CH715311A1 - Procédé de purification d'une solution. - Google Patents

Abstract

L’invention concerne un procédé de purification au moins partielle d’une solution, typiquement un plasma sanguin, qui comprend une étape de mise de la solution sous l’influence d’un composé soufré notamment disulfure. Le procédé a pour effet la suppression des séquences aqueuses dérivées de l’ADN de Borrelia burgdorferi par des émanations de gaz H2S. L’invention concerne aussi un procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution contenant initialement un élément biochimique, comprenant les étapes E2 à E6. Un médicament est aussi revendiqué.

Description

[0001] La présente invention porte sur un procédé de purification d’une solution. Elle porte aussi sur un procédé de diagnostic de l’état, purifié ou non, d’une solution. Elle est particulièrement applicable à la purification d’une solution comprenant des agents infectieux, notamment provenant du sang d’un patient. Elle permet la mise au point d’un médicament pour le traitement de maladies chroniques d’origine infectieuse.

[0002] La recherche de la présence d’éléments biochimiques de type bactéries, ou de formes bactériennes, de virus, etc., est très utile dans de nombreuses situations, notamment pour des applications médicales, pour réaliser un diagnostic le plus pertinent possible. Dans ces applications médicales, la recherche bactérienne ou virale est par exemple souvent effectuée à partir d’un plasma sanguin dont on extrait de l’ADN. Une telle recherche est complexe car il faut éviter toute contamination bactérienne des prélèvements sanguins, qui fausserait les résultats. De plus, les procédés existants mettent en œuvre des domaines de filtrations et autres étapes traditionnelles, qui s’avèrent insuffisantes dans certaines situations. Il en résulte que certaines bactéries ou certains virus, et plus généralement certains éléments biochimiques, notamment lorsqu’ils sont présents en faible quantité, restent très difficiles, voire impossibles à détecter, ce qui induit des erreurs de diagnostic et des traitements thérapeutiques inadaptés. Il en résulte de même qu’il est très difficile de savoir si une certaine solution est pure ou comprend certains éléments biochimiques en faible quantité. En complément, il s’avère que les procédés existants sont insuffisants pour purifier une solution contenant des éléments biochimiques en faible quantité.

[0003] La présente invention vise à pallier ces inconvénients des procédures traditionnelles de l’état de la technique et cherche une solution de purification d’une solution contenant un élément biochimique en faible quantité.

[0004] En outre, l’invention repose aussi sur un procédé permettant de valider l’état purifié ou non d’une certaine solution.

[0005] A cet effet, l’invention porte sur un procédé de purification au moins partielle d’une solution, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise de la solution sous l’influence d’un composé soufré.

[0006] Le procédé de purification d’une solution peut comprendre tout ou partie des étapes suivantes: <tb>a.<SEP>Ajout dudit composé soufré, sous forme gazeuse ou liquide, à la solution ou à une eau dans laquelle la solution est diluée; et/ou <tb>b.<SEP>Mise de la solution en contact avec une atmosphère comprenant ledit composé soufré.

[0007] Ledit composé soufré peut comprendre du disulfure S2.

[0008] La solution peut être purifiée d’un composant biochimique qu’elle contient, de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella.

[0009] La solution peut être un plasma sanguin.

[0010] L’invention porte aussi sur un procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution contenant initialement un élément biochimique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: Avant la purification de ladite solution: forte dilution de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–3>; amplification d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse et/ou par séquençage d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse du résultat permettant de détecter la présence dudit élément biochimique; puis

[0011] Mise en œuvre du procédé de purification de la solution selon l’une des revendications précédentes, puis, après purification de ladite solution: forte dilution de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–3>; amplification d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse et/ou par séquençage d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse du résultat permettant de constater la disparition d’une détection de la présence dudit élément biochimique constatée avant la purification.

[0012] La forte dilution de la solution peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une dilution à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><4>, ou 10<–><8>, ou 10<–><10>, ou 10<–><1><3>, voire à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><15>et/ou à un taux de dilution compris entre 10<–3>et 10<–3><0>inclus, voire entre 10<–><10>et 10<–><20>inclus.

