CH643069A5

CH643069A5 - Immunochemische bestimmung des lactat dehydrogenase isoenzyms ldh(1).

Info

Publication number: CH643069A5
Application number: CH171379A
Authority: CH
Inventors: Magdalena Usategui Gomez; Richard Walter Wicks
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-02-27
Filing date: 1979-02-21
Publication date: 1984-05-15
Also published as: NL185240B; NL7901537A; DE2907228A1; JPS6243501B2; CA1117414A; FR2418464B1; IT7920097A0; GB2015157A; DE2907228C2; GB2015157B; IT1166626B; NL185240C; JPS54124797A; FR2418464A1; US4224406A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine immunochemische Bestimmung des Isoenzyms LDHi, eines bekannten Herzin-farkt-Anzeigers.

Die US-PS 4 046 634 offenbart eine Bestimmung für Isoenzyme, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, die Ionenaus-tauschsäulenchromatographie zum Isolieren eines Gemischs von LDHi- und LDHî-Isoenzymen anwendet, die dann nach herkömmlichen Techniken, wie der Wacker-LDH-Methode, nachgewiesen werden.

Die DE-AS 21 28 670 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, durch Behandeln der Testprobe mit einem grossen Über-schuss eines spezifischen Antikörpers entweder zum Isoenzym LDHi oder LDHs zur quantitativen Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes. Nach dem Inkubieren und Zentrifu-gieren des ausgefällten Komplexes wird die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit nach der in Z. Klin. Chemie und Klin. Biochemie 8, 658 (1970) berichteten Methode bestimmt.

Sussman et al. haben im Journal of Biological Chemistry 243, 160 (1968) eine Bestimmung für einzelne organspezifische Isoenzyme alkalischer Humanphosphatase unter Anwendung einer zweistufigen Arbeitsweise beschrieben. In der ersten Stufe wurde der spezifische Antikörper zu dem gewünschten Isoenzym mit der Testprobe umgesetzt, und dann wurde in einer folgenden Stufe der Antikörper-Antigen-Komplex mit einem zweiten Antikörper (Anti-y-globulin) gefällt. Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit auf restliche Isoenzymaktivität getestet.

Die Verwendung eines zweiten, auf einem festen Trägermaterial unlöslich gemachten Antikörpers bei Radioimmuntestverfahren ist in der US-PS 4 048 298 beschrieben. Dazu gehört auch die Verwendung zweiter Antikörper, die an der

Oberfläche polymerer, fester Trägermaterialien adsorbiert sind.

Die US-PS 3 843 443 betrifft ein Verfahren zum Unbeweglichmachen von Proteinen an einem Fluorkohlenstoffpolymerisat-Träger. Zu den offenbarten Proteinen gehören Antikörper, und das bevorzugte polymere Trägermaterial ist Polyvi-nylidenfluorid (Kynar).

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Testprobe, z.B. eine Serumprobe, mit einem löslichen Antikörper behandelt, der gegen die M-Untereinheit der LDH-Isoenzyme, d.h. LDH2, LDH3, LDH4 und LDH5, spezifisch ist. Nach kurzzeitigem Mischen und Inkubieren wird ein zweiter Antikörper, der an einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, zugegeben, und es wird gemischt und dann nochmal kurzzeitig inkubiert. Der unlösliche Anti-gen-Antikörper( 1 )-Antikörper(2)-Festträger-Komplex wird abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird auf ihre LDH-Isoenzym-Aktivität getestet. Die beobachtete Aktivität ist im wesentlichen die der LDHi-Isoenzym-Kompo-nente der Ausgangsprobe.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat erhebliche Vorteile gegenüber bisher bei der Isoenzymbestimmung angewandten Arbeitsweisen. Es ist sehr schnell, äusserst genau und reproduzierbar. Die Herstellung der LDHi enthaltenden überstehenden Flüssigkeit kann in Minuten anstelle von mehreren Stunden, wie bisher für immunologische Techniken erforderlich, geschehen. Zudem führt das erfindungsgemässe Verfahren zu einer sauberen Trennung des LDHi von den anderen LDH-Isoenzymen, die nach Ionenaustauschsäulen-Arbeits-weisen nicht möglich ist.

Der gegenüber der M-Untereinheit des LDH spezifische, erfindungsgemäss verwendete Antikörper ist dem Fachmann bekannt, vgl. z.B. die genannte DE-AS 21 28 670. Weitere,

sich auf solchen Antikörper beziehende Beschreibungen finden sich in J.S. Burd et al., Clinica Chimica Acta 46, 205-216 (1973) und J.S. Burd et al., Biochimica, Biophysica Acta 310, 238-247 (1973).

Der zweite Antikörper wird durch Immunisieren eines anderen als des Tieres hergestellt, in dem der erste spezifische Antikörper hergestellt wird, mit einem y-Globulin aus dem Blut der für die Herstellung des ersten Antikörpers verwendeten Wirtsart. So ist der zweite Antikörper immunoreaktiv für den ersten Antikörper und bildet mit ihm einen Komplex.

Der zweite Antikörper wird unlöslich gemacht, indem er an ein unlösliches Trägermaterial gebunden wird. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. wasserunlösliche organische polymere Substanzen, wie Cellulose oder andere Polysaccharide, ein Vinyl-Additionspolymerisat oder ein Kondensationspolymerisat oder eine wasserunlösliche anorganische Substanz polymerer Natur, wie Glas oder Silikonharze, oder der zweite Antikörper kann an der Oberfläche eines festen Trägers, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyfluoräthylen oder Polyvinyli-denfluorid, adsorbiert werden. Die Art der Verbindung des zweiten Antikörpers mit dem festen Träger ist nicht sehr kritisch und kann folgende Möglichkeiten umfassen: 1. Kova-lentes Kuppeln des löslichen zweiten Antikörpers an irgendeine unlösliche Polymersubstanz, 2. physikalisches Ein-schliessen von Teilchen des zweiten Antikörpers in den Poren eines Gelpolymers, wie eines vernetzten Polyacrylamids, oder 3. physikalische Adsorption an einer unlöslichen Polymersubstanz.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der zweite Antikörper an aktiviertes Polyvinylidenfluorid (Kynar) unter Anwendung der allgemeinen, in der US-PS 3 843 443 offenbarten Arbeitsweisen adsorbiert.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel weiter veranschaulicht.

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5

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15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

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Beispiel

1. Reagentien a) Antiserum zu LDHs: Ziegen-Anti-LDHs-Serum wird auf eine Konzentration verdünnt, die 300 bis 400 I.E./l an gereinigtem LDHs-Isoenzym unter Anwendung der Fisher-Diagnostik oder äquivalenter Reagentien zur Bestimmung der LDH-Enzymaktivität bindet. Die Verdünnung des Antise-rums erfolgt in 0,02 m Tris vom pH 7,5 mit 0,1% NaN3.

b) Unlösliches Antiserum zu Ziegen-y-Globulin.

Bei der Herstellung eines unlöslichen Antiserums zu Ziegen-y-Globulin (zweiter Antikörper) werden die folgenden speziellen Schritte befolgt: Das Ausgangsmaterial ist ungesintertes Polyvinylidenfluoridharzpulver (Kynar), Qualität 301 F (der Pennwalt Corp.). Das Pulver wird in Isopropanol (2-Pro-panol) in Anteilen von 50 g in 1000 ml Isopropanol disper-giert. Die Suspension wird dann 5 min mit einem Brinkmann Polytron mit einer Frequenz von 4000 Hz homogenisiert. Das Polyvinylidenfluorid/Isopropanol-Gemisch wird dann in einen Zylinder überführt, der 10 1 Salzlösung enthält, und gerührt, bis es dispergiert ist. Dann kann sich das Polyvinyli-denfluorid absetzen, und der grösste Teil der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird das Polyvinylidenfluorid erneut in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,0) mit (0,01%) Merthiolat zu einer 2%igen Polyvinylidenfluoridkonzentration suspendiert. Das Polyvinylidenfluorid ist nun im aktivierten Zustand und in der Lage, Protein aufzunehmen. Während das Isopropanol-aktivierte Polyvinylidenfluorid gerührt wird, werden 0,5 ml Esel-Antiziegen-y-Globulin-Serum pro g Polyvinylidenfluorid zugesetzt. Das Gemisch wird dann wieder mit dem Polytron 5 min bei gleicher Frequenz wie zuvor homogenisiert. Die Suspension wird dann bei Raumtemperatur mindestens 6 h weitergerührt, dann mindestens 12 h bei 4° C. Nun ist die Suspension bereit, gewaschen zu werden. Dies geschieht durch lOminütiges Zentrifugieren mit 1500 x g und anschliessendes erneutes Suspendieren in 0,02 m Tris-hydroxymethylaminomethan (Tham) bei pH 7,5 mit 0,1% NaN3. Dieser Vorgang wird nochmal wiederholt, und das fertige Material wird erneut in 0,02 m Tris vom pH 7,5 mit 0,1% NaN3 zu 100 g Polyvinylidenfluorid/1000 ml Puffer suspendiert. Das Gemisch wird wieder gerührt, und 5 g Rinder-Seru-malbumin (RSA)/100 g Polyvinylidenfluorid werden zugesetzt. Homogenisieren mit dem Polytron bei 4000 Hz für 5 min ist die letzte Stufe bei dieser Arbeitsweise.

2. Arbeitsweise a) Zu 200 (il Patientenserum werden 10 |il lösliches Zie-gen-Anti-LDHs-Serum gegeben und durchwirbelt. Dann wird 5 min gewartet.

b) 200 jj.1 des unlöslichen zweiten Antikörpers (Es ist dafür zu sorgen, dass die Suspension des unlöslichen Antikörpers vor Verwendung gut gemischt wird. Ein kleiner Rührstab wird in die Reagensflasche gebracht und während der Entnahme des Antikörpers gemischt.) werden zugesetzt und durchwirbelt. Es wird 5 min gewartet.

c) Rotation für 5 min bei etwa 1000 x g.

d) Von der überstehenden Flüssigkeit wird soviel abge-

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nommen, wie für eine herkömmliche LDH-Aktivitätsbestim-mung nötig. Anzuwenden ist die gleiche Arbeitsweise.

3. Berechnungen

LDHi-Aktivität = Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit x2,05.

4. Interpretation

Zur Entscheidung über einen Endpunkt für LDHi wird ein willkürlicher Wert festgelegt. Dieser Wert wird für jedes einzelne Labor in Abhängigkeit von dem normalen Gesamt-LDH-Bereich des angewandten Enzymtests differieren. Zur Festlegung einer Obergrenze des Normalen für LDHt(H4) nehme man 30% des oberen Werts des Normalen für den Test der Gesamt-LDH-Enzymaktivität. Der Fisher-Diagnostik-LDH-Test z.B. lieferte eine Obergrenze des Normalen von 149 I.E./l (der Normalbereich ist 52-149 I.E./l). Daher erweist sich der angenommene Endpunkt als 30% von 149 oder 45 I.E./l. Jedes Serum, das eine LDHi-Aktivität über 45 I.E./l zeigt, ist dann als Herzinfarkt-positiv anzusehen.

Klinische Ergebnisse

Seren von 106 Patienten einer Herzpflegestation wurden auf LDHi-Erhöhung geprüft. Bei allen 72 Patienten, bei denen ein Herzinfarkt diagnostiziert wurde, wurde eine LDHi-Erhöhung beobachtet. Für alle 34 Nichtherzinfarktpatienten jedoch blieb LDHi nicht erhöht. Ein Endpunkt von 45 I.E./l wurde für biochemische Infarktdiagnose festgelegt. Der Bereich der LDHi-Aktivität in Herzinfarktpatienten betrug 46-470 I.E./l. Der Bereich für die Nichtherzinfarktpatienten betrug 9 bis 44 I.E./l. Derzeit bestimmen die meisten Laboratorien das «Hochschnellen» von LDHi/LDH2 durch Elektrophorese. Diese Technik ist umständlich und zeitraubend. Die erfindungsgemässe immunochemische Arbeitsweise dagegen ist einfach und schnell. Zudem ist die Bestimmung der LDHi-Erhöhung empfindlicher als die übliche Methode. In 59 der 72 Herzinfarktpatienten trat das Hochschnellen des LDH am gleichen Tag ein wie der Anstieg des LDHi. In acht Fällen jedoch trat es einen Tag nach dem LDHi-Anstieg ein, und in 5 Herzinfarktpatienten wurde es überhaupt nicht erhalten (vgl. Tabellen I, II und III).

Tabelle I

Zahl der Herzinfarktpatienten

LDHi erhöht

LDH-«Sprung» am gleichen Tag wie der LDHi-Anstieg am Tag nach dem

LDHi-Anstieg nicht vorhanden

72

59

8

5

Tabelle II

Zahl der Patienten ohne Herzinfarkt

LDHi erhöht

LDH-«Sprung»

34

0

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

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4

Tabelle III (Teil A)

Zahl der Herzinfarktpatienten

LDHi erhöht CPK-MB am gleichen Tag vorhanden wie CPK

einen Tag überhaupt nicht nach CPK

LDH-«Sprung» am gleichen einen Tag Tag wie CPK nach CPK

überhaupt nicht

58

55 43

12 0

31 19

5

Tabelle III (Teil B)

Zahl der

Herzinfarktpatienten

DPK-MB LDHi fehlend erhöht

LDH-«Sprung»

am gleichen Tag wie die

LDHi-Erhöhung einen Tag nach der LDHi-Erhöhung

überhaupt nicht

58

3 3

2

1

0

G

Claims

643 069 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Bestimmen der LDHi-Aktivität in einer Serumprobe, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Schritte:

a) Behandeln der Serumprobe mit einem für die M-Unter-einheit von LDH-Isoenzymen immunologisch selektiven ersten Antikörper, der mit in der Probe vorhandenem LDH2, LDH3, LDH4 und LDHs einen Komplex bildet,

b) Behandeln des Immunoreaktionsprodukts der Stufe a) mit einem in einer anderen als der zur Bildung des ersten Antikörpers verwendeten Tierart immunologisch erzeugten zweiten Antikörper, der auf einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, zu einem Immunoreaktions-produkt zwischen dem Produkt der Stufe a) und dem unlöslich gemachten zweiten Antikörper,

c) Abtrennen des Reaktionsprodukts der Stufe b) von der überstehenden Lösung und d) Bestimmen der verbleibenden LDHi-Aktivität der überstehenden Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Antikörper an aktiviertem Polyvinylidenfluo-rid unlöslich gemacht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als erster Antikörper Ziegen-Anti-LDHs-Antikörper verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als zweiter Antikörper Esel-Anti-Ziegen-y-globulin verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch der Stufe a) vor Durchführung der Stufe b) etwa 5 min gemischt und inkubiert wird.