CH715311A1 - Method for purifying a solution. - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un procédé de purification au moins partielle d’une solution, typiquement un plasma sanguin, qui comprend une étape de mise de la solution sous l’influence d’un composé soufré notamment disulfure. Le procédé a pour effet la suppression des séquences aqueuses dérivées de l’ADN de Borrelia burgdorferi par des émanations de gaz H2S. L’invention concerne aussi un procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution contenant initialement un élément biochimique, comprenant les étapes E2 à E6. Un médicament est aussi revendiqué.The invention relates to a process for at least partial purification of a solution, typically a blood plasma, which comprises a step of placing the solution under the influence of a sulfur compound, in particular disulfide. The effect of the process is the removal of aqueous sequences derived from Borrelia burgdorferi DNA by fumes of H2S gas. The invention also relates to a method for diagnosing a purified state of a solution initially containing a biochemical element, comprising steps E2 to E6. A drug is also claimed.
Description
[0001] La présente invention porte sur un procédé de purification d’une solution. Elle porte aussi sur un procédé de diagnostic de l’état, purifié ou non, d’une solution. Elle est particulièrement applicable à la purification d’une solution comprenant des agents infectieux, notamment provenant du sang d’un patient. Elle permet la mise au point d’un médicament pour le traitement de maladies chroniques d’origine infectieuse. The present invention relates to a method of purifying a solution. It also relates to a process for diagnosing the state, purified or not, of a solution. It is particularly applicable to the purification of a solution comprising infectious agents, in particular originating from the blood of a patient. It allows the development of a drug for the treatment of chronic diseases of infectious origin.
[0002] La recherche de la présence d’éléments biochimiques de type bactéries, ou de formes bactériennes, de virus, etc., est très utile dans de nombreuses situations, notamment pour des applications médicales, pour réaliser un diagnostic le plus pertinent possible. Dans ces applications médicales, la recherche bactérienne ou virale est par exemple souvent effectuée à partir d’un plasma sanguin dont on extrait de l’ADN. Une telle recherche est complexe car il faut éviter toute contamination bactérienne des prélèvements sanguins, qui fausserait les résultats. De plus, les procédés existants mettent en œuvre des domaines de filtrations et autres étapes traditionnelles, qui s’avèrent insuffisantes dans certaines situations. Il en résulte que certaines bactéries ou certains virus, et plus généralement certains éléments biochimiques, notamment lorsqu’ils sont présents en faible quantité, restent très difficiles, voire impossibles à détecter, ce qui induit des erreurs de diagnostic et des traitements thérapeutiques inadaptés. Il en résulte de même qu’il est très difficile de savoir si une certaine solution est pure ou comprend certains éléments biochimiques en faible quantité. En complément, il s’avère que les procédés existants sont insuffisants pour purifier une solution contenant des éléments biochimiques en faible quantité. The search for the presence of biochemical elements of the bacteria type, or of bacterial forms, of viruses, etc., is very useful in many situations, in particular for medical applications, in order to carry out the most relevant diagnosis possible. In these medical applications, bacterial or viral research is for example often carried out from a blood plasma from which DNA is extracted. Such research is complex because it is necessary to avoid any bacterial contamination of blood samples, which would distort the results. In addition, the existing methods implement areas of filtration and other traditional steps, which prove to be insufficient in certain situations. As a result, certain bacteria or certain viruses, and more generally certain biochemical elements, in particular when they are present in small quantities, remain very difficult, if not impossible to detect, which induces diagnostic errors and unsuitable therapeutic treatments. As a result, it is very difficult to know whether a certain solution is pure or includes certain biochemical elements in small quantities. In addition, it turns out that the existing methods are insufficient to purify a solution containing biochemical elements in small quantities.
[0003] La présente invention vise à pallier ces inconvénients des procédures traditionnelles de l’état de la technique et cherche une solution de purification d’une solution contenant un élément biochimique en faible quantité. The present invention aims to overcome these drawbacks of the traditional procedures of the prior art and seeks a solution for purifying a solution containing a biochemical element in small quantities.
[0004] En outre, l’invention repose aussi sur un procédé permettant de valider l’état purifié ou non d’une certaine solution. In addition, the invention is also based on a method for validating the purified state or not of a certain solution.
[0005] A cet effet, l’invention porte sur un procédé de purification au moins partielle d’une solution, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise de la solution sous l’influence d’un composé soufré. To this end, the invention relates to a process for at least partial purification of a solution, characterized in that it comprises a step of placing the solution under the influence of a sulfur compound.
[0006] Le procédé de purification d’une solution peut comprendre tout ou partie des étapes suivantes: <tb>a.<SEP>Ajout dudit composé soufré, sous forme gazeuse ou liquide, à la solution ou à une eau dans laquelle la solution est diluée; et/ou <tb>b.<SEP>Mise de la solution en contact avec une atmosphère comprenant ledit composé soufré.The process for purifying a solution can include all or part of the following steps: <tb> a. <SEP> Adding said sulfur-containing compound, in gaseous or liquid form, to the solution or to a water in which the solution is diluted; and or <tb> b. <SEP> Placing the solution in contact with an atmosphere comprising said sulfur-containing compound.
[0007] Ledit composé soufré peut comprendre du disulfure S2. Said sulfur compound may comprise disulfide S2.
[0008] La solution peut être purifiée d’un composant biochimique qu’elle contient, de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella. The solution can be purified from a biochemical component that it contains, of the virus or bacteria type, in particular the Borrelia burgdorferi bacterium or related species, or the Sutterella bacteria.
[0009] La solution peut être un plasma sanguin. The solution can be a blood plasma.
[0010] L’invention porte aussi sur un procédé de diagnostic d’un état purifié d’une solution contenant initialement un élément biochimique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: Avant la purification de ladite solution: forte dilution de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–3>; amplification d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse et/ou par séquençage d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse du résultat permettant de détecter la présence dudit élément biochimique; puisThe invention also relates to a method for diagnosing a purified state of a solution initially containing a biochemical element, characterized in that it comprises the following steps: Before the purification of said solution: high dilution of the solution, according to a dilution rate less than or equal to 10 <–3>; amplification of a certain trace of said biochemical element in the highly diluted solution by chain reaction by PCR polymerase; search for the presence of said biochemical element in the amplified solution by an electrophoresis step and / or by sequencing a fragment obtained, in particular by the Sanger method, then analysis of the result making it possible to detect the presence of said biochemical element; then
[0011] Mise en œuvre du procédé de purification de la solution selon l’une des revendications précédentes, puis, après purification de ladite solution: forte dilution de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–3>; amplification d’une certaine trace dudit élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; recherche de la présence dudit élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse et/ou par séquençage d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse du résultat permettant de constater la disparition d’une détection de la présence dudit élément biochimique constatée avant la purification.Implementation of the method for purifying the solution according to one of the preceding claims, then, after purification of said solution: high dilution of the solution, according to a dilution rate less than or equal to 10 <–3>; amplification of a certain trace of said biochemical element in the highly diluted solution by chain reaction by PCR polymerase; search for the presence of said biochemical element in the amplified solution by an electrophoresis step and / or by sequencing of a fragment obtained, in particular by the Sanger method, then analysis of the result making it possible to note the disappearance of a detection of the presence of said biochemical element observed before purification.