[0013] Le procédé peut être répété, de manière similaire avant et après purification, à partir de l’étape d’amplification, avec plusieurs échantillons de la solution correspondant à plusieurs fortes dilutions différentes.

[0014] Le procédé peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de forte agitation de la solution fortement diluée avant l’étape d’amplification.

[0015] L’étape de forte dilution peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de dilution qui comprend une série de dilutions successives de la solution, dans de l’eau non contaminée, avec une agitation pendant au moins 10 secondes, voire au moins 15 secondes, entre tout ou partie des dilutions de la série de dilutions successives.

[0016] L’étape d’amplification peut mettre en œuvre une réaction en chaîne par polymérase PCR comprenant au moins 45 thermocycles, et/ou utilisant comme polymérase celle connue par son nom commercial de PerFecTa, de manière similaire avant et après purification.

[0017] L’invention porte aussi sur un médicament pour soigner une maladie infectieuse chronique du type la maladie de Lyme, l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, ou la maladie d’AIzheimer, caractérisé en ce qu’il comprend un composé soufré.

[0018] Ce médicament peut comprendre un composé soufré, gazeux ou liquide. Ledit composé soufré peut comprendre du disulfure S2.

[0019] Le médicament peut agir par inhibition d’un composant biochimique de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella.

[0020] Ces objets, caractéristiques et avantages de la présente invention seront exposés en détail dans la description suivante d’un mode d’exécution particulier fait à titre non-limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles; <tb>La fig. 1<SEP>représente un logigramme des étapes d’un procédé de détection de la présence d’un élément biochimique dans une solution, qui sera utilisé par un mode de réalisation de l’invention. <tb>Les fig. 2a et 2b<SEP>représentent respectivement les résultats de l’application du procédé de détection obtenus sur un patient de 14 ans et sa mère, tous deux atteints par la maladie de Lyme. <tb>La fig. 3<SEP>représente les résultats de l’application du procédé de détection d’une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau Millipore. <tb>La fig. 4<SEP>représente les résultats de l’application du procédé de détection d’une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique.

[0021] En préambule, un procédé de détection de la présence d’un élément biochimique dans une solution va être décrit dans le cadre d’une recherche à titre d’exemple à partir d’un plasma sanguin.

[0022] Ce procédé comprend une première étape préalable de préparation E1 du plasma sanguin.

[0023] Pour cela, il est possible de prélever entre 2 et 5 ml de sang d’un patient en présence d’un anti-coagulant tel que l’EDTA (Acide éthylène Diamine Tetra Acétique). Le sang est ensuite centrifugé à une vitesse de 3000 trs/min pendant cinq minutes, à une température régulée de 20 °C. Cette opération permet de séparer et de récupérer le plasma sanguin. Le plasma sanguin est stocké à une température de –20 °C s’il n’est pas utilisé immédiatement. Il est stocké à une température de 4 °C s’il est utilisé immédiatement.

[0024] Ensuite, selon une première sous-étape de dilution E11 de cette étape de préparation E1, un échantillon de plasma est dilué dans de l’eau stérile selon un ratio de 1:100. Cette étape de dilution au niveau de la préparation a pour fonction d’obtenir une quantité plus importante de plasma, ce qui peut être utile si de nombreuses analyses sont prévues. Cette sous-étape reste donc optionnelle.

[0025] Une deuxième sous-étape de filtration E12 comprend le passage successif du plasma dilué à travers des filtres de 450 nm et 100 nm, par exemple à l’aide de filtres Millex commercialisés par la société Millipore. Cette filtration permet de supprimer potentiellement toute ou quasi-toute bactérie et une grande partie, voire la totalité, des virus du plasma. Il reste les corps les plus petits, notamment les traces d’ADN et d’ARN. Ainsi, comme cela va être détaillé par la suite, le procédé de détection repose d’abord sur la détection d’une trace d’un élément biochimique, particulièrement de l’acide nucléique ou des nucléotides, que nous appellerons aussi trace d’ADN, provenant de cet élément biochimique ou correspondant à cet élément chimique, avant de pouvoir conclure a posteriori à la présence initiale de l’élément biochimique dans le plasma analysé.

