DE3780506T2 - Reinigung des einkettigen und zweikettigen gewebeplasminogenaktivators. - Google Patents
Reinigung des einkettigen und zweikettigen gewebeplasminogenaktivators.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von einkettigem und/oder zweikettigem Gewebeplasminogenaktivator (nachfolgend mit sc-tPA bzw. dc-tPA bezeichnet) aus einem Gemisch, das sc-tPA und/oder dc-tPA enthält.
- tPA (Gewebeplasminogenaktivator) ist ein Protein, das in einem Gewebe eines höheren Tieres produziert wird und dazu dient Plasminogen zu aktivieren, das ein Vorläufer von Plasmin ist, welches als für Fibrin spezifisches proteolytisches Protein bekannt ist. tPA wurde nun als potentielles thrombolytisches Mittel in den Brennpunkt des Interesses gerückt.
- tPA hat zwei molekulare Formen, einkettiges tPA und zweikettiges tPA, die dasselbe Molekulargewicht haben (ungefähr 70000 Dalton) und wird als ein Gemisch in gewöhnlichen Verfahren für die tPA-Produktion erhalten. Eine zweikettige Form hat ungefähr 10-fach höhere Aktivität für die Aktivierung von Plasminogen als eine einkettige Form (europäische Patentanmeldung Nr. 112122A). Jedoch ist bekannt, daß sc-tPA eine stärkere Fähigkeit als dc-tPA besitzt, Fibrin zu binden und daß sobald es an Fibrin gebunden ist, es sich schnell in dc-tPA umwandelt (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem 257, 2920-2925, 1982). Deshalb sollte bei der Behandlung von Thrombosen durch tPA eine erhöhte Bindungsfähigkeit von tPA an Fibrin bei der Blutgerinnung erhalten werden, und zwar durch Verwendung eines tPA-Gemischs, das eine erhöhte Menge sc-tPA enthält oder durch Verwendung einer Präparation, die nur sc-tPA enthält.
- Unter diesen Umständen und auch, um Eigenschaften und Funktionen von tPA in größerem Detail zu untersuchen, besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zum Erhalt von ausschließlich einkettiger Form und zum getrennten Isolieren von einkettiger und zweikettiger Form aus einem Gemisch davon.
- Ein schon früher bekanntes Verfahren zur Präparation von tPA umfaßt zum Beispiel: Kultivieren von Zellen, die die angeborene Fähigkeit besitzen, tPA zu produzieren oder so verändert worden sind, so daß sie ein tPA-Gen tragen, und dann Isolieren von tPA aus den sich ergebenden kultivierten Zellen und/oder aus dem Kulturüberstand. Zum Beispiel offenbart die oben erwähnte Europäische Patentveröffentlichung Nr. 112122A ein Verfahren zum Reinigen von tPA unter Verwendung von Erythrin-Trypsin-Inhibitor (nachfolgend als ETI bezeichnet) oder von immobilisiertem Kunits-Inhibitor, der aus Samen von Erythrina latissima oder anderen Erythrina-Pflanzen hergestellt worden ist und als Inhibitor für Trypsin, Plasmin und tPA, aber nicht für Urokinase, wirkt. Jedoch wird bei diesem Verfahren eine getrennte Isolation von sc-tPA und dc-tPA nicht in Erwägung gezogen.
- In einem früher bekannten Verfahren zur Präparation von sc- tPA wird ein Proteinase-Inhibitor, wie z.B. Aprotinin, zu dem Kulturmedium hinzugefügt, um die Umwandlung von tPA aus der einkettigen in die zweikettige Form zu unterdrücken (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035-7041, 1981).
- Bei einem anderen Verfahren zur Reinigung von sc-tPA wird ein immobilisierter monoklonaler Antikörper, der sc-tPA spezifisch adsorbiert, verwendet (Katalog von BioPool, Schweden). Jedoch ist dieses Verfahren minderwertiger als das Verfahren mit ETI in Bezug auf die Fähigkeit tPA zu adsorbieren und die Stabilität der zu verwendenden Säule. Darüberhinaus und unvorteilhafterweise kann dieses Verfahren keine Proteinverunreinigung mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton entfernen, welche potentiell als Antigen wirkt, um mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper zu reagieren.
- Im Verlauf verschiedener Untersuchungen an Verfahren zum Reinigen von tPA aus einer tPA-Rohpräparation bei der tPA- Produktion haben vier der vorliegenden Erfinder ein Verfahren zum Isolieren und Entfernen des Proteins mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton entwickelt, wobei dieses mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper, der in einem fötales Kälberserum enthaltendem Kulturmedium hergestellt worden ist, reagiert; und ein Verfahren zum Kultivieren von umgeformten bzw. transformierten Zellen, die durch Genmanipulation hergestellt worden sind, und zum selektiven Abtrennen von tPA, das aus menschlichen Zellen stammt, von tPA, das aus Wirtszellen stammt (Europäische Patentanmeldung Nr. 0210870).
