KR102606027B1 - 난과식물에 관여하는 바이러스 CMV 및 CymMV 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 - Google Patents
난과식물에 관여하는 바이러스 CMV 및 CymMV 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 난과식물 바이러스 검출 방법이 제공되며, 상기 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함할 수 있으며, CMV(Cucumber Mosaic virus), CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus), 또는 그 조합을 검정할 수 있다.
Description
본 발명은 난과식물에 감염되는 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 난과식물에 감염되는 CMV(Cucumber Mosaic Virus) 및/또는 CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus)를 특이적으로 증폭시켜 각각의 바이러스에 대한 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있으며, 나아가 특정 조합의 프라이머를 이용하는 경우 다중 검정 시에도 다른 종류의 프라이머 간에 간섭 현상을 일으키지 않아, 바이러스들의 복합 감염 여부도 정확하게 판정할 수 있는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
난과식물은 800여 속에 60000여 종으로 이루어진 많은 종류를 갖는 식물로서, 감상 가치가 높은 대표적인 속에 속하는 난과식물은 국내외에서 수요가 증가하고 있어 산업적으로 그 중요성이 점점 더 높아지고 있다. 최근, 미국과 한국의 협상 타결에 의해 난초류에 대한 수출 검역 요건이 제정되어, 호접란이 화분에 심은 상태로 수출되기 시작하였으며, 앞으로 한국 난초류의 미국 수출이 본격화될 전망이다. 이에 따라, 난과식물의 수출시 바이러스 검정은 필수적인 과정이 될 것으로 예상된다.
심비디움의 경우, 바이러스에 감염된 종묘는 성장이 둔화되고, 개화 품질이 저급하게 되어 몇 만 주씩 폐기 처분되는 경우도 많았다.
난과식물 바이러스병의 진단은, 감염식물의 병징, 발생 시기, 주위의 감염식물 유무 등의 육안으로 관찰하는 병징에 의한 포장진단과 바이러스 검정에 의한 진단 등이 있으며, 바이러스 검정 방법으로는 지표 식물을 이용한 생물 검정법, ELISA(Enzyme-LinKed ImmunoSpecific Assay)를 이용하는 항혈청 검정법, 특정 바이러스의 RNA 단편을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하는 PCR 검정법 등이 알려져 있다.
난과식물에 감염되는 바이러스로는 ORSV(Odontoglossumringspotvirus), CyMV(Cymbidium mosaicvirus) 및 OFV(Orchidfleckvirus) 등이 알려져 있으며, 특허문헌 1에 특정 프라이머를 이용하여 이 세 가지 바이러스를 검정할 수 있는 기술이 개시되어 있다.
그러나, 최근 이 세 가지 바이러스 외에 CMV(Cucumber Mosaic virus)와 CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus) 감염 사례가 보고되고 있다. CMV나 CymMV에 감염되면 난초의 잎이 반점으로 얼룩덜룩해지는 모자이크 증상을 보이고, 잎의 모양이 기포가 생긴 것처럼 변형되거나 쭈글쭈글해지며, 발육 장애를 겪어 제대로 성장하지 못하게 된다.
이에, CMV 및 CymMV의 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 난과식물에 감염되는 바이러스인 CMV 및/또는 CymMV를 특이적으로 증폭시켜 각각의 바이러스 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있고, 나아가 특정 조합의 프라이머를 이용하는 경우, 동시 다중 검정 시에도 다른 종류의 프라이머 간에 간섭 현상을 일으키지 않아, 2종의 바이러스의 감염 여부의 동시 검정도 가능한 난과식물에 감염되는 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 제공하며, 상기 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함할 수 있으며, CMV(Cucumber Mosaic virus), CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus), 또는 그 조합을 검정할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 일 실시예는 난과식물 바이러스 검출 방법을 제공하며, 상기 난과식물 바이러스 검출 방법은 ⅰ) 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계; 및 ⅱ) PCR 산물에 전기영동을 실시하여 바이러스 DNA 밴드 유무를 검정함으로써 난과식물 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함할 수 있으며, CMV(Cucumber Mosaic virus), CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus), 또는 그 조합을 검정할 수 있다.
본 발명에 따른 난과식물에 감염되는 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 CMV 및/또는 CymMV를 특이적으로 증폭시켜 각각의 바이러스에 대한 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있다.