[0012] La forte dilution de la solution peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une dilution à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><4>, ou 10<–><8>, ou 10<–><10>, ou 10<–><1><3>, voire à un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><15>et/ou à un taux de dilution compris entre 10<–3>et 10<–3><0>inclus, voire entre 10<–><10>et 10<–><20>inclus. The high dilution of the solution may include, similarly before and after purification, dilution at a dilution rate less than or equal to 10 <–> <4>, or 10 <–> <8>, or 10 <–> <10>, or 10 <–> <1> <3>, or even at a dilution rate less than or equal to 10 <–> <15> and / or at a dilution rate between 10 <–3 > and 10 <–3> <0> included, or even between 10 <–> <10> and 10 <–> <20> included.
[0013] Le procédé peut être répété, de manière similaire avant et après purification, à partir de l’étape d’amplification, avec plusieurs échantillons de la solution correspondant à plusieurs fortes dilutions différentes. The process can be repeated, similarly before and after purification, from the amplification step, with several samples of the solution corresponding to several different high dilutions.
[0014] Le procédé peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de forte agitation de la solution fortement diluée avant l’étape d’amplification. The process can include, similarly before and after purification, a sub-step of vigorous stirring of the highly diluted solution before the amplification step.
[0015] L’étape de forte dilution peut comprendre, de manière similaire avant et après purification, une sous-étape de dilution qui comprend une série de dilutions successives de la solution, dans de l’eau non contaminée, avec une agitation pendant au moins 10 secondes, voire au moins 15 secondes, entre tout ou partie des dilutions de la série de dilutions successives. The high dilution step may include, similarly before and after purification, a dilution sub-step which comprises a series of successive dilutions of the solution, in uncontaminated water, with stirring during at least 10 seconds, or even at least 15 seconds, between all or part of the dilutions of the series of successive dilutions.
[0016] L’étape d’amplification peut mettre en œuvre une réaction en chaîne par polymérase PCR comprenant au moins 45 thermocycles, et/ou utilisant comme polymérase celle connue par son nom commercial de PerFecTa, de manière similaire avant et après purification. The amplification step can implement a chain reaction by PCR polymerase comprising at least 45 thermocycles, and / or using as polymerase that known by its trade name of PerFecTa, in a similar manner before and after purification.
[0017] L’invention porte aussi sur un médicament pour soigner une maladie infectieuse chronique du type la maladie de Lyme, l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, ou la maladie d’AIzheimer, caractérisé en ce qu’il comprend un composé soufré. The invention also relates to a medicament for treating a chronic infectious disease such as Lyme disease, autism, rheumatoid arthritis, or Alzheimer's disease, characterized in that it comprises a sulfur compound.
[0018] Ce médicament peut comprendre un composé soufré, gazeux ou liquide. Ledit composé soufré peut comprendre du disulfure S2. This drug may include a sulfur, gas or liquid compound. Said sulfur compound may include disulfide S2.
[0019] Le médicament peut agir par inhibition d’un composant biochimique de type virus ou bactérie, notamment la bactérie Borrelia burgdorferi ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella. The drug can act by inhibition of a biochemical component of the virus or bacteria type, in particular the Borrelia burgdorferi bacterium or related species, or the Sutterella bacterium.
[0020] Ces objets, caractéristiques et avantages de la présente invention seront exposés en détail dans la description suivante d’un mode d’exécution particulier fait à titre non-limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles; <tb>La fig. 1<SEP>représente un logigramme des étapes d’un procédé de détection de la présence d’un élément biochimique dans une solution, qui sera utilisé par un mode de réalisation de l’invention. <tb>Les fig. 2a et 2b<SEP>représentent respectivement les résultats de l’application du procédé de détection obtenus sur un patient de 14 ans et sa mère, tous deux atteints par la maladie de Lyme. <tb>La fig. 3<SEP>représente les résultats de l’application du procédé de détection d’une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau Millipore. <tb>La fig. 4<SEP>représente les résultats de l’application du procédé de détection d’une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique.These objects, characteristics and advantages of the present invention will be described in detail in the following description of a particular embodiment made without limitation in relation to the attached figures among which; <tb> Fig. 1 <SEP> represents a flow diagram of the steps of a method for detecting the presence of a biochemical element in a solution, which will be used by an embodiment of the invention. <tb> Figs. 2a and 2b <SEP> respectively represent the results of the application of the detection method obtained on a 14 year old patient and his mother, both suffering from Lyme disease. <tb> Fig. 3 <SEP> represents the results of the application of the method for detecting a solution infected with the bacteria Borrelia burgdorferi diluted in Millipore water. <tb> Fig. 4 <SEP> represents the results of the application of the method for detecting a solution infected with the bacteria Borrelia burgdorferi diluted in thermal water containing hydrogen sulphide.
[0021] En préambule, un procédé de détection de la présence d’un élément biochimique dans une solution va être décrit dans le cadre d’une recherche à titre d’exemple à partir d’un plasma sanguin. In the preamble, a method of detecting the presence of a biochemical element in a solution will be described in the context of research by way of example from a blood plasma.
[0022] Ce procédé comprend une première étape préalable de préparation E1 du plasma sanguin. This method comprises a first preliminary step of preparation E1 of the blood plasma.
[0023] Pour cela, il est possible de prélever entre 2 et 5 ml de sang d’un patient en présence d’un anti-coagulant tel que l’EDTA (Acide éthylène Diamine Tetra Acétique). Le sang est ensuite centrifugé à une vitesse de 3000 trs/min pendant cinq minutes, à une température régulée de 20 °C. Cette opération permet de séparer et de récupérer le plasma sanguin. Le plasma sanguin est stocké à une température de –20 °C s’il n’est pas utilisé immédiatement. Il est stocké à une température de 4 °C s’il est utilisé immédiatement. For this, it is possible to draw between 2 and 5 ml of blood from a patient in the presence of an anticoagulant such as EDTA (Ethylene acid Diamine Tetra Acetic). The blood is then centrifuged at a speed of 3000 rpm for five minutes, at a regulated temperature of 20 ° C. This operation separates and collects the blood plasma. Blood plasma is stored at a temperature of –20 ° C if it is not used immediately. It is stored at 4 ° C if used immediately.
[0024] Ensuite, selon une première sous-étape de dilution E11 de cette étape de préparation E1, un échantillon de plasma est dilué dans de l’eau stérile selon un ratio de 1:100. Cette étape de dilution au niveau de la préparation a pour fonction d’obtenir une quantité plus importante de plasma, ce qui peut être utile si de nombreuses analyses sont prévues. Cette sous-étape reste donc optionnelle. Then, according to a first dilution sub-step E11 of this preparation step E1, a plasma sample is diluted in sterile water in a ratio of 1: 100. The purpose of this dilution stage in the preparation is to obtain a larger quantity of plasma, which can be useful if numerous analyzes are planned. This sub-step therefore remains optional.
[0025] Une deuxième sous-étape de filtration E12 comprend le passage successif du plasma dilué à travers des filtres de 450 nm et 100 nm, par exemple à l’aide de filtres Millex commercialisés par la société Millipore. Cette filtration permet de supprimer potentiellement toute ou quasi-toute bactérie et une grande partie, voire la totalité, des virus du plasma. Il reste les corps les plus petits, notamment les traces d’ADN et d’ARN. Ainsi, comme cela va être détaillé par la suite, le procédé de détection repose d’abord sur la détection d’une trace d’un élément biochimique, particulièrement de l’acide nucléique ou des nucléotides, que nous appellerons aussi trace d’ADN, provenant de cet élément biochimique ou correspondant à cet élément chimique, avant de pouvoir conclure a posteriori à la présence initiale de l’élément biochimique dans le plasma analysé. A second filtration sub-step E12 comprises the successive passage of the diluted plasma through filters of 450 nm and 100 nm, for example using Millex filters sold by the company Millipore. This filtration makes it possible to potentially remove all or almost all bacteria and a large part, or even all, of the plasma viruses. The smallest bodies remain, including traces of DNA and RNA. Thus, as will be detailed later, the detection process is first based on the detection of a trace of a biochemical element, particularly nucleic acid or nucleotides, which we will also call DNA trace , coming from this biochemical element or corresponding to this chemical element, before being able to conclude a posteriori to the initial presence of the biochemical element in the analyzed plasma.
[0026] Cette étape préalable de préparation E1 étant finalisée, le procédé de détection, qui consiste en un procédé de détection ultrasensible d’un élément biochimique dans une solution, par l’intermédiaire de la détection d’une trace de cet élément, comme un nucléotide, un acide nucléique ou trace ou séquence d’ADN de cet élément dans la solution, va maintenant être décrit. This prior preparation step E1 being finalized, the detection method, which consists of a method of ultrasensitive detection of a biochemical element in a solution, by means of the detection of a trace of this element, such as a nucleotide, nucleic acid or DNA trace or sequence of this element in the solution will now be described.
[0027] En remarque, ces étapes sont réalisées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II. L’opérateur porte des vêtements de protection, comme une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et un masque. Note, these steps are carried out in a class II biological safety enclosure. The operator wears protective clothing, such as a lab coat, nitrile gloves and a mask.
[0028] Le procédé comprend d’abord une deuxième étape de dilution E2. The method first comprises a second dilution step E2.
[0029] Cette étape est mise en œuvre à partir d’eau stérile. Le procédé met alors en œuvre une première sous-étape de filtration E21 de l’eau stérile, par un filtre à 220 nm, pour éliminer les éventuels corps microbiens qui contamineraient l’eau. Cette sous-étape est conseillée mais optionnelle, elle dépend de la qualité de l’eau stérile disponible. This step is carried out using sterile water. The process then implements a first substep of filtration E21 of sterile water, by a filter at 220 nm, to eliminate any microbial bodies which would contaminate the water. This sub-step is recommended but optional, it depends on the quality of the sterile water available.
[0030] Enfin, le procédé met en œuvre une deuxième sous-étape de dilution E22 en tant que telle. Cette sous-étape comprend une série de dilutions successives dans l’eau non contaminée de la solution à analyser, résultant des étapes précédentes, c’est-à-dire le plasma sanguin dans ce mode de réalisation. Finally, the method implements a second dilution sub-step E22 as such. This sub-step comprises a series of successive dilutions in the uncontaminated water of the solution to be analyzed, resulting from the previous steps, that is to say the blood plasma in this embodiment.
[0031] Plusieurs microtubes en polypropylène de 1,5 ml peuvent être remplis de 0,9 ml d’eau chacun. Ensuite, 0,1 ml d’un échantillon de plasma est ajouté au premier microtube, puis 0,1 ml de ce premier microtube est prélevé et reporté dans le deuxième microtube, et ainsi de suite. Cela permet donc d’enchainer en série plusieurs dilutions décimales. Avantageusement, après chaque remplissage d’un microtube, soit après chaque dilution décimale, le microtube rempli est agité au vortex à la vitesse maximale pendant au moins 10 secondes, de préférence au moins 15 secondes, avant de poursuivre avec une nouvelle dilution. Un nombre d’au moins 10 dilutions, voire au moins 20, est ainsi réalisé. Several 1.5 ml polypropylene microtubes can be filled with 0.9 ml of water each. Then 0.1 ml of a plasma sample is added to the first microtube, then 0.1 ml of this first microtube is taken and transferred to the second microtube, and so on. This therefore makes it possible to chain several decimal dilutions in series. Advantageously, after each filling of a microtube, ie after each decimal dilution, the filled microtube is vortexed at maximum speed for at least 10 seconds, preferably at least 15 seconds, before continuing with a further dilution. A number of at least 10 dilutions, or even at least 20, is thus produced.
[0032] Ce nombre de dilutions est avantageusement compris entre 10 et 20 inclus, voire au-delà de 20 dilutions. Autrement dit, le taux de dilution est inférieur ou égal à 10<–><10>, ou compris entre 10<–10>et 10<–><2><0>inclus, voire inférieur ou égal à 10<–><2><0>. This number of dilutions is advantageously between 10 and 20 inclusive, or even beyond 20 dilutions. In other words, the dilution rate is less than or equal to 10 <–> <10>, or between 10 <–10> and 10 <–> <2> <0> inclusive, or even less than or equal to 10 <–> <2> <0>.
[0033] Toutefois, cette dilution dépend de l’élément biochimique recherché et le procédé pourra commencer à donner des résultats pour des fortes dilutions de quatre dilutions décimales, soit un taux de dilutions de 10<–><4>. En remarque, ce taux de dilution correspond au taux de dilution total, c’est-à-dire prenant en compte les éventuelles dilutions réalisées avant la mise en œuvre de cette deuxième étape E2, par exemple durant l’étape de préparation E1 mentionnée précédemment. However, this dilution depends on the biochemical element sought and the process may begin to give results for large dilutions of four decimal dilutions, ie a dilution rate of 10 <–> <4>. Note, this dilution rate corresponds to the total dilution rate, that is to say taking into account any dilutions carried out before the implementation of this second step E2, for example during the preparation step E1 mentioned above. .
[0034] Cette deuxième étape E2 permet donc d’obtenir une solution très fortement diluée, que nous appellerons plasma fortement dilué pour la suite de la description. This second step E2 therefore makes it possible to obtain a very highly diluted solution, which we will call highly diluted plasma for the remainder of the description.
[0035] En remarque, le procédé de détection prévoit une forte agitation de la solution avant l’étape d’amplification qui va être décrite ci-après. Ce procédé prévoit aussi avantageusement une forte agitation de la solution au cours de la réalisation de cette sous-étape de dilution, par la succession de sous-étapes de dilutions et d’agitations. L’agitation est plus généralement mise en œuvre entre tout ou partie des dilutions successives. De plus, l’agitation est une forte agitation, au vortex à grande vitesse, par exemple dans un dispositif à 50 Hz à une vitesse de 2700 trs/min, pendant au moins dix secondes, voire au moins quinze secondes. Note, the detection method provides for strong stirring of the solution before the amplification step which will be described below. This process also advantageously provides for strong stirring of the solution during the carrying out of this dilution sub-step, by the succession of dilution and stirring sub-steps. The agitation is more generally implemented between all or part of the successive dilutions. In addition, the agitation is strong agitation, at high speed vortex, for example in a device at 50 Hz at a speed of 2700 rpm, for at least ten seconds, or even at least fifteen seconds.
[0036] Naturellement, l’étape de dilution E2 peut en variante comprendre d’autres dilutions que des dilutions décimales. Naturally, the dilution step E2 can alternatively include other dilutions than decimal dilutions.
[0037] Avantageusement, cette étape de dilution E2 est mise en œuvre par un robot diluteur, qui comprend un bras permettant de réaliser automatiquement les opérations d’ouverture d’un microtube, de prélèvement d’une dose prédéfinie avec précision, fermeture du microtube, versement d’une dose dans un microtube voisin, etc. En complément, ce robot diluteur met de plus en œuvre une fonction d’agitation de microtube. Pour cela, il peut comprendre un support rotatif pour microtube, permettant son agitation par sa mise en rotation. En variante, un autre moyen d’agitation est possible. Avantageusement, la vitesse et/ou la durée d’agitation est réglable. Advantageously, this dilution step E2 is implemented by a diluting robot, which comprises an arm making it possible to automatically carry out the operations of opening a microtube, of withdrawing a predefined dose with precision, closing the microtube , pouring a dose into a neighboring microtube, etc. In addition, this diluting robot also implements a microtube shaking function. For this, it can comprise a rotary support for microtube, allowing its agitation by its rotation. Alternatively, another means of agitation is possible. Advantageously, the speed and / or the duration of agitation is adjustable.
[0038] Le procédé met alors en œuvre une troisième étape E3 d’amplification de traces d’ADN au sein de la solution fortement diluée. The method then implements a third step E3 of amplifying traces of DNA within the highly diluted solution.
[0039] Cette troisième étape utilise un procédé de réaction en chaîne par polymérase PCR. This third step uses a PCR polymerase chain reaction process.
[0040] Pour cela, plusieurs échantillons de plasma fortement dilué peuvent être utilisés, pour augmenter la fiabilité du procédé. Ces échantillons peuvent correspondre à plusieurs forts taux de dilution distincts et/ou identiques. For this, several samples of highly diluted plasma can be used, to increase the reliability of the process. These samples can correspond to several distinct and / or identical high dilution rates.
[0041] A titre d’exemple, un échantillon de plasma fortement dilué de 5 µl est versé dans un microtube de 0,2 ml, dans lequel on ajoute une polymérase adaptée au procédé PCR, comme celle connue par son nom commercial de PerFecTa ThoughMix de la société Quantabio, et 0,2 µM de chaque amorce choisie, pour obtenir un volume total de 20 µl. By way of example, a highly diluted plasma sample of 5 μl is poured into a 0.2 ml microtube, in which a polymerase suitable for the PCR process is added, such as that known by its commercial name of PerFecTa ThoughMix from the company Quantabio, and 0.2 μM of each primer chosen, to obtain a total volume of 20 μl.
[0042] A titre d’exemple, dans le cas où la bactérie recherchée est la Borrelia burgdorferi, responsable par exemple de la maladie de Lyme, alors le procédé PCR peut être mis en œuvre dans un thermocycleur, par exemple tel que connu par son nom commercial Nexus GSX1/GX2e commercialisé par la société Eppendorf, de la manière suivante: une première étape de dénaturation est engagée à 95 °C pendant 5 minutes, suivie par 45 cycles de températures, comprenant chacun une période de 30 secondes à 95° C, puis 30 secondes à 61 °C, puis 40 secondes à 72 °C, avant une incubation finale de 15 minutes à 72 °C. Le ou les échantillons ainsi traités sont alors refroidis à une température de 4 °C. For example, in the case where the bacteria sought is Borrelia burgdorferi, responsible for example of Lyme disease, then the PCR method can be implemented in a thermocycler, for example as known by its trade name Nexus GSX1 / GX2e marketed by the company Eppendorf, in the following manner: a first denaturation step is initiated at 95 ° C for 5 minutes, followed by 45 temperature cycles, each comprising a period of 30 seconds at 95 ° C , then 30 seconds at 61 ° C, then 40 seconds at 72 ° C, before a final incubation of 15 minutes at 72 ° C. The sample or samples thus treated are then cooled to a temperature of 4 ° C.
[0043] Cette démarche est menée simultanément ou parallèlement, à partir du même échantillon de la solution fortement diluée ou de plusieurs échantillons distincts, pour chaque élément biochimique recherché. Naturellement, les amorces utilisées lors du procédé PCR seront adaptées à l’élément biochimique recherché. En remarque, dans le cas où le ou les éléments biochimiques ne sont pas connus, le procédé utilise une amorce relativement générique, c’est-à-dire compatible avec une multitude de séquences d’ADN. Le procédé PCR peut aussi être mis en œuvre plusieurs fois, avec des amorces différentes, pour rechercher une multitude d’éléments biochimiques potentiels. D’autre part, il est avantageux dans tous les cas de mettre en œuvre au moins 45 thermocyles. This approach is carried out simultaneously or in parallel, from the same sample of the highly diluted solution or from several separate samples, for each biochemical element sought. Naturally, the primers used during the PCR process will be adapted to the biochemical element sought. As a note, in the case where the biochemical element or elements are not known, the method uses a relatively generic primer, that is to say compatible with a multitude of DNA sequences. The PCR process can also be implemented several times, with different primers, to search for a multitude of potential biochemical elements. On the other hand, it is advantageous in all cases to use at least 45 thermocyles.
[0044] Cette troisième étape E3 utilise donc au moins partiellement une méthode connue de démultiplication, autrement dit d’amplification, de traces d’ADN. La méthode PCR est basée sur une polymérase thermorésistante, qui permet de recopier des séquences de brins d’ADN. La reconnaissance de cette séquence de manière très rapide parmi un grand nombre de séquences est un phénomène particulier qui a parfois été expliqué par le mouvement brownien, ce qui est controversé. Le procédé est ici mis en œuvre avec succès de manière originale à partir d’un plasma fortement dilué, ce qui suggère la mise en œuvre potentielle d’autres phénomènes que le mouvement brownien. Il s’avère que cette mise en œuvre particulière permet d’obtenir de manière inattendue une plus grande sensibilité. Cet effet s’explique par un fonctionnement de la polymérase différent de celui traditionnellement admis, n’impliquant pas une simple copie d’une séquence d’un modèle mais une transmission d’information de nature différente. En remarque, la méthode PCR n’est pas mise en œuvre sur de l’ADN extrait du plasma, comme traditionnellement dans l’état de la technique, mais directement sur le plasma fortement dilué. This third step E3 therefore uses at least partially a known method of reduction, in other words amplification, of traces of DNA. The PCR method is based on a heat-resistant polymerase, which makes it possible to copy DNA strand sequences. The recognition of this sequence very quickly among a large number of sequences is a particular phenomenon which has sometimes been explained by Brownian motion, which is controversial. The method is here successfully implemented in an original manner from a highly diluted plasma, which suggests the potential implementation of other phenomena than Brownian motion. It turns out that this particular implementation makes it possible to unexpectedly obtain greater sensitivity. This effect is explained by a functioning of the polymerase different from that traditionally accepted, not implying a simple copy of a sequence of a model but a transmission of information of a different nature. Note, the PCR method is not implemented on DNA extracted from plasma, as traditionally in the prior art, but directly on highly diluted plasma.
[0045] Naturellement, le procédé peut utiliser différentes variantes d’amplifications PCR, ou tout procédé d’amplification équivalent ou alternatif. Naturally, the method can use different variants of PCR amplifications, or any equivalent or alternative amplification method.
[0046] A la fin de cette troisième étape E3, l’amplification permet d’atteindre une quantité suffisante de séquences d’ADN pour leur détection et analyse. Nous appellerons simplement solution amplifiée la solution issue de cette troisième étape. At the end of this third step E3, the amplification makes it possible to reach a sufficient quantity of DNA sequences for their detection and analysis. We will simply call the amplified solution the solution from this third step.
[0047] Le procédé selon le mode de réalisation met alors en œuvre une quatrième étape E4 d’électrophorèse. Une quantité de 5 µl de chaque échantillon issu de l’étape précédente est mélangée avec 1 ml d’un tampon connu par son nom commercial 6X, formant un marqueur, et soumise à une électrophorèse sur gel d’agarose à 1,2%, en présence d’un colorant fluorescent de l’ADN, connu par son nom anglais de SybrSAFE commercialisé par la société InVitrogen. Une échelle de marqueurs, par exemple connue par sa dénomination 100 bp ladder, commercialisée par la société InVitrogen, est utilisée en parallèle pour estimer la taille des fragments. Cette étape permet la séparation des éléments biochimiques en fonction de leur poids moléculaire et la visualisation du fragment d’ADN présent dans le plasma fortement dilué amplifié (amplicon). Il peut notamment être vérifié que la hauteur de la bande correspond à celle d’un témoin positif. The method according to the embodiment then implements a fourth step E4 of electrophoresis. A quantity of 5 μl of each sample from the previous step is mixed with 1 ml of a buffer known by its trade name 6X, forming a marker, and subjected to electrophoresis on 1.2% agarose gel, in the presence of a fluorescent DNA dye, known by its English name of SybrSAFE marketed by the company InVitrogen. A scale of markers, for example known by its name 100 bp ladder, sold by the company InVitrogen, is used in parallel to estimate the size of the fragments. This step allows the separation of biochemical elements according to their molecular weight and the visualization of the DNA fragment present in highly diluted amplified plasma (amplicon). In particular, it can be verified that the height of the strip corresponds to that of a positive control.
[0048] Dans certains cas, selon l’élément biochimique recherché, cette quatrième étape E4 s’avère suffisante, c’est-à-dire transmet une information suffisante pour l’identification d’un élément biochimique lors de l’étape d’analyse de résultat E6. In some cases, depending on the biochemical element sought, this fourth step E4 turns out to be sufficient, that is to say transmits sufficient information for the identification of a biochemical element during the step of result analysis E6.
[0049] Le procédé peut mettre en œuvre une cinquième étape E5, en complément ou remplacement de la quatrième étape E4, de séquençage des amplicons produits par le procédé PCR de la troisième étape. Pour cela, les amplicons sont purifiés avec un kit de purification, par exemple celui dénommé «QIAquick PCR purification kit» commercialisé par la société QIAGEN. Les amplicons purifiés sont ensuite séquences directement par la méthode de Sanger, en utilisant les amorces du procédé PCR. The method can implement a fifth step E5, in addition to or replacement of the fourth step E4, sequencing the amplicons produced by the PCR process of the third step. For this, the amplicons are purified with a purification kit, for example that called "QIAquick PCR purification kit" sold by the company QIAGEN. The purified amplicons are then sequenced directly by the Sanger method, using the primers of the PCR method.
[0050] En variante, particulièrement s’il s’avère que le nombre d’amplicons est faible, les amplicons purifiés sont clones dans un vecteur de plasmide pCR2.1, par exemple en utilisant le kit de clonage connu par son nom commercial TOPO TA commercialisé par la société InVitrogen, qui est utilisé pour transformer des bactéries compétentes qui sont cultivées sur des boites de sélection de milieu gélose LB contenant de l’ampicilline. Des colonies sont isolées et cultivées à partir d’une seule bactérie dans des bouillons de culture LB de 4 ml contenant également de l’ampicilline et des clones de plasmide sont purifiés et dépistés par digestion par l’endonucléase de restriction EcoRI pour vérifier la présence d’inserts. Les plasmides positifs sont séquences par la méthode de Sanger en utilisant des amorces universelles directes et inverses M13. Alternatively, particularly if it turns out that the number of amplicons is low, the purified amplicons are cloned into a plasmid vector pCR2.1, for example using the cloning kit known by its trade name TOPO TA marketed by the company InVitrogen, which is used to transform competent bacteria which are cultivated on selection boxes of LB agar medium containing ampicillin. Colonies are isolated and cultured from a single bacterium in 4 ml LB culture broths also containing ampicillin and plasmid clones are purified and screened by digestion with EcoRI restriction endonuclease to verify the presence inserts. Positive plasmids are sequenced by the Sanger method using direct and reverse M13 universal primers.
[0051] Le procédé met ensuite en œuvre une sixième étape E6 d’analyse de résultat. Cette étape peut comprendre la simple comparaison du résultat de la quatrième étape E4 par rapport à des témoins. Elle peut aussi, ou en variante, comprendre une analyse des séquences obtenues par la cinquième étape E5, ce qui peut se faire par une recherche dans une banque de données, par exemple avec l’outil Blast. La séquence des nucléotides des amplicons purifiés ou clones est analysée avec cet outil pour comparer les éléments obtenus par le procédé avec des données mémorisées, et identifier des rapprochements significatifs qui permettent de conclure à l’identification des séquences de l’espèce bactérienne impliquée. The method then implements a sixth step E6 of result analysis. This step may include the simple comparison of the result of the fourth step E4 with controls. It can also, or alternatively, include an analysis of the sequences obtained by the fifth step E5, which can be done by searching a database, for example with the Blast tool. The nucleotide sequence of the purified or cloned amplicons is analyzed with this tool to compare the elements obtained by the process with stored data, and identify significant reconciliations which make it possible to conclude with the identification of the sequences of the bacterial species involved.
[0052] Le procédé décrit précédemment permet donc finalement de détecter tout élément biochimique, notamment de nature bactérienne ou virale. Il permet par exemple de détecter la bactérie Borrelia burgdorferi, ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella. En remarque, le procédé sera naturellement adapté à l’élément biochimique recherché. Notamment, comme explicité précédemment, l’étape d’amplification E3 utilise des amorces adaptées. De plus, les filtrations seront de même adaptées à la dimension de l’élément recherché, de sorte à éliminer de la solution le maximum d’éléments, tout en conservant des traces de type acide nucléique microbien, pour pouvoir les détecter par la suite. Ainsi, dans le cas d’une recherche d’un élément biochimique de type virus, le procédé décrit selon ce mode de réalisation pourra être mis en œuvre de manière identique en remplaçant le filtrage à 100 nm par un filtrage à 20 nm (sous-étape de filtration E12), pour tenir compte de la plus petite dimension de l’élément biochimique. The method described above therefore finally allows to detect any biochemical element, in particular of bacterial or viral nature. It allows for example to detect the bacteria Borrelia burgdorferi, or the neighboring species, or the bacteria Sutterella. As a note, the process will naturally be adapted to the biochemical element sought. In particular, as explained above, the amplification step E3 uses adapted primers. In addition, the filtrations will likewise be adapted to the size of the element sought, so as to eliminate the maximum number of elements from the solution, while retaining traces of microbial nucleic acid type, in order to be able to detect them subsequently. Thus, in the case of a search for a biochemical element of virus type, the method described according to this embodiment could be implemented in an identical manner by replacing the filtering at 100 nm by a filtering at 20 nm (sub- filtration step E12), to take account of the smallest dimension of the biochemical element.
[0053] Le procédé a été décrit sur la base de plasma sanguin, mais peut être implémenté à partir de toute solution. The method has been described on the basis of blood plasma, but can be implemented from any solution.
[0054] En remarque, une caractéristique essentielle du procédé consiste à procéder à une forte dilution de la solution à tester. Nous appelons forte dilution toute dilution d’au moins trois ou quatre fois la dilution décimale, soit un taux de dilution inférieur ou égal à 10<–><3>ou 10<–><4>. En variante, le taux de dilution pourra être inférieur ou égal à 10<–><8>, voire à 10<–10>, voire à 10<–1><3>, voire à 10<–1><5>, c’est-à-dire une dilution équivalente à une dilution supérieure ou égale à 8, voire 10 ou 13 ou 15, dilutions décimales. De préférence, le taux de dilution est compris entre 10<–><3>et 10<–><3><0>inclus, voire entre 10<–10>et 10<–><2><0>inclus. Cette forte dilution apporte l’effet inattendu d’une plus forte sensibilité de la détection d’un élément biochimique qu’un même procédé mis en œuvre sans forte dilution, comme mentionné précédemment. En remarque, cet effet est vérifié quel que soit l’élément biochimique concerné, et plus précisément quelle que soit la trace ADN de l’élément biochimique dans la solution. Note, an essential characteristic of the process consists in carrying out a strong dilution of the solution to be tested. We call high dilution any dilution of at least three or four times the decimal dilution, i.e. a dilution rate less than or equal to 10 <–> <3> or 10 <–> <4>. As a variant, the dilution rate may be less than or equal to 10 <–> <8>, or even 10 <–10>, or even 10 <–1> <3>, or even 10 <–1> <5> , i.e. a dilution equivalent to a dilution greater than or equal to 8, or even 10 or 13 or 15, decimal dilutions. Preferably, the dilution rate is between 10 <–> <3> and 10 <–> <3> <0> inclusive, or even between 10 <–10> and 10 <–> <2> <0> inclusive. This high dilution brings the unexpected effect of a higher sensitivity of the detection of a biochemical element than a same process implemented without high dilution, as mentioned previously. Note, this effect is verified regardless of the biochemical element concerned, and more precisely whatever the DNA trace of the biochemical element in the solution.