- Und weiter im Verlauf eingehender Untersuchungen von verschiedenen Merkmalen von sc-tPA und dc-tPA haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, daß diese zwei Formen von tPA sich in einer Affinität für ETI unterscheiden.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zur Isolation von sc-tPA und dc-tPA, und zwar erfolgreich und einfach aus einem Gemisch davon.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zur Isolation von sc-tPA und/oder dc-tPA aus einer tPA-Rohpräparation, die sc-tPA und/oder dc-tPA enthält.
- Verfahren, die die Erfindung darstellen, enthalten die Schritte: dichtes Inberührungbringen eines Gemisches, das sc-tPA und/oder dc-tPA enthält, mit einer immobilisierten ETI-Säule, um tPA zu adsorbieren und dann selektives Eluieren des gewünschten sc-tPA und/oder dc-tPA durch Änderung des pH-Wertes der Elutionsmittel, um tPA zu eluieren.
- Entweder eine der zwei Formen kann gereinigt werden oder die zwei Formen können voneinander isoliert und wie gewünscht gereinigt werden.
- Die Erfindung stellt ein Verfahren zum getrennten Reinigen von einkettigem Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und zweikettigem tPA bereit, das durch die Schritte gekennzeichnet ist:
- (a) dichtes Inberührungbringen eines Gemisches enthaltend einkettigen und zweikettigen tPA mit einem Adsorbtionsmittel (z.B. in einer Säule enthalten), welches einen immobilisierten Erythrin-Trypsin-Inhibitor als Affintätsmittel für die Adsorbtion der tPas an das Adsorbtionsmittel enthält;
- (b) Behandeln des Adsorbtionsmittels mit einem Elutionsmittel, das einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0 hat, zur selektiven Elution voneinkettigem tPA; und
- (c) Behandeln des Adsorbtionsmittels mit einem Elutionsmittel, das einen pH-Wert unter 4,5 hat, zur selektiven Elution von zweikettigem tPA.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reingung von einkettigem tPA aus einem Gemisch, das einkettigen tPA enthält, gekennzeichnet durch die Schritte des dichten Inberührungbringens eines Gemischs, das den einkettigen tPA enthält, mit einem Adsorbtionsmittel (z.B. in einer Säule enthalten), das einen immobilisierten Erythrin-Trypsin-Inhibitor als Affinitätsmittel enthält und danach selektives Eluieren von einkettigem tPA, der auf dem Adsorbtionsmittel adsorbiert ist, mit einem Elutionsmittel mit einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0.
- Die Erfindung stellt auch die Verwendung von einkettigem tPA, der durch das erfindungsgemäße Verfahren gereingt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombose bereit.
- In einem anderen Aspekt der Erfindung kann sc-tPA und/oder dc-tPA erfolgreich isoliert werden und durch Zusatz von Guanidin- oder Amidin-Derivaten, wie z.B. Arginin oder Benzamidin, zu dem Elutionsmittel gereinigt werden.
- Die vorliegende Erfindung ist unabhängig vom Zelltyp, der tPA produziert, anwendbar; sc-tPA und/oder dc-tPA können von irgendwelchen Säugetierzellen, wie Melanomzellen und normalen menschlichen Zellen oder von Zellen mit einem menschlichen tPA-Gen, das mittels Genmanipulation dort eingebaut worden ist, isoliert werden. Zusätzlich können sc-tPA und dc-tPA aus einem mit Serum versetzten Medium und auch aus einem serumfreien Medium, d.h. unabhängig von Bestandteilen des Kulturmediums, isoliert und gereinigt werden.
- Es folgt nun eine Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung. Diese Beschreibung wird nur als Beispiel gegeben und nicht, um die Erfindung zu beschränken.
- In einer Ausführungsform wird ein Gemisch, das sc-tPA und dc-tPA enthält, zuerst über eine Säule gegeben, die immobilisierten ETI enthält, um tPA zu adsorbieren; sc-tPA wird dann mit einem Elutionsmittel, das einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0 hat, eluiert, und dc-tPA wird mit einem Elutionsmittel mit einem unter 4,5 liegenden pH-Wert eluiert.
- In einer anderen Ausführungsform wird ein Gemisch, das sc- tPA und/oder dc-tPA enthält, über eine Säule gegeben, die immobilisierten ETI enthält, und dann, falls auschließlidh sc-tPA gewünscht ist, wird die Säule mit einem Elutionsmittel mit einem pH-Wert, der im Bereich von 4,5 bis 6,0 liegt, behandelt und, falls ausschließlich dc-tPA gewünscht ist, wird die Säule mit einem Elutionsmittel mit einem unter 4,5 liegenden pH-Wert behandelt. Somit kann entweder sc-tPA oder dc-tPA, wie benötigt, isoliert und gereinigt werden.
- Das oben beschriebene Verfahren zur Isolation und Reingung kann wirksam durch Zufügen eines Amidin-Derivats oder Guanidin-Derivats, wie z.B. Arginin oder Benzamidin, als Zusatz zu dem Elutionsmittel ausgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Elutionsmuster mit (einem) genügend scharfen Aktivitätspeak(s) für tPA unter verschiedenen Elutionsbedingungen, die eine Vielzahl von Säulengrößen und ähnliches einschließen, erhalten werden.
