大鼠脑组织的病理损伤。对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。
实验三、抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型脑血管通透性的影响
1试验材料
1.1实验药物
1、抱茎苦荬菜提取物：自制，批号：020501。人用量为60mg/日。使用时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。
2、阳性对照药：碟脉灵注射液，通化华夏药业有限责任公司生产，规格10ml/支，2.5mg/10ml，静滴，一次10-50ml，用5％葡萄糖或0.9％氯化钠注射液稀释后应用。批号：020918。
1.2主要仪器及试剂
1、7230型分光光度计：上海分析仪器厂生产。
2、戊巴比妥钠，丹麦进口分装，由中国医药公司上海化学试剂采购供应站分装，批号970213。
3、0.9％氯化钠注射液，四川科大药厂生产，批号：021218-24。
4、伊文思蓝：BDH进口分装，上海化学试剂采购供应站分装，批号：000126。
5、甲酰胺溶液：北京昌平石鹰化工厂，批号：996123。
1.3实验动物
SD大鼠，清洁级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：沪动合证字153号。购买后置于清洁级动物室分笼饲养，室温控制在18-22℃，自由摄食饮水。
2试验方法与结果
2.1实验方法
取大鼠70只，雄性大鼠，体重286±26g，随机分为7组：1、假手术对照组。2、脑缺血模型组。3、抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予5.4mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为60×0.018×5＝5.4mg/kg)。4、抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予10.8mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。5、抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予21.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。6、抱茎苦荬菜提取物灌胃给药对照组：给予10.8mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。7、碟脉灵注射液阳性对照组：给予2.25mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为12.5×0.018×5＝1.125mg/kg)。末次给药后30分钟，对照组于股静脉注射伊文思蓝50mg/kg，不结扎双侧颈总动脉；缺血模型组及各给药组则在结扎颈总动脉前5分钟由股静脉注射相同剂量伊文思蓝。给伊文思蓝3小时后，断头取脑，称重，分别浸泡于甲酰胺溶液中，在45℃恒温箱中温育72小时，待脑组织中色素全部浸出，取色素液用7210型分光光度计，620nm进行比色，根据标准曲线计算出脑内伊文思蓝的含量，以μg/g脑湿重表示。
2.2实验结果
由表5可见，脑缺血模型组大鼠脑中伊文思蓝含量明显增高，与对照组比较P＜0.01。抱茎苦荬菜提取物组三个剂量组可显著降低脑缺血大鼠脑中伊文思蓝含量，与脑缺血模型组大鼠比较P＜0.01。同剂量的抱茎苦荬菜提取物注射给药作用优于灌胃给药。阳性对照组碟脉灵注射液亦可显著降低脑缺血大鼠脑中伊文思蓝含量，与脑缺血模型组大鼠比较P＜0.01。
表5抱茎苦荬菜提取物对脑缺血模型大鼠脑组织伊文思蓝含量的影响( x±SDn＝10)
组别     给药剂量(mg/kg)   给药途径     伊文思蓝(μg/g)
对照组模型组抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 5.410.821.6 iviviviviv 4.97±0.178.64±0.25##6.89±0.33**5.98±0.47**4.96±0.38**
抱茎苦荬菜提取物碟脉灵注射液 10.82.25 igiv 6.68±0.56**6.31±0.62**
与对照组比较##P＜0.01    与模型组比较**P＜0.01
3实验结论
抱茎苦荬菜提取物能减少脑缺血模型大鼠脑组织中伊文思蓝的含量，减轻由于脑缺血缺氧导致的毛细血管通透性的增加，对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。，
实验四、抱茎苦荬菜提取物对小鼠脑缺血缺氧的影响
1试验材料
1.1实验药物
1、抱茎苦荬菜提取物：自制，批号：020501。人用量为60mg/日。使用时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。
2、阳性对照药：碟脉灵注射液，通化华夏药业有限责任公司生产，规格10ml/支，2.5mg/10ml，静滴，一次10-50ml，用5％葡萄糖或0.9％氯化钠注射液稀释后应用。批号：020918。
1.2实验动物
昆明种小鼠18-22g，♀、♂兼备，由湖南医药工业研究所提供，合格证号：041。动物自由摄食与饮水，实验室温度22-25℃，湿度55-65％。
1.3仪器及主要试剂
分析天平，上海第二分析天平生产。注射器1ml，0.25ml。秒表，上海秒表厂生产。***，上海试剂厂产品。生理盐水，湖南中医学院附一院制剂室生产，规格500ml/瓶。
2试验方法与结果
2.1对小鼠脑循环性缺氧存活时间的影响
小鼠，50只，♀、♂各半，随机分为5组：1.对照组(生理盐水)；2.抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予7.8mg/kg药物，用药量相当于人临床用药的等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为60×0.0026×50＝7.8mg/kg)。3.抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予15.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。4.抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予31.2mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。5.碟脉灵注射液阳性对照组：给予3.25mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为12.5×0.0026×50＝1.625mg/kg)。每天给药一次，给药体积为20ml/kg。连续给药3天，末次给药后30min，小鼠经***麻醉后，分离双侧颈总动脉并穿线结扎，观察结扎双侧颈总动脉后动物存活时间。以完全阻断双侧颈总动脉血流开始计时，至小鼠10秒内呼吸2次为止，为小鼠缺血后存活时间，试验结果见表6。抱茎苦荬菜提取物可明显延长小鼠脑缺血后存活的时间，其中剂量为7.8，15.6，31.2mg/kg，差异具有显著性意义。
表6抱茎苦荬菜提取物对小鼠脑缺血后存活时间的影响(n＝10， x±SD)
组别    剂量(mg/kg)   存活时间(min)
    对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 3.257.815.631.2   5.21±1.317.11±1.48**6.42±1.14*6.50±1.33*7.52±1.45**
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
2.2对断头小鼠张口呼吸持续时间的影响
小鼠，50只，♀、♂各半，随机分为5组：1.对照组(生理盐水)；2.抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予7.8mg/kg药物，用药量相当于人临床用药的等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为60×0.0026×50＝7.8mg/kg)。3.抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予15.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。4.抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予31.2mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。5.碟脉灵注射液阳性对照组：给予3.25mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为12.5×0.0026×50＝1.625mg/kg)。每天给药一次，给药体积为20ml/kg，连续给药3天，末次给药后30min用剪刀在小鼠双耳连线处快速断头，立即用秒表记录断头小鼠的张口动作持续时间，结果抱茎苦荬菜提取物(15.6，31.2mg/kg)与对照组比较，能明显延长断头小鼠张口呼吸动作持续时间。见表7。
表7抱茎苦荬菜提取物对小鼠断头张口呼吸动作持续时间的影响(n＝10， x±SD)
组别    剂量(mg/kg)     张口呼吸持续时间(秒)
    对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 3.257.815.631.2     15.2±6.120.6±4.9*18.1±3.820.1±4.2*22.0±4.0**
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
2.3对***中毒缺氧小鼠存活时间的影响
小鼠，50只，♀、♂各半，随机分为5组：1.对照组(生理盐水)；2.抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予7.8mg/kg药物，用药量相当于人临床用药的等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为60×0.0026×50＝7.8mg/kg)。3.抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予15.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。4.抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予31.2mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。5.碟脉灵注射液阳性对照组：给予3.25mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为12.5×0.0026×50＝1.625mg/kg)。每天给药一次，给药体积为20ml/kg，连续给药3天，末次给药后30min，小鼠尾静脉注射***(5mg/kg)，立即记录小鼠存活时间，结果见表8。抱茎苦荬菜提取物(15.6，31.2mg/kg)可明显延长小鼠***中毒缺氧的存活时间。
表8抱茎苦荬菜提取物对***中毒缺氧小鼠存活时间影响(n＝10， x±SD)
组别     剂量(mg/kg)     存活时间(秒)
    对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 3.257.815.631.2     36.1±11.146.2±9.5*43.0±10.346.4±10.1*52.3±11.2**
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
3实验结论
实验结果显示：小鼠静脉注射给予抱茎苦荬菜提取物(7.8，15.6，31.2mg/kg，qd×3d)能延长小鼠颈动脉结扎后的存活时间，能延长小鼠断头张口呼吸动作的持续时间，能延长小鼠***中毒性缺氧的存活时间。提示抱茎苦荬菜提取物对小鼠脑缺血缺氧具有一定的保护作用。
实验五、抱茎苦荬菜提取物活血化瘀作用试验研究
1试验材料
1.1实验药物
1、抱茎苦荬菜提取物：自制，批号：020501。人用量为60mg/日。使用时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。
2、阳性对照药：碟脉灵注射液，通化华夏药业有限责任公司生产，规格10ml/支，2.5mg/10ml，静滴，一次10-50ml，用5％葡萄糖或0.9％氯化钠注射液稀释后应用。批号：020918。
1.2实验动物
KM小鼠，18-22g，♀、♂各半，由湖南医药工业研究所提供，合格证号：041。SD大鼠，200-250g，♀、♂各半，由湖南医药工业研究所提供，合格证号：039。日本大耳白家兔，2.0-2.5kg，♂，由湖南中医学院实验动物中心提供，合格证号：医动字第20-003号。动物自由摄食与饮水，实验室温度22-25℃，湿度55-65％。
1.3仪器及主要试剂
LD4-2A离心机，北京医用离心机厂，LBY-S5型血栓测定仪，北京普利生公司产品，LBY-NJ2型血小板聚集仪，北京普利生公司产品，LBY-N7型血液流变仪，北京普利生公司产品，TN-扭力天平，上海第二天平厂，TG-T29B型光电分析天平，上海天平仪器厂，ADP，北京普利生公司产品，批号030112，规格40μM×1ml，枸橼酸钠，上海化学试剂厂，批号011013。肾上腺素，由天津金耀氨基酸有限公司(原人民制药厂)生产，规格：1mg/1ml/支，批号：021102。
2试验方法与结果
2.1对血瘀证大鼠血液流变学的影响
大鼠，200-250g，60只，♀、♂各半，随机分为6组，分别给予下列药物：(1)对照组(生理盐水)；(2)血瘀证模型组(生理盐水)；(3)碟脉灵注射液组(2.25mg/kg)；(4)-(6)抱茎苦荬菜提取物低、中、高剂量组(5.4，10.8，21.6mg/kg)，每天静脉注射给药一次，每次给药体积为10ml/kg，连续给药3天，第3天给药后，除对照组外，其余各组动物皮下注射0.1％肾上腺素0.8ml/kg，共2次，两次间隔4小时，在两次注射肾上腺素之间(前后各间隔2小时)，将大鼠浸入冰水中5分钟，处置后禁食不禁水，于次晨颈动脉取血，肝素抗凝，用LBY-N7型血液流变仪测定全血粘度高切、中切、低切及血浆粘度。试验结果见表9。抱茎苦荬菜提取物(5.4，10.8，21.6mg/kg)具有不同程度的降低全血比粘度及血浆比粘度，改善血液流变性的作用。
表9抱茎苦荬菜提取物对血瘀证大鼠血液流变性的影响
                (n＝10， x±SD)
组别   剂量(mg/kg)                             全血粘度 血浆粘度
    高切     中切      低切
  对照组模型组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 2.255.410.821.6   3.916±1.0545.495±1.147△△4.483±0.949*4.816±0.8564.059±1.130*3.836±1.015**   5.945±1.1928.155±1.189△△6.715±1.081*7.219±1.3676.329±1.453**6.141±1.089**   13.031±1.98615.949±2.325△△12.850±1.860**13.372±1.843*13.024±2.130**12.790±1.190**     1.679±0.3102.114±0.388△1.600±0.298**1.872±0.3341.655±0.405*1.576±0.292**
与对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2对家兔血小板聚集及血栓形成的影响
家兔，2.0-2.5kg，50只，♂，随机分为5组：1.对照组(生理盐水)；2.抱茎苦荬菜提取物小剂量组：给予2.8mg/kg药物，用药量相当于人临床用药的等效剂量(成人用药量为60mg/日，按体表面积比值折算，兔用药的等效剂量为60×0.07/1.5＝2.8mg/kg)。3.抱茎苦荬菜提取物中剂量组：给予5.6mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量2倍。4.抱茎苦荬菜提取物大剂量组：给予11.2mg/kg药物，相当于人临床用药等效剂量4倍。5.碟脉灵注射液阳性对照组：给予1.17mg/kg给予，相当于人临床用药等效剂量2倍(成人用药量为12.5mg/日，按体表面积比值折算，小鼠用药的等效剂量为12.5×0.07/1.5＝0.58mg/kg)。每天静脉给药一次，每次给药体积为4ml/kg，连续给药3天，末次给药后60min，颈动脉取血，测定血小板聚集率、及血栓各指标。①血小板聚集率测定：取血3.6ml，以3.8％枸橼酸钠(1∶9)(V∶V)抗凝，1000rpm，离心5min，取上层血浆0.2ml作为富含血小板血浆(PRP)，剩余血浆以4000rpm，离心15min，制备贫血小板血浆(PPP)。由PPP调PRP，使血小板数为2×108/L，将PRP2ml加入测定管内，置于LBY-NJ2型血小板聚集仪中，37℃保温1min，经PPP标定后，以40μMADP30μl作为诱导剂测定1min、3min、5min血小板聚集率及最大聚集率(MPAR)。②血栓测定：末次给药60min后，取血1.8ml置硅化胶管中，以LBY-S5血栓测定仪，37℃，17rpm旋转15min以形成血栓，取出血栓用滤纸吸干血测定血栓长度及湿重，然后将血栓条置于80℃烘箱中烘烤4h，称其干重。试验结果见表10、表11。抱茎苦荬菜提取物(2.8，5.6，11.2mg/kg)具有不同程度的降低血小板聚集率，抑制血栓形成的作用。
表10抱茎苦荬菜提取物对家兔血小板聚集率(％)的影响(n＝10， x±SD)
组别   剂量(mg/kg)     血小板聚集率(％)
    1min     3min     5min     MA
 对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 1.172856112     4361±8253436±662*3834±7043338±568**3210±664**     6281±8544659±7.10**5649±7924988±666**4408±798**     5695±7844004±754**4965±6.77*4214±606**3909±660**   6603±7885059±664**6321±8.425746±5.47*5043±662**
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表11抱茎苦荬菜提取物对家兔血栓形成的影响(n＝10， x±SD)
组别   剂量(mg/kg)     血栓长度(cm)     湿重(mg)     干重(mg)
  对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提 1.172.85.6     4.49±1.052.88±1.30**3.99±0.773.12±1.47*     236.1±55.6137.2±69.0**178.3±44.5*170.1±68.9*     66.9±15.839.4±17.5**52.9±17.249.3±18.9*
  取物抱茎苦荬菜提取物 11.2 2.43±1.19** 122.5±60.1** 33.4±15.4**
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2、3对小鼠凝血时间及出血时间的影响
KM小鼠，18-22g，50只，♀、♂各半，随机分为5组，每组10只，分别给予下列药物：(1)对照组(生理盐水)；(2)碟脉灵注射液组(3.25mg/kg)；(3)-(5)抱茎苦荬菜提取物低、中、高剂量组(7.8，15.6，31.2mg/kg)。每天静脉注射给药一次，给药体积为20ml/kg，连续给药3天，末次给药后60分钟，测定凝血时间及出血时间。①凝血时间测定：以毛细玻管法内耻取血至毛细管内血柱达5cm，每隔30秒折断毛细玻管一小段，检查有无出现血凝丝，计算从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间，即为凝血时间。②出血时间测定：末次给药后60分钟，以利剪将小鼠尾部约5mm处横断，使血液自行溢出开始计时，每隔30秒用滤纸吸去血滴一次，直到血液自然停止(滤纸吸附时无血)时为止，计录出血时间。结果见表12。小鼠静脉抱茎苦荬菜提取物(7.8，15.6，31.2mg/kg)，能不同程度的延长小鼠出血时间及凝血时间。
表12抱茎苦荬菜提取物对小鼠凝血时间及出血时间的影响(n＝10， x±SD)
组别     剂量(mg/kg)     凝血时间(min)     出血时间(min)
    对照组碟脉灵注射液抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物抱茎苦荬菜提取物 3.257.815.631.2     2.20±0.352.60±0.39*2.45±0.442.75±0.68*2.80±0.67*     7.35±0.788.45±1.32*7.70±1.168.35±0.94*8.95±1.34*
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
3实验结论
大鼠静脉抱茎苦荬菜提取物(5.4，10.8，21.6mg/kg)能降低血液粘度及血浆粘度。家兔静脉抱茎苦荬菜提取物(2.8，5.6，11.2mg/kg)能抑制ADP诱导的家兔血小板聚集及血栓形成。小鼠静脉抱茎苦荬菜提取物(7.8，15.6，31.2mg/kg)能延长凝血时间及出血时间。以上结果提示，抱茎苦荬菜提取物具有活血化瘀的作用。
本发明的抱茎苦荬菜提取物具有显著的药理活性，能使犬脑血流量增加、脑血管阻力降低，具有增加脑血流量的作用。对大鼠脑缺血所致脑含水量及脑指数的升高有显著降低作用；对大鼠脑缺血所致的脑组织过氧化脂质含量升高及毛细血管通透性增加有显著降低作用；能减轻脑缺血大鼠脑组织的病理损伤；对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。能明显延长小鼠颈总动脉结扎后存活时间，延长小鼠断头张口呼吸动作持续时间，延长小鼠***中毒性缺氧的存活时间，对小鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。能降低血瘀证大鼠血液粘度及血浆粘度。降低家兔血小板聚集率，降低家兔血栓长度及重量；延长小鼠凝血时间及出血时间，具有活血化瘀的作用。该提取物可以用来预防和治疗脑血管疾病。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明
实施例1、
干燥的抱茎苦荬菜全草10kg，切成3-5cm段，碾碎，用原生药重量16倍量的水加热回流提取，热提3次(7倍量，5倍量，4倍量)，分别提取1h、0.5、0.5小时，然后提取液减压浓缩为1ml相当于原生药0.3-0.5g，调节pH5，加入壳聚糖，静置12h，上清夜浓缩至比重为1.12-1.18，加入4倍量95％的乙醇，静置18h，滤过，回收乙醇至无醇味，流浸膏加适量水溶解，通过聚酰胺柱色谱，用水洗脱，弃去，60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至比重为1.18-1.20，加入90％丙酮溶解，滤过，溶液于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥后得抱茎苦荬菜提取物150g。
实施例2、
干燥的抱茎苦荬菜全草50kg，切成3-5cm段，碾碎，用原生药重量13倍量的水加热回流提取，热提3次(7倍量，3倍量，3倍量)，分别提取1h、0.5、0.5小时，然后提取液减压浓缩为1ml相当于原生药0.4g，调节pH5，加入壳聚糖，静置12h，上清夜浓缩至比重为1.12-1.18，加入4倍量95％的乙醇，静置18h，滤过，回收乙醇至无醇味，流浸膏加适量水溶解，通过聚酰胺柱色谱，用5％乙醇洗脱，弃去，60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至比重为1.12-1.16，加入95％丙酮溶解，滤过，溶液于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥后得抱茎苦荬菜提取物600g。
实施例3
胶囊剂
[处方]抱茎苦荬菜提取物120g
制成胶囊1000粒
[制法]将抱茎苦荬菜提取物120g，加入药用辅料微晶纤维素等混匀，制粒，干燥，装入胶囊即可。
实施例4
丸剂
[处方]抱茎苦荬菜提取物240g
制成丸剂1000袋
[制法]将抱茎苦荬菜提取物240g，加入药用辅料糊精、微晶纤维素等，制成泛丸，干燥，分装即可。
实施例5
片剂
[处方]抱茎苦荬菜提取物120g
制成片剂1000片
[制法]将桑抱茎苦荬菜提取物120g，加入药用辅料微晶纤维素等混匀，制粒，干燥，加入适量润滑剂，压片即可。
实施例6
颗粒剂
[处方]抱茎苦荬菜提取物240g
制成颗粒剂1000袋
[制法]将抱茎苦荬菜提取物240g，加入药用辅料糊精、甜味剂等混匀，制粒，干燥，装袋即可。
实施例7
口服液
[处方]抱茎苦荬菜提取物240g
制成口服液1000支
[制法]将抱茎苦荬菜提取物100g，溶解于水，加入适量矫味剂，灭菌，灌装即可。
实施例8
注射液
[处方]抱茎苦荬菜提取物10g
制成注射液1000支
[制法]将抱茎苦荬菜提取物10g，溶解于注射用水，调节pH7.2，5万分子量中空纤维超滤，加注射用水至2000ml，1万分子量中空纤维超滤，加入0.1％焦亚硫酸钠稳定剂，0.22μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即可。
实施例9
[处方]抱茎苦荬菜提取物10g
制成冻干粉针1000支
[制法]将抱茎苦荬菜提取物10g，溶解于注射用水，调节pH7.2，加入0.1％焦亚硫酸钠稳定剂，3％甘露醇支持剂，搅拌溶解，再加入0.05％活性炭处理，纸板滤过，5万分子量中空纤维超滤，加注射用水至2000ml，1万分子量中空纤维超滤，再经0.22μm微孔滤膜滤过，分装于西林瓶中，每支2ml，于-50℃予冻3小时，随后抽真空(真空度为10pa)，升温干燥，最终温度为35℃干燥30小时，即得冻干粉针剂制品。

Claims (10)

1、一种抱茎苦荬菜提取物，含有有效成分黄酮和腺苷，其特征在于，提取物中黄酮成分不少于80％，其中黄酮木犀草素7-O-葡萄糖醛酸不少于24％，提取物中腺苷不少于0.18％。
2、权利要求1的抱茎苦荬菜提取物在制备预防和/或治疗脑血管疾病的药物中的应用。
3、含有权利要求1的抱茎苦荬菜提取物的药物制剂。
4、权利要求3的药物制剂，是适合服用的药物剂型，选自片剂、胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射用水针剂、注射用小输液剂、注射用大输液剂、注射用粉针剂。
5、权利要求1的抱茎苦荬菜提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
a.将干燥的抱茎苦荬菜全草切成段，碾碎；
b.用水或有机溶剂回流提取，提取液减压浓缩，调节pH，加入絮凝剂，静置；
c.上清液浓缩，加入乙醇，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得流浸膏；
d.加水溶解流浸膏，通过柱色谱，用水和有机溶剂洗脱，收集有机溶剂洗脱液，浓缩；
e.浓缩液加入有机溶剂溶解，减压浓缩、干燥。
6、权利要求5的抱茎苦荬菜提取物的制备方法，其特征在于，
步骤a是将干燥的抱茎苦荬菜全草切成3-5cm段，碾碎；
步骤b是用原生药重量5-30倍量的水或有机溶剂加热回流提取2-3次，每次1-3小时，提取液减压浓缩至1ml中相当于原生药0.3-0.5g浓度，调节pH到5，加入絮凝剂，静置12h；
步骤c是将上清液浓缩至比重为1.12-1.18，加入4倍量95％的乙醇，静置18h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得流浸膏；
步骤d是加水溶解流浸膏，通过选择性吸附黄酮的柱色谱，用水和不同浓度的有机溶剂洗脱，收集有机溶剂洗脱液，浓缩至稠浸膏；
步骤e是加入有机溶剂溶解稠浸膏，溶液于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥。
7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自脂肪族低级醇，低级酮，所述絮凝剂选自明胶，海藻酸钠，琼脂，甲壳素及其衍生物，ZTC1+1，所述选择性吸附黄酮的柱色谱选自聚酰胺柱色谱，大孔树脂柱色谱。
8、根据权利要求7的制备方法，所述的脂肪族低级醇是乙醇，脂肪族低级酮是丙酮，所述的甲壳素及其衍生物是壳聚糖。
9、权利要求8的制备方法，在步骤b中的有机溶剂为乙醇，步骤e中的有机溶剂为丙酮。
10、权利要求9的制备方法，步骤e中的丙酮为80-100％的丙酮。
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