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PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-cyclosporin E, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum Cyclosporin E katalytisch hydriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-cyclosporin E.
Erfindungsgemäss gelangt man zu Dihydro-cyclosporin E durch katalytische Hydrierung des Antibiotikums Cyclosporin E.
Die Hydrierung des Antibiotikums Cyclosporin E wird vorteilhafterweise so ausgeführt, dass man das Antibiotikum Cyclosporin E in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart von katalytisch aktiviertem Wasserstoff hydriert. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise niedere aliphatische Alkohole, wie z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, oder Äthylacetat in Frage. Die Hydrierung erfolgt zweckmässigerweise im neutralen Bereich bei Temperaturen zwischen 20 und 300C und bei Atmosphärendruck oder wenig erhöhtem Druck. Als Katalysator kommt vorzugsweise Palladium, z.B.
Palladium auf Kohle, in Frage. Das so erhaltene Hydrierungsprodukt des Antibiotikums Cyclosporin E kann hierauf in an sich bekannter Weise gereinigt werden, z.B. durch Chromatographie an Kieselgel, oder durch Kristallisation.
Das als Ausgangsmaterial benützte Antibiotikum Cyclosporin E kann, wie in nachstehendem Beispiel beschrieben, hergestellt werden.
Eigenschaften von Dihydro-cyclosporin E
Farblose, prismatische Kristalle
Smp. 156-158 [a],20 = 176,60 (c = 0,76 in CHCl3).
Elementaranalyse für: C6lHlllNllOl2 berechnet: C 61,5 H 9,4 N 12,9 0 16,1 gefunden: C 61,5 H 9,5 N 13,2 0 16,3
Dihydro-cyclosporin E ist bei Raumtemperatur leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; mässig löslich in Äther; praktisch unlöslich in Wasser und gesättigten Kohlenwasserstoffen.
UV-Spektrum in CH3OH: Endabsorption.
IR-Spektrum in CH2Cl2: siehe Fig. 1.
lH-NMR-Spektrum in CDCls, 90 MHz, mit Tetramethylsilan als internem Standard: siehe Fig. 2.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Polygram SIL G-Folien mit Chloroform-Methanol (96:4), Laufstrecke 10 cm, werden folgende Rf-Werte beobachtet:
Dihydro-cyclosporin E 0,35
Cyclosporin E 0,35
Die Detektion erfolgt mit Joddampf oder Dragendorff Reagens.
Das neue Antibiotikum-Derivat Dihydro-cyclosporin E zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zelchnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 ug/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Prolifera tionsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver
Index (SI) ausgedrückt; SI = 0,62 nach 5 X 70 mg/kg p.o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann die Substanz zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 60 bis 300 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 300 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 150 bis 300 mg des neuen Antibiotikum Derivates Dihydro-cyclosporin E neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum-Derivat Dihydro-cyclosporin E allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
250 mg Palladium-Kohle (10% Palladium) werden in 7 ml Äthanol während 40 Minuten vorhydriert. Zu dieser Suspension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 2,5 g Cyclosporin E in 25 ml Äthanol zugegeben und darauf bei 230 und einem Druck von 737 mm Quecksilbersäule bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschliessend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 400 zur Trockne ein. Der Rückstand wird anschliessend aus 12 ml Äther bei -16" kristallisiert, wobei dünnschichtchromatographisch einheitliches Dihydro-cyclosporin E in Form farbloser Prismen vom Smp. 156-158 erhalten wird (nach Trocknen im Hochvakuum während 4 Stunden bei 80 ).
Das als Ausgangsmaterial verwendete Cyclosporin E wird wie folgt hergestellt:
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO4. 7H2O, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./ Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2 455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Dieses wird anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A neben Cyclosporin B und Cyclosporin E enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A-, B- und E-haltigen Fraktionen erneut an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend aus Cyclosporin A und die später eluierten Anteile aus Cyclosporin B und E bestehen. Diese werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm
(Merck) mit Chloroform-Methanol (98:2) weiter aufgetrennt, wobei die ersten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin E und die späteren Fraktionen Cyclosyorin B enthalten. Zur weiteren Anreicherung werden die Cyclosporin E-haltigen Fraktionen an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Äther-Methanol (95:5) nachchromatographiert. Die laut Dünnschichtchromatogramm Polygram SIL G-Folien, Fliessmittel Chloroform-Methanol (96:4)] Cyclosporin E enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und aus Äther bei +70 kristallisiert. Dabei wird ein stark angereichertes Rohkristallisat von Cyclosporin E erhalten.
Wiederholte Kristallisation aus Äther bei +7 liefert dünnschichtchromatographisch einheitliches Cyclosporin E als farblose, prismatische Kristalle, die nach Waschen mit wenig eiskaltem Äther und anschliessendem Trocknen im Hochvakuum bei 80" während 3 Stunden einen Smp. von 149-152 aufweisen.
[a]D20 = -178,70 (c = 0,54 in CHCl3) = -186,10 (c = 0,51 in CH3OH).
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PATENT CLAIM
Process for the preparation of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin E, characterized in that the antibiotic cyclosporin E is catalytically hydrogenated.
The present invention relates to a process for the preparation of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin E.
According to the invention, dihydrocyclosporin E is obtained by catalytic hydrogenation of the antibiotic cyclosporin E.
The hydrogenation of the antibiotic cyclosporin E is advantageously carried out by hydrogenating the antibiotic cyclosporin E in a suitable solvent in the presence of catalytically activated hydrogen. Lower aliphatic alcohols, such as e.g. Methanol, ethanol, isopropanol, or ethyl acetate in question. The hydrogenation is expediently carried out in the neutral range at temperatures between 20 and 300C and at atmospheric pressure or slightly elevated pressure. Palladium, e.g.
Palladium on coal, in question. The hydrogenation product of the antibiotic cyclosporin E thus obtained can then be purified in a manner known per se, e.g. by chromatography on silica gel, or by crystallization.
The antibiotic cyclosporin E used as the starting material can be prepared as described in the example below.
Properties of Dihydro-cyclosporin E.
Colorless, prismatic crystals
M.p. 156-158 [a], 20 = 176.60 (c = 0.76 in CHCl3).
Elemental analysis for: C6lHlllNllOl2 calculated: C 61.5 H 9.4 N 12.9 0 16.1 found: C 61.5 H 9.5 N 13.2 0 16.3
Dihydro-cyclosporin E is easily soluble at room temperature in methanol, ethanol, acetone and chlorinated hydrocarbons; moderately soluble in ether; practically insoluble in water and saturated hydrocarbons.
UV spectrum in CH3OH: final absorption.
IR spectrum in CH2Cl2: see Fig. 1.
1 H-NMR spectrum in CDCls, 90 MHz, with tetramethylsilane as internal standard: see FIG. 2.
The following Rf values are observed in a thin layer chromatogram on Polygram SIL G foils with chloroform-methanol (96: 4), running distance 10 cm:
Dihydro-cyclosporin E 0.35
Cyclosporin E 0.35
Detection is carried out with iodine vapor or Dragendorff reagent.
The new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin E is characterized by interesting pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger, and in particular the substance squeezes out due to its immunosuppressive effect.
The immunosuppressive effect can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janossy, in vitro concentrations of 0.01 to 10.0 µg / ml show a strong inhibition of H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blastogenesis of with concanavalin A stimulated lymphocyte from mouse spleen was found.
b) Oxazolone test on the mouse:
The decrease in ear swelling is called a suppressive
Index (SI) expressed; SI = 0.62 after 5 X 70 mg / kg p.o.
Due to its immunosuppressive effect, the substance can be used for the prophylaxis and treatment of diseases that are related to the negative effects of the defense reaction.
The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated. In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 60 to 300 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form. For larger mammals, the daily dose is around 300 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 150 to 300 mg of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin E in addition to solid and liquid carrier substances.
As a remedy, the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin E can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
250 mg palladium-carbon (10% palladium) are pre-hydrogenated in 7 ml ethanol for 40 minutes. The solution of 2.5 g of cyclosporin E in 25 ml of ethanol is added to this suspension of the palladium catalyst and then hydrogenated at 230 and a pressure of 737 mm of mercury until the hydrogen uptake has ended. The catalyst is then filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo at 20 to 400. The residue is then crystallized from 12 ml of ether at -16 ", whereby thin-layer chromatography uniform dihydro-cyclosporin E in the form of colorless prisms of mp 156-158 is obtained (after drying in a high vacuum for 4 hours at 80).
The cyclosporin E used as the starting material is produced as follows:
500 liters of a nutrient solution containing 40 g glucose, 5 g casein peptone, 5 g MgSO4 per liter. Containing 7H2O, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and demineralized water are inoculated with 50 liters of a pre-culture of strain NRRL 8044 and in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration ( 1 liter air / min. / Liter nutrient solution) incubated at 27 for 13 days (see DOS 2 455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. This is then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions which eluted first contain predominantly cyclosporin A in addition to cyclosporin B and cyclosporin E, the later eluted fractions predominantly cyclosporin C.
For further purification, the fractions containing cyclosporin A, B and E are again chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions which eluted first predominantly from cyclosporin A and the later eluted portions consist of cyclosporin B and E. These are then on silica gel 60, grain size 0.063-0.20 mm
(Merck) with chloroform-methanol (98: 2) further separated, the first fractions predominantly containing cyclosporin E and the later fractions cyclosyorin B. For further enrichment, the cyclosporin E-containing fractions are re-chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with ether-methanol (95: 5). The fractions according to the thin-layer chromatogram of Polygram SIL G foils, eluent chloroform-methanol (96: 4)] cyclosporin E are combined and crystallized from ether at +70. A strongly enriched crude crystal of cyclosporin E is obtained.
Repeated crystallization from ether at +7 provides thin-layer chromatography uniform cyclosporin E as colorless, prismatic crystals, which after washing with a little ice-cold ether and then drying in a high vacuum at 80 "for 3 hours have an mp of 149-152.
[a] D20 = -178.70 (c = 0.54 in CHCl3) = -186.10 (c = 0.51 in CH3OH).