- Bevorzugte Beispiele eines Trägers für die ETI-Immobilisierung schließen unlösliche Agarose, Dextran, Cellulose, Polyacrylamid und Polyethylenglycidylmetacrylat-Polymer ein. Bevorzugte Beispiele eines Verfahrens für die ETI-Immobilisierung schließen bekannte Verfahren ein, wie z.B. ein Verfahren der Bindung von ETI an einen mit Cyanbromid vor-aktivierten Träger; eine Carbo-Imido-Kopplungsmethode, in der eine freie Aminogruppe an eine freie Carboxylgruppe gebunden ist; und eine Glutaraldehyd-Kopplungsmethode, in der eine Aminogruppe an einen vorher in eine Aminoalkylform umgewandelten Träger gebunden ist. Ein anderes Beispiel für einen immobilisierten ETI-Träger ist einer, der Perjodat-aktiviert ist, bei dem eine darin gebildete Aldehydgruppe mit einer Aminogruppe in ETI bei einem pH-Wert zwischen 4 bis 6 reagiert, um eine Schiff'sche Base zu bilden und dann durch Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid reduziert wird. Weiter kann ein Material für einen Träger in ein Hydrazid- Succinyl-Derivat umgewandelt werden, bei dem ein Carboxyl- Ligand an eine Aminogruppe durch EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid) oder durch Diazonisierung zu binden ist. Cellulosefasern und -partikel sind in Hydrazid-Derivate umzuwandeln und können gemäß des Verfahrens von Parikh et al. (Methods in Enzymology, 34, 77-102, Herausgeber: W.B. Jakobi und Wilckeck, Academic Press, N.Y.) angewendet werden. Polyacrylamidpartikel können direkt durch eine Glutaraldehyd-Kopplungsmethode oder durch Diazonisierung eines p- Aminobenzamidoethyl-Derivats oder eines Hydrazid-Derivats gebunden werden.
- Zu verwendende Elutionsmittel zum Eluieren von tPA schließen saure Lösungen mit pH-Werten unter 6, wasserlösliche Salzlösungen und Pufferlösungen ein.
- Bevorzugte Beispiele solcher saurer Lösungen schließen solche ein, die mindestens eine Säure ausgewählt aus der Säuregruppe enthalten, die typischerweise umfaßt: Zitronensäure, Oxalsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Phthalsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Adipinsäure, Phosphorsäure und Salzsäure.
- Bevorzugte Beispiele solcher wasserlöslicher Salzlösungen schließen wässrige Lösungen ein, die mindestens ein Salz ausgewählt aus der Salzgruppe enthalten, die typischerweise umfaßt: Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid, Ammoniumchlorid, Bariumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumnitrat, Kaliumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat.
- Weiter schließen bevorzugte Beispiele solch einer Pufferlösung einen Natriumphosphatpuffer, einen Kaliumphosphatpuffer, einen Veronalpuffer, Zusätze in einer Kombination, wie z. B. Natriumphosphat-Phosphorsäure, Kaliumphosphat-Phosphorsäure, Zitronensäure-Natriumcitrat, Bernsteinsäure-Borat, Essigsäure-Natriumlaktat, Essigsäure-Natriumacetat, Oxalsäure-Natriumoxalat, Glycin-Salzsäure und Kaliumhydrogenphthalat-Natriumhydroxid ein.
- Diese Elutionsmittel können weiter ein oder mehrere wasserlösliche organische Lösungsmittel enthalten.
- Bevorzugte Konzentrationen eines Zusatzes, der aus einem Amidinderivat oder einem Guanidinderivat besteht und zum Eluieren von tPA zu verwenden ist, reichen von 1 mM bis zu dessen maximaler Löslichkeit. Zum Beispiel erniedrigt sich die anwendbare Konzentration bei einem pH-Wert zwischen 4,5 bis 6,0 verhältnismäßig zu der Annäherung des pH-Wertes auf 4,5, während eine höhere Konzentration verhältnismäßig zu einer Annäherung des pH-Wertes auf 6,0 benötigt wird.
- Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt: Laufenlassen eines Zellkulturüberstandes, der menschlichen tPA enthält, über eine ETI-Säule, um tPA zu adsorbieren; Entfernen unerwünschter Proteine durch Waschen; anschließendes Ablösen (Rückgewinnung) von sc-tPA von der Säule unter Verwendung eines Elutionsmittels mit einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0 mit einem Zusatz und dann Ablösen (Rückgewinnung) von dc-tPA durch Aenderung des pH-Wertes des Elutionsmittels auf unter 4,5.
- Es ist einem Fachmann bekannt, daß ein Amidin-Derivat oder ein Guanidin-Derivat kompetitiv an ein aktives Zentrum einer Trysin-ähnlichen Proteinase bindet, um einen Enzym-Inhibitor-Komplex zu dissozieren. Jedoch ist es eine völlig neue Technik, dieses Phänomen auf solch einen speziellen Fall wie die Isolation von sc-tPA und dc-tPA in geeigneten Bedingungen für die Isolation anzuwenden.
- Falls das zu behandelnde Ausgangsmaterial möglicherweise eine geringe Menge unerwünschter Substanzen, wie z.B. Trypsin-ähnliche Enzyme usw. enthält, können diese Substanzen von ETI adsorbiert oder desorbiert werden und wirken als störende Faktoren beim Reinigungsverfahren. Deshalb ist eine Vorbehandlung, falls notwendig, zum Entfernen dieser unerwünschten Substanzen zu empfehlen.
- Dieses Entfernungsverfahren wird durch Verwendung eines immobilisierten Sojabohnen-Trypsin-Inhibitors (nachfolgend als STI bezeichnet) oder eines anderen Kunits-Typ-Inhibitors ausgeführt, welcher in Sojabohnensamen produziert wird und ein ähnliches Molekulargewicht wie ETI hat, und die Aminosäuresequenz ist 80% oder mehr zu der von ETI homolog.
- STI ist in seiner Spezifität zu ETI sehr ähnlich, aber es inhibiert nicht tPA. Eine kombinierte Verwendung dieser beiden Inhibitoren resultiert in einer Selektivität, die mit der vergleichbar ist, die durch Verwendung eines immobilisierten anti-Mensch tPA monoklonalen Antikörpers erreicht wird. Dieses Verfahren umfaßt: Laufenlassen eines Zellkulturübertstandes, der menschlichen tPA enthält, über eine immobilisierte STI-Säule, um einen Anteil einer kleinen Menge von unerwünschten Proteinasen, die im Kulturüberstand enthalten sind, zu binden und dadurch zu entfernen; dann Laufenlassen des sich ergebenden ausfließenden Mediums über eine immobilisierte ETI-Säule, um tPA zu binden; Waschen der ETI-Säule, um unerwünschte Proteine zu entfernen; und schließlich getrenntes Isolieren und Reinigen von sc-tPA und dc-tPA durch Anderung des pH-Wertes des Elutuionsmittels.
- Das Verfahren kann unabhängig vom Typ der tPA-enthaltenden Zellen angewendet werden. Es ist möglich, sc-tPA undloder dc-tPA aus irgendeinem Typ von Zellen, wie z.B. Melanomzellen, normalen menschlichen Zellen und Zellen, die mittels Genmanipulation mit menschlichem tPA-Gen umgeformt worden sind, zu isolieren und zu reinigen. Zusätzlich ist es möglich, sc-tPA und/oder dc-tPA aus einem serumversetzten Kulturüberstand sowie aus einem serumfreien Kulturüberstand zu isolieren und zu reinigen, d.h. unabhängig von den Bestandteilen des Kulturmediums.
- Das bereitgestellte Verfahren ist bei jeder gewünschten Stufe der Isolation und Reinigung von sc-tPA und/oder dc-tPA bei verschiedenen Behandlungen von, oder bei präparativen Verfahren für, tPA entsprechend anwendbar. Zum Beispiel wird die Isolation und Reinigung von gewünschtem sc-tPA und/oder dc-tPA ausgeführt durch Kultivieren von Zellen, die fähig sind tPA zu produzieren, um tPA zu produzieren, und dann Behandeln des sich ergebenden Gemischs, das aus der Kultur stammt, durch ein Verfahren, das die Erfindung darstellt. Das aus der Kultur stammende Gemisch kann ein Rohextrakt von Kulturzellen, ein zellfreier Kulturüberstand oder ein behandeltes Material von diesen sein.
- Eine in den nachfolgenden Beispielen zu verwendende Säule, die ein immobilisiertes Affinitätsmittel, ETI oder STI, enthält, wurde in der folgenden Weise hergestellt.
- In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Joubert et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 531-538, 1981) wurden Samen von Erythrina latissima gesammelt und aufbereitet. Gemahlene und entfettete Samen ließ man über Nacht bei 10ºC in einer 0,5 M NaCl-Lösung zur Extraktion stehen. Die Lösung mit den Samen wurde zentrifugiert, um den überstand zu sammeln und die beabsichtigte Substanz wurde aus dem überstand durch Ammoniumsulfat-Präzipitation gesammelt. Das so hergestellte Material wurde einer Chromatographie nacheinander auf Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals), DEAE-Cellulose (Phoenix Chemicals) und DEAE-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) unterworfen. Die sich ergebende gereinigte Präparation zeigte eine einzelne Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 22000 Daltons, wenn sie einer Elektrophorese auf einem 15%-Polyacrylamidgel, das 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, unterworfen wurde.