[0026] Cette étape préalable de préparation E1 étant finalisée, le procédé de détection, qui consiste en un procédé de détection ultrasensible d’un élément biochimique dans une solution, par l’intermédiaire de la détection d’une trace de cet élément, comme un nucléotide, un acide nucléique ou trace ou séquence d’ADN de cet élément dans la solution, va maintenant être décrit.

[0027] En remarque, ces étapes sont réalisées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II. L’opérateur porte des vêtements de protection, comme une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et un masque.

[0028] Le procédé comprend d’abord une deuxième étape de dilution E2.

[0029] Cette étape est mise en œuvre à partir d’eau stérile. Le procédé met alors en œuvre une première sous-étape de filtration E21 de l’eau stérile, par un filtre à 220 nm, pour éliminer les éventuels corps microbiens qui contamineraient l’eau. Cette sous-étape est conseillée mais optionnelle, elle dépend de la qualité de l’eau stérile disponible.

[0030] Enfin, le procédé met en œuvre une deuxième sous-étape de dilution E22 en tant que telle. Cette sous-étape comprend une série de dilutions successives dans l’eau non contaminée de la solution à analyser, résultant des étapes précédentes, c’est-à-dire le plasma sanguin dans ce mode de réalisation.

[0031] Plusieurs microtubes en polypropylène de 1,5 ml peuvent être remplis de 0,9 ml d’eau chacun. Ensuite, 0,1 ml d’un échantillon de plasma est ajouté au premier microtube, puis 0,1 ml de ce premier microtube est prélevé et reporté dans le deuxième microtube, et ainsi de suite. Cela permet donc d’enchainer en série plusieurs dilutions décimales. Avantageusement, après chaque remplissage d’un microtube, soit après chaque dilution décimale, le microtube rempli est agité au vortex à la vitesse maximale pendant au moins 10 secondes, de préférence au moins 15 secondes, avant de poursuivre avec une nouvelle dilution. Un nombre d’au moins 10 dilutions, voire au moins 20, est ainsi réalisé.

[0032] Ce nombre de dilutions est avantageusement compris entre 10 et 20 inclus, voire au-delà de 20 dilutions. Autrement dit, le taux de dilution est inférieur ou égal à 10<–><10>, ou compris entre 10<–10>et 10<–><2><0>inclus, voire inférieur ou égal à 10<–><2><0>.

[0033] Toutefois, cette dilution dépend de l’élément biochimique recherché et le procédé pourra commencer à donner des résultats pour des fortes dilutions de quatre dilutions décimales, soit un taux de dilutions de 10<–><4>. En remarque, ce taux de dilution correspond au taux de dilution total, c’est-à-dire prenant en compte les éventuelles dilutions réalisées avant la mise en œuvre de cette deuxième étape E2, par exemple durant l’étape de préparation E1 mentionnée précédemment.

[0034] Cette deuxième étape E2 permet donc d’obtenir une solution très fortement diluée, que nous appellerons plasma fortement dilué pour la suite de la description.

[0035] En remarque, le procédé de détection prévoit une forte agitation de la solution avant l’étape d’amplification qui va être décrite ci-après. Ce procédé prévoit aussi avantageusement une forte agitation de la solution au cours de la réalisation de cette sous-étape de dilution, par la succession de sous-étapes de dilutions et d’agitations. L’agitation est plus généralement mise en œuvre entre tout ou partie des dilutions successives. De plus, l’agitation est une forte agitation, au vortex à grande vitesse, par exemple dans un dispositif à 50 Hz à une vitesse de 2700 trs/min, pendant au moins dix secondes, voire au moins quinze secondes.