[0055] En remarque, le procédé est avantageusement répété avec plusieurs échantillons de la solution fortement diluée, caractérisés par plusieurs taux de dilution différents. Il peut alors être conclu lors de la sixième étape E6 d’analyse de résultat que l’élément biochimique était bien présent dans la solution initiale, dès lors que au moins un, voire ou au moins deux ou trois, échantillon(s) permet(tent) sa détection. Cette approche permet ainsi d’obtenir un résultat positif même lorsque l’élément biochimique est présent en très faible quantité dans la solution. Note, the process is advantageously repeated with several samples of the highly diluted solution, characterized by several different dilution rates. It can then be concluded during the sixth step E6 of result analysis that the biochemical element was indeed present in the initial solution, as soon as at least one, or even or at least two or three, sample (s) allows ( tent) its detection. This approach thus makes it possible to obtain a positive result even when the biochemical element is present in very small quantities in the solution.
[0056] Un exemple d’application du procédé décrit précédemment à un patient de 14 ans souffrant de la maladie chronique de Lyme, se manifestant par de la fatigue, des douleurs articulaires, ainsi qu’une inflammation intestinale, va maintenant être décrit, en référence avec la fig. 2a . An example of application of the method described above to a 14 year old patient suffering from chronic Lyme disease, manifested by fatigue, joint pain, as well as intestinal inflammation, will now be described, in reference with fig. 2a.
[0057] Si on applique de manière classique le procédé PCR pour ce patient, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4. Autrement dit, le procédé de l’état de la technique ne permet pas de détecter la présence de la bactérie Borrelia burgdorferi. If the PCR method is conventionally applied to this patient, which is not shown, no detection is obtained as a result of the fourth step of electrophoresis E4. In other words, the prior art method does not make it possible to detect the presence of the bacteria Borrelia burgdorferi.
[0058] La fig. 2a représente les résultats obtenus pour ce patient, en appliquant le procédé de détection décrit précédemment, à partir du plasma fortement dilué. Les différentes colonnes numérotées de 1 à 20 représentent les différentes dilutions décimales appliquées au plasma déjà dilué au centième dans la sous-étape E11. Ainsi, la colonne 1 correspond à une troisième dilution décimale et à un taux de dilution de 103, et ainsi de suite. La fig. 2a montre qu’une bande à 499 bp est détectée pour la colonne 3, puis pour les colonnes 14 à 20. Le séquençage de Sanger de l’amplicon purifié (cinquième étape E5) et l’analyse par l’outil Blast (sixième étape E6) indiquent finalement la plus forte homologie de la séquence de type Borrelia ribosomale 16s attendue à +/– 1 bp en comparaison avec la séquence de référence de la séquence de Borrelia burgdorferi B31 fournie par ATCC, qui correspond bien à la maladie de Lyme. [0058] FIG. 2a represents the results obtained for this patient, by applying the detection method described above, from the highly diluted plasma. The different columns numbered from 1 to 20 represent the different decimal dilutions applied to the plasma already diluted to the hundredth in sub-step E11. Thus, column 1 corresponds to a third decimal dilution and a dilution rate of 103, and so on. Fig. 2a shows that a band at 499 bp is detected for column 3, then for columns 14 to 20. Sanger sequencing of the purified amplicon (fifth step E5) and analysis by the Blast tool (sixth step E6) finally indicate the strongest homology of the Borrelia ribosomal 16s type sequence expected at +/– 1 bp in comparison with the reference sequence of the Borrelia burgdorferi B31 sequence provided by ATCC, which corresponds well to Lyme disease.
[0059] En complément, il faut noter que la mère du patient développait aussi sensiblement les mêmes symptômes que son fils. La fig. 2b illustre les résultats obtenus par la quatrième étape d’électrophorèse pour plusieurs taux de dilution sur le plasma de la mère, lors de la mise en œuvre du procédé décrit précédemment de manière similaire au procédé de la fig. 2a . On obtient une détection d’une faible bande à 499 bp avec un taux de dilution de 10<–><3>, puis une détection pour de nombreux autres taux de dilution. En remarque, si on applique de manière classique le procédé PCR pour cette patiente, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4. In addition, it should be noted that the patient's mother also developed substantially the same symptoms as her son. Fig. 2b illustrates the results obtained by the fourth step of electrophoresis for several dilution rates on the plasma of the mother, during the implementation of the method described above in a similar manner to the method of FIG. 2a. Low band detection at 499 bp is obtained with a dilution rate of 10 <–> <3>, followed by detection for many other dilution rates. As a note, if the PCR method is applied in a conventional manner for this patient, which is not shown, no detection is obtained as a result of the fourth step of electrophoresis E4.
[0060] Cet exemple illustre que le procédé de détection décrit précédemment atteint contre toute attente une très forte sensibilité en utilisant des forts taux de dilution, ce qui permet la détection de la présence d’un élément biochimique qui n’était pas possible auparavant. Il en résulte donc un diagnostic nouveau et plus fiable, comme illustré dans cet exemple avec la maladie de Lyme, permettant de définir une médication adaptée, contrairement à ce qui était proposé précédemment. This example illustrates that the detection method described above unexpectedly achieves a very high sensitivity by using high dilution rates, which allows the detection of the presence of a biochemical element which was not previously possible. This therefore results in a new and more reliable diagnosis, as illustrated in this example with Lyme disease, making it possible to define an appropriate medication, contrary to what was previously proposed.
[0061] La fig. 3 représente les résultats de l’application du procédé de détection décrit précédemment sur une solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi diluée dans de l’eau Millipore. La solution comprend initialement des traces d’ADN 16 S de la bactérie Borrelia burgdorferi à un taux de 2 ng/ml. Cette figure permet de montrer plusieurs mises en évidence de la bactérie. Les colonnes 1 et 2 correspondent à des faibles dilutions et à des détections relativement proches des solutions traditionnelles. De nombreuses colonnes complémentaires correspondent à des fortes dilutions, et mettent de plus en évidence la bactérie selon le principe d’ultra-sensibilité décrit précédemment. [0061] FIG. 3 shows the results of the application of the detection method described above on a solution infected with the bacteria Borrelia burgdorferi diluted in Millipore water. The solution initially includes traces of 16 S DNA from the bacteria Borrelia burgdorferi at a rate of 2 ng / ml. This figure allows to show several highlights of the bacteria. Columns 1 and 2 correspond to low dilutions and to detections relatively close to traditional solutions. Many additional columns correspond to high dilutions, and further highlight the bacteria according to the principle of ultra-sensitivity described above.
[0062] La fig. 4 représente les résultats de l’application du procédé de détection sur une même solution infectée par la bactérie Borrelia burgdorferi, mais diluée dans de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique. Le résultat obtenu montre qu’il ne reste plus que les détections traditionnelles des colonnes 1 et 2. En revanche, les fortes dilutions ne donnent plus de détection, au contraire du procédé utilisé avec l’eau Millipore. Cette différence entre les deux eaux illustre un effet inhibiteur de l’eau thermale contenant du gaz sulfhydrique. [0062] FIG. 4 shows the results of the application of the detection method on the same solution infected with the bacteria Borrelia burgdorferi, but diluted in thermal water containing hydrogen sulphide. The result obtained shows that only the traditional detections of columns 1 and 2 remain. On the other hand, high dilutions no longer give detection, unlike the process used with Millipore water. This difference between the two waters illustrates an inhibiting effect of thermal water containing hydrogen sulfide gas.
[0063] Une troisième expérience a été réalisée avec de l’eau stérilisée enrichie par un gaz soufré, à base d’un composé contenant du disulfure H2S commercial. Nous avons constaté le même effet inhibiteur à partir du gaz H2S produit sous la hotte à flux laminaire du laboratoire. En effet, le résultat obtenu est sensiblement le même que celui de la fig. 4 . Ces expériences illustrent finalement qu’un composé soufré apporte un effet inhibiteur, au moins partiel, d’une bactérie présente dans une solution. Le composé soufré, provenant d’émanations de gaz H2S, a pour effet la suppression des séquences aqueuses dérivées de l’ADN de Borrelia burgdorferi. A third experiment was carried out with sterilized water enriched with a sulfur gas, based on a compound containing commercial H2S disulfide. We found the same inhibitory effect from the H2S gas produced under the laboratory's laminar flow hood. Indeed, the result obtained is substantially the same as that of FIG. 4. These experiments finally illustrate that a sulfur compound provides an inhibitory effect, at least partially, of a bacteria present in a solution. The sulfur compound, originating from H2S gas emanations, has the effect of suppressing the aqueous sequences derived from the DNA of Borrelia burgdorferi.
[0064] En remarque, l’action de ce composé soufré, en complément d’une stérilisation conventionnelle, permet d’inhiber totalement la solution de la bactérie Borrelia burgdorferi. Note, the action of this sulfur compound, in addition to conventional sterilization, can completely inhibit the solution of the bacteria Borrelia burgdorferi.
[0065] Ainsi, l’invention porte sur un procédé de purification d’une solution, comprenant une étape consistant à ajouter un composé soufré, sous forme gazeuse ou liquide, à la solution, ou plus généralement à mettre la solution en contact avec un composé soufré. On remarque en effet que cet effet inhibiteur est vérifié si l’expérience est réalisée en présence d’une atmosphère légèrement soufrée. Ainsi, la purification est possible sous la simple influence d’un composé soufré. Thus, the invention relates to a process for purifying a solution, comprising a step consisting in adding a sulfur-containing compound, in gaseous or liquid form, to the solution, or more generally in bringing the solution into contact with a sulfur compound. It is indeed noted that this inhibitory effect is verified if the experiment is carried out in the presence of a slightly sulfur atmosphere. Thus, purification is possible under the simple influence of a sulfur compound.
[0066] En remarque, les constatations précédentes se vérifient sur tout élément biochimique, notamment de nature bactérienne ou virale. Le procédé permet ainsi par exemple une application à la bactérie Borrelia burgdorferi, ou aux espèces voisines, ou à la bactérie Sutterella. Note, the previous findings are verified on any biochemical element, in particular of bacterial or viral nature. The process thus allows, for example, an application to the bacteria Borrelia burgdorferi, or to neighboring species, or to the bacteria Sutterella.
[0067] En outre, les remarques précédentes permettent aussi la mise en œuvre d’une médication adaptée aux maladies infectieuses comme la maladie de Lyme, particulièrement les maladies infectieuses chroniques. Cette médication comprend donc un médicament comprenant un composé soufré. Ce composé soufré peut se présenter sous toute forme, gazeuse, liquide ou solide. In addition, the previous remarks also allow the implementation of a medication adapted to infectious diseases such as Lyme disease, particularly chronic infectious diseases. This medication therefore includes a drug comprising a sulfur compound. This sulfur compound can be in any form, gaseous, liquid or solid.
[0068] L’invention porte aussi sur un procédé et un dispositif de diagnostic de l’état purifié ou non d’une certaine solution, ainsi que, indirectement, sur l’état guéri ou non d’un patient souffrant d’une maladie infectieuse chronique. Ce procédé met notamment en œuvre le procédé de détection décrit précédemment. The invention also relates to a method and a device for diagnosing the purified state or not of a certain solution, as well as, indirectly, on the cured state or not of a patient suffering from a disease chronic infectious. This method notably implements the detection method described above.
[0069] L’invention utilise aussi sur un dispositif de détection d’un élément biochimique pour mettre en œuvre le procédé de détection d’au moins un élément biochimique tel que décrit précédemment, de manière au moins partiellement automatique, qui comprend: un robot diluteur, qui met en œuvre la dilution d’une solution dans un tube et une agitation d’un tube comprenant la solution diluée; et un thermocycleur mettant en œuvre une amplification par réaction en chaîne par polymérase PCR.The invention also uses on a device for detecting a biochemical element to implement the method for detecting at least one biochemical element as described above, in an at least partially automatic manner, which comprises: a diluting robot, which implements the dilution of a solution in a tube and the agitation of a tube comprising the diluted solution; and a thermocycler implementing amplification by PCR polymerase chain reaction.
[0070] Ce dispositif peut aussi comprendre un dispositif d’analyse de résultats par électrophorèse et/ou séquençage, de manière connue. This device can also include a device for analyzing results by electrophoresis and / or sequencing, in a known manner.
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ZIQIANG MENG ET AL: "DNA damage in mice treated with sulfur dioxide by inhalation", ENVIRONMENTAL AND MOLECULAR MUTAGENESIS., vol. 46, no. 3, 1 January 2005 (2005-01-01), GB, pages 150 - 155, XP055536379, ISSN: 0893-6692, DOI: 10.1002/em.20142 * |
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