- Sechsundzwanzig Milligramm dieser gereinigten Präparation waren an 5 ml Bromcyanid-aktivierte Agarose (Sepharose, Pharmacia Fine Chemicals) zu binden, die mit Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,4 M NaCl, 0,1% Triton X-100 (Wako Jun-yaku Co., Japan) und 0,02% Natriumazid als Stabilisator enthielt, equilibriert war, und wurden schließlich in eine Wegwerf- Plastikspritze gepackt, um eine 5 ml Säule zu bilden (nachfolgend mit ETI-Sepharose-Säule bezeichnet)
- Fünfundzwanzig Milligramm chromatographiereiner STI (von Sigma Co.) wurden an 5 ml Bromcyanid-aktivierte Agarose gebunden, die mit einem Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,4 M NaCl und 0,1% Triton X-100 enthielt, equilibriert war und wurden schließlich in eine Wegwerf-Plastikspritze gepackt, um eine 5 ml Säule zu bilden (nachfolgend mit STI-Sepharose-Säule bezeichnet).
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von menschlichen Melanomzellen (Bowes, ATCC CRL 1224 G361), die 10% hitzeinaktiviertes (bei 56ºC für 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KIU (Kallikrein-Inhibitor-Einheiten)/ml Aprotinin enthielten, wurden mit 0,02% Tween 80 (Wako Junyaku Co., Japan) und 0,4 M NaCl stabilisiert und auf eine STI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der STI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 98% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Das ausfließende Medium wurde mit 0,1 M NaCl (Endkonzentration) stabilisiert und dann auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der ETI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Durch Zymographie mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium zwei Fraktionen für Plasminogenaktivator, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton. Nachdem alles ausfließende Medium über die Säule gelaufen war, wurde die Säule mit einem 20-fachen Säulenvolumen einer Flüssigkeit bzw. eines Fluids gewaschen, das 1,0 M NaCl und 0,2% Tween 80 enthielt. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte durch Zymographie zwei Plasminogenaktivator-Fraktionen, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Daltons und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Daltons.
- Auf der Säule adsorbierte Proteine wurden durch Anwenden eines linearen pH-Gradienten von 5,5 bis 3,0 unter Verwendung eines 0,2 M Zitronensäurepuffers, der 0,15 M NaCl enthielt, eluiert.
- Durch diese Elution wurden zwei Aktivitätspeaks beobachtet, ein Peak wurde bei einem pH-Wert zwischen 5,2 und 4,5 eluiert und der andere bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 3,7. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 Dalton bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Aktivität dieser kombinierten Fraktionen war ungefähr 80-85% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität.
- Diese zwei Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta- Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es hat sich gezeigt, dar die bei einem pH-Wert im Bereich von 5,2 bis 4,5 eluierte Fraktion eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion zeigte, während die bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 3,7 eluierte Fraktion eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber die Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton verschwand nach der Reduktion. Mit diesem Ergebnis wurde der mit einem Puffer bei einem pH-Wert zwischen 5,2 bis 4,5 eluierte tPA als sc-tPA identifiziert und der bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 3,7 eluierte tPA wurde als dc-tPA identifiziert.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von menschlichen fötalen Vorhautzellen (Flow 7000 (Flow Laboratories Inc. USA)), die 10% hitzeinaktiviertes (bei 56ºC für 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KUI/ml Aprotinin enthielten, wurden mit 0,02% Tween 80 und 0,4 M NaCl stabilisiert und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf eine STI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der STI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibriolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 98% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Das ausfließende Medium wurde mit 1,0 M NaCl (Endkonzentration) stabilisiert und dann auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der ETI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 45% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Durch Zymographie mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium verschiedene Fraktionen oder Banden für den Plasminogenaktivator, einige Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100000 Dalton, mehrere Banden mit ungefähr 50000 bis 70000 Dalton und eine mit ungefähr 35000 Dalton.
- Die ETI-Sepharose-Säule wurde mit einem 20-fachen Säulenvolumen von 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,5, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,2% Tween 80, gewaschen. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte dieselben Zymographiebanden wie oben beschrieben.
- Die Elution wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt, außer daß Puffer, die 0,15 M NaCl und 0,1 M Glycin enthielten, pH 4,5 und 3,5, angewendet wurden.
- Als ein Ergebnis wurde ein Elutionsmuster ähnlich zu dem von Beispiel 2 beobachtet. Die Aktivität dieser kombinierten Fraktionen war ungefähr 40-45% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Diese zwei Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta-Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es wurde gezeigt, daß die mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 eluierte Fraktion ein Molekulargewicht von 70000 Dalton hatte, und sie zeigte keine Änderung bei dem Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während die mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 3,5 eluierte Fraktion eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber keine Bande, die einer Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton nach der Reduktion entsprach. Mit diesem Ergebnis wurde der bei einem pH-Wert von 4,5 eluierte tPA als sc-tPA identifiziert und der bei einem pH-Wert von 3,5 tPA als dc-tPA identifiziert.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von Mausfibroblastenzellen, die mit einem menschlichen tPA-Gen umgeformt bzw. transformiert worden waren (Europäische Patentanmeldung Nr. 86 30 9250.8), wobei der überstand mit 2% hitzeinaktiviertem (bei 56ºC für 30 Minuten) fötalem Kälberserum und 20 KUI/ml Aprotinin ergänzt worden war, wurden mit 0,02% Tween 80 und 0,4 M NaCl stabilisiert und auf eine STI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der STI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 98% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Das ausfließende Medium wurde mit 1,0 M NaCl (Endkonzentration) stabilisiert und dann auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der ETI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Durch Zymographie mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium zwei Fraktionen für den Plasminogenaktivator, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Daltons und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton. Nach Durchlaufen des gesamten ausfließenden Mediums durch die Säule wurde die Säule mit einem 20-fachen Säulenvolumen eines Fluids gewaschen, das 2,0 M NaCl und 0,2% Tween 80 enthielt. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte durch Zymographie zwei Plasminogenaktivator-Fraktionen, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton.