[0036] Naturellement, l’étape de dilution E2 peut en variante comprendre d’autres dilutions que des dilutions décimales.

[0037] Avantageusement, cette étape de dilution E2 est mise en œuvre par un robot diluteur, qui comprend un bras permettant de réaliser automatiquement les opérations d’ouverture d’un microtube, de prélèvement d’une dose prédéfinie avec précision, fermeture du microtube, versement d’une dose dans un microtube voisin, etc. En complément, ce robot diluteur met de plus en œuvre une fonction d’agitation de microtube. Pour cela, il peut comprendre un support rotatif pour microtube, permettant son agitation par sa mise en rotation. En variante, un autre moyen d’agitation est possible. Avantageusement, la vitesse et/ou la durée d’agitation est réglable.

[0038] Le procédé met alors en œuvre une troisième étape E3 d’amplification de traces d’ADN au sein de la solution fortement diluée.

[0039] Cette troisième étape utilise un procédé de réaction en chaîne par polymérase PCR.

[0040] Pour cela, plusieurs échantillons de plasma fortement dilué peuvent être utilisés, pour augmenter la fiabilité du procédé. Ces échantillons peuvent correspondre à plusieurs forts taux de dilution distincts et/ou identiques.

[0041] A titre d’exemple, un échantillon de plasma fortement dilué de 5 µl est versé dans un microtube de 0,2 ml, dans lequel on ajoute une polymérase adaptée au procédé PCR, comme celle connue par son nom commercial de PerFecTa ThoughMix de la société Quantabio, et 0,2 µM de chaque amorce choisie, pour obtenir un volume total de 20 µl.

[0042] A titre d’exemple, dans le cas où la bactérie recherchée est la Borrelia burgdorferi, responsable par exemple de la maladie de Lyme, alors le procédé PCR peut être mis en œuvre dans un thermocycleur, par exemple tel que connu par son nom commercial Nexus GSX1/GX2e commercialisé par la société Eppendorf, de la manière suivante: une première étape de dénaturation est engagée à 95 °C pendant 5 minutes, suivie par 45 cycles de températures, comprenant chacun une période de 30 secondes à 95° C, puis 30 secondes à 61 °C, puis 40 secondes à 72 °C, avant une incubation finale de 15 minutes à 72 °C. Le ou les échantillons ainsi traités sont alors refroidis à une température de 4 °C.

[0043] Cette démarche est menée simultanément ou parallèlement, à partir du même échantillon de la solution fortement diluée ou de plusieurs échantillons distincts, pour chaque élément biochimique recherché. Naturellement, les amorces utilisées lors du procédé PCR seront adaptées à l’élément biochimique recherché. En remarque, dans le cas où le ou les éléments biochimiques ne sont pas connus, le procédé utilise une amorce relativement générique, c’est-à-dire compatible avec une multitude de séquences d’ADN. Le procédé PCR peut aussi être mis en œuvre plusieurs fois, avec des amorces différentes, pour rechercher une multitude d’éléments biochimiques potentiels. D’autre part, il est avantageux dans tous les cas de mettre en œuvre au moins 45 thermocyles.

[0044] Cette troisième étape E3 utilise donc au moins partiellement une méthode connue de démultiplication, autrement dit d’amplification, de traces d’ADN. La méthode PCR est basée sur une polymérase thermorésistante, qui permet de recopier des séquences de brins d’ADN. La reconnaissance de cette séquence de manière très rapide parmi un grand nombre de séquences est un phénomène particulier qui a parfois été expliqué par le mouvement brownien, ce qui est controversé. Le procédé est ici mis en œuvre avec succès de manière originale à partir d’un plasma fortement dilué, ce qui suggère la mise en œuvre potentielle d’autres phénomènes que le mouvement brownien. Il s’avère que cette mise en œuvre particulière permet d’obtenir de manière inattendue une plus grande sensibilité. Cet effet s’explique par un fonctionnement de la polymérase différent de celui traditionnellement admis, n’impliquant pas une simple copie d’une séquence d’un modèle mais une transmission d’information de nature différente. En remarque, la méthode PCR n’est pas mise en œuvre sur de l’ADN extrait du plasma, comme traditionnellement dans l’état de la technique, mais directement sur le plasma fortement dilué.