나아가, 특정 조합의 프라이머를 이용하는 경우, 동시 다중 검정 시에도 다른 종류의 프라이머 간에 간섭 현상을 일으키지 않으므로, 쉽고 간단한 방법으로 2종의 바이러스를 동시에 효율적으로 검정할 수 있어, 바이러스 복합 감염 여부도 정확하게 판정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하면, 난과식물 바이러스의 감염 경로를 추적하거나 증식용 모주의 바이러스 감염여부를 진단할 수 있으며, 나아가 난과식물 바이러스 감염을 사전에 예방, 방제할 수 있다.
도 1은 개발된 3종의 CMV 검정용 프라이머를 이용하여 증폭된 CMV PCR 산물을 나타낸 전기영동 사진.
도 2는 개발된 CymMV 검정용 프라이머를 이용하여 증폭된 CymMV PCR 산물을 나타낸 전기영동 사진.
도 3은 개발된 CMV 검정용 프라이머와 CymMV 검정용 프라이머의 3종의 조합을 이용하여 동시 다중 검정으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동 사진.
도 4는 CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하여 동시 다중 검정으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동 사진.
도 2는 개발된 CymMV 검정용 프라이머를 이용하여 증폭된 CymMV PCR 산물을 나타낸 전기영동 사진.
도 3은 개발된 CMV 검정용 프라이머와 CymMV 검정용 프라이머의 3종의 조합을 이용하여 동시 다중 검정으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동 사진.
도 4는 CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하여 동시 다중 검정으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동 사진.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다. 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예는 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하며, CMV(Cucumber Mosaic virus), CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus), 또는 그 조합을 검정하는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 실시예의 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는, 난과식물에 감염되는 CMV 및/또는 CymMV를 특이적으로 증폭시킬 수 있어, 쉽고 간단한 방법으로 CMV및 CymMV 각각의 바이러스에 대한 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있다.
CMV는 브로모바이러스(Bromoviridae)과 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus)속에 소하며, 직경이 28-30 nm인 공모양 3분절 게놈의 다입자성 바이러스이다. RNA-1과 RNA-2는 병원성을 지니고 있고, RNA-3은 이동단백질의 정보를 갖는다. RNA-3의 일부분으로 구성된 RNA-4도 있으며 외피단백질의 서브게놈이고, 계통에 따라 위성 RNA(RNA-5 또는 CARNA 5)를 가지는 것도 있다.
CymMV는 알파플렉시바이러스(Alphaflexiviridae)과 포텍스바이러스(Potexvirus)속에 속하며, 직경 30nm 바이러스 게놈은 4개의 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 크기가 4,081 nt인 양성 가닥 RNA 분자이다.
서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 및 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머는 CMV 검정용 프라이머이다.
서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머는, CMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(967-987bp)를 증폭시킬 수 있으며, PCR 산물로 711bp 바이러스 DNA를 증폭시킬 수 있다.
서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머는, CMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(1662-1679bp)를 증폭시킬 수 있으며, PCR 산물로 498 bp 바이러스 DNA를 증폭시킬 수 있다.
서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머는, CMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(1679-1724bp)를 증폭시킬 수 있으며, PCR 산물로 463 bp 바이러스 DNA를 증폭시킬 수 있다.
서열번호 7의 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8의 CymMV-230R 프라이머는 CymMV 검정용 프라이머이다.
서열번호 7의 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8의 CymMV-230R 프라이머는, CymMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(111-341bp)를 증폭시킬 수 있으며, PCR 산물로 230bp 바이러스 DNA를 증폭시킬 수 있다.
본 실시예의 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 CMV 및/또는 CymMV가 감염될 수 있는 모든 종류의 난과식물에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, CMV 및 CymMV 각각에 대한 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있는 것에 더하여, 동시 다중 검정에 의해 CMV 및 CymMV를 동시에 검정함으로써, 바이러스 복합 감염 여부도 쉽고 간단한 방법으로 신뢰성 있게 판정할 수 있다.
2종 이상의 상이한 바이러스를 동시에 검출하기 위한 PCR를 이용하는 동시 다중 검정에 있어서, 각각의 바이러스 검정용 프라이머 간에 간섭 현상이 발생하여 DNA 증폭에 문제를 일으켜 바이러스 검출의 신뢰도가 낮아지는 경우가 많다. 이에, 2종 이상의 바이러스에 대한 동시 다중 검정에 있어서는 상이한 프라이머 간의 간섭 현상에 의한 DNA 증폭의 이상 현상 없이 각각의 프라이머가 특이적으로 바이러스 DNA를 증폭시킬 수 있어야 한다.
본 발명자는 CMV와 CymMV를 효율적으로 동시 검정하는데 이용될 수 있는 프라이머의 조합을 찾기 위하여, 상기한 CMV 검정용 프라이머와 CymMV 검정용 프라이머를 CMV-711F/CMV-711R과 CymMV-230F/CymMV-230R, CMV-498F/CMV-498R과 CymMV-230F/CymMV-230R, CMV-4631F/CMV-463R과 CymMV-230F/CymMV-230R의 세 가지 조합으로 하여 동시 다중 검정 시 간섭 현상 발생 유무를 분석하였다. 그 결과, CMV-711F/CMV-711R과 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합의 경우, 동시 다중 검정 시 프라이머 간의 간섭 현상 없이 각각 CMV 및 CymMV DNA를 증폭시켜, CMV 및 CymMV 감염 여부를 동시에 효율적으로 검정할 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머에 포함되는 CMV 검정용 프라이머 및 CymMV 검정용 프라이머, 즉 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2의 CMV-711R 프라이머, 서열번호 7의 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8의 CymMV-230R 프라이머의 조합은 동시 다중 검정 시에도 서로 간섭 현상을 일으키지 않아, CMV 및 CymMV를 동시에 효율적으로 검출할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는, 난과식물에 감염되는 바이러스인 CMV 및 CymMV 각각을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하여 각각의 바이러스 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있다. 나아가, 특정 조합, 즉 CMV-711F/CMV-711R과 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하는 경우, CMV 및 CymMV의 동시 검출 시에도 프라이머 간에 간섭 현상을 일으키지 않고 특이적으로 CMV 및 CymMV를 특이적으로 증폭시켜, CMV 및 CymMV 복합 감염 여부를 동시에 효율적으로 검정할 수 있다.
또한, 본 실시예의 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 난과식물 바이러스의 감염 경로 추적 또는 증식용 모주의 바이러스 감염여부 진단에 적용될 수 있으며, 나아가 난과식물 바이러스 감염을 사전에 예방하고 방제함에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 ⅰ) 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 CMV-463F 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 CMV-463R 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계; 및 ⅱ) PCR 산물에 전기영동을 실시하여 바이러스 DNA 밴드 유무를 검정함으로써 난과식물 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하며, CMV(Cucumber Mosaic virus), CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus), 또는 그 조합을 검정할 수 있는 난과식물 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
본 실시예에 이용되는 난과식물 바이러스 검출용 PCR 프라이머에 대해서는 전술한 실시예에 있어서 상세하게 설명하였으므로, 본 실시예에 있어서는 반복을 피하기 위하여 그 상세한 설명을 생략한다.
PCR은 중합효소(polymerase)의 연쇄반응로서, 핵산의 특정 나선의 복제본을 다량으로 획득하여, DNA의 특정 부분을 여러 번 복제하여 증폭하는 기법이다.
RT-PCR은 DNA가 아닌 mRNA에서 역전사효소를 사용하여 인위적으로 cDNA를 합성하고, 이 cDNA로부터 PCR 단계를 거치게 된다.
PCR을 이용한 바이러스 검정법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 이를 수행하기 위한 키트도 상업적으로 입수 가능하다. 본 실시예에 있어서는, 이와 같이 공지된 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse tranion polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용할 수 있으며, 구체적인 반응 조건 등은 통상의 기술자의 지식 범위 내에서 적절하게 설정될 수 있다.
일 실시예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 중합효소 연쇄반응(PCR)은 별개의 개별적인 단계로 수행될 수 있다. 즉, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시한 후, 만들어진 cDNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시할 수 있다.
다른 일 실시예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 중합효소 연쇄반응(PCR)은 단일 단계(one-step)로 실시될 수 있다. 원 스텝으로 RT-PCR 및 PCR을 수행하기 위한 키트도 상업적으로 입수 가능하다.
PCR 후 전기영동을 실시하여 PCR 산물의 크기를 확인할 수 있다. PCR 산물에 대하여 전기영동을 실시하여 CMV 및 CymMV 바이러스 DNA 밴드 유무를 검정함으로써 난과식물 바이러스의 감염여부를 판단할 수 있다.
본 실시예의 난과식물 바이러스 검출 방법에 따르면, 난과식물에 감염되는 바이러스인 CMV 및 CymMV 각각을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용함으로써 쉽고 간편한 방법으로 CMV 및 CymMV를 검출할 수 있다. 나아가, 특정 조합, 즉 CMV-711F/CMV-711R과 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하는 경우, CMV 및 CymMV의 동시 검출 시에도 프라이머 간에 간섭 현상을 일으키지 않고 CMV 및 CymMV 바이러스 밴드가 각각 뚜렷하게 나타나므로, CMV 및 CymMV를 동시에 효율적으로 검출할 수 있으며, 바이러스의 복합 감염도 정확하게 판정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 난과식물 바이러스 검정용 프라이머 제작
(1) CMV 검정용 프라이머 제작
CMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(967-987bp)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 및 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, CMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(1662-1679bp)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3으로 표시되는 CMV-498F 및 서열번호 4로 표시되는 CMV-498R 프라이머, 바이러스 복제유전자의 일부(1679-1724 bp)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5의 CMV-463F 및 서열번호 6의 CMV-463R 프라이머를 제작하였다. CMV-711F/CMV-711R 프라이머는 711bp DNA 절편을 증폭시킨다. CMV-498F/CMV-498R 프라이머는, 498 bp DNA 절편을 증폭시킨다. CMV-463F/CMV-463R 프라이머는, 463 bp DNA 절편을 증폭시킨다.
(2) CymMV 검정용 프라이머
CymMV RNA 바이러스 복제유전자의 일부(111-341bp)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 및 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머를 제작하였다. CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머는 230 bp의 DNA 절편을 증폭시킨다.
실시예 2. 난과식물 바이러스 검정용 프라이머를 이용한 난과식물 바이러스 검출
(1) 바이러스 RNA 분자 추출
CMV, CymMV에 감염된 식물을 동정하였고, 바이러스 입자와 바이러스 RNA를 정제하였다. 바이러스 RNA를 추출하기 위하여, 식물체를 0.5 g 채취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고, 디스포저블 호모지나이저로 ppb-ss용액을 100 ㎕ 첨가하여 마쇄한 후, 5분간 상온에서 흔들어 준다. 이후 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이후, 상등액을 PCR 튜브에 넣고, 상충액의 바이러스가 튜브벽에 붙을 수 있도록 37℃에서 10분 동안 처리하였다. PCR 튜브에 있던 상충액을 버리고, 100 ㎕의 세척 버퍼(washing buffer)로 2번 세척한 후, 100 ㎕의 DEPC 워터로 1번 세척하였다. 이후, 50 ㎕의 DEPC 워터를 넣고 Tapping하여 바이러스 입자가 튜브벽에서 떨어져 나가도록 하였다. 95℃에서 3분간 처리하여 바이러스 RNA 분자를 추출한 뒤 얼음에서 식혔다.
(2) CMV RNA 및 PCR 프라이머를 이용한 CMV 검출
정제한 CMV RNA를 주형으로, CMV-711F/CMV-711R 프라이머, CMV-498F/CMV-498R프라이머, CMV-463F/CMV-463R을 이용하여 RT-PCR 반응과 PCR 증폭을 one step으로 실시하였다(Enzymenomics Top Script Kit).
