CA2563394A1 - Methode d'etude de la variabilite genique et fonctionnelle du vih et kit pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes : (a) l'extraction de l'ARN viral ; (b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout o u partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ; (c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse ; (d) l'amplificatio n du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces ; (e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l~étape (d) avec un vecteur; (f) l~analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moi ns deux gènes ; (g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e).
Description
DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des brevets JUVIBO APPLICATIONS/PATENTS
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VOLUME
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
MÉTHODE D'ETUDE DE LA VARIABILITE GENIQUE ET
FONCTIONNELLE DU VIH ET KIT POUR SA'MISE EN ~UVRE.
La présente invention concerne le domaine de l'analyse du virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Plus particulièrement l'invention se rapporte à une méthode et ses moyens de mise en aeuvre pour l'investigation de la variabilité génique et fonctionnelle du VIH.
Le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus enveloppé dont le génome code notamment pour trois enzymes distinctes :
la Transcriptase Inverse qui transcrit l'ARN viral en ADN double brin, l'intégrase qui permet l'intégration de l'ADN"viral dans le génome de la cellule cible et la protéase qui est nécessaire pour la maturation des virions. Les enzymes virales, Transcriptase Inverse (RT) et protéase (PR) vont être les principales cibles des anti-rétroviraux.
Actuellement une quinzaine molécules anti-rétrovirales inhibant la Transcriptase Inverse et la protéase sont utilisées en pratique clinique.
L'utilisation combinée de ces inhibiteurs conduit à de fortes diminutions de la réplication virale, mais ces associations de drogues sont souvent compliquées par d'importants effets secondaires, une faible compliance et le développement de souches virales résistantes aux anti-rétroviraux.
Une des causes majeures d'échec des traitements du Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) est l'émergence de virus mutants résistants aux traitements antiviraux qui apparaissent lbrsque la suppression de la réplication virale est incomplète.
L'échappement à la pression exercée par les drogues
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
MÉTHODE D'ETUDE DE LA VARIABILITE GENIQUE ET
FONCTIONNELLE DU VIH ET KIT POUR SA'MISE EN ~UVRE.
La présente invention concerne le domaine de l'analyse du virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Plus particulièrement l'invention se rapporte à une méthode et ses moyens de mise en aeuvre pour l'investigation de la variabilité génique et fonctionnelle du VIH.
Le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus enveloppé dont le génome code notamment pour trois enzymes distinctes :
la Transcriptase Inverse qui transcrit l'ARN viral en ADN double brin, l'intégrase qui permet l'intégration de l'ADN"viral dans le génome de la cellule cible et la protéase qui est nécessaire pour la maturation des virions. Les enzymes virales, Transcriptase Inverse (RT) et protéase (PR) vont être les principales cibles des anti-rétroviraux.
Actuellement une quinzaine molécules anti-rétrovirales inhibant la Transcriptase Inverse et la protéase sont utilisées en pratique clinique.
L'utilisation combinée de ces inhibiteurs conduit à de fortes diminutions de la réplication virale, mais ces associations de drogues sont souvent compliquées par d'importants effets secondaires, une faible compliance et le développement de souches virales résistantes aux anti-rétroviraux.
Une des causes majeures d'échec des traitements du Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) est l'émergence de virus mutants résistants aux traitements antiviraux qui apparaissent lbrsque la suppression de la réplication virale est incomplète.
L'échappement à la pression exercée par les drogues
2 entraîne l'apparition de mutations dans les enzymes et protéines virales (RT et PR) qui jouent un rôle important dans la réplication et l'infectivité virale (Fitness). Les virus résistants peuvent présenter une infectivité réduite en comparaison aux virus sauvages . Cliniquement, il apparaît important de disposer dans le même temps d'informations sur la variabilité génique et fonctionnelle sur les 2 principales cibles puisque ces traitements sont associés en pratique clinique. Aujourd'hui, un tel outil n'est pas disponible. Les tests présents ne sont pas suffisants, à partir du même échantillon viral de patient, pour explorer dans le même temps les mutations connues et inconnues et l'infectivité en présence ou en absence de drogues ceci sur au moins 2 cibles géniques d'intérêt.
Les différents tests diagnostics actuels permettent de juger soit de la variabilité génique (génotype) soit de la variabilité fonctionnelle (phénotype et capacité réplicative) des virus de patients infectés par le VIH aux antiviraux (Figure 1) - Tests génotypiques de Résistance - Tests Phénotypiques de Résistance - Tests de réplication virale - Tests associés Les tests génotypiques de Résistance.
Dans les tests de résistance génotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et la protéase sont analysées.
Aujourd'hui, leur méthode d'analyse repose sur la position de l'acide aminé muté précédé et suivi
Les différents tests diagnostics actuels permettent de juger soit de la variabilité génique (génotype) soit de la variabilité fonctionnelle (phénotype et capacité réplicative) des virus de patients infectés par le VIH aux antiviraux (Figure 1) - Tests génotypiques de Résistance - Tests Phénotypiques de Résistance - Tests de réplication virale - Tests associés Les tests génotypiques de Résistance.
Dans les tests de résistance génotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et la protéase sont analysées.
Aujourd'hui, leur méthode d'analyse repose sur la position de l'acide aminé muté précédé et suivi
3 par une lettre indiquant l'acide aminé sauvage et le mutant respectivement. Par exemple, pour la mutation de résistance à la lamivudine M184V, la Valine remplace la Méthionine en position 184 de la RT.
Les tests actuels utilisent majoritairement des techniques de séquençage automatique des gènes cibles. Ces tests détectent toutes les mutations présentes dans la région séquencée mais ne peuvent pas toutes les interpréter. En effet, seules les mutations connues sont interprétées en fonction d'algorithmes qui sont remis à jour régulièrement par des comités d'experts internationaux. Ces algorithmes sont devenus de plus en plus complexes avec les associations thérapeutiques en croissance et plus de 15 drogues disponibles sur le marché.
D'autres tests, comme le Line Probe Assay (LiPA) ou les Gene Chips proposés par la Société Affymetrix, sont basés sur des techniques d'hybridation et utilisent des sondes spécifiques limitées à l'identification de certaines mutations.
L'interprétation des résultats des tests génotypiques est complexe en raison de la difficulté à
estimer les effets cumulatifs de mutations multiples dont certaines peuvent avoir des effets additifs tandis que d'autres vont restaurer la sensibilité.
Les tests Phénotypiques de Résistance.
Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues.
Dans les tests phénotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et/ou la protéase sont
Les tests actuels utilisent majoritairement des techniques de séquençage automatique des gènes cibles. Ces tests détectent toutes les mutations présentes dans la région séquencée mais ne peuvent pas toutes les interpréter. En effet, seules les mutations connues sont interprétées en fonction d'algorithmes qui sont remis à jour régulièrement par des comités d'experts internationaux. Ces algorithmes sont devenus de plus en plus complexes avec les associations thérapeutiques en croissance et plus de 15 drogues disponibles sur le marché.
D'autres tests, comme le Line Probe Assay (LiPA) ou les Gene Chips proposés par la Société Affymetrix, sont basés sur des techniques d'hybridation et utilisent des sondes spécifiques limitées à l'identification de certaines mutations.
L'interprétation des résultats des tests génotypiques est complexe en raison de la difficulté à
estimer les effets cumulatifs de mutations multiples dont certaines peuvent avoir des effets additifs tandis que d'autres vont restaurer la sensibilité.
Les tests Phénotypiques de Résistance.
Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues.
Dans les tests phénotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et/ou la protéase sont
4 amplifiées par PCR. Les amplicons sont recombinés in vitro dans un vecteur défectif pour former une particule virale. Cette particule virale est mise en culture en présence de concentrations croissantes de drogues. Les résultats sont exprimés en ratio fold change de l'IC 50 (ou IC90) vis-à-vis d'un virus contrôle, qui correspond à la concentration de la drogue qui inhibe 50% (ou 90%) de la réplication virale en comparaison au virus sauvage de référence. Le niveau de résistance est défini en fonction de seuils de sensibilité (cut off).
Trois principaux tests de, résistance Phénotypique sont actuellement disponibles sur le marché : PhenoSenseTM (Virologic, USA), AntivirogramT"
(Virco, Belgique) et PhenoscriptTM (VIRalliance, France). Ces tests donnent des renseignements sur la susceptibilité des drogues vis-à-vis de leur cible mais ne préjugent pas de l'impact de mutations sentinelles sur l'évolution de la résistance du virus.
Ces deux informations, génotype et phénotype, ont pu être regroupées pour valider la technique mais dans ce cas la méthodologie inclut une étape comprenant la construction d'un vecteur de recombinaison par ligation (Parkin et al 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48 :437) ou nécessite de multiples cycles d'infections pour le phénotypage (demande de brevet PCT W00233638). Ces deux approches techniques peuvent introduire un biais dans la représentativité du virus du patient.
D'autre part, les tests de phénotypage actuels ne sont pas conçus pour être compatibles avec les tests de génotypage en usage sauf pour une utilisation interne.
Les tests de réplication virale.
Les mutations de résistance induites par les inhibiteurs de protéase et de transcriptase inverse sont connues pour modifier la capacité réplicative des
Trois principaux tests de, résistance Phénotypique sont actuellement disponibles sur le marché : PhenoSenseTM (Virologic, USA), AntivirogramT"
(Virco, Belgique) et PhenoscriptTM (VIRalliance, France). Ces tests donnent des renseignements sur la susceptibilité des drogues vis-à-vis de leur cible mais ne préjugent pas de l'impact de mutations sentinelles sur l'évolution de la résistance du virus.
Ces deux informations, génotype et phénotype, ont pu être regroupées pour valider la technique mais dans ce cas la méthodologie inclut une étape comprenant la construction d'un vecteur de recombinaison par ligation (Parkin et al 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48 :437) ou nécessite de multiples cycles d'infections pour le phénotypage (demande de brevet PCT W00233638). Ces deux approches techniques peuvent introduire un biais dans la représentativité du virus du patient.
D'autre part, les tests de phénotypage actuels ne sont pas conçus pour être compatibles avec les tests de génotypage en usage sauf pour une utilisation interne.
Les tests de réplication virale.
Les mutations de résistance induites par les inhibiteurs de protéase et de transcriptase inverse sont connues pour modifier la capacité réplicative des
5 virus du VIH.
Les tests de détermination de la capacité
réplicative in vitro sont basés sur l'utilisation d'un plasmide recombinant, transfecté puis amplifié en culture cellulaire. Après normalisation de la quantité
de virus, le surnageant viral est utilisé pour infecter de nouvelles cellules. La capacité réplicative est alors évaluée sur une période donnée, correspondant à
un unique cycle ou plusieurs cycles de réplication selon la méthodologie utilisée. La capacité réplicative d'un variant muté s'exprime d'une façon générale comparativement à celle d'un variant sauvage.
La qualification d'un virus de forte infectivité est aujourd'hui déconnectée de sa variabilité génique et fonctionnelle à partir du même prélèvement de patient.
Les tests associés.
La demande de brevet PCT W00233638 décrit la possibilité de réaliser un phénotype et un génotype à partir d'un même produit d'amplification. Cependant, la technique de phénotypage utilisée ne décrit pas un cycle unique de réplication virale. Dans un premier temps, elle nécessite une production virale dans des cellules permissives permettant dans un deuxième temps la réinfection de cellules indicatrices pour mesurer les IC50 (demande de brevet PCT W09727480). Ces étapes sont peu représentatives des populations virales initiales du patient en raison de cycles multiples
Les tests de détermination de la capacité
réplicative in vitro sont basés sur l'utilisation d'un plasmide recombinant, transfecté puis amplifié en culture cellulaire. Après normalisation de la quantité
de virus, le surnageant viral est utilisé pour infecter de nouvelles cellules. La capacité réplicative est alors évaluée sur une période donnée, correspondant à
un unique cycle ou plusieurs cycles de réplication selon la méthodologie utilisée. La capacité réplicative d'un variant muté s'exprime d'une façon générale comparativement à celle d'un variant sauvage.
La qualification d'un virus de forte infectivité est aujourd'hui déconnectée de sa variabilité génique et fonctionnelle à partir du même prélèvement de patient.
Les tests associés.
La demande de brevet PCT W00233638 décrit la possibilité de réaliser un phénotype et un génotype à partir d'un même produit d'amplification. Cependant, la technique de phénotypage utilisée ne décrit pas un cycle unique de réplication virale. Dans un premier temps, elle nécessite une production virale dans des cellules permissives permettant dans un deuxième temps la réinfection de cellules indicatrices pour mesurer les IC50 (demande de brevet PCT W09727480). Ces étapes sont peu représentatives des populations virales initiales du patient en raison de cycles multiples
6 PCT/FR2005/000917 d'infection sans la pression de sélection des drogues avec le risque d'évolution du virus initial.
La demande de brevet PCT W02004003513 propose une méthode de génotypage, phénotypage et par ailleurs de capacité réplicative, centrées sur la construction par ligation d'un vecteur de recombinaison contenant un gène rapporteur et la séquence étudiée.
Cette méthode est aussi moins représentative de la réalité du comportement du virus au cours de l'infection du patient. Le clonage par ligation est intéressant pour le rendement de recombinaison, mais peut introduire des biais dans la sélection des populations virales initiales du patient.
Les tests décrits dans la demande de brevet PCT W00238792, permettent de mesurer l'infectivité
(capacité réplicative) et le phénotype à partir du même vecteur de recombinaison. En particulier, le grand fragment (>2800 pb) codant pour une partie du gène gag et des régions du cadre de lecture du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, peut être utilisé pour déterminer la capacité réplicative du virus. Or, ce grand fragment, en pratique courante, ne permet pas d'obtenir un taux de succès d'amplification et un taux de réplication suffisant pour permettre la mesure de l'infectivité. Les étapes suivantes ne sont donc pas réalisables, ce qui limite l'usage de ce grand fragment.
Les méthodes d'étude du virus VIH décrites dans l'art antérieur sont limitées par la difficulté à
réaliser à la fois une bonne représentativité du comportement du virus (recombinaison homologue), un niveau d'amplification et de réplication suffisants y compris pour des virus très mutés. La méthode de
La demande de brevet PCT W02004003513 propose une méthode de génotypage, phénotypage et par ailleurs de capacité réplicative, centrées sur la construction par ligation d'un vecteur de recombinaison contenant un gène rapporteur et la séquence étudiée.
Cette méthode est aussi moins représentative de la réalité du comportement du virus au cours de l'infection du patient. Le clonage par ligation est intéressant pour le rendement de recombinaison, mais peut introduire des biais dans la sélection des populations virales initiales du patient.
Les tests décrits dans la demande de brevet PCT W00238792, permettent de mesurer l'infectivité
(capacité réplicative) et le phénotype à partir du même vecteur de recombinaison. En particulier, le grand fragment (>2800 pb) codant pour une partie du gène gag et des régions du cadre de lecture du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, peut être utilisé pour déterminer la capacité réplicative du virus. Or, ce grand fragment, en pratique courante, ne permet pas d'obtenir un taux de succès d'amplification et un taux de réplication suffisant pour permettre la mesure de l'infectivité. Les étapes suivantes ne sont donc pas réalisables, ce qui limite l'usage de ce grand fragment.
Les méthodes d'étude du virus VIH décrites dans l'art antérieur sont limitées par la difficulté à
réaliser à la fois une bonne représentativité du comportement du virus (recombinaison homologue), un niveau d'amplification et de réplication suffisants y compris pour des virus très mutés. La méthode de
7 l'invention permet maintenant de renseigner et mieux interpréter les données du virus et les données du traitement du malade à partir du même prélèvement.
Il existe en effet aujourd'hui un besoin important pour une stratégie permettant, à partir d'un même échantillon biologique d'un patient atteint par le VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité réplicative du virus.
La présente invention a précisément pour but d'offrir une nouvelle stratégie permettant, à
partir d'un même échantillon biologique d'un patient infecté par le VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité
réplicative du virus, de façon à disposer d'une meilleure compréhension de la situation du patient et donc de réaliser une meilleure orientation thérapeutique.
Ce but est atteint selon l'invention grâce à une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes :
a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus VIH ;
b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au môins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ;
Il existe en effet aujourd'hui un besoin important pour une stratégie permettant, à partir d'un même échantillon biologique d'un patient atteint par le VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité réplicative du virus.
La présente invention a précisément pour but d'offrir une nouvelle stratégie permettant, à
partir d'un même échantillon biologique d'un patient infecté par le VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité
réplicative du virus, de façon à disposer d'une meilleure compréhension de la situation du patient et donc de réaliser une meilleure orientation thérapeutique.
Ce but est atteint selon l'invention grâce à une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes :
a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus VIH ;
b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au môins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ;
8 ladite méthode comprenant en outre - l'étape (c), et/ou - la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g), ci-après :
c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à
établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit amplifié de transcription inverse ;
d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en aeuvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré
par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ;
e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ;
f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ;
g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle offre la possibilité de mesurer l'impact des traitements anti-rétroviraux, jugé à la fois sur :
c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à
établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit amplifié de transcription inverse ;
d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en aeuvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré
par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ;
e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ;
f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ;
g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle offre la possibilité de mesurer l'impact des traitements anti-rétroviraux, jugé à la fois sur :
9 - la variation génique enregistrant les mutations connues, les mutations associées et les mutations inconnues ;
- la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité ou capacité réplicative du virus en présence ou en absence d'anti-rétroviraux ;
Elle permet d'étudier à la fois sur le même prélèvement biologique issu d'un malade l'impact d'un agent antiviral sur la variabilité génique et fonctionnelle sur sa cible initiale, par exemple l'enzyme virale pour laquelle l'anti-rétroviral a été
conçu, mais également l'outil va renseigner en parallèle sur les mêmes données, variabilité génique et fonctionnelle, sur une ou plusieurs cibles d'intérêt.
La méthode de l'invention permet en outre d'être très représentative du comportement du virus du patient, elle est aussi représentative pour évaluer la variabilité génique et fonctionnelle d'une ou plusieurs cibles de virus VIH-1 appartenant aux sous types B et non-B.
Chaque paramètre, génotype, phénotype, capacité réplicative, pris individuellement apporte des informations sur la résistance, et selon l'invention le virus testé est le plus proche de son comportement naturel. L'invention permet à partir du même échantillon biologique de mesurer les 3 paramètres clés de la résistance . génotype, phénotype et capacité
réplication . Elle assure une efficacité dans l'isolement des populations virales, permet la normalisation des virus reconstitués et une analyse quantitative des résultats. Les 3 volets permettent une meilleure interprétation clinique et un éclairage réciproque de ces items pour en faire un outil combiné
d'utilité clinique.
La méthode de l'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'échantillons susceptible de contenir des virus VIH appartenant aux 5 sous-types B et non B. Ainsi, l'ARN est celui d'un virus VIH appartenant aux sous-types B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (a), la méthode de l'invention s'intéresse plus
- la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité ou capacité réplicative du virus en présence ou en absence d'anti-rétroviraux ;
Elle permet d'étudier à la fois sur le même prélèvement biologique issu d'un malade l'impact d'un agent antiviral sur la variabilité génique et fonctionnelle sur sa cible initiale, par exemple l'enzyme virale pour laquelle l'anti-rétroviral a été
conçu, mais également l'outil va renseigner en parallèle sur les mêmes données, variabilité génique et fonctionnelle, sur une ou plusieurs cibles d'intérêt.
La méthode de l'invention permet en outre d'être très représentative du comportement du virus du patient, elle est aussi représentative pour évaluer la variabilité génique et fonctionnelle d'une ou plusieurs cibles de virus VIH-1 appartenant aux sous types B et non-B.
Chaque paramètre, génotype, phénotype, capacité réplicative, pris individuellement apporte des informations sur la résistance, et selon l'invention le virus testé est le plus proche de son comportement naturel. L'invention permet à partir du même échantillon biologique de mesurer les 3 paramètres clés de la résistance . génotype, phénotype et capacité
réplication . Elle assure une efficacité dans l'isolement des populations virales, permet la normalisation des virus reconstitués et une analyse quantitative des résultats. Les 3 volets permettent une meilleure interprétation clinique et un éclairage réciproque de ces items pour en faire un outil combiné
d'utilité clinique.
La méthode de l'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'échantillons susceptible de contenir des virus VIH appartenant aux 5 sous-types B et non B. Ainsi, l'ARN est celui d'un virus VIH appartenant aux sous-types B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (a), la méthode de l'invention s'intéresse plus
10 particulièrement à des échantillons dérivés d'un prélèvement d'un patient. Il peut s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon biologique peut également provenir d'une culture virale. De façon générale, un échantillon biologique correspond à tous types d'échantillons contenant un ou plusieurs variants de VIH, notamment de VIH-1. Par virus VIH-1, on entend, comme indiqué ci-dessus, toute souche virale appartenant aux sous type B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (b), la méthode de l'invention s'intéresse plus particulièrement à une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse, aussi désigné ci-après amplicon, comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux.
Ainsi, l'étape (b) met en oeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par :
- La présence à chacune de ses extrémités de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales,
Pour la réalisation de l'étape (b), la méthode de l'invention s'intéresse plus particulièrement à une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse, aussi désigné ci-après amplicon, comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux.
Ainsi, l'étape (b) met en oeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par :
- La présence à chacune de ses extrémités de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales,
11 - la présence potentielle de mutations d'intérêt.
Une forme de réalisation préférée de l'invention, comprend, à l'étape (b), la mise en aeuvre d'une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un amplicon, comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse impliqués dans la capacité réplicative du virus, et susceptible de conférer, au virus, une résistance thérapeutique.
Il s'agit alors à l'étape (b) d'obtenir un amplicon possédant outre les caractéristiques ci-dessus :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention, met en aeuvre une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
Une forme de réalisation préférée de l'invention, comprend, à l'étape (b), la mise en aeuvre d'une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un amplicon, comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse impliqués dans la capacité réplicative du virus, et susceptible de conférer, au virus, une résistance thérapeutique.
Il s'agit alors à l'étape (b) d'obtenir un amplicon possédant outre les caractéristiques ci-dessus :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention, met en aeuvre une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
12 Plus particulièrement, la paire d'amorces mise en aeuvre à l'étape (b) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces mise en aeuvre à l'étape (b) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces mise en aeuvre à l'étape (b) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
13 - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 (Tableau 1) - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 (Tableau 1) - des fragments ou analogues de ces séquences.
On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la mise en aeuvre à l'étape (b) d'une paire d'amorce choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces R1 de séquences SEQ ID
NO.1 et SEQ ID NO.2 du tableau 1 - la paire d'amorces R2 de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 du tableau 1 - la paire d'amorces R3 de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6 du tableau 1.
L'étape (c) de séquençage de la méthode de l'invention permet d'identifier les mutations connues, inconnues et associées à partir des données disponibles dans la littérature.
A l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met aeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par
ID NO. 5 (Tableau 1) - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 (Tableau 1) - des fragments ou analogues de ces séquences.
On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la mise en aeuvre à l'étape (b) d'une paire d'amorce choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces R1 de séquences SEQ ID
NO.1 et SEQ ID NO.2 du tableau 1 - la paire d'amorces R2 de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 du tableau 1 - la paire d'amorces R3 de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6 du tableau 1.
L'étape (c) de séquençage de la méthode de l'invention permet d'identifier les mutations connues, inconnues et associées à partir des données disponibles dans la littérature.
A l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met aeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par
14 - la présence à chacune de ses extrémités de zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral, - la présence potentielle de mutations d'intérêt.
A l'étape (d), l'amplification dù produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse est avantageusement réalisé avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en aeuvre à l'étape (b), permettant d'obtenir un amplicon comprenant en outre :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention, met en aeuvre une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides nucléiques, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
Plus particulièrement, la paire d'amorces mise en aeuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région 5 phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région 10 phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces
A l'étape (d), l'amplification dù produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse est avantageusement réalisé avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en aeuvre à l'étape (b), permettant d'obtenir un amplicon comprenant en outre :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention, met en aeuvre une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides nucléiques, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
Plus particulièrement, la paire d'amorces mise en aeuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région 5 phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région 10 phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces
15 mise en oeuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de. la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant
- complémentaire en 5' de. la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant
16 - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 (Tableau 4) - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 (Tableau 4) - des fragments ou analogues de ces séquences.
On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la mise en aeuvre à l'étape (d) d'une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces N1 de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 du tableau 4 - la paire d'amorces N2 de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10 du tableau 4.
L'analyse fonctionnelle de l'étape (f) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à infecter des cellules cibles du VIH
avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues. A
titre d'exemple, on peut citer l'infection de cellules cibles du VIH, en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues, contenant un gène indicateur, indépendant du vecteur rétroviral, dont l'expression est liée à l'infection virale.
On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la mise en aeuvre à l'étape (d) d'une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces N1 de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 du tableau 4 - la paire d'amorces N2 de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10 du tableau 4.
L'analyse fonctionnelle de l'étape (f) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à infecter des cellules cibles du VIH
avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues. A
titre d'exemple, on peut citer l'infection de cellules cibles du VIH, en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues, contenant un gène indicateur, indépendant du vecteur rétroviral, dont l'expression est liée à l'infection virale.
17 La mesure de la capacité réplicative à
l'étape (g) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à mesurer l'expression d'un gène indicateur en réponse à l'infection par le virus recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un virus de référence. A titre d'exemple, on peut citer les procédés intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées.
Selon une forme particulière de réalisation, la méthode de l'invention comprend dans le cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été
effectuées :
h) le traitement des données relatives - à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité réplicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement.
A titre d'exemple de tels traitements de ces données, on peut citer les algorithmes d'interprétation des mutations identifiées en (c), les valeurs des concentrations de drogues inhibant 50%
(IC50) ou 90% (IC90) de la réplication virale obtenues en (f), la comparaison de la capacité réplicative du virus recombinant en (g) avec un virus de référence en absence de drogues. Ceux-ci permettent une interprétation réciproque des caractéristiques du virus
l'étape (g) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à mesurer l'expression d'un gène indicateur en réponse à l'infection par le virus recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un virus de référence. A titre d'exemple, on peut citer les procédés intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées.
Selon une forme particulière de réalisation, la méthode de l'invention comprend dans le cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été
effectuées :
h) le traitement des données relatives - à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité réplicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement.
A titre d'exemple de tels traitements de ces données, on peut citer les algorithmes d'interprétation des mutations identifiées en (c), les valeurs des concentrations de drogues inhibant 50%
(IC50) ou 90% (IC90) de la réplication virale obtenues en (f), la comparaison de la capacité réplicative du virus recombinant en (g) avec un virus de référence en absence de drogues. Ceux-ci permettent une interprétation réciproque des caractéristiques du virus
18 et du traitement, de façon à disposer d'un nouvel outil de suivi épidémiologique individuel et collectif.
L'invention concerne aussi des amorces et combinaisons de celles-ci pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques du VIH comme définies précédemment.
La méthode de l'invention permet de disposer d'un nouveau test capable, à partir du même échantillon biologique d'un patient VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité réplicative du virus c'est-à-dire la variation génique enregistrant les mutations connues, les mutations associées et les mutations inconnues et la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité
ou capacité réplicative du virus en présence ou en absence d'anti-rétroviraux (figure 2).
L'invention concerne donc encore un kit pour la mise en aeuvre d'une méthode comme décrite comprenant une ou plusieurs amorces définies précédemment. Un tel kit comprend également une méthode d'analyse des 3 données obtenues grâce à la méthode de l'invention : génotype, phénotype et capacité
réplicative, etc...
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente les étapes principales des analyses du génotype, du phénotype et de la capacité réplicative.
L'invention concerne aussi des amorces et combinaisons de celles-ci pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques du VIH comme définies précédemment.
La méthode de l'invention permet de disposer d'un nouveau test capable, à partir du même échantillon biologique d'un patient VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité réplicative du virus c'est-à-dire la variation génique enregistrant les mutations connues, les mutations associées et les mutations inconnues et la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité
ou capacité réplicative du virus en présence ou en absence d'anti-rétroviraux (figure 2).
L'invention concerne donc encore un kit pour la mise en aeuvre d'une méthode comme décrite comprenant une ou plusieurs amorces définies précédemment. Un tel kit comprend également une méthode d'analyse des 3 données obtenues grâce à la méthode de l'invention : génotype, phénotype et capacité
réplicative, etc...
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente les étapes principales des analyses du génotype, du phénotype et de la capacité réplicative.
19 La figure 2 représente la compatibilité des analyses du génotype, du phénotype et de la capacité
réplicative selon la méthode de l'invention.
La figure 3 montre.une meilleure efficacité
d'amplification des populations virales . Les ARN
provenant de 4 patients (A, B, C, D) ont été
rétrotrancrits et amplifiés dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792 (test 1) ou dans les conditions définies par la présente invention dans son exemple 1 (test 2).
La figure 4 représente la courbe DO/P24 obtenue dans un test de capacité réplicative pour un virus de patient (virus 1) et un virus de référence.
La figure 5 représente la position des paires d'amorces de l'invention sur le génome du VIH.
En outre, la figure montre l'organisation des gènes gag et pol du VIH-1 :
- Gène gag Matrice (matrix) : p17 . Capside (core) : p24 Nucléocapside (CA) : p2, p7, pl, p6 - Gène pol :
. Protéase (PR) : p10 Clivage et maturation gag et pol . Reverse transcriptase (RT) : p51 Transcription Inverse = RNAse H : p15 : Activité RNAse H
= Intégrase (Int) : p31 : Intégration ADN
proviral La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3.
Exemple 1 Analyse génique et fonctionnelle de la protéase et de la transcriptase inverse.
La méthode selon la présente invention se 5 caractérise en premier lieu par la génération d'un acide nucléique spécifique compatible à la fois avec les techniques de génotypage et les techniques de phénotypage.
Pour générer ce premier amplicon 10 spécifique, on procède de la façon suivante 1) On extrait l'ARN viral contenu dans un échantillon biologique. L'échantillon biologique peut être dérivé d'un prélèvement d'un patient. Il peut 15 s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon biologique peut également provenir d'une culture virale. De façon générale, un échantillon biologique
réplicative selon la méthode de l'invention.
La figure 3 montre.une meilleure efficacité
d'amplification des populations virales . Les ARN
provenant de 4 patients (A, B, C, D) ont été
rétrotrancrits et amplifiés dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792 (test 1) ou dans les conditions définies par la présente invention dans son exemple 1 (test 2).
La figure 4 représente la courbe DO/P24 obtenue dans un test de capacité réplicative pour un virus de patient (virus 1) et un virus de référence.
La figure 5 représente la position des paires d'amorces de l'invention sur le génome du VIH.
En outre, la figure montre l'organisation des gènes gag et pol du VIH-1 :
- Gène gag Matrice (matrix) : p17 . Capside (core) : p24 Nucléocapside (CA) : p2, p7, pl, p6 - Gène pol :
. Protéase (PR) : p10 Clivage et maturation gag et pol . Reverse transcriptase (RT) : p51 Transcription Inverse = RNAse H : p15 : Activité RNAse H
= Intégrase (Int) : p31 : Intégration ADN
proviral La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3.
Exemple 1 Analyse génique et fonctionnelle de la protéase et de la transcriptase inverse.
La méthode selon la présente invention se 5 caractérise en premier lieu par la génération d'un acide nucléique spécifique compatible à la fois avec les techniques de génotypage et les techniques de phénotypage.
Pour générer ce premier amplicon 10 spécifique, on procède de la façon suivante 1) On extrait l'ARN viral contenu dans un échantillon biologique. L'échantillon biologique peut être dérivé d'un prélèvement d'un patient. Il peut 15 s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon biologique peut également provenir d'une culture virale. De façon générale, un échantillon biologique
20 correspond à tous types d'échantillons contenant un ou plusieurs variants VIH-1. Par virus VIH-1, on entend toute souche virale appartenant aux sous types B et non B.
2) On rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une des paires d'amorces spécifiques du tableau 1 ci-après pour obtenir un amplicon caractérisé par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales ;
- la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ;
2) On rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une des paires d'amorces spécifiques du tableau 1 ci-après pour obtenir un amplicon caractérisé par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales ;
- la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ;
21 - la présence d'une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage ;
- la totalité de la séquence codant pour la protéase - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 1 RT- Taille Nom séquence PCR pb Paire 2379 FIT ex+ CCTCCAggggCAAATggTACATCA
R1 (SEQ ID NO. 1) FIT ex- CTTgATAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 2) Paire 2358 GP A+ TCACCTAgAACTTTAAATgC
R2 (SEQ ID NO. 3) RT A- TTAAATggCTCTTgATAAATTTgA
(SEQ ID NO. 4) Paire 2586 GP B+ AgCCAggTCAgCCAAAATTA
R3 (SEQ ID NO. 5) RT B- CATgCTTCCCATgTTTCCTT
(SEQ ID NO. 6) La figure 3 montre que, sur 4 patients, la méthode du brevet donne une meilleure amplification des populations virales que dans les conditions du brevet antérieur. D'autre part, sur une série de 26 patients, la méthode du brevet permet l'amplification de la totalité des échantillons alors que la méthode décrite dans le brevet antérieur ne permet l'amplification efficace que de 16 échantillons sur les 26 testés (4 sont négatifs et 6 sont trop faiblement amplifiés).
- la totalité de la séquence codant pour la protéase - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 1 RT- Taille Nom séquence PCR pb Paire 2379 FIT ex+ CCTCCAggggCAAATggTACATCA
R1 (SEQ ID NO. 1) FIT ex- CTTgATAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 2) Paire 2358 GP A+ TCACCTAgAACTTTAAATgC
R2 (SEQ ID NO. 3) RT A- TTAAATggCTCTTgATAAATTTgA
(SEQ ID NO. 4) Paire 2586 GP B+ AgCCAggTCAgCCAAAATTA
R3 (SEQ ID NO. 5) RT B- CATgCTTCCCATgTTTCCTT
(SEQ ID NO. 6) La figure 3 montre que, sur 4 patients, la méthode du brevet donne une meilleure amplification des populations virales que dans les conditions du brevet antérieur. D'autre part, sur une série de 26 patients, la méthode du brevet permet l'amplification de la totalité des échantillons alors que la méthode décrite dans le brevet antérieur ne permet l'amplification efficace que de 16 échantillons sur les 26 testés (4 sont négatifs et 6 sont trop faiblement amplifiés).
22 Les tableaux 2 et 3 ci-après montrent deux exemples d'échantillons de plasmas respectivement des patients 1 et 2 pour lesquels les amplicons générés par la méthode de l'invention ci-dessus ont permis la réalisation du génotype selon les techniques Trugene et Viroseq et du Phénotype selon la technique Phenoscript.
Tableau 2 Patient 1 Viroseq Trugene Phenoscript Liste des Evidence Interpré- Contribution mutations drogues de la tation des à la réponse identifiées Résistance Résistances thérapeu-tique NRT I NRT I ''' D67N AZT Haute Résistance Improbable K70R 3TC Haute Résistance Improbable M184V ddC Haute nd nd T215Y ddI Possible Résistance Probable K219E d4T Haute Résistance Probable Pas de ABC Possible résistance Possible Pas de TDF nd résistance nd NNRTI NNRTI ~., K103N DLV Haute Résistance nd V1081 EFV Haute Résistance Improbable P225H NVP Haute Résistance Improbable IP IP
Pas de L63P APV Nulle résistance Probable Pas de IDV Nulle résistance Probable Pas de SQV Nulle résistance Probable Pas de LPV Nulle résistance Probable Pas de RTV Nulle résistance nd Pas de NFV Nulle résistance Probable
Tableau 2 Patient 1 Viroseq Trugene Phenoscript Liste des Evidence Interpré- Contribution mutations drogues de la tation des à la réponse identifiées Résistance Résistances thérapeu-tique NRT I NRT I ''' D67N AZT Haute Résistance Improbable K70R 3TC Haute Résistance Improbable M184V ddC Haute nd nd T215Y ddI Possible Résistance Probable K219E d4T Haute Résistance Probable Pas de ABC Possible résistance Possible Pas de TDF nd résistance nd NNRTI NNRTI ~., K103N DLV Haute Résistance nd V1081 EFV Haute Résistance Improbable P225H NVP Haute Résistance Improbable IP IP
Pas de L63P APV Nulle résistance Probable Pas de IDV Nulle résistance Probable Pas de SQV Nulle résistance Probable Pas de LPV Nulle résistance Probable Pas de RTV Nulle résistance nd Pas de NFV Nulle résistance Probable
23 Tableau 3 Patient 2 Viroseq Trugene Phenoscript Liste des Evidence Interprétat Contribution mutations drogues de la ion des à la réponse identifiées Résistance Résistances thérapeutiqu e NRTI NRTI
M41L AZT Haute Résistance Improbable M184V 3TC Haute Résistance Improbable T215Y ddC Haute nd nd L210W ddI Possible Résistance Possible d4T Possible Résistance Probable Résistance ABC Possible possible Possible TDF nd Résistance nd NNRTI NNRTI
Pas de DLV Nulle résistance nd Pas de EFV Nulle résistance Probable Pas de NVP Nulle résistance Probable Pas de M36L APV Nulle résistance Probable Pas de L63P IDV Nulle résistance Probable Pas de SQV Nulle résistance Probable Pas de LPV Nulle résistance Probable Pas de RTV Nulle résistance nd Pas de NFV Possible résistance Probable Exemple 2 Analyse de la capacité
réplicative de virus VIH provenant de patients présentant des mutations dans la protéase et la transcriptase inverse.
Dans cet exemple, la méthode de l'invention comprend les étapes suivantes :
M41L AZT Haute Résistance Improbable M184V 3TC Haute Résistance Improbable T215Y ddC Haute nd nd L210W ddI Possible Résistance Possible d4T Possible Résistance Probable Résistance ABC Possible possible Possible TDF nd Résistance nd NNRTI NNRTI
Pas de DLV Nulle résistance nd Pas de EFV Nulle résistance Probable Pas de NVP Nulle résistance Probable Pas de M36L APV Nulle résistance Probable Pas de L63P IDV Nulle résistance Probable Pas de SQV Nulle résistance Probable Pas de LPV Nulle résistance Probable Pas de RTV Nulle résistance nd Pas de NFV Possible résistance Probable Exemple 2 Analyse de la capacité
réplicative de virus VIH provenant de patients présentant des mutations dans la protéase et la transcriptase inverse.
Dans cet exemple, la méthode de l'invention comprend les étapes suivantes :
24 1) On extrait l'ARN viral contenu dans un échantillon biologique.
2) On Rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une paire d'amorces spécifiques permettant d'amplifier de façon régulière un amplicon spécifique, comprenant au moins 2 gènes d'intérêt dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux, comme décrit à l'exemple 1.
3) La préparation d'un nouvel amplicon à
partir de l'amplicon obtenu à l'étape (2) ci-dessus à
l'aide d'une nouvelle paire d'amorces décrite dans le tableau 4 ci-après. Ce nouvel amplicon est caractérisé, par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral - la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ;
- la présence d'une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage ;
- la totalité de la séquence codant pour la protéase ;
- la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 4 Neste taille Nom de séquence d PCR l'amorce Paire 2360 FIT in+ TggTACATCAggCCATATCACCTAgAACTT
N1 pb (SEQ ID NO. 7) FIT in- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTTgCC
(SEQ ID NO. 8) Paire 2338 GP E+ AgAACTTTAAATgCATgggT
N2 pb (SEQ ID NO. 9) RT E- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 10) Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent une meilleure 5 recombinaison sur des patients présentant de nombreuses mutations avec un nouveau vecteur rétroviral délété
d'une partie du gène gag, de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase et une partie de la transcriptase inverse du VIH-1 que la recombinaison 10 décrite dans les conditions du brevet antérieur.
Dans les tableaux 5 et 6 ci-dessous, sont listées les mutations identifiées dans le gène de la protéase et de la transcriptase inverse pour une série de 6 patients. Le tableau 7 donne les valeurs moyennes 15 de capacité réplicative obtenue pour ces 6 patients dans deux tests indépendants avec la méthode de la présente invention. Dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792), sur cette série de patients présentant de nombreuses mutations, la 20 recombinaison avec le vecteur rétroviral n'était pas assez efficace pour produire un niveau suffisant de virus recombinants et permettre une analyse de la capacité réplicative.
Tableau 5 : liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de protéase (IP) sur les six patients étudiés.
Tableau 6: liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de transcriptase inverse (RTI) sur les six patients étudiés.
T69 S+V+A D D
Tableau 7 Patients Moyenne du Ecartype CV%
% de la référence CR 01 42,14 16,14 38,3 CR 02 5,78 0,09 1,5 CR 03 11,88 5,65 47,6 CR 04 8,76 0,31 3,6 CR 05 14,09 3,73 26,5 CR 06 20,70 2,90 14,0 Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent, sur une autre série de 4 patients en outre la production d'une quantité de virus recombinants plus importante que la recombinaison décrite dans les conditions du brevet antérieur ainsi que la normalisation de l'infection des cellules indicatrices en utilisant, par exemple, le dosage de l'antigène p24. Le tableau 8 ci-dessous décrit que la quantité de p24 produite par les virus recombinants de 4 patients selon la méthode du brevet (vecteur GRF) est supérieure à celle du brevet antérieur (vecteur GPR).
Tableau 8 Patients Vecteur quantité de p24 ng/ml Les amorces du tableau 4 permettent encore de mesurer la capacité réplicative sur une gamme de virus recombinants en comparaison à un virus de référence selon des méthodes quantitatives intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées (Figure 4).
Les amorces du tableau 4 permettent enfin d'obtenir une bonne reproductibilité de la mesure de la capacité réplicative sur deux échantillons contrôles dont l'un présentant des mutations connues pour diminuer la capacité réplicative. Le tableau 9 ci-dessous rapporte la reproductibilité de la valeur de capacité réplicative sur 2 échantillons contrôles présentant des mutations connués dans la protéase. 3 tests indépendants.
Tableau 9 Echantillons Mutations dans Moyenne la protéase du % de la Ecartype CV%
référence GPCA L101, G48V, 17,3 2,1 12,3 GPCB 154V, A71V, 46,8 3,1 6,6 Exemple 3 : Compatibilité de l'amplicon des exemples 1 et 2 avec les différents tests commerciaux.
1) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de génotypage.
Les 4 principaux tests commerciaux sont décrits dans un article de W. Cavert & H.H. Balfour (Detection of antiretroviral resistance in HIV-1 Clin Lab Med 2003 23 :915).
1.1) TrugeneTM kit (Bayer Visible Genetics Inc,) (Demande de brevet WO 02/070731 ; Grant et. al.
Accuracy of the Trugene HIV-1 Genotyping kit J Clin Microbiol 2003 41:1586).
Le Kit de génotypage Trugene HIV-1 est utilisé pour déterminer le génotype de virus de sous types B et non B. L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1300 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 247. Le produit de RT-PCR ainsi obtenu est utilisé
dans chacune des 16 réactions de séquençage en utilisant le principe de la réaction CLIPT", technique de séquençage utilisant des amorces marquées (dye primers). Quatre paires d'amorces différentes sont utilisées pour cette méthode de séquençage, deux paires pour le séquençage de la protéase et deux autres paires pour le séquençage de la transcriptase inverse. Chaque réaction de séquence est initiée par une amorce spécifique marquée (CLIPTM) puis interrompue par le nucléotide marqué correspondant. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique, indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués.
Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à
la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.2) ViroSeqTM (Applied Biosystems) (Mracna M et. al. J Clin Microbiol. 2001. 39:4323).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon une technique classique d'extraction 5 basée sur l' af f inité de l'ARN vis-à-vis de colonnes de sicile, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 10 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 335. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé avec 7 amorces différentes selon la technologie Big Dye"
Terminator, technique de séquençage utilisant des nucléotides marqués (dye terminators). La réaction de 15 séquence est initiée par chaque amorce spécifique non marquée puis interrompue par chacun des nucléotides marqués. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse. La couleur du fluorochrome sera alors enregistrée par un séquenceur 20 automatique (séquenceur ABI Prism 377 DNA), indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués. Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.3) GeneSeqTM (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437).
Cette technologie utilise les vecteurs de résistance construits pour le test d'étude phénotypique PhenoSense. La séquence d'acides nucléiques du vecteur comprenant, pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant, pour la transcriptase inverse les codons 1 à 305, est analysée par séquençage en utilisant différentes combinaisons de sondes fluorescentes, les acides nucléiques sont ensuite déposés sur un gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique. Les séquences obtenues sont comparées à
celles obtenues pour des virus de référence.
1.4) GenoSureT" (Virco) (Demande de brevet PCT WO 01/81624).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques d'extraction, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 415. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé selon la technologie Big DyeT" Terminator, précédemment décrite.
2) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de phénotypage.
Une synthèse récente de M. Youle Clinical Issues in HIV publiée en décembre 2003 sur le site www.hivandhepatitis.com décrit les principaux tests de résistance.
Trois tests sont actuellement disponibles PhenoscriptTM (Viralliance) ; AntivirogramTM (Virco) PhenoSenseTM (ViroLogic).
2.1) Le test développé par Virco, AntivirogramTM, n'est pas compatible avec la méthode de l'invention car le fragment d'acides nucléiques de 2200 pb amplifié à partir de l'ARN du patient comprend la protéase du codon 10 au codon 99 et la totalité de la transcriptase inverse. (Hertogs et. al. 1998.
Antimicrob.Agents Chemother).
2.2) PhenoSenseT" (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437 ;
Petropoulos et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2000.
44 :920).
Le test PhenoSense est réalisé à partir de l'ARN viral extrait du plasma d'un patient VIH. Les régions du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse sont amplifiées par RT-PCR pour obtenir une séquence d'acides nucléiques de 1500 pb comprenant les sites de clivage de la protéine gag (p7-pl-p6) la région entière codant pour la protéase et la région de la transcriptase inverse allant du codon 1 au codon 313. Cette séquence est ensuite insérée par ligation dans un vecteur rétroviral VIH contenant un gène rapporteur (Luciférase) et délété dans la protéine d'enveloppe du VIH. Le vecteur retroviral est ensuite co-transfecté dans des cellules 293T avec un vecteur codant pour la protéine d'enveloppe MLV (Murine Leukemia Virus). Les virus produits sont utilisés pour infecter de nouvelles cellules en présence ou en absence d'antirétroviraux. L'activité luciférase dans les cellules infectées en présence de drogue est comparée à l'activité luciférase en absence de drogue ce qui permet le calcul des concentrations inhibant 50%
de la production virale (IC50).
Le tableau 10 ci-dessous résume les caractéristiques des séquences d'acides nucléiques amplifiées dans les principaux tests décrits précédemment.
Tableau 10 Test Taille du gag protéase Transcript fragment ase amplifié inverse Trugene" 1300 pb nd Codons Codons 1-ViroSeqT" 1800 pb nd Codons Codons 1-GeneSeq" 1400 pb nd Codons Codons 1-GenoSureTM 1800 pb nd Codons Codons 1-PhenoSenseT" 1500 pb p7-pl-p6 Codons Codons 1-La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3. L'amplicon selon la présente invention, désigné nouvel amplicon dans la figure 6 est compatible avec l'ensemble de ces tests.
Exemple 4 : Détermination d'un score comme outil d'aide à la décision thérapeutique.
A partir d'un échantillon biologique d'un patient VIH, la méthode de l'invention permet de prendre en compte dans un système de score les mesures de variabilité génique et fonctionnelle d'un virus VIH
appartenant aux sous types B et non B.
La mesure de la variabilité génique est réalisée à partir de la séquence d'acides nucléiques spécifique amplifiée selon la méthode de l'invention, puis analysée selon les techniques de séquençage usuelles (Trugene, ViroSeq). Les mutations dans les gènes de la protéase et de la transcriptase inverse identifiées par ces tests sont interprétées selon des algorithmes remis à jour régulièrement par des comités d'experts. Un premier score de 0 à 2 est attribué à
chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 11 ci-dessous résume les interprétations données par les tests Trugene et ViroSeq en fonction des mutations identifiées et des antirétroviraux (ARV) utilisés et attribue un score génotypique correspondant à l'importance de la résistance.
Tableau 11 ViroSeqTM TrugeneT" score Evidence de la Interprétation de génotypique Résistance la résistance Haute Résistance 0 Possible Résistance 1 Possible Nulle Pas de résistance 2 La mesure de la variabilité fonctionnelle d'un virus VIH consiste en l'analyse de la capacité
réplicative du virus en présence (phénotype) ou en absence d'antirétroviraux (Fitness).
Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues, comparée à un virus de référence (index de résistance). Le niveau de résistance est défini en fonction de seuils de sensibilité (cut off). Un second score de 0 à 2 est attribué à chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 12 résume les interprétations données par les principaux tests Phénotypiques PhenoSense et Phenoscript en fonction de leurs seuils de sensibilité
et attribue un score phénotypique correspondant à
l'importance de la résistance.
Le tableau 12 ci-dessous rapporte l'attribution d'un score phénotypique en fonction de 5 l'interprétation des seuils phénotypiques.
Tableau 12 PhenosenseT" Phenoscriptz" Score Comparaison de la Contribution à la Phénotypique sensibilité réponse thérapeutique Moins sensible Improbable 0 sensible possible 1 Plus sensible probable 2 La capacité réplicative d'un virus, ou fitness, en l'absence d'antirétroviral est mesurée en 10 comparaison à un virus de référence. Elle renseigne sur la capacité du virus à se répliquer et est exprimée en % du virus de référence. A titre d'exemples, on peut citer un virus ayant une fitness de 100% qui sera considéré comme ayant une forte activité réplicative et 15 un virus ayant une fitness de 10% qui sera considéré
comme ayant une faible activité réplicative.
La combinaison des deux scores, génotype, phénotype et du pourcentage de capacité réplicative à
partir d'un même échantillon biologique doit permettre 20 une meilleure interprétation des données cliniques et fournir un outil d'aide à la décision thérapeutique. En pratique, l'addition des scores génotypiques et phénotypiques pour un antirétroviral donné, combinée à
la mesure de la capacité réplicative peut permettre
2) On Rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une paire d'amorces spécifiques permettant d'amplifier de façon régulière un amplicon spécifique, comprenant au moins 2 gènes d'intérêt dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux, comme décrit à l'exemple 1.
3) La préparation d'un nouvel amplicon à
partir de l'amplicon obtenu à l'étape (2) ci-dessus à
l'aide d'une nouvelle paire d'amorces décrite dans le tableau 4 ci-après. Ce nouvel amplicon est caractérisé, par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral - la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ;
- la présence d'une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage ;
- la totalité de la séquence codant pour la protéase ;
- la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 4 Neste taille Nom de séquence d PCR l'amorce Paire 2360 FIT in+ TggTACATCAggCCATATCACCTAgAACTT
N1 pb (SEQ ID NO. 7) FIT in- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTTgCC
(SEQ ID NO. 8) Paire 2338 GP E+ AgAACTTTAAATgCATgggT
N2 pb (SEQ ID NO. 9) RT E- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 10) Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent une meilleure 5 recombinaison sur des patients présentant de nombreuses mutations avec un nouveau vecteur rétroviral délété
d'une partie du gène gag, de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase et une partie de la transcriptase inverse du VIH-1 que la recombinaison 10 décrite dans les conditions du brevet antérieur.
Dans les tableaux 5 et 6 ci-dessous, sont listées les mutations identifiées dans le gène de la protéase et de la transcriptase inverse pour une série de 6 patients. Le tableau 7 donne les valeurs moyennes 15 de capacité réplicative obtenue pour ces 6 patients dans deux tests indépendants avec la méthode de la présente invention. Dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792), sur cette série de patients présentant de nombreuses mutations, la 20 recombinaison avec le vecteur rétroviral n'était pas assez efficace pour produire un niveau suffisant de virus recombinants et permettre une analyse de la capacité réplicative.
Tableau 5 : liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de protéase (IP) sur les six patients étudiés.
Tableau 6: liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de transcriptase inverse (RTI) sur les six patients étudiés.
T69 S+V+A D D
Tableau 7 Patients Moyenne du Ecartype CV%
% de la référence CR 01 42,14 16,14 38,3 CR 02 5,78 0,09 1,5 CR 03 11,88 5,65 47,6 CR 04 8,76 0,31 3,6 CR 05 14,09 3,73 26,5 CR 06 20,70 2,90 14,0 Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent, sur une autre série de 4 patients en outre la production d'une quantité de virus recombinants plus importante que la recombinaison décrite dans les conditions du brevet antérieur ainsi que la normalisation de l'infection des cellules indicatrices en utilisant, par exemple, le dosage de l'antigène p24. Le tableau 8 ci-dessous décrit que la quantité de p24 produite par les virus recombinants de 4 patients selon la méthode du brevet (vecteur GRF) est supérieure à celle du brevet antérieur (vecteur GPR).
Tableau 8 Patients Vecteur quantité de p24 ng/ml Les amorces du tableau 4 permettent encore de mesurer la capacité réplicative sur une gamme de virus recombinants en comparaison à un virus de référence selon des méthodes quantitatives intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées (Figure 4).
Les amorces du tableau 4 permettent enfin d'obtenir une bonne reproductibilité de la mesure de la capacité réplicative sur deux échantillons contrôles dont l'un présentant des mutations connues pour diminuer la capacité réplicative. Le tableau 9 ci-dessous rapporte la reproductibilité de la valeur de capacité réplicative sur 2 échantillons contrôles présentant des mutations connués dans la protéase. 3 tests indépendants.
Tableau 9 Echantillons Mutations dans Moyenne la protéase du % de la Ecartype CV%
référence GPCA L101, G48V, 17,3 2,1 12,3 GPCB 154V, A71V, 46,8 3,1 6,6 Exemple 3 : Compatibilité de l'amplicon des exemples 1 et 2 avec les différents tests commerciaux.
1) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de génotypage.
Les 4 principaux tests commerciaux sont décrits dans un article de W. Cavert & H.H. Balfour (Detection of antiretroviral resistance in HIV-1 Clin Lab Med 2003 23 :915).
1.1) TrugeneTM kit (Bayer Visible Genetics Inc,) (Demande de brevet WO 02/070731 ; Grant et. al.
Accuracy of the Trugene HIV-1 Genotyping kit J Clin Microbiol 2003 41:1586).
Le Kit de génotypage Trugene HIV-1 est utilisé pour déterminer le génotype de virus de sous types B et non B. L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1300 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 247. Le produit de RT-PCR ainsi obtenu est utilisé
dans chacune des 16 réactions de séquençage en utilisant le principe de la réaction CLIPT", technique de séquençage utilisant des amorces marquées (dye primers). Quatre paires d'amorces différentes sont utilisées pour cette méthode de séquençage, deux paires pour le séquençage de la protéase et deux autres paires pour le séquençage de la transcriptase inverse. Chaque réaction de séquence est initiée par une amorce spécifique marquée (CLIPTM) puis interrompue par le nucléotide marqué correspondant. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique, indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués.
Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à
la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.2) ViroSeqTM (Applied Biosystems) (Mracna M et. al. J Clin Microbiol. 2001. 39:4323).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon une technique classique d'extraction 5 basée sur l' af f inité de l'ARN vis-à-vis de colonnes de sicile, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 10 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 335. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé avec 7 amorces différentes selon la technologie Big Dye"
Terminator, technique de séquençage utilisant des nucléotides marqués (dye terminators). La réaction de 15 séquence est initiée par chaque amorce spécifique non marquée puis interrompue par chacun des nucléotides marqués. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse. La couleur du fluorochrome sera alors enregistrée par un séquenceur 20 automatique (séquenceur ABI Prism 377 DNA), indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués. Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.3) GeneSeqTM (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437).
Cette technologie utilise les vecteurs de résistance construits pour le test d'étude phénotypique PhenoSense. La séquence d'acides nucléiques du vecteur comprenant, pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant, pour la transcriptase inverse les codons 1 à 305, est analysée par séquençage en utilisant différentes combinaisons de sondes fluorescentes, les acides nucléiques sont ensuite déposés sur un gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique. Les séquences obtenues sont comparées à
celles obtenues pour des virus de référence.
1.4) GenoSureT" (Virco) (Demande de brevet PCT WO 01/81624).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques d'extraction, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 415. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé selon la technologie Big DyeT" Terminator, précédemment décrite.
2) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de phénotypage.
Une synthèse récente de M. Youle Clinical Issues in HIV publiée en décembre 2003 sur le site www.hivandhepatitis.com décrit les principaux tests de résistance.
Trois tests sont actuellement disponibles PhenoscriptTM (Viralliance) ; AntivirogramTM (Virco) PhenoSenseTM (ViroLogic).
2.1) Le test développé par Virco, AntivirogramTM, n'est pas compatible avec la méthode de l'invention car le fragment d'acides nucléiques de 2200 pb amplifié à partir de l'ARN du patient comprend la protéase du codon 10 au codon 99 et la totalité de la transcriptase inverse. (Hertogs et. al. 1998.
Antimicrob.Agents Chemother).
2.2) PhenoSenseT" (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437 ;
Petropoulos et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2000.
44 :920).
Le test PhenoSense est réalisé à partir de l'ARN viral extrait du plasma d'un patient VIH. Les régions du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse sont amplifiées par RT-PCR pour obtenir une séquence d'acides nucléiques de 1500 pb comprenant les sites de clivage de la protéine gag (p7-pl-p6) la région entière codant pour la protéase et la région de la transcriptase inverse allant du codon 1 au codon 313. Cette séquence est ensuite insérée par ligation dans un vecteur rétroviral VIH contenant un gène rapporteur (Luciférase) et délété dans la protéine d'enveloppe du VIH. Le vecteur retroviral est ensuite co-transfecté dans des cellules 293T avec un vecteur codant pour la protéine d'enveloppe MLV (Murine Leukemia Virus). Les virus produits sont utilisés pour infecter de nouvelles cellules en présence ou en absence d'antirétroviraux. L'activité luciférase dans les cellules infectées en présence de drogue est comparée à l'activité luciférase en absence de drogue ce qui permet le calcul des concentrations inhibant 50%
de la production virale (IC50).
Le tableau 10 ci-dessous résume les caractéristiques des séquences d'acides nucléiques amplifiées dans les principaux tests décrits précédemment.
Tableau 10 Test Taille du gag protéase Transcript fragment ase amplifié inverse Trugene" 1300 pb nd Codons Codons 1-ViroSeqT" 1800 pb nd Codons Codons 1-GeneSeq" 1400 pb nd Codons Codons 1-GenoSureTM 1800 pb nd Codons Codons 1-PhenoSenseT" 1500 pb p7-pl-p6 Codons Codons 1-La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3. L'amplicon selon la présente invention, désigné nouvel amplicon dans la figure 6 est compatible avec l'ensemble de ces tests.
Exemple 4 : Détermination d'un score comme outil d'aide à la décision thérapeutique.
A partir d'un échantillon biologique d'un patient VIH, la méthode de l'invention permet de prendre en compte dans un système de score les mesures de variabilité génique et fonctionnelle d'un virus VIH
appartenant aux sous types B et non B.
La mesure de la variabilité génique est réalisée à partir de la séquence d'acides nucléiques spécifique amplifiée selon la méthode de l'invention, puis analysée selon les techniques de séquençage usuelles (Trugene, ViroSeq). Les mutations dans les gènes de la protéase et de la transcriptase inverse identifiées par ces tests sont interprétées selon des algorithmes remis à jour régulièrement par des comités d'experts. Un premier score de 0 à 2 est attribué à
chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 11 ci-dessous résume les interprétations données par les tests Trugene et ViroSeq en fonction des mutations identifiées et des antirétroviraux (ARV) utilisés et attribue un score génotypique correspondant à l'importance de la résistance.
Tableau 11 ViroSeqTM TrugeneT" score Evidence de la Interprétation de génotypique Résistance la résistance Haute Résistance 0 Possible Résistance 1 Possible Nulle Pas de résistance 2 La mesure de la variabilité fonctionnelle d'un virus VIH consiste en l'analyse de la capacité
réplicative du virus en présence (phénotype) ou en absence d'antirétroviraux (Fitness).
Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues, comparée à un virus de référence (index de résistance). Le niveau de résistance est défini en fonction de seuils de sensibilité (cut off). Un second score de 0 à 2 est attribué à chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 12 résume les interprétations données par les principaux tests Phénotypiques PhenoSense et Phenoscript en fonction de leurs seuils de sensibilité
et attribue un score phénotypique correspondant à
l'importance de la résistance.
Le tableau 12 ci-dessous rapporte l'attribution d'un score phénotypique en fonction de 5 l'interprétation des seuils phénotypiques.
Tableau 12 PhenosenseT" Phenoscriptz" Score Comparaison de la Contribution à la Phénotypique sensibilité réponse thérapeutique Moins sensible Improbable 0 sensible possible 1 Plus sensible probable 2 La capacité réplicative d'un virus, ou fitness, en l'absence d'antirétroviral est mesurée en 10 comparaison à un virus de référence. Elle renseigne sur la capacité du virus à se répliquer et est exprimée en % du virus de référence. A titre d'exemples, on peut citer un virus ayant une fitness de 100% qui sera considéré comme ayant une forte activité réplicative et 15 un virus ayant une fitness de 10% qui sera considéré
comme ayant une faible activité réplicative.
La combinaison des deux scores, génotype, phénotype et du pourcentage de capacité réplicative à
partir d'un même échantillon biologique doit permettre 20 une meilleure interprétation des données cliniques et fournir un outil d'aide à la décision thérapeutique. En pratique, l'addition des scores génotypiques et phénotypiques pour un antirétroviral donné, combinée à
la mesure de la capacité réplicative peut permettre
25 d'orienter le choix thérapeutique. Le score génotypique + phénotypique sera compris entre 0 et 4 pour chaque ARV et sera accompagné d'un % de capacité réplicative.
Ainsi, pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1 et que la capacité réplicative est élevée (100% ou plus), il faut favoriser l'arrêt de la molécule car, le virus est résistant et garde une forte capacité à se répliquer en présence de cet ARV.
Pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1, et la capacité réplicative faible (10%), la poursuite de la molécule peut être préférée à
l'arrêt du traitement par le clinicien en l'absence d'alternative thérapeutique..
DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des brevets JUVIBO APPLICATIONS/PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION/PATENT CONTAINS MORE THAN ONE
VOLUME
NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Patent Office NOM DU FICHIER / FILE NAME:
NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
Ainsi, pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1 et que la capacité réplicative est élevée (100% ou plus), il faut favoriser l'arrêt de la molécule car, le virus est résistant et garde une forte capacité à se répliquer en présence de cet ARV.
Pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1, et la capacité réplicative faible (10%), la poursuite de la molécule peut être préférée à
l'arrêt du traitement par le clinicien en l'absence d'alternative thérapeutique..
DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des brevets JUVIBO APPLICATIONS/PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION/PATENT CONTAINS MORE THAN ONE
VOLUME
NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Patent Office NOM DU FICHIER / FILE NAME:
NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
Claims (32)
1) Méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes :
a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus VIH ;
b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ;
ladite méthode comprenant en outre - l'étape (c), et/ou - la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g), ci-après :
c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à
établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit de transcription inverse ;
d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en uvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré
par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ;
e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ;
f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ;
g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus VIH ;
b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ;
ladite méthode comprenant en outre - l'étape (c), et/ou - la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g), ci-après :
c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à
établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit de transcription inverse ;
d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en uvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré
par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ;
e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ;
f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ;
g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
2) Une méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la première paire d'amorces permet l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse, comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux.
3) Une méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la première paire d'amorces permet de préparer un produit amplifié de transcription inverse présentant :
- à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales, - potentiellement des mutations d'intérêt.
- à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales, - potentiellement des mutations d'intérêt.
4) Une méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la première paire d'amorces permet de préparer un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse impliqués dans la capacité réplicative du virus, et susceptible de conférer, au virus, une résistance thérapeutique.
5) Une méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on obtient un produit amplifié de transcription inverse possédant - une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
6) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à
l'étape (b) on obtient un produit amplifié de transcription inverse présentant une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
l'étape (b) on obtient un produit amplifié de transcription inverse présentant une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
7) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la première paire d'amorces encadre une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, et complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
8) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la première paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
9) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la première paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
10) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) l'amplification est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 - des fragments ou analogues de ces séquences.
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 - des fragments ou analogues de ces séquences.
11) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) l'amplification est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6.
- la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6.
12) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'étape (c) de séquençage permet d'identifier les mutations connues, inconnues et associées à partir des données disponibles dans la littérature.
13) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à
l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met oeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon présentant :
- à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral - potentiellement des mutations d'intérêt.
l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met oeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon présentant :
- à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral - potentiellement des mutations d'intérêt.
14) Une méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'à l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à
l'étape (b) comprend tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, est réalisée avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en oeuvre à
l'étape (b), et permettant d'obtenir un amplicon comprenant :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
l'étape (b) comprend tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, est réalisée avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en oeuvre à
l'étape (b), et permettant d'obtenir un amplicon comprenant :
- une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
15) Une méthode selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que l'amplicon présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
16) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que l' amplification de l'étape (d) met en oeuvre une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides nucléiques, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
17) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que la paire d'amorces mise en uvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
18) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que la paire d'amorces mise en uvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
19) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 - des fragments ou analogues de ces séquences.
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 - des fragments ou analogues de ces séquences.
20) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 19, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10.
- la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10.
21) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'analyse fonctionnelle de l'étape (f) consiste à
infecter des cellules cibles du VIH avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues.
infecter des cellules cibles du VIH avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues.
22) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mesure de la capacité réplicative à l'étape (g) consiste à mesurer l'expression d'un gène indicateur en réponse à l'infection par le virus recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un virus de référence.
23) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que dans le cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été
effectuées, ladite méthode comprend :
h) le traitement des données relatives :
- à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité réplicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement.
effectuées, ladite méthode comprend :
h) le traitement des données relatives :
- à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité réplicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement.
24) Un jeu d'amorces susceptibles d'être mise en uvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, et complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
25) Un jeu d'amorces selon la revendication 24, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome).
26) Un jeu d'amorces selon l'une des revendication 24 ou 25, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
- complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
27) Un jeu d'amorces selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce que ladite paire est choisie dans le groupe comprenant :
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 - des fragments ou analogues de ces séquences.
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 - des fragments ou analogues de ces séquences.
28) Un jeu d'amorces selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que ladite paire est choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6.
- la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6.
29) Un jeu d'amorces susceptibles d'être mise en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce qu'il comprend ou est constitué d'une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant :
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 - des fragments ou analogues de ces séquences.
- comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 - des fragments ou analogues de ces séquences.
30) Un jeu d'amorces selon la revendication 29, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces est choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10.
- la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10.
31) Un jeu d'amorce selon l'une quelconque des revendications 24 à 30, caractérisée en ce que ladite paire d'amorces permet d'amplifier une séquence présentant une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
32) Un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à
23, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un jeu d'amorces selon l'une quelconque des revendications 24 à 31.
23, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un jeu d'amorces selon l'une quelconque des revendications 24 à 31.
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