[0045] Naturellement, le procédé peut utiliser différentes variantes d’amplifications PCR, ou tout procédé d’amplification équivalent ou alternatif.

[0046] A la fin de cette troisième étape E3, l’amplification permet d’atteindre une quantité suffisante de séquences d’ADN pour leur détection et analyse. Nous appellerons simplement solution amplifiée la solution issue de cette troisième étape.

[0047] Le procédé selon le mode de réalisation met alors en œuvre une quatrième étape E4 d’électrophorèse. Une quantité de 5 µl de chaque échantillon issu de l’étape précédente est mélangée avec 1 ml d’un tampon connu par son nom commercial 6X, formant un marqueur, et soumise à une électrophorèse sur gel d’agarose à 1,2%, en présence d’un colorant fluorescent de l’ADN, connu par son nom anglais de SybrSAFE commercialisé par la société InVitrogen. Une échelle de marqueurs, par exemple connue par sa dénomination 100 bp ladder, commercialisée par la société InVitrogen, est utilisée en parallèle pour estimer la taille des fragments. Cette étape permet la séparation des éléments biochimiques en fonction de leur poids moléculaire et la visualisation du fragment d’ADN présent dans le plasma fortement dilué amplifié (amplicon). Il peut notamment être vérifié que la hauteur de la bande correspond à celle d’un témoin positif.

[0048] Dans certains cas, selon l’élément biochimique recherché, cette quatrième étape E4 s’avère suffisante, c’est-à-dire transmet une information suffisante pour l’identification d’un élément biochimique lors de l’étape d’analyse de résultat E6.

[0049] Le procédé peut mettre en œuvre une cinquième étape E5, en complément ou remplacement de la quatrième étape E4, de séquençage des amplicons produits par le procédé PCR de la troisième étape. Pour cela, les amplicons sont purifiés avec un kit de purification, par exemple celui dénommé «QIAquick PCR purification kit» commercialisé par la société QIAGEN. Les amplicons purifiés sont ensuite séquences directement par la méthode de Sanger, en utilisant les amorces du procédé PCR.

[0050] En variante, particulièrement s’il s’avère que le nombre d’amplicons est faible, les amplicons purifiés sont clones dans un vecteur de plasmide pCR2.1, par exemple en utilisant le kit de clonage connu par son nom commercial TOPO TA commercialisé par la société InVitrogen, qui est utilisé pour transformer des bactéries compétentes qui sont cultivées sur des boites de sélection de milieu gélose LB contenant de l’ampicilline. Des colonies sont isolées et cultivées à partir d’une seule bactérie dans des bouillons de culture LB de 4 ml contenant également de l’ampicilline et des clones de plasmide sont purifiés et dépistés par digestion par l’endonucléase de restriction EcoRI pour vérifier la présence d’inserts. Les plasmides positifs sont séquences par la méthode de Sanger en utilisant des amorces universelles directes et inverses M13.

[0051] Le procédé met ensuite en œuvre une sixième étape E6 d’analyse de résultat. Cette étape peut comprendre la simple comparaison du résultat de la quatrième étape E4 par rapport à des témoins. Elle peut aussi, ou en variante, comprendre une analyse des séquences obtenues par la cinquième étape E5, ce qui peut se faire par une recherche dans une banque de données, par exemple avec l’outil Blast. La séquence des nucléotides des amplicons purifiés ou clones est analysée avec cet outil pour comparer les éléments obtenus par le procédé avec des données mémorisées, et identifier des rapprochements significatifs qui permettent de conclure à l’identification des séquences de l’espèce bactérienne impliquée.