- Auf der Säule adsorbierte Proteine wurden mit 0,2 M Natriumphosphatlösungen, enthaltend 0,15 M NaCl, pH 4,5 und 3,5, eluiert. Das Elutionsmuster war ähnlich zu dem, das in Beispiel 2 erhalten wurde. Die Aktivität der resultierenden zwei kombinierten Fraktionen war ungefähr 80% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 Dalton bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
- Diese zwei Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta- Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es hat sich gezeigt, daß das Eluat mit der Lösung mit pH 4,5 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton zeigte und somit keine Änderung beim Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während das Eluat mit der Lösung mit pH 3,5 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber keine Bande, die der Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton nach der Reduktion entsprach. Mit diesem Ergebnis wurde bestätigt, daß der bei pH 4,5 eluierte tPA sc-tPA ist und der bei pH 3,5 eluierte tPA dc-tPA ist.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von menschlichen Melanomzellen (Bowes, ATCC CRL 1224 G361), der 10% hitzeinaktiviertes (bei 56ºC für 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KUI/ml Aprotinin enthielt, wurden mit 0,02% Tween 80 und 1 M NaCl stabilisiert und auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen
- Das aus der Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Durch Zymographie mit einem anti- Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium zwei Fraktionen für den Plasminogenaktivator, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Daltons und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton.
- Nach Durchlaufen des gesamten ausfließenden Mediums durch die Säule, wurde die Säule mit einem 20-fachen Säulenvolumen eines Fluids gewaschen, das 2,0 M NaCl und 0,2% Tween 80 enthielt. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte durch Zymographie zwei Plasminogenaktivator-Fraktionen, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton.
- Auf der Säule adsorbierte Proteine wurden durch Anlegen eines linearen pH-Gradienten von 6,5 bis 3,0 unter Verwendung eines 0,2 M Veronalpuffers, der 0,2 M Benzamidin und 0,15 M NaCl enthielt, eluiert.
- Bei dieser Elution wurden zwei Aktivitätspeaks beobachtet, ein Peak, der in einem pH-Bereich von 6,0 bis 4,5 eluiert wurde und der andere in einem pH-Bereich von 4,5 bis 3,5. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 Dalton bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Aktivität dieser kombinierten Fraktionen war ungefähr 80-85% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität.
- Diese zwei Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta- Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es hat sich gezeigt, daß die in einem pH-Bereich von 6,0 bis 4,5 eluierte Fraktion eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton zeigte und somit keine Änderung beim Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während die in einem pH-Bereich von 4,5 bis 3,5 eluierte Fraktion eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber die Bande mit einem Molekulargewicht von 70 000 Dalton verschwand nach der Reduktion. Mit diesem Ergebnis wurde der mit einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6,0 und 4,5 eluierte tPA als sc-tPA identifiziert und der bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 3,5 eluierte tPA als dc-tPA identifiziert.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von menschlichen fötalen Vorhautzellen (Flow 7000), die 10% hitzeinaktiviertes (bei 56ºC für 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KUI/ml Aprotinin enthielten, wurden mit 0,02% Tween 80 und 1 M NaCl stabilisiert und auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der ETI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 45% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert.
- Gemäß Zymographie mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium verschiedene Fraktionen oder Banden für den Plasminogenaktivator, einige Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100000 Dalton, mehrere Banden mit Molekulargewichten von ungefähr 50000 bis 70000 Dalton und eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 35000 Dalton.
- Die ETI-Sepharose-Säule wurde dann mit einem 20-fachen Säulenvolumen von 0,1 M Dinatriumphosphat-Natriumhydroxidpuffer, pH 9,5, enthaltend 2,0 M NaCl, gewaschen. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte dieselben Banden wie oben bei der Zymographie beschrieben.
- Die Elution wurde mit 0,1 M Natriumphosphat-Phosphorsäurelösung, die 0,3 M Arginin und 0,15 M NaCl enthielt (pH 5,5) und 0,2 M Zitronensäurepuffer (pH 3,0), der 0,15 M NaCl enthielt, ausgeführt.
- Als ein Ergebnis wurden zwei Fraktionen aus dem Eluat mit Puffern, die verschiedene pH-Werte haben, erhalten. Die Aktivität dieser kombinierten Fraktionen war ungefähr 40-45% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
- Diese Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta-Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es wurde gezeigt, daß das Eluat mit dem Puffer mit pH-Wert 5,5 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton zeigte und somit keine Änderung bei dem Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während das Eluat mit dem Puffer mit pH-Wert 3,0 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber die Bande, die der Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton entsprach, verschwand nach der Reduktion.
- Mit diesem Ergebnis wurde der bei einem pH-Wert von 5,5 eluierte tPA als sc-tPA identifiziert und der bei einem pH-Wert von 3,0 tPA als dc-tPA identifiziert.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von Mausfibroblastenzellen, die mit einem menschlichen tPA-Gen umgeformt bzw. transformiert worden waren (Europäische Patentanmeldung Nr. 86 30 9250.8), wobei der Überstand mit 2% hitzeinaktiviertem (bei 56ºC für 30 Minuten) fötalem Kälberserum und 20 KUI/ml Aprotinin ergänzt worden war, wurden mit 1 M NaCl stabilisiert und auf eine ETI-Sepharose-Säule aufgetragen.
- Das aus der ETI-Säule ausfließende Medium wurde gesammelt und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde detektiert. Durch Zymographie mit einem anti-Mensch tPA-Antikörper nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das ausfließende Medium zwei Fraktionen für den Plasminogenaktivator, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Daltons und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton Nach Durchlaufen des gesamten ausfließenden Mediums durch die Säule, wurde die Säule mit einem 20-fachen Säulenvolumen einer 2 M NaCl-Lösung gewaschen. Das rückgewonnene Fluid hatte ungefähr 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität und zeigte durch Zymographie zwei Banden für den Plasminiogenaktivator, eine mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton und die andere mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton.
- Auf der Säule adsorbierte Proteine wurden dann mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,5 M Benzamidin und 0,15 M NaCl enthielt und 0,1 M Zitronensaure-Puffer (pH 3,0), der 0,15 M NaCl enthielt, eluiert. Zwei verschiedene Fraktionen wurden in zwei verschiedenen Eluaten erhalten. Die Aktivität der resultierenden zwei kombinierten Fraktionen war ungefähr 80% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 Dalton bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
- Diese zwei Fraktionen wurden nach der Reduktion mit beta- Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es hat sich gezeigt, daß das Eluat mit dem Puffer mit pH 6,0 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton zeigte und somit keine Änderung beim Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während das Eluat mit dem Puffer mit pH 3,0 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber keine Bande, die der Bande mit dem Molekulargewicht von ungefähr 70000 Dalton nach der Reduktion entsprach. Mit diesem Ergebnis wurde der bei pH 6,0 eluierte tPA als sc-tPA identifiziert und der bei pH 3,0 eluierte tPA als dc-tPA identifiziert.
- Zwei Liter eines Kulturüberstandes von Ovarienzellen des chinesischen Hamsters, die mit einem menschlichen tPA-Gen umgeformt bzw. transformiert worden waren (CHO-Zelle C1271; ATCC CRL 1616), wobei der überstand mit 10% hitzeinaktiviertem (bei 56ºC für 30 Minuten) fötalem Kälberserum und 40 KUI/ml Aprotinin ergänzt worden war, wurden mit 1 M NaCl stabilisiert und auf eine ETI-Sepharose-Säule mit 5 ml Volumen aufgetragen, wobei die Säule mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), der 1,0.M NaCl enthielt, equilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 0,05 M Na&sub2;HP0&sub4; (pH 9,5), das 2,0 M NaCl und 10 mM Arginin enthielt, gewaschen.
- Das gesamte aus der ETI-Säule ausfließende Medium hatte ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Plasminogen-abhängigen fibrinolytischen Aktivität und zeigte durch Zymographie eine Bande mit einem Molekulargewicht von 110000 ± 20000 Dalton und eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 70000 Dalton.
- Auf der Säule adsorbierte Proteine wurden erst mit 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4;-NaOH-Puffer (pH 4,5), der 0,01 M Arginin und 0,1 M NaCl enthielt, eluiert. Die fibrinolytische Aktivität des Eluats war ungefähr 60% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Auf der Säule bleibende Proteine wurden mit 0,1 M Zitronensäurepuffer (pH 3,0), der 0,1 M NaCl enthielt, eluiert. Ungefähr 25% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde wiedergewonnen. Diese zwei Fraktionen zeigten ein gemeinsames Molekulargewicht von 70000 Dalton bei der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
- Die Eluatfraktionen wurden nach der Reduktion mit beta-Mercaptoethanol einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und dann einer Silverstain-Analyse. Es hat sich gezeigt, daß das Eluat mit dem Puffer mit pH 4,5 eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 70000 Dalton zeigte und somit keine Änderung beim Molekulargewicht oder eine eher langsamer wandernde Bande auf dem Gel nach der Reduktion, während das Eluat mit dem Puffer mit pH 3,0 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 Dalton zeigte, aber die Bande mit dem Molekulargewicht von ungefähr 70000 Dalton verschwand nach der Reduktion. Mit diesem Ergebnis wurde bestätigt, daß der bei pH 4,5 eluierte tPA sc- tPA war und der bei pH 3,0 eluierte tPA dc-tPA war.
- Aus diesen experimentellen Ergebnissen wurde die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Konzentration von Arginin für die Elution von sc-tPA wie folgt bestimmt. Bei pH 4,5: 1 mM - 50 mM; bei pH 5,0: 0,03 M oder mehr; bei pH 5,5: 0,10 M oder mehr; und bei pH 6,0: 0,2 M oder mehr.
- Ein Mol NaCl (Endkonzentration) wurde zu 2 Litern eines Kulturüberstandes von menschlichen fötalen Amnionzellen (FL, ATCC CCL-62) hinzugefügt, die mit einem menschlichen tPA- Gen, das mit menschlichem Zytomegalievirus (HCMV) als Promoter für die menschliche tPA-Expression verbunden war, umgeformt bzw. transformiert worden waren. Der Zellkulturüberstand wurde dann einer Reinigung von einkettigem und zweikettigem tPA unterworfen unter Verwendung einer ETI-Säule, und zwar in der gleichen wie in Beispiel 8 beschriebenen Weise.
- Die fibrinolytische Aktivität der bei pH 4,5 und pH 3,0 eluierten Fraktionen war ungefähr 70% bzw. ungefähr 15% von derjenigen, die auf die Säule aufgetragen worden war.
- Wirtszellen, Saccharomyces cerevisiae, die mit einem menschlichen tPA-Gen umgeformt bzw. transformiert worden waren, wurden gemäß der bekannten Methode (Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in the Molecular Bio-
- logy of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, Seiten 603-636, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y., 1982) kultiviert.
- Die Zellen wurden mit Glaskügelchen aufgebrochen und durften in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), der 1 M NaCl und 0,02% Tween 80 enthielt, für die Extraktion eintauchen. Der filtrierte Extrakt wurde einer Reinigung von tPA in der gleichen wie in Beispiel 6 beschriebenen Weise unterworfen.
- Das Eluat mit dem Puffer mit pH 5,5 hatte ein Molekulargewicht von 70000 Dalton, das sich nicht durch die Reduktion änderte, wie sie in den obigen Beispielen 2-8 ausgeführt wurde, und es zeigte eine 85%ige Aktivität von derjenigen, die auf die Säule aufgetragen worden war. Das Eluat mit dem Puffer mit pH 3,0 änderte sein Molekulargewicht (70000 Dalton) durch die Reduktion, d.h. eine Bande mit einem Molekulargewicht von 70000 Dalton verschwand und eine Bande mit einem Molekulargewicht von 30000 bis 40000 erschien stattdessen. Ungefähr 10% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde in diesem Eluat beobachtet.
Claims (7)
1. Verfahren zur getrennten Reinigung von einkettigem
Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und zweikettigem tPA, gekennzeichnet
durch folgende Schritte:
(a) dichtes Inberührungbringen eines Gemisches, enthaltend
einkettigen und zweikettigen tPA mit einem Adsorbtionsmittel
(z.B in einer Säule enthalten), welches einen immobilisierten
Erythrin-trypsin-Inhibitor als Affinitätsmittel für die
Adsorbtion des tPA's an das Adsorbtionsmittel hat;
(b) Behandeln des Adsorbtionsmittels mit einem Elutionsmittel,
das einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0 hat, zur
selektiven Elution des einkettigen tPA; und
(c) Behandeln des Adsorbtionsmittels mit einem Elutionsmittel,
das einen pH-Wert unter 4,5 hat, zur selektiven Elution von
zweikettigem tPA.
2. Verfahren zum Reinigen von einkettigem tPA aus einem Gemisch,
das einen einkettigen tPA enthält, gekennzeichnet durch die
Schritte des dichten Inberührungsbringens eines Gemisches, das
den einkettigen tPA enthält, mit einem Adsorbtionsmittel (z. B.
enthalten in einer Säule) das einen immobilisierten Erythrin-
trypsin-Inhibitor als Affinitätsmittel enthält und danach
selektives Eluieren von einkettigem tPA, der auf dem
Adsorbtionsmittel adsorbiert ist, mit einem Elutionsmittel mit einem
pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,0.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Elutionsmittel ein
Amidinderivat oder Guanidinderivat in einer Konzentration von
z.B. wenigstens 1 mMol enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Derivat Benzamidin oder
Arginin ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das
Gemisch abgeleitet ist von einer Kultur von tPA-erzeugenden
Zellen, z.B. Melanomzellen, menschlicher Föten-Vorhautzellen
oder rekombinierenden Zellen, die durch Einführen menschlicher
tPA-Gene umgeformt sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die rekombinierenden Zellen
Ovarienzellen des chinesischen Hamsters, Amnionzellen von
menschlichen Föten, Hefezellen oder Mäuse-Fibroblastenzellen
sind.
7. Verwendung von einkettigem tPA, der nach einem Verfahren gemäß
Anspruch 1 oder Anspruch 2 gereinigt worden ist, zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Behandlung von
Thrombosen.
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