- PCR 반응 용액 조성
| PCR 반응 용액 | |
| 바이러스 RNA 추출액 | 13 ㎕ |
| CMV-F 프라이머 | 1 ㎕(10 pM) |
| CMV-R 프라이머 | 1 ㎕(10 pM) |
| Top script 반응용액 | 5 ㎕ |
| 합계 | 20 ㎕ |
- PCR 조건
50℃ 30분 → 95℃ 10분 → [95℃ 30초 → 55℃ 30초 → 72℃ 1분(35 사이클)] → 72℃ 5분
- 바이러스 DNA 밴드검출 방법
PCR 반응 후 아가로즈 젤(1.2%)에 전기영동하여 UV transilluminater를 이용하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다. 도 1은 개발된 CMV 검정용 프라이머 세 가지를 이용하여 증폭된 CMV PCR 산물을 나타낸 전기영동 사진이며, S는 Size maker, 레인 1은 CMV-711F/CMV-711R, 레인 2는 CMV-498F/CMV-498R, 레인 3은 CMV-463F/CMV-463R을 나타낸다. 도 1을 참조하면, CMV-711F/CMV-711R, CMV-498F/CMV-498R, CMV-463F/CMV-463R은 각각 711 bp, 498 bp, 463 bp에서 PCR 산물이 확인되었다. 따라서, 실시예 1에서 제조한 CMV-711F/CMV-711R, CMV-498F/CMV-498R, CMV-463F/CMV-463R 프라이머는 감염된 시료로부터 CMV DNA를 특이적으로 증폭시킴을 확인할 수 있었다. 즉, CMV-711F/CMV-711R, CMV-498F/CMV-498R, CMV-463F/CMV-463R 프라이머는 각각 CMV 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있는 프라이머이다.
(3) CymMV RNA 및 PCR 프라이머를 이용한 CymMV 검출
정제한 CymMV RNA를 주형으로, CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머를 이용하여, RT-PCR 반응과 PCR 증폭을 one step으로 실시하였다(Enzymenomics Top Script Kit)
- PCR 반응 용액 조성
| PCR 반응 용액 | |
| 바이러스 RNA 추출액 | 13 ㎕ |
| CymMV-F 프라이머 | 1 ㎕(10 pM) |
| CymMV-R 프라이머 | 1 ㎕(10 pM) |
| Top script 반응용액 | 5 ㎕ |
| 합계 | 20 ㎕ |
- PCR 조건
50℃ 30분 → 95℃ 10분 → [95℃ 30초 → 55℃ 30초 → 72℃ 1분(35 사이클)] → 72℃ 5분
- 바이러스 DNA 밴드 검출
PCR 반응 후 아가로즈 젤(1.2%)에 전기영동하여 UV transilluminater를 이용하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다. 도 2는 개발된 CymMV 검정용 프라이머를 이용하여 증폭된 CymMV PCR 산물을 나타낸 전기영동 사진이며, S는 Size maker, 레인 1은 Control(CymMV-792F/CymMV-792R) 및 레인 2는 CymMV-230F/CymMV-230R을 나타낸다. 도 2를 참조하면, CymMV-230F/CymMV-230R는 230 bp에서 PCR 산물이 확인되었다. 따라서 실시예 1 에서 제조한 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머는 감염된 시료로부터 CymMV DNA를 증폭시킴을 확인할 수 있었다. 즉, CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머는 CymMV 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있는 프라이머이다.
실시예 3. 3종의 CMV 프라이머와 1종의 CymMV 프라이머 간의 PCR 반응시 간섭 현상 분석
CMV와 CymMV에 감염된 심비디움으로부터 RNA를 분리하고, 실시예 1의 프라이머로부터, CMV-711F/CMV-711R과 CymMV-230F/CymMV-230R, CMV-498F/CMV-498R과 CymMV-230F/CymMV-230R, CMV-4631F/CMV-463R과 CymMV-230F/CymMV-230R의 세 가지 조합으로 RT-PCR 반응과 PCR 증폭 반응을 실시하여, 동시 다중 검정 시 프라이머 간의 간섭 현상이 발생하는지 여부를 분석하였다. PCR 반응 후 아가로즈 젤(1.2%)에 전기영동하여 UV transilluminater를 이용하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다. 도 3에 PCR 산물의 전기영동 사진이며, S는 Size maker, 레인 1은 CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합, 레인 2는 CMV-4981F/CMV-4981R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합, 레인 3은 CMV-498F/CMV-498R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 나타낸다.
- PCR 조건
50℃ 30분 → 95℃ 10분 → [95℃ 30초 → 55℃ 30초 → 72℃ 1분(35 사이클)] → 72℃ 5분
도 3에 나타내어진 바와 같이, PCR 후 전기영동으로 바이러스 DNA 밴드 유무를 검정한 결과, CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 적용한 결과(레인 1)는 711 bp의 CMV 바이러스 DNA 밴드와 230 bp의 CymMV 바이러스 DNA 밴드가 뚜렷하게 나타났다. 반면, CMV-4981F/CMV-4981R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머(레인 2)의 조합, 및 CMV-498F/CMV-498R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머(레인 3) 조합을 적용한 결과에서는 CymMV 바이러스 DNA 밴드가 검출되지 않아 동시 다중 검정시 프라이머간 간섭으로 DNA 증폭에서 문제가 있는 것으로 판단되었다.
이로부터, CMV 및 CymMV를 동시 검출하기 위해서는, CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하는 것이 효율적임을 확인할 수 있다. 그러나, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, CMV-4981F/CMV-4981R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머 각각은 CMV를 특이적으로 증폭시킬 수 있어, CMV 감염 여부를 효율적으로 검정할 수 있는 프라이머이다.
실시예 4. 바이러스 교차 감염주로부터 CMV 프라이머와 CymMV 프라이머를 이용하여 CMV와 CymMV 밴드를 동시에 검출하는 방법
CMV와 CymMV 교차 감염된 심비디움으로부터 RNA를 분리하고, 실시예 1의 프라이머 중, CMV-711F/CMV-711R 프라이머와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머의 조합을 이용하여 RT-PCR 반응과 PCR 증폭 반응을 실시하였다. PCR 반응 후 아가로즈 젤(1.2%)에 전기영동하여 UV transilluminater를 이용하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다. 도 4에 PCR 산물의 전기영동 사진을 나타낸다.
- PCR 조건
50℃ 30분 → 95℃ 10분 → [95℃ 30초 → 55℃ 30초 → 72℃ 1분(35 사이클)] → 72℃ 5분
도 4에 나타내어진 바와 같이, CMV-711F/CMV-711R와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머 조합을 적용하여 교차감염된 심비디움 시료를 이용하여 PCR한 결과, 이 두 종류의 프라이머 조합은 뚜렷하게 711 bp의 CMV DNA 밴드와 230 bp의 CymMV DNA 밴드를 나타내었다. 도 4에 나타내어진 실험 결과, CMV-711F/CMV-711R와 CymMV-230F/CymMV-230R 프라이머 조합은 동시 다중 검정 시에도 프라이머 간의 간섭 현상 없이 CMV와 CymMV 두 종류의 바이러스를 동시에 검출하여 바이러스 복합 감염 여부를 검정할 수 있는 효율적인 프라이머임을 확인할 수 있다.
본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
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<110> SONG, YUNHEE
<120> PRIMERS FOR DETECTING ORCHID INFECTING VIRUS CMV AND CymMV AND
SCREENING METHOD OF VIRUS USING THE SAME
<130> P20P0062
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
cgcaggtggt taacggtct 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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cgcgaaacaa gcttyttatc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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agctccaata agctcagcca t 21
Claims (10)
- 서열번호 1로 표시되는 CMV-711F 프라이머와 서열번호 2로 표시되는 CMV-711R 프라이머, 및 서열번호 7로 표시되는 CymMV-230F 프라이머와 서열번호 8로 표시되는 CymMV-230R 프라이머의 조합을 포함하며,
상기 CMV-711F 프라이머 및 CMV-711R 프라이머는, 상기 CymMV-230F 프라이머 및 CymMV-230R 프라이머와 동시 다중 검정 시에 서로 간섭 현상을 일으키지 않고, 각각 CMV DNA 및 CymMV DNA를 증폭시켜, CMV 및 CymMV 감염 여부를 동시에 검정할 수 있는
CMV(Cucumber Mosaic virus) 및 CymMV(Cymbidium Chlorotic Mosaic Virus)의 동시 다중 검정용 PCR 프라이머. - 삭제
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| KR1020200134223A KR102606027B1 (ko) | 2020-10-16 | 2020-10-16 | 난과식물에 관여하는 바이러스 CMV 및 CymMV 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 |
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| KR1020200134223A KR102606027B1 (ko) | 2020-10-16 | 2020-10-16 | 난과식물에 관여하는 바이러스 CMV 및 CymMV 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 |
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|---|---|---|---|---|
| KR101139802B1 (ko) | 2009-11-05 | 2012-06-27 | 대한민국 | 난과식물 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법 |
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2020
- 2020-10-16 KR KR1020200134223A patent/KR102606027B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Kondo 등, Archives of Virology, Vol. 160, No. 8, p.2099-2104 (2015.05.31.)* |
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| KR20220050488A (ko) | 2022-04-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |