CH652418A5

CH652418A5 - Processo per la preparazione di carbamil derivati di alpha-idrossiacidi e dei corrispondenti alpha-idrossiacidi.

Info

Publication number: CH652418A5
Application number: CH7331/80A
Authority: CH
Inventors: Roberto Olivieri; Bianchi Giancarlo Eletti; Eugenio Fascetti; Felice Centini; Ludwig Degen; Walter Marconi
Original assignee: Eni Ente Naz Idrocarb
Priority date: 1979-10-17
Filing date: 1980-10-01
Publication date: 1985-11-15
Also published as: IE801948L; IT1125486B; NL8005738A; AT373914B; LU82827A1; AU6244680A; DE3039132A1; FI71167C; AU540872B2; DK161718B; ES8205017A1; US4489208A; GB2061269A; DK161718C; DK394580A; IT7926547A0; CA1146889A; IE50297B1; DE3039132C2; FR2467843B1

Description

La presente invenzione ha per oggetto un processo per la preparazione di a-idrossiacidi per idrolisi di composti aventi la formula generale (I).

R H C

O = C

5 1 4

0

(D

\n3 /2C = 0

I

H

20 ove R può essere un residuo aromatico o alifatico, sostituito o no.

Secondo la presente invenzione i composti aventi formula generale (I), cioè i 2,4-ossazolidin dioni 5-sostituiti, possono subire una reazione di dirolisi che comporta l'aper-25 tura dell'anello secondo Io schema seguente:

R HC

R I

0 II

HC — OC-NH,

30

o=c c=o

H2°

«»

(I)

t

H

o~c I

OH

(ID

Il composto di formula generale (II) ottenuto in seguito all'idrolisi risulta essere il carbamil derivato di un a-idrossiacido, dal quale l'a-idrossiacido può essere ottenuto sottoponendo ad ulteriore idrolisi il composto (II) secondo lo 40 schema:

E

H00C-CH-0C0NH + HO

i 4L. tL

45 ^

R-CH-COO-H + CO +NH-I 2 3

OH (III)

so II prodotto finale (III) è l'a-idrossiacido.

Un ulteriore importante oggetto della presente invenzione è costituito da un procedimento per la produzione diretta di D-carbamil a-idrossiacidi mediante idrolisi enzimatica stereoselettiva di miscele raceme dei composti rientranti 55 nella formula generale (I).

Si è infatti sorprendentemente trovato che è possibile eseguire enzimaticamente l'idrolisi di DL-2,4 ossazolidindioni 5-sostituiti in modo da ottenere il solo D-carbamil-a--idrossiacido, cioè uno solo dei due isomeri ottici possibili. 60 Dal carbamilderivato otticamente attivo si può ottenere, per semplice idrolisi, l'a-idrossiacido libero a configurazione D.

Composti come quelli descritti nella formula (I) possono essere facilmente preparati dai corrispondenti a-idrossiacidi fatti reagire con urea secondo quanto descritto da Helge 65 Aspelund in Acta Acad. Aböensins Math, e Phys. 22 (7) 12 (1961).

La risoluzione della miscela racema avviene per idrolisi stereoselettiva dell'anello ossazolidinico operata da enzimi

3

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facilmente reperibili da colture di svariati microorganismi o da estratti di organi animali quali ad esempio il fegato di vitello.

Un caso particolare, invero assai interessante ma non limitante la validità generale del processo suddetto, è costituito dalla preparazione dell'acido D(—) mandelico

(7)— ÇH - COOH (rv

OH

che è un importante intermedio per la preparazione di antibiotici semisintetici.

Questo intermedio è generalmente preparato per risoluzione della miscela racema mediante formazione di sali diastereo-isomerici con basi naturali otticamente attive, come ad esempio la brucina. Questi procedimenti danno in ogni caso una resa massima teorica del 50 % in quanto l'enantiomero L deve essere racemizzato prima di essere riciclato. Secondo la presente invenzione il carbamil derivato dell'acido D(—) mandelico può essere vantaggiosamente preparato mediante idrolisi enzimatica stereoselettiva del corrispondente 5-fenil 2,4-ossazolidin dione. Un ulteriore notevole vantaggio del procedimento oggetto di questa invenzione, consiste nel fatto che il substrato della reazione enzimatica racemizza spontaneamente nelle condizioni di idrolisi, così che a fine reazione si ottiene il carbammato dell'acido D-mandelico in quantità stechiometrica rispetto al substrato di partenza.

Lo schema di reazione è il seguente:

(°X & s

H. 0 0 C-NH,

/Oc 0 N'I I v H I

0n i<=l x K roH

A /\ q/ V0 o

ONO I D

H H

L D

Successivamente dal carbammato dell'acido D-mandelico si ottiene l'acido D(—) mandelico per idrolisi in ambiente acido.

L'attività enzimatica utile per la preparazione del carbammato dell'acido D(—) mandelico è stata riscontrata,

oltre che negli omogenati di fegato di vitello, nei microorganismi sottoelencati:

Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevi-bacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micro-coccus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomy-ces, Candida, Rhodotorula, Pichia o Paecilomyces.

Particolarmente adatti si sono rivelati i microorganismi dei generi seguenti:

Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291

deposito il 6 aprile 1978 Bacillus Brevis NRRL B 11080 deposito l'I 1 febbraio 1977 Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079

deposito l'I 1 febbraio 1977 Pseudomonas sp CBS 145.75 deposito il 5 marzo 1975 Pseudomonas sp CBS 146.75 deposito il 5 marzo 1975 Pseudomonas sp ATCC 11299

Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 Pseudomonas putida ATCC 12633

accessibili al pubblico prima del 17 ottobre 1979) data di priorità del presente brevetto, vedasi il catalogo ATCC e la relativa dichiarazione del 19 maggio 1977 Pseudomonas desmolytica NCIB 8859

accessibile al pubblico prima del 17 ottobre 1979, data di priorità del presente brevetto, vedasi il catalogo NCIB.

Gli indirizzi dei centri di raccolta sopraccitati sono:

NRRL Agriculture Research Service,

Culture Collection,

Northern Regional Research Laboratory 1815 North University Street,

Peoria, Illinois 61604, USA

CBS Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Postbus 273,

3740 Baarn, Olanda

ATCC American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,

Rockville, Maryland 20852, USA

NCIB Torry Research Statoin,

National Collection of Industriai Bacteria, 135 Abbey Road, P.O. Box 31,

Aberdeen AB9 8DG, Regno Unito di Gran Bretagna

Per la realizzazione del processo secondo la presente invenzione i microorganismi dei generi sopra descritti vengono coltivati in condizioni aerobiche in terreni di coltura contenenti fonti di azoto, carbonio, fosforo e sali minerali ad una temperatura compresa tra 20°C e 80°C per un tempo tra 10 e 72 ore e ad un pH tra 6.0 e 8.0.

Come fonti di carbonio possono essere usati glucosio, lattato, acetato, corn steep liquor e lattosio.

Come fonti di azoto possono essere usati idrolizzati di carne, di caseina o soia, sali ammoniacali, urea, idantoine ecc.

Un terreno di coltura idoneo ha, per esempio, la seguente composizione:

peptone di carne 5 g estratto di carne 5 g glucosio 5 g acqua distillata 1000 cc.

pH 7.0 + 7.2

Il D(—) carbammato dell'acido mandelico può essere prodotto direttamente nei terreni di fermentazione contenenti il corrispondente DL-2,4 ossazolidindione oppure può essere prodotto utilizzando direttamente la pasta microbica come «resting cells» oppure utilizzando estratti di essa. L'estrazione dalla pasta batterica dei complessi enzimatici oggetto della presente invenzione avviene con i comuni metodi usati in enzimologia.

Per questo scopo le cellule vengono disintegrate con appositi apparecchi, per esempio French Pressure-Cell Press, Manton Gaulin Homogenizer, disintegratori rotativi ecc., oppure con ultrasuoni.

L'idrolisi del D,L-2,4-ossazolidindione 5-sostituito può essere effettuata aggiungendo alla miscela di reazione l'enzima sotto le seguenti forme: cellule fresche, cellule liofilizzate, cellule toluenizzate, polvere acetonica o estratti grezzi o purificati.

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60

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'4

Un ulteriore miglioramento tecnico ed economico può essere apportato immobilizzando gli enzimi attraverso combinazione con composti macromolecolari mediante formazione di legami chimici con la matrice oppure legami di tipo ionico oppure mediante immobilizzazione fisica.

Gli esempi che seguono evidenziano altre modalità operative concernenti la presente invenzione ma non sono limitanti di essa.

Esempio 1

Veniva preparato un brodo di coltura avente la seguente composizione:

peptone di carne 5 g estratto di carne 3 g glucosio 5 g acqua distillata 1000 cc.

Il pH veniva aggiustato a 7,2 con soda ed il terreno distribuito in porzioni di 100 mi in beute da 500 mi. Dopo sterilizzazione per 30 minuti a 110°C le beute venivano inoculate con una coltura del ceppo Pseudomonas CBS 145.75 da slant contenente lo stesso terreno con il 2% di agar (DIFCO) e incubate per 24 ore a 30°C sotto agitazione orbitale (220 r.p.m.).

Da questa precoltura (D.O. a 550 nm: = 0.250 di 1 X 1:10) venivano inoculati 1 mi in 5 beute da 500 mi contenenti 100 mi dello stesso terreno e la coltura veniva incubata a 30°C sotto agitazione orbitale (220 r.p.m.) per 24 ore (D.O. a 550 nm: = 0.450 dil 1:10).

Le cellule venivano poi raccolte, lavate in soluzione fisiologica e alla fine sospese in 100 mi di tampone pirofosfato 0.1 M pH 8,7 contenenti 2 g di DL 5-fenil-2,4-ossa-zolidin-dione alla temperatura di 50°C.

Dopo 70 ore di incubazione in queste condizioni, si completava l'idrolisi a carbammato dell'acido D-mandelico, comprovata dall'analisi polarimetrica della miscela di reazione. Il carbammato veniva isolato dalla miscela di reazione, previo allontanamento della pasta cellulare per centrifugazione, raffreddando e portando il pH a 2,5 con HCl conc. Il precipitato così ottenuto veniva filtrato, lavato con H20 fredda ed essiccato sotto vuoto. Si ottenevano 1,8 g 5 di carbammato la cui identità veniva comprovata dagli spettri IR, NMR e dalla analisi elementare.

Il potere ottico rotatorio specifico della soluzione alcolica del carbammato ottenuto come sopradescritto era: Md25 = -141.

io II suo punto di fusione (con decomposizione) era pari a 169°C.

1,4 grammi di carbammato sono stati sospesi in 100 mi di H20, quindi riscaldati a ricadere per 4 ore. La soluzione acquosa, così ottenuta, veniva acidificata e quindi estratta i5 con etere etilico e la fase organica concentrata sotto vuoto fino a secchezza.

Si ottenevano 1.10 grammi di ac. mandelico grezzo Md25 = ~ 120 (resa ottica = 76%).

Il prodotto grezzo cristallizzato da acqua aveva un 20 p.f. = 130°C ed un [a]D25 = —154.5 in acqua, contro un p.f. = 133°C e un [a]D25 = —158 descritti in letteratura per l'acido D(—) mandelico.

Esempio 2

25 1 g di polvere acetonica di un omogenato di fegato di vitello veniva aggiunto ad una soluzione contenente 500 mg di DL-5-fenil-2,4-ossazolidindione in 50 mi di tampone pirofosfato 0,1 M pH = 8,5.

La miscela di reazione così ottenuta veniva incubata a 30 30°C per 40 ore.

Veniva quindi effettuato il recupero del carbammato dell'acido D mandelico come descritto nell'esempio 1.

Si ottenevano 380 mg di carbammato grezzo con un potere ottico rotatorio specifico [a]D25 = —136 in etanolo. 35 Veniva quindi effettuata l'idrolisi acida del carbammato grezzo e l'estrazione dell'acido mandelico così come descritto nell'esempio 1 ottenendo 300 mg di acido D mandelico grezzo con [a]D25 = —116. (resa ottica = 73.5%).

v

Claims

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2. Processo secondo la rivendicazione 1 secondo la preparazione di D-carbamil a-idrossiacidi consistente nel sottoporre ad idrolisi enzimatica stereoselettiva DL-2,4 ossazo-lidindioni 5-sostituiti di formula generale (I).

2

RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di carbamil derivati di a-idrossiacidi consistente nel sottoporre ad idrolisi 2,4 ossa-zolidindioni 5 sostituiti di formula generale (I)

quoso il corrispondente carbammato ad una temperatura compresa tra 40 e 100°C e ad un pH compreso tra 1 e 3,5.

R l

H.C 0

I | (I)

0 = C . C = 0

\ N /

!

H

ove R è un residuo aromatico od alifatico, sostituito o no.
3. Processo per la preparazione di D-carbamil a-idrossiacidi secondo la rivendicazoine 2, caratterizzato dal fatto che gli agenti aventi attività enzimatica nell'idrolisi stereo-selettiva di 2,4 ossazolidindioni 5-sostituiti sono ottenuti da omogenati di fegato di vitello.
4. Processo per la preparazione di D-carbamil-a-idros-siacidi secondo una delle rivendicazioni 2 e 3, caratterizzato dal fatto che gli agenti aventi attività enzimatica nell'idrolisi stereoselettiva di 2,4 ossazolidindioni 5-sostituiti sono prodotti da microorganismi scelti fra i seguenti: Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Micro-bacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia o Paecilomyces.
5. Processo per la preparazione di D-carbamil-a-idros-siacidi secondo una delle rivendicazioni 2, 3 e 4, caratterizzato dal fatto che gli agenti aventi attività enzimatica nell'idrolisi stereoselettiva di DL 2,4-ossazolidindioni 5-sosti-tuiti sono preferibilmente prodotti dai micro-organismi dei generi seguenti: Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo thermophi-lus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp ATCC 11 299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluo-rescens ATCC 11 250 e Pseudomonas putida ATCC 12 633.
6. Processo per la preparazione di D-carbamil-œ-idros-siacidi secondo una delle rivendicazioni 2, 3 e 5, caratterizzato dal fatto che i microorganismi vengono coltivati in condizioni aerobiche ad una temperatura compresa tra 20°C e 80°C.
7. Processo per la preparazione di D-carbamil a-idrossi-acidi secondo una delle rivendicazioni 2, 3, 5 e 6, caratterizzato dal fatto che il tempo di coltivazione dei microorganismi è compreso tra 10 e 72 ore.
8. Processo per la preparazione di D-carbamil a-idrossiacidi secondo una delle rivendicazioni 1 a 7, caratterizzato dal fatto che il pH del terreno di coltura dei microorganismi è compreso nell'intervallo 6-8.
9. Processo per la preparazione di D-carbamil 'a-idrossiacidi secondo una delle rivendicazioni 1 a 8, caratterizzato dal fatto che il D a-idrossiacido e l'acido D(—) mandelico ed il substrato di formula generale (I) è costituito da DL-5--fenil 2,4-ossazolidindione.
10. Utilizzazione del processo secondo una delle rivendicazioni 1 a 9 per la produzione di acido D(—) mandelico consistente nel sottoporre a idrolisi acida in ambiente ac-