[0052] Le procédé décrit précédemment permet donc finalement de détecter tout élément biochimique, notamment de nature bactérienne ou virale. Il permet par exemple de détecter la bactérie Borrelia burgdorferi, ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella. En remarque, le procédé sera naturellement adapté à l’élément biochimique recherché. Notamment, comme explicité précédemment, l’étape d’amplification E3 utilise des amorces adaptées. De plus, les filtrations seront de même adaptées à la dimension de l’élément recherché, de sorte à éliminer de la solution le maximum d’éléments, tout en conservant des traces de type acide nucléique microbien, pour pouvoir les détecter par la suite. Ainsi, dans le cas d’une recherche d’un élément biochimique de type virus, le procédé décrit selon ce mode de réalisation pourra être mis en œuvre de manière identique en remplaçant le filtrage à 100 nm par un filtrage à 20 nm (sous-étape de filtration E12), pour tenir compte de la plus petite dimension de l’élément biochimique.

[0053] Le procédé a été décrit sur la base de plasma sanguin, mais peut être implémenté à partir de toute solution.

[0054] En remarque, une caractéristique essentielle du procédé consiste à procéder à une forte dilution de la solution à tester. Nous appelons forte dilution toute dilution d’au moins trois ou quatre fois la dilution décimale, soit un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><3>ou 10<–><4>. En variante, le taux de dilution pourra être inférieur ou égal à 10<–><8>, voire à 10<–10>, voire à 10<–1><3>, voire à 10<–1><5>, c’est-à-dire une dilution équivalente à une dilution supérieure ou égale à 8, voire 10 ou 13 ou 15, dilutions décimales. De préférence, le taux de dilution est compris entre 10<–><3>et 10<–><3><0>inclus, voire entre 10<–10>et 10<–><2><0>inclus. Cette forte dilution apporte l’effet inattendu d’une plus forte sensibilité de la détection d’un élément biochimique qu’un même procédé mis en œuvre sans forte dilution, comme mentionné précédemment. En remarque, cet effet est vérifié quel que soit l’élément biochimique concerné, et plus précisément quelle que soit la trace ADN de l’élément biochimique dans la solution.

[0055] En remarque, le procédé est avantageusement répété avec plusieurs échantillons de la solution fortement diluée, caractérisés par plusieurs taux de dilution différents. Il peut alors être conclu lors de la sixième étape E6 d’analyse de résultat que l’élément biochimique était bien présent dans la solution initiale, dès lors que au moins un, voire ou au moins deux ou trois, échantillon(s) permet(tent) sa détection. Cette approche permet ainsi d’obtenir un résultat positif même lorsque l’élément biochimique est présent en très faible quantité dans la solution.

[0056] Un exemple d’application du procédé décrit précédemment à un patient de 14 ans souffrant de la maladie chronique de Lyme, se manifestant par de la fatigue, des douleurs articulaires, ainsi qu’une inflammation intestinale, va maintenant être décrit, en référence avec la fig. 2a .

[0057] Si on applique de manière classique le procédé PCR pour ce patient, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4. Autrement dit, le procédé de l’état de la technique ne permet pas de détecter la présence de la bactérie Borrelia burgdorferi.

[0058] La fig. 2a représente les résultats obtenus pour ce patient, en appliquant le procédé de détection décrit précédemment, à partir du plasma fortement dilué. Les différentes colonnes numérotées de 1 à 20 représentent les différentes dilutions décimales appliquées au plasma déjà dilué au centième dans la sous-étape E11. Ainsi, la colonne 1 correspond à une troisième dilution décimale et à un taux de dilution de 103, et ainsi de suite. La fig. 2a montre qu’une bande à 499 bp est détectée pour la colonne 3, puis pour les colonnes 14 à 20. Le séquençage de Sanger de l’amplicon purifié (cinquième étape E5) et l’analyse par l’outil Blast (sixième étape E6) indiquent finalement la plus forte homologie de la séquence de type Borrelia ribosomale 16s attendue à +/– 1 bp en comparaison avec la séquence de référence de la séquence de Borrelia burgdorferi B31 fournie par ATCC, qui correspond bien à la maladie de Lyme.

[0059] En complément, il faut noter que la mère du patient développait aussi sensiblement les mêmes symptômes que son fils. La fig.  2b illustre les résultats obtenus par la quatrième étape d’électrophorèse pour plusieurs taux de dilution sur le plasma de la mère, lors de la mise en œuvre du procédé décrit précédemment de manière similaire au procédé de la fig.  2a . On obtient une détection d’une faible bande à 499 bp avec un taux de dilution de 10<–><3>, puis une détection pour de nombreux autres taux de dilution. En remarque, si on applique de manière classique le procédé PCR pour cette patiente, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4.

[0060] Cet exemple illustre que le procédé de détection décrit précédemment atteint contre toute attente une très forte sensibilité en utilisant des forts taux de dilution, ce qui permet la détection de la présence d’un élément biochimique qui n’était pas possible auparavant. Il en résulte donc un diagnostic nouveau et plus fiable, comme illustré dans cet exemple avec la maladie de Lyme, permettant de définir une médication adaptée, contrairement à ce qui était proposé précédemment.

[0061] La fig. 3 représente les résultats de l’application du procédé de détection décrit précédemment sur une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau Millipore. La solution comprend initialement des traces d’ADN 16 S de la bactérie Borrelia burgdorferi à un taux de 2 ng/ml. Cette figure permet de montrer plusieurs mises en évidence de la bactérie. Les colonnes 1 et 2 correspondent à des faibles dilutions et à des détections relativement proches des solutions traditionnelles. De nombreuses colonnes complémentaires correspondent à des fortes dilutions, et mettent de plus en évidence la bactérie selon le principe d’ultra-sensibilité décrit précédemment.

[0062] La fig. 4 représente les résultats de l’application du procédé de détection sur une même solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi, mais diluée dans de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique. Le résultat obtenu montre qu’il ne reste plus que les détections traditionnelles des colonnes 1 et 2. En revanche, les fortes dilutions ne donnent plus de détection, au contraire du procédé utilisé avec l’eau Millipore. Cette différence entre les deux eaux illustre un effet inhibiteur de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique.

[0063] Une troisième expérience a été réalisée avec de l’eau stérilisée enrichie par un gaz soufré, à base d’un composé contenant du disulfure H2S commercial. Nous avons constaté le même effet inhibiteur à partir du gaz H2S produit sous la hotte à flux laminaire du laboratoire. En effet, le résultat obtenu est sensiblement le même que celui de la fig. 4 . Ces expériences illustrent finalement qu’un composé soufré apporte un effet inhibiteur, au moins partiel, d’une bactérie présente dans une solution. Le composé soufré, provenant d’émanations de gaz H2S, a pour effet la suppression des séquences aqueuses dérivées de l’ADN de Borrelia burgdorferi.

[0064] En remarque, l’action de ce composé soufré, en complément d’une stérilisation conventionnelle, permet d’inhiber totalement la solution de la bactérie Borrelia burgdorferi.

[0065] Ainsi, l’invention porte sur un procédé de purification d’une solution, comprenant une étape consistant à ajouter un composé soufré, sous forme gazeuse ou liquide, à la solution, ou plus généralement à mettre la solution en contact avec un composé soufré. On remarque en effet que cet effet inhibiteur est vérifié si l’expérience est réalisée en présence d’une atmosphère légèrement soufrée. Ainsi, la purification est possible sous la simple influence d’un composé soufré.

[0066] En remarque, les constatations précédentes se vérifient sur tout élément biochimique, notamment de nature bactérienne ou virale. Le procédé permet ainsi par exemple une application à la bactérie Borrelia burgdorferi, ou aux espèces voisines, ou à la bactérie Sutterella.

[0067] En outre, les remarques précédentes permettent aussi la mise en œuvre d’une médication adaptée aux maladies infectieuses comme la maladie de Lyme, particulièrement les maladies infectieuses chroniques. Cette médication comprend donc un médicament comprenant un composé soufré. Ce composé soufré peut se présenter sous toute forme, gazeuse, liquide ou solide.

