CN1853701A - 一种洋参生脉药物的有效部位及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种洋参生脉药物的有效部位及其制备方法,确切的说涉及一种治疗心衰、冠心病、心绞痛、休克以及提高癌症病人的免疫力的药物的有效部位,其由中药西洋参、麦冬、五味子制成。本发明还涉及含有该有效部位的药物组合物及其制备方法。本发明的药用有效部位无毒副作用,从而无不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,涉及一种洋参生脉药物的有效部位及其制备方法,确切的说涉及一种治疗心衰、冠心病、心绞痛、休克以及提高癌症病人的免疫力的药物的有效部位,还涉及含有该有效部位的药物组合物及其制备方法。更具体地说,涉及由中药西洋参、麦冬、五味子制成的中药有效部位。
背景技术
心血管类疾病是一种常见的多发性疾病,该类疾病严重地影响病人的身心健康及日常生活。现有的治疗药物有生脉粉针、生脉注射液,主要成份为:人参、麦冬、五味子,该方源于金代李东垣《内处伤辩惑》中的生脉散,主要具有益气生津、复脉固脱之效,能改善心肌供血、调节血压、改善微循环。临床上用于治疗心脏疾病:心力衰竭、心肌炎、冠心病、心绞痛、心律失常、原发性低血压;各种类型的休克:过敏性休克、心源性休克、感染性休克。方中以人参补肺益气以生津为主,辅以麦冬养阴清热以生津;五味子敛肺止汗生津。三药合用具一补、一清、一敛之功,共盛益气养阴,生津止渴,固表止汗之效,使气复津回,汗止而阴存。现市售的生脉注射液已收载于部颁标准十五册,并被国家中医药管理局指定为中医急诊科(室)必备中成药之一,广泛应用于休克、冠心病、心衰等循环***和神经疾病。
但随着临床应用的扩展,生脉制剂不断有不良反应的报道,其不良反应综述如下:
(1)诱发心动过速:临床报道多例静脉注射生脉注射液后引起心动过速的病例,王氏认为与方中主药红参具有增强心肌自律性,提高心肌兴奋性和收缩性并有兴奋中枢神经***,尤其是兴奋交感神经***,从而诱发心律失常。
(2)诱发心绞痛:张氏认为其原因可能与药物进入快速,强心作用过于明显并使心率增快,从而心肌耗氧量增加、心肌缺氧诱发心绞痛发作。
(3)严重腹胀:周小琳等报道了在给予生脉注射液治疗过程中出现严重腹胀的病例,周氏认为生脉注射液是益气养阴之补剂,大量久用后过于补气使中焦气滞不行而至腹胀满。
(4)过敏性休克:罗康,吴继萍等报道了生脉注射液所至过敏性休克的病例,作者认为过敏原可能与红参有关,为其特异体质所致。
(5)皮肤过敏。
可见,生脉制剂引起的不良反应均疑与方中主药红参有关。红参为五加科植物人参panax ginseng C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根,是临床上常用的益气扶正,滋补强壮药。性甘、微苦,温。红参能提高心肌收缩力,有似强心甙样作用,对中枢神经***有兴奋作用,故临床特点为益气固脱,大补元气。其强心升压、补气的特性可能是引起上述不良反应的主要原因,这就提示生脉制剂方中主药红参既起主要功效又会引起一些不良反应。
针对现有的生脉制剂存在的上述缺陷,临床上不断寻找更有效、无不良反应的的方剂。
发明内容:
本发明的目的就是为了克服现有生脉制剂的缺陷,提供了一种洋参生脉药物的有效部位,其无不良反应、能有效治疗心衰、冠心病、心绞痛、休克以及提高癌症病人的免疫力。
本发明目的还在于提供一种含有所述中药有效部位的药物制剂。
本发明目的还在于提供一种所述中药有效部位的制备方法。
本发明目的还在于提供一种含有所述中药有效部位的药物制剂的制备方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案来实现:
一种洋参生脉药物的有效部位,其由西洋参、麦冬和五味子按以下重量份配比制备而成:西洋参3-6,麦冬6-12,五味子1.5-6。
优选中药原料西洋参、麦冬和五味子的重量份配比为:1∶3.12∶1.56。
一种洋参生脉药物制剂,其含有上述的有效部位以及药用辅料,有效部位与药用辅料的重量比为1∶1-1∶10,优选1∶1-1∶5。该药物制剂可以是各种剂型,包括注射剂、大容量注射剂、冻干粉针剂,给药途经为静脉注射,药用辅料可以是甘露醇、吐温-80、右旋糖酐S40。
本发明的洋参生脉药物的有效部位是通过以下方法制备而成:
1)取西洋参干燥茎叶,加水煎煮,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬,加乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用乙醇回流提取,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液。减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子,加乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;药渣用水煎煮,滤液浓缩至稠膏状,加乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过。滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味。取大孔吸附树脂装于玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液;
5)任选地,将上述的西洋参、麦冬、五味子的混合液进一步纯化,制得药用有效部位。
本发明有效部位制备方法中的步骤4)中所使用的大孔吸附树脂包括D101、D21、AB-8等型号。
优选,本发明的洋参生脉药物的有效部位是通过以下方法制备而成:
1)取西洋参干燥茎叶粉碎成细粒,加6-10倍量水煎煮2-3次,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬粉碎成细粒,加3-6倍量60-70%乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用4-8倍量60-70%乙醇回流提取2-3次,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液。减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子粉碎破壳,加4-8倍量70-90%乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。药渣用3-6倍量水煎煮1-2次,滤液浓缩至稠膏状,加2-4倍量85-95%乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入6-10倍量85-95%乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过。滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加2-4倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入6-10倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味。取D101大孔吸附树脂装于R12×H190cm的玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用60-80%乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液;
5)任选地,将上述的西洋参、麦冬、五味子的混合液进一步纯化,制得药用有效部位。
本发明的洋参生脉注射剂是通过以下方法制备而成:
1)取西洋参干燥茎叶,加水煎煮,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬,加乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用乙醇回流提取,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液。减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子,加乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。药渣用水煎煮,滤液浓缩至稠膏状,加乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过。滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味。取大孔吸附树脂装于玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液。
5)向上述混合液中加入乙醇,放置过夜,过滤。取脱色树脂,装于玻璃柱中。药液过脱色色谱柱脱色后,流出液减压回收乙醇至无醇味,浓缩。浓缩液加水,摇匀,静置,滤过,按体积加入针用活性炭搅拌,过滤脱炭,微孔滤膜过滤,熔封于安瓿中,灭菌即得。每一个制剂单位中含有,按折合生药计:西洋参3-6g,麦冬6-12g,五味子1.5-6g。
本发明所述注射剂的制备方法中的步骤5)中所使用的脱色树脂为强碱性的离子交换树脂,诸如ZTC-2,D301.
本发明处方中的西洋参Panax quinquefolium L.与人参同为五加科植物人参属植物,也是临床上常用的益气扶正,滋补强壮药。因西洋参与红参原植物为同科同属植物,故所含大类化学成分基本相同。其味甘,微苦,性凉,能补脾降火,生津滋阴,除烦倦。
本发明是在现有的生脉注射液的基础加以改进,以五加科人参属植物西洋参(Panax quinquefolium L.)地上部分分离纯化得到的西洋参茎叶总皂苷或20s-原人参二醇组皂苷(PQDS)替代红参。西洋参传统药用其根,地上部分很少应用。化学成分分析表明:其主要有效成分皂苷在叶部的含量(9.05%~10.45%)明显高于根部(3.89%~6.49%)。由于西洋参皂苷(PQS)含有的20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)是其溶血的主要成分,且难溶于水,而影响PQS制成注射剂,故不适于缺血性心脏病急症治疗。此外,PQTS主要含单体皂苷Rg1,Re和P F11,以Rg1为主;PQDS主要含Rb3,Rd,Rb2和Rb1,以Rb3为主。有资料证明Rb与Ro是抗心肌缺血的有效单体成分,而Rg为无效甚至有害成分;且PF11具有钙通道激活作用,而Rb3具有钙通道阻制作用。因此,从西洋参茎叶中提取有效组分不仅为制成注射剂创造了条件,并能增强抗心肌缺血作用,成为治疗急性心肌梗死的新药。
经研究发现:PQDS能明显缩小犬急性心肌梗死范围,降低血清CK,LDH活性,并纠正缺血时FFA代谢紊乱,对抗自由基引发的脂质过氧化反应,增强体内抗氧化酶活性;PQDS能明显减慢HR,使舒张期延长,延长心内膜供血时间;加之可减少LVEDP的升高幅度,降低左室舒张期内压,亦可增加心内膜心肌供血;此外,PQDS还可增加MBF,降低CVR,从而改善缺血区血流供应;PQDS对急性心肌缺血具有明显的保护作用;PQDS明显增加急性心肌梗死犬心肌血流量,降低冠脉血管阻力,改善缺血心肌供血,亦是其抗心肌缺血的重要药理依据。西洋参二醇组皂苷能加强超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶的活力并减少质氧化物的生成,表明它对心肌缺血再灌注操作具有保护作用。因此,方中用西洋参提取物取代红参后,在保留原有功效的同时可以降低毒副作用,从而减少不良反应的发生。
麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon japonicus(Thunb.)Ker-Gawl.的干燥块根。性微寒,味甘微苦,具有养阴生津,润肺清心之功。近年来麦冬的研究发展很快,国内外学者从麦冬类植物中分得45种皂苷、21种高异黄酮等其它成分。
现代药化及药理研究发现,麦冬主含多种甾体皂苷及β-谷甾醇等成分,能增强垂体肾上腺皮质***功能,提高肌体适应性。同时有大量研究资料表明,麦冬对心血管***有显著作用,即麦冬能改善心肌收缩性,增强心脏排血量,降低心脏负荷和心肌耗氧量,并具有明显改善左心室功能和抗休克作用,现代临床研究发现,单味麦冬的水煎剂及注射剂,均对慢性心功能不全,冠心病有明显疗效。
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的成熟果实,性温,味酸甘,含挥发油约0.8%,木脂素约5%,柠檬酸,苹果酸及少量酒石酸等有机酸9.11%,有助于心脏活动,对不正常的心压有调整作用,尤其对循环衰竭者,生高血压颇为显著。
从五味子科植物中分离出的五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲和酯乙均有不同程度的降低因化学物质引起的血清转氨酶升高作用。五味子挥发油主要是萜类化合物,能加速戊巴比妥钠的代谢,对中枢***具有兴奋作用。分离出的木脂素,具有保肝降酶活性的大多数为联苯环辛烯类木脂素,此类物质对肝脏有保肝、诱导药酶增加解毒功能,抗氧化,促进蛋白质生物合成和糖原生成等作用。五味子还具有降低血压的作用,与其含有的多种有机酸可使血管舒张有关。五味子作为滋补药,能使神经***兴奋和抑制过程加强,促进二者平衡,有利于神经衰老的恢复。五味子有与人参相似的“适应原”的作用,能增强肌体对非特性刺激的防御能力,有抗菌消炎的功效。
本发明的药物制剂克服了现有生脉注射液在临床应用过程中诱发心动过速、心绞痛、严重腹胀、过敏性休克、皮肤过敏等不良反应的缺陷。现有生脉注射液的不良反应均疑与方中主药红参强心升压、补气的特性有关。本发明以西洋参替代红参,在保留原有功效的同时可以降低毒副作用,从而减少不良反应的发生。
本发明在对西洋参、麦冬和五味子的有效成分理化性质充分研究的基础上,根据每味药本身特性分别提取精制,最大限度的保留有效成分,除去有关杂质成分,使固体物中可测成分达到80%以上;同时研究了提取纯化后的制剂成型工艺,为临床上用于治疗心衰、冠心病、心绞痛、休克以及提高癌症病人的免疫力等提供了新途经。
具体实施方式
下列实施例是为了进一步举例描述本发明,而不是以任何方式限制本发明。
实施例1:注射剂
1)取1kg西洋参干燥茎叶粉碎成细粒,加8倍量水煎煮三次,每次120分钟,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为7,冷藏放置24小时,沉淀,滤过,冷藏备用;
2)取3.12kg麦冬粉碎成细粒,加5倍量65%乙醇浸泡24小时,滤过,滤液备用,药渣用6倍量65%乙醇回流提取三次,每次1.5小时,滤过,药渣用少量乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液。减压回收乙醇至无醇味,滤过,冷藏备用。
3)取1.56kg五味子粉碎破壳,加6倍量85%乙醇回流提取60分钟,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。药渣用5倍量水煎煮2次,每次30分钟,滤液浓缩至稠膏状,加3倍量95%乙醇使酒精度为70度,用饱和NaOH溶液调pH值为7.5,搅拌均匀,冷藏放置24小时,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入8倍量95%乙醇使酒精度为85度,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为8.0,搅拌均匀,冷藏放置48小时,滤过。滤液减压回收乙醇,冷藏备用。
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释至3.5L,加3倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至8.0,静置冷藏24小时,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状约4.0L,加入8倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至7.5,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味约5.0L。取D101大孔吸附树脂(干树脂)15kg装于R12×H190cm的玻璃柱中,用蒸馏水淋洗3倍量柱体积,加入1000ml上述浓缩液,水洗2倍柱体积,流速为每小时12L。弃去水洗液,再用约5~6倍柱体积的70%乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩至1200ml,合并五味子提取液800ml。
5)向上述混合液中加入6000ml乙醇,放置过夜,过滤。取1kg脱色树脂ZTC-2装于R10×H100cm玻璃柱中,树脂厚度约为40cm。药液过脱色色谱柱脱色后,流出液减压回收乙醇至无醇味,浓缩。浓缩液加水至5000ml,摇匀,静置冷藏24小时,滤过,按体积加入0.5%的针用活性炭30-40度加热搅拌45分钟,待稍冷后过滤脱炭,微孔滤膜过滤,分别熔封于5ml安瓿中,105℃热压灭菌即得。
实施例2:冻干粉针剂
1)取1kg西洋参干燥茎叶粉碎成细粒,加8倍量水煎煮三次,每次120分钟,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为7,冷藏放置24小时,沉淀,滤过,冷藏备用。
2)取3.12kg麦冬粉碎成细粒,加5倍量65%乙醇浸泡24小时,滤过,滤液备用,药渣用6倍量65%乙醇用回流提取三次,每次1.5小时,滤过,药渣用少量乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液。减压回收乙醇至无醇味,滤过,冷藏备用。
3)取1.56kg五味子粉碎破壳,加6倍量85%乙醇用回流提取60分钟,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。药渣用5倍量水煎煮2次,每次30分钟,滤液浓缩至稠膏状,加3倍量95%乙醇使酒精度为70度,用饱和NaOH溶液调pH值为7.5,搅拌均匀,冷藏放置24小时,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用。合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入8倍量95%乙醇使酒精度为85度,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为8.0,搅拌均匀,冷藏放置48小时,滤过。滤液减压回收乙醇至适量,冷藏备用。
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释至3.5L,加3倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至8.0,静置冷藏24小时,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状约4.0L,加入8倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至7.5,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味约5.0L。取D101大孔吸附树脂15kg装于R12×H190cm的玻璃柱中,用蒸馏水淋洗3倍量柱体积,加入1000ml上述浓缩液,水洗2倍柱体积,流速为每小时12L。弃去水洗液,再用约5~6倍柱体积的70%乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩至1200ml,合并五味子提取液。
5)向上述混合液中加入6000ml乙醇,放置过夜,过滤。取1kg脱色树脂ZTC-2装于R10×H100cm玻璃柱中,树脂厚度约为40cm。药液过脱色色谱柱脱色后,流出液减压回收乙醇至无醇味,浓缩。浓缩液加水至2150ml,摇匀,静置冷藏24小时,滤过,按体积加入0.5%的针用活性炭30-40度加热搅拌45分钟,过滤脱碳,加入350ml 15%甘露醇溶液,摇匀,先过0.8μm的膜,再过0.45μm膜,再用0.22μm的微孔滤膜滤过除菌。灌封每支2.5ml。冷冻干燥即得。冻干条件:真空度750mmHg,预冻温度-50℃,预冻时间2小时;升华温度-30℃,升华时间20小时;第二次升华温度-10℃,升华时间6小时;干燥温度40℃,干燥时间4小时,即得。
用法:一次60-300mg,5-10%葡萄糖注射液稀释后缓慢静脉滴注,一日一次。
本发明注射用洋参生脉的主要药效学研究
1.抗休克作用
2.实验目的
研究本发明注射用洋参生脉的抗休克作用,为临床用药提供初步临床前药理试验依据。
3.实验材料
3.1受试药物
名称:本发明实施例2制备的注射用洋参生脉冻干粉针剂
规格:每支相当于市售生脉注射液2支(即20ml),药材含量为70mg/支。
提供单位:沈阳药科大学药剂教研室
样品配制:每支用2ml 0.9%NaCl注射液溶解,即每mL含35mg。
3.2阳性对照药
名称:生脉注射液(市售):
规格:10ml/支
批号:030708
提供单位:山西太行药业股份有限公司
3.3实验动物
昆明种小白鼠,体重18~26g,雌雄兼用,由沈阳药科大学动物中心提供,合格证号:SCXK(辽)2003-0008。
Wistar大鼠,体重200-300g,雌雄兼用,由沈阳药科大学动物中心提供,合格证号:SCXK(辽)2003-0008。
白色豚鼠,体重300-400g,雌雄兼用,由沈阳双义实验动物研究所提供,合格证号:SCXK(辽)2003-0012。
家犬,体重11~15kg,雌雄兼用,由***总医院动物室提供。生产许可证:SCXK(军)2002-017
3.4其他药物和试剂
乌拉坦:中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号:C20020828;
水合氯醛:中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号:W20021128;
戊巴比妥钠:北京化学试剂公司(德国进口分装),批号:020919;
盐酸异丙肾上腺素:上海禾丰制药有限公司,批号:000701;
盐酸肾上腺素:上海禾丰制药有限公司,批号:030601
SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:20040326;
MDA试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:20040322;
LDH试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:20040331;
CK试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:20040520;
GOT试剂盒:北京北华康泰临床试剂有限公司,批号:040408;
标准蛋白试剂盒(总蛋白72.7g/l):南京建成生物工程研究所,批号:20040305;
氯化硝基四氮唑蓝(NBT):中国医药集团上海试剂公司,批号F20040308
0.9%氯化钠注射液:黑龙江科伦制药有限公司,批号:040213-03;
碳酸氢钠:500g/瓶,天津市博迪化工有限公司,批号:20040206
铁***:500g/瓶,沈阳市试剂一厂,批号:860107
注射用环磷酰胺:200mg/瓶,上海华联制药有限公司,批号:030205
绵羊红细胞:沈阳市大东区前进生物试剂厂
印度墨汁:Indian ink 北京市西中化工厂20020301
磷酸二氢钾:沈阳市试剂一厂,批号:870402
碳酸钠:沈阳化学试剂厂,批号:9511012
肝素钠注射液:天津市生物化学制药厂,批号:20030107
GIEMSA STAIN:1g/管,由华美提供
三氯乙酸:北京市兴津化工厂,批号:20020412;
硫代巴比妥酸:上海试剂二厂,批号:920620;
肝素钠注射液:天津市生物化学制药厂,规格12500单位/支,批号:20020502;
枸橼酸钠:北京化工厂,批号:980326;
碱石灰:北京市南山钙制品厂出品,批号:200050800;
正丁醇:天津市博迪化工有限公司,批号:20040212;
考马斯亮蓝:中国上海化学试剂公司分装,批号:890220;
3.5仪器
RM6300八道生理记录仪:日本光电株式会社
ZMTC-621电磁流量计:日本光电株式会社
CL-770自动生化分析仪:日本岛津公司;
JY2002电子天平:上海精密科学仪器有限公司(天平仪器厂制造);
722分光光度计:上海第三分析仪器厂,(22PC22006);
DL-4000B型离心机:上海安亭科学仪器厂;
HH-S型电热恒温水浴锅:江苏红旗医疗器械厂;
JN-A型精密扭力天平:上海第二天平仪器厂;
电热灼烧器:上海医用电子仪器厂
赛科希德SA-6000血液粘度测试仪:北京赛科希德公司
LG-KOALA血小板聚集测试仪:北京世帝科学仪器公司
烤箱:浙江余姚低塘恒温器厂;
4.给药途径
静脉注射,静脉滴注,同临床给药途径一致。
5.统计方法
根据实验指标不同,分别采用组间比较T检验或X2检验。
6、实验方法与结果
6.1抗休克作用
1、本发明注射用洋参生脉粉针剂(CD)对犬心源性休克的影响
取健康成年杂种犬36只,随机分为6组,分别为空白对照组(不结扎),模型组,CD大剂量组(0.64ml/kg)、中剂量组(0.32ml/kg)、小剂量组(0.16ml/kg),市售生脉注射液组(1.6ml/kg)。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)iv麻醉,背位固定,用烧灼器切开颈部皮肤,分离气管,连接人工呼吸机,频率25~30次/min,常规分离颈总动脉,经压力换能器,测定平均动脉压(MAP);犬右侧卧位固定,左侧第4~5肋间开胸,暴露心脏,剪开心包形成心包床,分离主动脉根部,安放适宜电磁流量计(8mm~12mm)测定心输出量(CO)。左心室插管经左心室心尖部创口***左心室腔内测量左心室内压(LVP)、左室内压上升最大变化率(+dp/dt)、左室舒张末期压(LEVDP);同时连接II导联心电图;上述各指标同步记录于八道生理记录仪上。同时分离股静脉以备输液给药。给药容量5ml/kg,控制滴速约20滴/min;于冠状动脉左前降支(LAD)根部、中部、末梢穿线待扎,冠状动脉左回旋支第一大分支远端备结扎线2~3处,每隔10min顺次结扎LAD末梢、中部、根部,观察MBP下降原70%以下,CO减小原30%以下为休克指标。如结扎LAD未达到休克指标,再分别从冠状动脉左回旋支远端向近端结扎。休克模型BP10min内不回升时,分别iv给药,模型组及空白对照组给于等容量的生理盐水,荧光动态监视给药后5、10、15、20、30、45、60、90、120时各项指标的变化。同时分别于给药后60min抽取股动脉血,测血清心肌酶水平。给药后120min记录完毕,立即取下心脏,N-BT染色,以称重法测定心肌梗塞范围。并计算心脏指数(CI),及总外周阻力(TPVR)。以变化率组间T检验。
梗塞重量占全心%=梗塞心肌重量(g)/全心重(g)*100%
梗塞重量占心室%=梗塞心肌重量(g)/心室重(g)*100%
心脏指数CI(L/min·m2)=心输出量(L/min)/体表面积(m2)
总外周阻力TPVR(kPa s/L)=血压(kPa)/心输出量(L/60s)
表1本发明注射用洋参生脉对心源性休克犬MAP、CO、HR、LVP、LVEDP的影响(
x±s,n=6)
参数 | 组别 | 给药前 | 休克 | 给药后各时间点(min) | |||||||
5 | 10 | 20 | 30 | 45 | 60 | 90 | 120 | ||||
MBP(kPa)Co | 空白 | 16.1±2.4 | 15.8±2.2 | 15.8±2.2 | 15.8±2.2 | 15.6±2.1 | 15.8±2.2 | 15.9±2.3 | 15.8±2.4 | 15.7±2.4 | 15.9±2.5 |
模型 | 15.3±2.0 | 10.4±1.6## | 10.6±1.7 | 10.8±1.5 | 10.5±1.1 | 10.0±2.0 | 9.7±1.9 | 9.5±1.9 | 9.2±2.1 | 9.1±2.2 | |
大剂量 | 16.4±2.9 | 9.6±1.8## | 10.2±2.3 | 10.9±2.7 | 12.0±2.8** | 12.9±3.0** | 13.8±2.8** | 14.3±2.7** | 14.6±2.7** | 14.8±2.7** | |
中剂量 | 16.7±2.1 | 10.4±2.3## | 11.3±2.2 | 11.8±2.3* | 12.5±2.1** | 13.0±2.0** | 13.4±1.8** | 13.7±2.0** | 14.0±1.8** | 14.0±1.9** | |
小剂量 | 18.6±1.9 | 11.1±2.0## | 11.5±2.1 | 11.9±2.3 | 12.6±2.2* | 13.1±2.2** | 13.6±2.4** | 13.8±2.3** | 14.0±2.4** | 14.1±2.5** | |
阳性 | 15.6±2.8 | 10.6±2.4## | 11.2±2.3 | 11.7±2.0 | 12.7±1.8* | 13.1±1.8* | 13.4±1.8** | 13.7±1.7** | 13.8±1.8** | 14.0±1.8** | |
CO(L/min) | 空白 | 0.78±0.19 | 0.76±0.20 | 0.75±0.21 | 0.76±0.20 | 0.75±0.20 | 0.76±0.20 | 0.77±0.21 | 076±0.21 | 076±0.19 | 0.76±0.21 |
模型 | 0.76±0.19 | 0.32±0.09## | 0.33±0.08 | 0.34±0.08 | 0.33±0.10 | 0.32±0.11 | 0.33±0.11 | 0.34±0.12 | 0.32±0.13 | 0.30±0.11 | |
大剂量 | 0.89±0.20 | 0.26±0.08## | 0.28±0.07 | 0.31±0.08 | 0.37±0.09** | 0.42±0.08** | 0.45±0.09** | 0.46±0.09** | 0.46±0.10** | 0.45±0.09** | |
中剂量 | 1.01±0.24 | 0.37±0.14## | 0.39±0.14 | 0.43±0.14* | 0.46±0.13** | 0.48±0.12** | 0.50±0.12** | 0.52±0.10** | 0.54±0.10** | 0.56±0.10** | |
小剂量 | 1.06±0.29 | 0.37±0.12## | 0.41±0.14 | 0.45±0.10* | 0.52±0.11** | 0.56±0.12** | 0.59±0.11** | 0.61±0.12** | 0.64±0.12** | 0.66±0.12** | |
阳性 | 0.87±019 | 0.31±0.13## | 0.32±0.13 | 0.36±0.13 | 0.40±0.14** | 0.43±0.14** | 0.45±0.16** | 0.47±0.13** | 0.47±0.16** | 0.47±0.16** | |
HR(次/min) | 空白 | 169±15 | 168±15 | 167±15 | 168±15 | 168±15 | 167±14 | 168±15 | 168±15 | 167±16 | 168±16 |
模型 | 156±21 | 128±21 | 127±20 | 128±21 | 128±19 | 130±19 | 128±21 | 126±19 | 126±19 | 126±18 | |
大剂量 | 152±18 | 103±15 | 104±17 | 107±16 | 109±18 | 112±19 | 115±22 | 116±21 | 117±20 | 117±23 | |
中剂量 | 147±23 | 119±15 | 119±18 | 120±18 | 121±21 | 122±21 | 120±19 | 120±19 | 122±20 | 123±20 | |
小剂量 | 141±17 | 91±17 | 92±17 | 94±18 | 97±18 | 99±16 | 102±16 | 102±16 | 104±16 | 104±17 | |
阳性 | 141±15 | 102±14 | 101±14 | 101±13 | 103±14 | 103±13 | 104±14 | 104±14 | 104±14 | 105±13 | |
LVP(kPa) | 空白 | 15.1±3.6 | 15.3±3.5 | 15.2±3.3 | 15.2±3.5 | 14.7±3.3 | 14.8±3.5 | 15.0±3.8 | 15.0±3.5 | 15.2±3.6 | 15.2±3.5 |
模型 | 17.3±4.3 | 11.7±3.1 | 11.6±3.0 | 11.6±3.0 | 11.4±3.1 | 11.3±3.3 | 11.5±3.6 | 11.2±3.3 | 11.1±3.4 | 11.2±3.4 | |
大剂量 | 15.0±3.5 | 7.8±1.4 | 8.0±1.3 | 8.4±1.6 | 8.9±1.5 | 9.6±1.2 | 10.0±1.4 | 10.6±1.6 | 10.8±1.9 | 11.1±2.1 | |
中剂量 | 15.9±2.8 | 9.0±1.5 | 10.2±1.7 | 10.7±1.8 | 10.7±1.1 | 11.0±1.1 | 11.7±1.4 | 12.3±1.9 | 12.4±1.8 | 12.5±1.8 | |
小剂量 | 17.5±4.1 | 9.8±1.6 | 9.9±1.6 | 10.2±1.8 | 10.7±2.0 | 11.1±2.0 | 11.3±2.2 | 11.6±2.3 | 11.9±2.5 | 12.2±2.6 | |
阳性 | 14.4±3.2 | 8.9±2.4 | 9.3±2.1 | 9.7±1.8 | 10.7±1.8 | 11.0±1.6 | 11.1±1.4 | 11.4±1.4 | 11.2±1.1 | 12.0±2.4 | |
LVEDP(kPa) | 空白 | 0.84±0.18 | 0.86±0.17 | 0.84±0.19 | 0.83±0.16 | 0.84±0.18 | 0.87±0.22 | 0.85±0.21 | 0.82±0.16 | 0.84±0.19 | 0.84±0.17 |
模型 | 0.87±0.22 | 1.17±0.31 | 1.24±0.34 | 1.13±0.27 | 1.12±0.29 | 1.20±0.32 | 1.14±0.33 | 1.14±0.35 | 1.15±0.33 | 1.16±0.35 | |
大剂量 | 0.82±0.19 | 1.25±0.30 | 1.24±0.31 | 1.22±0.31 | 1.12±0.29 | 1.14±0.30 | 1.12±0.29 | 1.03±0.25 | 1.04±0.26 | 1.03±0.26 | |
中剂量 | 0.76±0.23 | 1.28±0.49 | 1.14±0.33 | 1.10±0.31 | 1.06±0.28 | 0.97±0.27 | 0.94±0.26 | 0.88±0.31 | 0.82±0.27 | 0.80±0.25 | |
小剂量 | 0.82±0.27 | 1.28±0.44 | 1.28±0.51 | 1.26±0.50 | 1.24±0.51 | 1.21±0.52 | 1.20±0.53 | 1.14±0.52 | 1.13±0.54 | 1.04±0.49 | |
阳性 | 0.86±0.32 | 1.16±0.28 | 1.17±0.29 | 1.13±0.26 | 1.10±0.21 | 1.07±0.25 | 1.04±0.25 | 1.01±0.26 | 1.00±0.26 | 0.99±0.27 |
*P<0.05,**P<0.01组间变化率与生理盐水组比较。
表2本发明注射用洋参生脉对心源性休克犬CI、TPVR、+dp/dtmax的影响(
x±s,n=6)
参数 | 组别 | 给药前 | 休克 | 给药后各时间点(min) | |||||||
5 | 10 | 20 | 30 | 45 | 60 | 90 | 120 | ||||
CI(L/min·m2) | 空白 | 1.29±0.34 | 1.25±0.35 | 1.24±0.36 | 1.25±0.35 | 1.24±0.35 | 1.25±0.35 | 1.26±0.37 | 1.25±0.36 | 1.25±0.34 | 0.25±0.38 |
模型 | 1.23±0.28 | 0.52±0.14 | 0.53±0.13 | 0.54±0.13 | 0.53±0.16 | 0.52±0.18 | 0.53±0.18 | 0.55±0.20 | 0.52±0.21 | 0.48±0.17 | |
大剂量 | 1.51±0.40 | 0.44±0.15 | 0.47±0.14 | 0.52±0.14 | 0.63±0.15** | 0.71±0.15** | 0.75±0.16** | 0.77±0.15** | 0.77±0.18** | 0.76±0.17** | |
中剂量 | 1.62±0.37 | 0.58±0.21 | 0.63±0.21 | 0.68±0.20* | 0.73±0.19** | 0.77±0.17** | 0.80±0.17** | 0.83±0.15** | 0.86±0.14** | 0.89±0.13** | |
小剂量 | 1.74±0.47 | 0.61±0.19 | 0.66±0.22 | 0.74±0.16* | 0.85±0.17** | 0.92±0.19** | 0.96±0.18** | 1.00±0.18** | 1.05±0.18** | 1.09±0.19** | |
阳性 | 1.42±0.29 | 0.51±0.20 | 0.53±0.21 | 0.59±0.20 | 0.66±0.22** | 0.71±0.21** | 0.74±0.25** | 0.77±0.20** | 0.77±0.25** | 0.76±0.25** | |
TPVR(kPa·S/L | 空白 | 1292±367 | 1310±326 | 1319±328 | 1305±324 | 1306±356 | 1309±348 | 1306±349 | 1314±360 | 1301±340 | 1320±351 |
模型 | 1257±340 | 2008±396 | 1995±387 | 1984±366 | 2059±526 | 1944±375 | 1872±436 | 1807±535 | 1827±542 | 1922±394 | |
大剂量 | 1127±236 | 2388±970 | 2311±848 | 2165±723 | 1987±635* | 1873±545* | 1896±492 | 1889±432 | 1954±465 | 2023±209 | |
中剂量 | 1063±379 | 1978±1033 | 1973±932 | 1855±854 | 1796±738 | 1723±633 | 1692±535 | 1648±482 | 1610±398 | 1556±375 | |
小剂量 | 1114±328 | 1889±442 | 1834±494 | 1626±343 | 1490±318* | 1430±265* | 1413±293 | 1379±269 | 1333±315 | 1301±309 | |
阳性 | 1094±112 | 1139±729 | 2321±828 | 2084±555 | 2066±588 | 1943±489 | 1941±559 | 1809±353 | 1900±472 | 1942±525 | |
+dp/dt(kPa/s) | 空白 | 440±166 | 426±181 | 427±178 | 426±178 | 428±176 | 427±178 | 426±176 | 425±178 | 424±177 | 423±182 |
模型 | 475±219 | 262±104 | 261±102 | 261±94 | 258±99 | 247±98 | 238±93 | 230±82 | 231±82 | 226±84 | |
大剂量 | 412±141 | 210±84 | 212±85 | 234±90 | 248±106* | 277±108** | 311±130** | 312±126** | 323±146** | 324±96** | |
中剂量 | 381±111 | 199±65 | 220±69 | 236±81 | 239±86* | 246±91* | 253±81** | 293±84* | 291±70* | 296±74* | |
小剂量 | 511±186 | 262±62 | 272±51 | 278±65 | 305±42 | 344±46* | 360±50* | 373±53** | 378±56* | 388±58* | |
阳性 | 396±141 | 210±77 | 238±66 | 257±58 | 251±80 | 285±83* | 292±93** | 299±87** | 306±104** | 342±96** |
表3本发明注射用洋参生脉粉针剂对心源性休克犬心肌酶谱的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 指标 | ||||
LDH(U/L) | CK(U/ml) | MDA(nmol/ml) | SOD(U/ml) | GOT(U/L) | ||
生理盐水组 | - | 1446±357 | 349±35 | 7.76±1.78 | 37.2±6.9 | 153.7±20.2 |
大剂量 | 2.4 | 1070±171 | 276±70* | 6.37±0.76 | 49.1±10.6 | 131.1±12.0* |
中剂量 | 1.2 | 1042±198* | 263±73* | 5.35±1.72* | 56.9±16.5* | 124.9±10.6* |
小剂量 | 0.6 | 991±256* | 244±47** | 5.79±1.09* | 54.0±15.3* | 116.1±21.1* |
阳性药 | 1.2ml | 1000±194* | 254±65* | 5.93±0.92* | 51.1±10.0* | 129.4±16.2* |
*P<0.05,**P<0.01与生理盐水组比较。
表4本发明注射用洋参生脉粉针剂对心源性休克犬心肌梗塞范围的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 全心比(%) | 心室比(%) |
生理盐水组 | - | 15.84±3.59 | 19.77±6.28 |
大剂量组 | 2.4 | 9.99±1.24** | 12.15±1.53* |
中剂量组 | 1.2 | 11.10±1.86* | 13.53±2.56* |
低剂量组 | 0.6 | 12.29±2.39 | 14.87±3.33 |
阳性药 | 1.2ml | 11.99±1.78* | 14.79±3.11 |
*P<0.05,**P<0.01与生理盐水组比较。
6.2本发明注射用CD对微循环的影响
6.2.1本发明注射用CD对大鼠肠系膜的影响
Wister大鼠50只,雌雄各半,每组10只,分别为空白对照组,大剂量组(2ml/kg)、中剂量组(1ml/kg)、小剂量组(0.5ml/kg),市售洋参生脉注射液组(5.4ml/kg)尾静脉连续给药5天,每天一次,实验时禁食不禁水12h,20%的乌拉坦腹腔麻醉,背位固定,右下腹部剪毛,约3cm切口,拉出一段肠袢(回肠),平铺于有机玻璃的灌流槽中,大头针固定,用37℃恒温平衡克氏液缓慢灌注,以使肠系膜标保温。用体视显微镜放大100倍,固定视眼于肠系膜的第三分支。观察给药前微动脉的管径及血流状态,尾静脉注射高分子右旋糖苷40(6ml/kg),观察2,5,10min时肠系膜微动脉的管径变化及血流恢复时间。
以前后变化率组间T检验。结果见表5~6。
结果显示:本发明注射用CD可以改变由右旋糖苷所致的微循环障碍,微动脉管径与空白对照组同时间点相比有显著性差别,且中剂量组效果最明显,同时本发明注射用CD缩短由右旋糖苷所致微循环障碍的血流恢复时间。
表5本发明注射用CD对大鼠肠系膜微动脉的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 微动脉管径 | |||
给药前 | 2min | 5min | 10min | ||
空白对照组 | - | 29.0±4.3 | 16.3±3.9(-44.3±8.5) | 18.2±2.8(-36.7±8.1) | 21.1±2.6(-26.9±4.9) |
大剂量 | 2 | 26.8±5.5 | 18.3±4.3**(-31.6±6.8) | 21.5±4.6**(-19.4±6.1) | 23.4±5.2**(-12.9±3.6) |
中剂量 | 1 | 27.6±5.3 | 21.1±5.1**(-24.1±6.1) | 22.1±5.5**(-20.5±6.2) | 24.8±5.5**(-10.7±3.3) |
小剂量 | 0.5 | 29.0±5.0 | 18.9±4.5*(-35.1±9.7) | 22.6±4.3**(-21.7±9.2) | 24.9±3.8**(-13.7±4.2) |
阳性组 | 5 | 25.9±4.7 | 18.2±3.8**(-30.2±4.7) | 21.4±4.3**(-17.5±4.3) | 22.7±4.4**(-12.4±2.8) |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
表6本发明注射用CD对大鼠血流恢复时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 血流恢复时间(min) |
空白对照组 | - | 12.52±1.74 |
大剂量 | 2 | 11.06±1.04** |
中剂量 | 1 | 10.12±1.34** |
小剂量 | 0.5 | 10.63±1.01* |
阳性组 | 5 | 10.61±1.03** |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.2.2本发明注射用CD对小鼠肠系膜的影响
昆明种小鼠50只,雌雄各半,每组10只,分别为空白对照组,大剂量组(3.2ml/kg)、中剂量组(1.6ml/kg)、小剂量组(0.8ml/kg),市售洋参生脉注射液组(7.8ml/kg)连续给药5天,每天一次,实验时禁食不禁水12h,实验方法同6.2.1实验观察给药前微动脉的管径及血流状态。局部滴加50ug/100ml去甲肾上腺素100ul,观察并记录30’,1min,3min时微动脉管径变化及小鼠肠系膜血流恢复时间,变化率组间T检验结果见表7~8,结果显示,注射用CD可以改变由去甲肾上腺素所致的微循环障碍,微动脉管径与空白对照组同时间点相比有显著性差别,且中剂量组效果最明显,同时注射用CD缩短由去甲肾上腺素所致微循环障碍的血流恢复时间。
表7本发明注射用CD对小鼠肠系膜微动脉的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 微动脉管径 | |||
给药前 | 30s | 1min | 3min | ||
空白对照组 | - | 17.3±2.8 | 8.9±1.9(-48.5±7.0) | 11.0±2.2(-36.7±8.1) | 12.8±1.9(-25.9±5.3) |
大剂量 | 3.2 | 19.7±3.2 | 13.5±2.3**(-31.6±6.6) | 15.8±2.2**(19.4±6.1) | 17.6±2.5**(-10.5±3.0) |
中剂量 | 1.6 | 18.4±3.3 | 14.1±6.1**(-24.1±6.1) | 15.2±3.3**(17.6±6.8) | 16.7±2.8**(-8.7±2.7) |
小剂量 | 0.8 | 18.5±3.5 | 12.1±3.2**(-35.1±9.7) | 14.6±3.5**(-21.7±9.2) | 16.3±3.3**(-12.2±3.0) |
阳性组 | 7.8 | 19.8±2.8 | 12.4±1.7**(-30.2±4.7) | 14.7±2.2**(-17.5±4.3) | 15.6±2.4**(-12.4±2.8) |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
表8本发明注射用CD对小鼠血流恢复时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 血流恢复时间(min) |
空白对照组 | - | 5.45±1.31 |
大剂量 | 3.2 | 3.68±0.86** |
中剂量 | 1.6 | 3.31±0.83** |
小剂量 | 0.8 | 3.98±0.83** |
阳性组 | 7.8 | 3.77±1.08** |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.2.3本发明注射用CD对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响
取200~250克,Wistar大鼠60只,每组10只,分别为空白对照组,模型组,大剂量、中剂量、小剂量及阳性对照组,每天尾静脉给药1次,连续7天。末次给药后30分钟给药组、阳性组、模型组均皮下注射盐酸肾上腺素注射液80ug/kg,4小时后追加1次盐酸肾上腺素(s.c.80ug/kg),在2次之间(前后各间隔2h),将大鼠浸入冰水中5min,处置后各组大鼠均停食,次晨7%水合氯醛麻醉(0.5ml/kg),心脏取血,肝素抗凝(每毫升血中含31.25u肝素),测定血液流变学高、中、低切(200/s、30/s、5/s、1/s)全血粘度,血浆粘度及红细胞压积(HCT)等各项指标。结果见表9,注射用CD大、中、小剂量组均有降低急性血瘀大鼠全血粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05)。
表9、本发明注射用CD对血瘀大鼠血液流变学各项指标的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 全血粘度(厘泊) | 血浆粘度(mPas) | 血沉(mm/h) | 红细胞压积(L/L) | 红细胞聚集指数 | |||
200/S | 30/S | 5/S | 1/S | ||||||
空白组 | - | 3.55±0.83 | 5.22±0.69 | 9.40±2.67 | 21.20±4.91 | 1.48±0.03 | 3.20±1.03 | 0.42±0.02 | 5.54±1.22 |
模型组 | - | 4.80±0.65△△ | 6.93±0.86△△ | 13.69±1.46△△ | 32.71±4.11△△ | 1.55±0.07△ | 3.30±1.25 | 0.46±0.02△△ | 7.11±1.00△ |
CD | 2.0 | 3.82±1.05* | 5.45±1.38* | 10.11±3.95* | 24.10±7.37** | 1.48±0.04* | 3.80±1.69 | 0.43±0.03* | 6.18±0.78* |
1.0 | 3.69±0.92* | 5.55±1.22* | 10.78±3.43* | 26.76±5.77* | 1.49±0.04* | 3.00±1.49 | 0.43±0.03* | 6.05±1.08* | |
0.5 | 3.73±1.10* | 5.40±1.60* | 9.86±3.93* | 24.27±8.11* | 1.50±0.04* | 3.20±1.62 | 0.43±0.02* | 5.87±0.95* | |
市售苦碟子 | 5.0ml | 3.72±1.13* | 5.54±1.16* | 10.53±3.13* | 24.04±8.90* | 1.50±0.04* | 3.20±1.55 | 0.43±0.03* | 5.84±1.33* |
**P<0.0.1,*P<0.05,与模型组比较;△△P<0.01,△P<0.05,与空白对照组比较
6.3抗应激作用
6.3.1、对小鼠常压耐缺氧的影响
取小鼠50只,随机分为5组,实验分组及给药剂量同6.2.2,尾静脉给药,10ml/kg。10min后将小鼠分别放入150ml的磨口广口瓶内,密封。瓶内放钠石灰5.0g,用以吸收二氧化碳和水。钠石灰上垫的滤纸用以吸收尿液。广口瓶在用前均盛水校正容积。每瓶放小鼠一只,瓶口涂以凡士林油以防漏气。以最后一次呼吸为指标,观察小鼠的存活时间。结果见表10,结果显示,注射用CD能明显延长小鼠在密闭关口瓶中的存活时间,尤其大剂量的作用最显著。
表10本发明注射用CD对常压缺氧小鼠存活时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 存活时间(min) | 延长率(%) |
空白 | - | 14.9±2.7 | - |
大剂量 | 3.2 | 21.1±3.1** | 41.61 |
中剂量 | 1.6 | 19.6±2.9** | 31.54 |
小剂量 | 0.8 | 18.4±2.1* | 23.49 |
阳性 | 7.8 | 19.1±2.5** | 28.19 |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.3.2对小鼠异丙肾上腺素引起心肌耗氧量的影响
取小鼠60只随机分为6组,分别为生理盐水对照组、异丙肾上腺素模型组、大剂量组、中剂量组、小剂量组、阳性对照组。给药剂量同6.2.2,对照组尾静脉注射生理盐水0.1ml/10g,5min后腹腔注射生理盐水0.2ml/10g,模型组皮下注射异丙肾上腺素0.15mg/10g,给药组尾静脉注射CD,5min后按0.15ml/10g的剂量皮下注射盐酸异丙肾上腺素,10min后放入广口瓶中密封。观察小鼠在广口瓶中的存活时间并计算其延长率。结果见表11,结果显示,注射用CD明显延长小鼠在密闭广口瓶中的存活时间。
表11本发明注射用CD对小鼠异丙肾上腺素引起心肌耗氧量的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量 | 存活时间 | 延长率 |
空白 | - | 21.5±4.5 | - |
模型 | - | 14.3±1.4** | -33.49 |
大剂量 | 3.2 | 19.2±3.0** | -10.70 |
中剂量 | 1.6 | 18.9±2.9** | -12.09 |
小剂量 | 0.8 | 19.4±4.8** | -9.77 |
阳性 | 7.8 | 17.5±3.4** | -18.60 |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.3.3对小鼠断头喘气的影响
小鼠分组及给药方式同2.1.1。给药后10min,用大剪刀在耳根部快速断头并用载玻片接血,用秒表记录喘息时间,进行t检验。其结果见表12,结果显示,本发明注射用CD能明显延长小鼠断头喘气时间。
表12本发明注射用CD对小鼠断头喘气时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 喘气时间(min) | 延长率(%) |
空白 | - | 21.3±1.8 | - |
大剂量 | 3.2 | 28.3±3.0** | 32.86 |
中剂量 | 1.6 | 28.0±3.7** | 31.46 |
小剂量 | 0.8 | 27.2±1.7** | 27.70 |
阳性 | 7.8 | 28.0±4.3** | 31.46 |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.3.4对小鼠游泳时间的影响
昆明种小鼠50只,雌雄各半,实验分组及给药剂量同6.2.2,实验组静脉注射相应药物,空白对照组注射等容量的生理盐水,连续给药5天,每天一次,最后一次给药后30min,在小鼠尾部束2g的砝码,将小鼠放入玻璃缸内游泳(水温保持在20±0.5℃),计时,以小鼠头部沉入水中10秒钟不能浮出水面为体力耗竭。,结果见表13,结果显示CD能明显延长小鼠的游泳时间,与生理盐水组相比较,有显著性差别。
表13本发明注射用CD对小鼠游泳时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 小鼠游泳时间(Min) |
空白对照组 | - | 2.77±0.57 |
大剂量 | 3.2 | 4.22±1.38** |
中剂量 | 1.6 | 5.18±1.03** |
小剂量 | 0.8 | 4.34±1.10** |
阳性组 | 7.8 | 4.33±0.77** |
*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较
6.4对免疫的影响
6.4.1对正常及免疫力低下小鼠血清溶血素的影响
昆明种小鼠100只,随即分为10组,分别为生理盐水对照组、环磷酰胺模型组、大剂量组、中剂量组、小剂量组、阳性对照组、大剂量和环磷酰胺合用组、中剂量和环磷酰胺合用组、小剂量和环磷酰胺合用组、阳性药和环磷酰胺合用组。上述各组均腹腔给药0.1ml/10g,连续5天。于第3天ip20%绵阳红细胞(SRBC)0.2ml进行免疫,第3~5天给其中5组ip环磷酰胺20mg/kg造成免疫低下模型。第6天眼球取血分离血清,每只取血清20uL稀释500倍后供测定。
反应管内依次加入经稀释的血清1ml,5%SRBC0.5ml,10%补体1ml。置于37℃恒温水浴锅中保温30min,然后转移至冰浴中终止反应,1500r/min离心5min。取上清液1ml加都氏试剂3ml。摇匀放置10min,于540nm波长处比色读取吸光度值。
测定SRBC半数溶血值(HC50):取5%SRBC0.25ml加都氏试剂至4ml,比色读取吸光度值。计算血清HC50=样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。
补充说明:
都氏试剂:NaHCO31.0g,KCN0.05g,K3Fe(CN)60.2g,蒸馏水1000ml溶解,混匀后置5~10℃备用。
补体:豚鼠颈总动脉取血,离心取上清,用生理盐水1∶10稀释。
20%绵阳红细胞(SRBC)悬液:将绵阳血液用生理盐水洗涤血细胞多次,离心,取下层红细胞,用生理盐水1∶4稀释。
5%绵阳红细胞(SRBC)悬液:将绵阳血液用生理盐水洗涤血细胞多次,离心,取下层红细胞,用生理盐水0.5∶10稀释。
结果见表14~15,结果显示注射用CD能使正常小鼠血清溶血素水平明显增加。同时对环磷酰胺所造成的免疫力低下小鼠血清溶血素水平也明显增加。
表14本发明注射用CD对正常小鼠血清溶血素的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | HC50 |
空白 | - | 157.9±17.5 |
大剂量 | 3.2 | 206.5±30.5** |
中剂量 | 1.6 | 191.0±19.4** |
小剂量 | 0.8 | 201.1±23.7** |
阳性 | 7.8 | 184.1±24.6** |
*p<0.05,**p<0.01与空白对照组比较
表15本发明注射用CD对环磷酰胺所致小鼠免疫力低下小鼠血清溶血素的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | HC50 |
空白 | - | 157.9±17.5 |
模型(Cy) | - | 138.7±22.9## |
大剂量(Cy) | 3.2 | 186.9±24.3** |
中剂量(Cy) | 1.6 | 202.3±25.7** |
小剂量(Cy) | 0.8 | 190.9±14.4** |
阳性(Cy) | 7.8 | 187.3±16.4** |
#p<0.05,##p<0.01,与空白对照组比较;*p<0.05,**p<0.01与模型组比较
6.4.5本发明注射用CD对小鼠碳粒廓清能力的影响
取昆明种小鼠100只,雌性,体重18-22g,随机分为10组,实验分组及给药剂量同血清溶血素实验,连续给药5d,第3~5天ip环磷酰胺50mg/kg,末次给药后30min,尾静脉注射10%印度墨汁0.1ml/10g,分别于注射后2min,12min从眼眶静脉取血20微升,溶于2ml0.1%Na2CO3溶液中,在640nm测定吸光度OD值,同时摘取小鼠肝脏,脾脏,并称湿重,计算廓清指数K及吞噬指数α,并作t检验。
K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)
α=k^3*体重/(肝重+脾重)
OD1、OD2分别为两次取血所得的光密度;t2-t1:为两次取血样的时间差,此次实验中t2-t1=10结果见表16-17,结果显示:注射用CD能使正常小鼠的廓清能力增强,抑制由环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠廓清指数k和a的降低。
表16本发明注射用CD对正常小鼠碳粒廓清能力的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | k | a |
空白对照 | - | 0.029±0.017 | 2.858±1.454 |
大剂量 | 3.2 | 0.050±0.015* | 4.333±0.607** |
中剂量 | 1.6 | 0.053±0.011** | 4.030±0.397* |
小剂量 | 0.8 | 0.054±0.024* | 3.754±1.162 |
阳性 | 7.8 | 0.051±0.017* | 3.289±1.594 |
*p<0.05,**p<0.01与空白对照组比较
表17本发明注射用CD对免疫功能低下小鼠碳粒廓清能力的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | k | a |
空白对照 | - | 0.029±0.017 | 2.858±1.454 |
模型 | - | 0.017±0.005 | 2.369±0.869 |
大剂量+Cy | 3.2 | 0.035±0.016** | 3.435±0.887* |
中剂量+Cy | 1.6 | 0.032±0.017* | 2.820±1.212 |
小剂量+Cy | 0.8 | 0.042±0.016** | 3.101±1.223 |
阳性+Cy | 7.8 | 0.037±0.015** | 3.485±1.560 |
*p<0.05,**p<0.01与空白对照组比较
6.4.5对巨噬细胞吞噬能力的影响
昆明种小鼠18~22g,雄性,给药第4天各组小鼠ip肉汤培养液1ml。24小时后,各组小鼠同法给药一次。一小时后,ip2%鸡红细胞液0.5ml。40分钟后处死小鼠,剖腹取腹腔液涂片,染色,镜检。观察吞噬百分率及吞噬指数。
观察指标为:在显微镜视野下观察100个巨噬细胞
结果见表18,结果显示注射用CD中、小剂量能明显增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数,但大剂量作用不明显。
表18本发明注射用CD对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 吞噬百分率 | 吞噬指数 |
空白 | - | 23.50±0.55 | 0.768±0.076 |
大剂量 | 3.2 | 24.70±1.19** | 0.794±0.087 |
中剂量 | 1.6 | 23.56±1.50** | 1.005±0.143** |
小剂量 | 0.8 | 37.09±2.01** | 1.138±0.249** |
阳性 | 7.8 | 31.27±1.97** | 1.018±0.229** |
*p<0.05,**p<0.01与空白对照组比较
6.5对血液***的影响
6.5.1对小鼠凝血时间的影响[29]
昆明种小鼠18-22g,雄性,50只,实验分组及给药剂量同6.3.4,每只小鼠ip给药0.1ml/10g,1h后用内径1mm的玻璃毛细管眼眶后静脉丛中取血,迅速滴于玻片上立即计时,此后每30秒用干燥针头挑动血液一次,至针头能挑起纤维蛋白丝为止,即为凝血时间。结果见表19,结果显示本发明注射用CD能明显延长小鼠的凝血时间。
表19本发明注射用CD对小鼠凝血时间的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 凝血时间(s) | 延长率(%) |
空白 | - | 108.6±30.2 | - |
大剂量 | 3.2 | 160.8±59.1* | 48.07 |
中剂量 | 1.6 | 187.7±99.2* | 72.84 |
小剂量 | 0.8 | 204.8±73.7** | 88.58 |
阳性 | 7.8 | 198.5±56.0** | 82.78 |
*p<0.05,**p<0.01与空白对照组比较
6.6抗炎作用
6.6.1.对小鼠二甲苯性耳肿胀的影响
取体重25~30g雄性小鼠60只,随机分为6组,每组10只,实验组本发明注射用CD 3.2、1.6、0.8ml/kg,市售生脉注射液7.8ml/kg,空白对照静脉注射等容量生理盐水,每天1次,连续给药3天,末次给药后1小时,于小鼠右耳正反面涂二甲苯25ul/耳,1小时后脱颈椎处死,在左右耳相同部位用9mm打孔器打下耳片,扭力天平称重,计算肿胀度(mg)及抑制率(%),结果见表20。
肿胀度(mg)=右耳耳片重(mg)-左耳耳片重(mg)
结果显示,本发明注射用CD及市售生脉注射液组对小鼠二甲苯性耳肿胀均有较为明显的抑制作用(P<0.05)。
表20、本发明注射用CD对小鼠二甲苯性耳肿胀的影响(
x±s,n=10)
组别 | 剂量(ml/kg) | 肿胀度(mg) | 抑制率(%) |
生理盐水组 | - | 18.5±5.0 | |
大剂量 | 3.2 | 11.7±5.7* | 13.5 |
中剂量 | 1.6 | 12.7±3.9** | 14.8 |
小剂量 | 0.8 | 14.6±2.9 | 11.1 |
阳性组 | 7.8 | 12.9±3.6* | 12.5 |
*P<0.05,**p<0.01与生理盐水组比较;
6.6.2对离体豚鼠心脏冠脉流量的影响
按Langendoff法组装心脏灌流装置,通入氧气,使冷凝管内Kreb’s液被氧气饱合,调整冷凝管,使其距主动脉根部50cm左右。取450~500g豚鼠,雌雄兼用,击后脑致昏,剪开胸腔与心包膜,剪断与心脏相连的血管,取出心脏,立即放入低温(4℃左右)Kreb’s液中并轻轻挤压,排出余血。在升主动脉断端***主动脉插管,结扎固定于心脏灌流装置(在心脏下置一漏斗,下接量筒以测定冠脉流量),打开弹簧夹,按Langendoff法恒压恒速灌流,保持心脏内温度37±1℃,心脏适应和恢复10分钟左右后,冠脉流量基本稳定,连续测量3分钟的每分钟流量,若数量相近,以其均值作为给药前的正常流量(可根据心脏大小,适当调节灌流压而加以控制),从主动脉插管上方之橡皮管(或主动脉插管之侧管)
分别注入CD大(0.1ml/ml)、中(0.05ml/ml)、小(0.025ml/ml)及阳性药(0.25ml/ml)0.2ml,测定给药后1~5分钟内每分钟流量,找出其极值,算出给药后灌流量之最大增减百分率。
表21本发明注射用CD对离体豚鼠冠脉流量的影响(x±s,n=6)
组别 | 剂量(mg/ml) | 冠脉流量 | |||
给药前 | 给药后极值 | 增加值 | 增加百分率(%) | ||
大剂量中剂量小剂量阳性药 | 0.20.10.050.1ml | 7.07±1.237.08±1.107.12±1.347.13±0.94 | 11.60±1.0210.78±1.239.77±1.6811.18±1.23 | 4.53±1.643.70±1.602.65±1.444.05±1.03 | 68%55%39%58% |
结论:
1.抗休克作用
本发明注射用洋参生脉能显著提高心源性休克犬的血压,心输出量,降低总外周阻力,提高休克犬的左室内压,降低左室舒张末期压,降低血清中LDH、CK、MDA、GOT的含量,增加SOD的活力,减小心肌梗塞面积。于模型组相比有显著性差别。其作用于临床等效量的生脉注射液基本相当。
2、对微循环及血液流变学的影响
能明显改善由高分子右旋糖苷所致的大鼠微循环障碍,增加大鼠肠系膜的微动脉管径,缩短血流恢复时间;能改善由去甲肾上腺素所致的小鼠微循环障碍,增加小鼠肠系膜的微血管管径,缩短血流恢复时间。降低急性血瘀模型大鼠的全血比粘度(高、中、低切粘度),降低红细胞压积及红细胞聚集指数,改善血液流变性。
3、抗应激作用
能明显延长小鼠在密封广口瓶中的存活时间,拮抗异丙肾上腺素引起的小鼠心肌耗氧量增加作用;明显延长小鼠的断头喘气时间及在水中的游泳时间。
4、增强免疫作用
使正常及环磷酰胺免疫抑制小鼠碳粒廓清速率明显升高,显著增加血清溶血素含量,可对抗环磷酰胺的免疫抑制作用。能明显延长免疫低下小鼠的存活时间尤其是小剂量,对免疫功能有明显增强作用。能有效增加小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能,具有一定的增强体液免疫功能。
5、对血液的影响
能延长小鼠的凝血时间,抑制由ADP及AA诱导的血小板聚集,
6、其它
具有一定的抗炎作用,对小鼠二甲苯性耳肿胀均有较为明显的抑制作用,能增加离体豚鼠的冠脉流量。
综上所述,本发明注射用洋参生脉具有抗休克作用,增强免疫,抗应激作用。
Claims (10)
1.一种洋参生脉药物的有效部位,其由西洋参、麦冬和五味子按以下重量份配比制备而成:西洋参3-6,麦冬6-12,五味子1.5-6。
2.根据权利要求1的洋参生脉药物的有效部位,其中西洋参、麦冬和五味子的重量份配比为:1∶3.12∶1.56。
3.根据权利要求1的洋参生脉药物的有效部位的制备方法,其包括以下步骤:
1)取西洋参干燥茎叶,加水煎煮,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬,加乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用乙醇回流提取,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液,减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子,加乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;药渣用水煎煮,滤液浓缩至稠膏状,加乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过。滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,取大孔吸附树脂装于玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液;
5)任选地,将上述的西洋参、麦冬、五味子的混合液进一步纯化,制得药 用有效部位。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其中大孔吸附树脂包括D101、D21、AB-8。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其中工艺步骤为:
1)取西洋参干燥茎叶粉碎成细粒,加6-10倍量水煎煮2-3次,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬粉碎成细粒,加3-6倍量60-70%乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用4-8倍量60-70%乙醇回流提取2-3次,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液,减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子粉碎破壳,加4-8倍量70-90%乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用,药渣用3-6倍量水煎煮1-2次,滤液浓缩至稠膏状,加2-4倍量85-95%乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入6-10倍量85-95%乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加2-4倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入6-10倍量乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味。取D101大孔吸附树脂装于R12×H190cm的玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用60-80%乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液;
5)任选地,将上述的西洋参、麦冬、五味子的混合液进一步纯化,制得药用有效部位。
6.一种洋参生脉药物制剂,其含有权利要求1所述的药用有效部位以及药用辅料。
7.根据权利要求6所述的洋参生脉药物制剂,其中有效部位与药用辅料的重量比为1∶1-1∶10,优选1∶1-1∶5。
8.根据权利要求7所述的洋参生脉药物制剂,其中药用辅料包括甘露醇、吐温-80或右旋糖酐S40。
9.根据权利要求8所述的洋参生脉药物制剂,其制备成各种剂型,包括注射剂、大容量注射剂、冻干粉针剂。
10.根据权利要求6所述的洋参生脉药物制剂的制备方法,其包括以下步骤:
1)取西洋参干燥茎叶,加水煎煮,合并提取液,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,沉淀,滤过,备用;
2)取麦冬,加乙醇浸泡,滤过,滤液备用,药渣用乙醇回流提取,滤过,药渣用乙醇洗涤,合并提取液和洗涤液,减压回收乙醇至无醇味,滤过,备用;
3)取五味子,加乙醇回流提取,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;药渣用水煎煮,滤液浓缩至稠膏状,加乙醇,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,备用;合并乙醇提取液和水提醇沉液,加入乙醇,进行第二次醇沉,用饱和NaOH溶液调pH值为6-8,搅拌均匀,冷藏放置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,冷藏备用;
4)将西洋参、麦冬提取液混合,加水稀释,加乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH至6-8,静置,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入乙醇分散均匀,用饱和氢氧化钠调pH值至6-8,冷藏,取上清液滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,取大孔吸附树脂装于玻璃柱中,用蒸馏水淋洗,加入上述制得的浓缩液,水洗、弃去水洗液,再用乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Re和Rg1,收集、合并醇洗液,回收乙醇并浓缩,合并五味子提取液;
5)向上述混合液中加入乙醇,放置过夜,过滤,取脱色树脂,装于玻璃柱中,药液过脱色色谱柱脱色后,流出液减压回收乙醇至无醇味,浓缩,浓缩液加水,摇匀,静置,滤过,按体积加入针用活性炭搅拌,过滤脱炭,微孔滤膜过滤,熔封于安瓿中,灭菌即得。
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