[0068] L’invention porte aussi sur un procédé et un dispositif de diagnostic de l’état purifié ou non d’une certaine solution, ainsi que, indirectement, sur l’état guéri ou non d’un patient souffrant d’une maladie infectieuse chronique. Ce procédé met notamment en œuvre le procédé de détection décrit précédemment.

[0069] L’invention utilise aussi sur un dispositif de détection d’un élément biochimique pour mettre en œuvre le procédé de détection d’au moins un élément biochimique tel que décrit précédemment, de manière au moins partiellement automatique, qui comprend: un robot diluteur, qui met en œuvre la dilution d’une solution dans un tube et une agitation d’un tube comprenant la solution diluée; et un thermocycleur mettant en œuvre une amplification par réaction en chaîne par polymérase PCR.

[0070] Ce dispositif peut aussi comprendre un dispositif d’analyse de résultats par électrophorèse et/ou séquençage, de manière connue.

Claims (15)

1. Procédé de purification au moins partielle d’une solution, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise de la solution sous l’influence d’un composé soufré.

2. Procédé de purification d’une solution selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend tout ou partie des étapes suivantes: – ajout dudit composé soufré, sous forme gazeuse ou liquide, à la solution ou à une eau dans laquelle la solution est diluée; et/ou – mise de la solution en contact avec une atmosphère comprenant ledit composé soufré.

3. Procédé de purification d’une solution selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé soufré comprend du disulfure S2.

4. Procédé de purification d’une solution selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution est purifiée d’un composant biochimique qu’elle contient, de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella.

5. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution est un plasma sanguin.

6. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution contenant initialement un élément biochimique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: Avant la purification de ladite solution: – forte dilution (E2) de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><3>; – amplification (E3) d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; – recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse (E4) et/ou par séquençage (E5) d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse (E6) du résultat permettant de détecter la présence dudit élément biochimique; puis mise en œuvre du procédé de purification de la solution selon l’une des revendications précédentes, puis, après purification de ladite solution: – forte dilution (E2) de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–3>; – amplification (E3) d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; – recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse (E4) et/ou par séquençage (E5) d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse (E6) du résultat permettant de constater la disparition d’une détection de la présence dudit élément biochimique constatée avant la purification.

7. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la forte dilution de la solution comprend, de manière similaire avant et après purification, une dilution à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><4>, ou 10<–><8>, ou 10<–><10>, ou 10<–><1><3>, voire à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><15>et/ou à un taux de dilution compris entre 10<–3>et 10<–><30>inclus, voire entre 10<–><10>et 10<–><20>inclus.

8. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution selon l’une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que le procédé est répété, de manière similaire avant et après purification, à partir de l’étape d’amplification (E3), avec plusieurs échantillons de la solution correspondant à plusieurs fortes dilutions différentes.

9. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution selon l’une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le procédé comprend, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de forte agitation de la solution fortement diluée avant l’étape d’amplification (E3).

10. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution selon l’une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que l’étape de forte dilution (E2) comprend, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de dilution (E22) qui comprend une série de dilutions successives de la solution, dans de l’eau non contaminée, avec une agitation pendant au moins 10 secondes, voire au moins 15 secondes, entre tout ou partie des dilutions de la série de dilutions successives.

11. Procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution selon l’une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l’étape d’amplification (E3) met en œuvre une réaction en chaîne par polymérase PCR comprenant au moins 45 thermocycles, et/ou utilisant comme polymérase celle connue par son nom commercial de PerFecTa, de manière similaire avant et après purification.

12. Médicament pour soigner une maladie infectieuse chronique du type la maladie de Lyme, l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, ou la maladie d’Alzheimer, caractérisé en ce qu’il comprend un composé soufré.

13. Médicament selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend un composé soufré, gazeux ou liquide.

14. Médicament selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit composé soufré comprend du disulfure S2.

15. Médicament selon l’une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu’il agit par inhibition d’un composant biochimique de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella.