Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia fermentowanego produktu z mleka, zawiera¬ jacego zdolne do zycia bifidobakterie.Bifidobakterie sa dobrze znane jako bakterie dominujace znalezione we florze jelitowej niemo¬ wlat karmionych piersia. Bifiidotokterie te sa zna¬ ne jako te, które wykazuja róznorodne wlasci¬ wosci fizyczne, a mianowicie: (a) tlumienia bakterii gnilnych; (b) inhibitowanie wytwarzania toksycznych amin; (c) promotorowanie trawienia kazeiny mleka ko¬ biecego przez dzialanie fosfatazy fosforoproteiny; (d) inhibitowanie wzrostu bakterii chorobotwór¬ czych w polaczeniu z obnizaniem wartosci pH w jelitach przez wytwarzanie kwasu mlekowego, kwasu octowego, kwasu mrówkowego itp.Niemowle, które jest karmione butelka (lub „noworodek karmiony butelka") ma bardzo malo bifidobakterii jelitowych, które jak nadmieniono powyzej maija róznoorofdny wplyw na utirzymande w zdrowiu jelit. Jest to racjonalna przyczyna tego, ze niemowleta karmione butelka sa szczególnie podatne na choroby jelit w porównaniu z niemo¬ wletami karmionymi piersia. Z tego tez wzgledu w celu uzyskania flory jelit niemowlat karmio¬ nych butelka na podobna do tej, która wystepuje u niemowlat karmionych piersia wytworzono jako substytut mleka kobiecego, zmodyfikowane, zawierajace bifidobakterie, mleko, w proszku dla niemowlat. 10 15 20 25 30 Jednakze, zgodnie ze znanym sposobem hodo¬ wanie bifidobakterii w srodowisku, takim jak mleko i podobne napotyka na nizej podane trud¬ nosci i z tego wzgledu nie moze byc on przepro¬ wadzany na skale przemyslowa. Trudnosciami tymi jest (w porównaniu z procesem wytwarza¬ nia bakterii kwasu mlekowego, które sa bardzo szeroko stosowane w obróbce mleka): to, ze (a) warunki hodowli musza byc scisle beztlenowe; (b) wymaganie, dotyczace odzywek dla hodo¬ wania, jest skomplikowane oraz scisle okreslone i dlatego bakterie te nie rozmnazaja sie w srodo¬ wisku czystego mleka, które nie zawiera sub¬ stancji promotorujacych wzrost, takich jak eks¬ trakt drozdzy itp; oraz (c) trudno jest utrzymac zdolne do zycia bakterie w ciagu dlugiego czasu przy niskiej wartosci pH w konwencjonalnej fer¬ mentacji mleka ze wzgledu na niska odpornosc bifidobakterii na dzialanie kwasu.Jezeli substancja promotorujaca wzrost bifido¬ bakterii jest dodawana do srodowiska zawiera¬ jacego mleko wówczas bifidobakteria moze byc ewentualnie hodowana w warunkach tlenowych Jednakze produkty tej kultury wplywaja czesto szkodliwie na smak i zapach. Ponadto wada jest to, ze substancje promotorujace wzrost sa ogólnie kosztowne i dlatego nie maja praktycznego za¬ stosowania.Podczas badania kultury z zastosowaniem bifi¬ dobakterii nieoczekiwanie wykryto nowy szczep 107 2063 107 206 4 bifidobakterii, który ma przedluzone dzialanie rozwojowe w warunkach tlenowych w srodowisku czystego mleka, które nie zawiera substancji pro- motorujacych wzrost lub srodków redukujacych.W sposobie wedlug wynalazku wykorzystuje sie nowy szczep bifidobakterii do wytwarzania fer¬ mentowanego produktu mlecznego na drodze ho¬ dowania nowego szczepu bifidobakterii w srodo¬ wisku zawierajacym mleko, takim jak mleko pel¬ ne, mleko odtluszczone lub mleko rekonstytuowa¬ ne.Korzysci zastosowania nowego szczepu bifido¬ bakterii wedlug wynalazku sa nastepujace: (a) latwosc hodowania bez stosowania zadnych specjalnych warunków. Latwy rozwój w srodo¬ wisku tlenowym bez dodawania substancji pro- motorujacych wzrost; (b) mozliwosc zapobiegania wystepowaniu nie¬ pozadanego zapachu i ulatwienie dojrzewania kul¬ tury; (c) poniewaz kulturowany produkt sposobem wedlug wynalazku nie zawiera dodatków, takich jak substancje promotorujace wzrost, korzystnie stosuje sie go do wytwarzania pokarmu dla nie¬ mowlat lub dodatku do pokarmu dla niemowlat; (d) nowy szczep jest zasadniczo odporny na dzialanie tlenu, a warunki odzywiania podczas hodowania go sa proste.W konsekwencji kulturowany produkt (lub pod¬ czas wytwarzania takiego produktu) utrzymuje wysoka zdolnosc do zycia bakterii podczas prze¬ chowywania i jest stosunkowo latwy w zastoso¬ waniu do obróbki produktów spozywczych oraz napojów zawierajacych zdolne do zycia bakterie bez zasadniczego obnizania zywotnosci bakterii.Nowy szczep bifidobakterii stosowany w sposo¬ bie wedlug wynalazku i posiadajacy wyzej wy¬ mienione zalety stanowi „Bifidobacterium bifidum YIT-4002". Ten nowy szczep odkryto w sukce¬ sywnie transferowanej kulturze bifidobakterii po¬ branej z odchodów zdrowego niemowlaka kar¬ mionego piersia. Ma on nastepujaca charakte¬ rystyke: (1) Glówne wlasciwosci bakteriologiczne.Szczep ten jest gramo-dodatnia, nie wytwarza¬ jaca zarodników paleczka (0,5X2—3ja) i ma we¬ wnatrz komórek granulki reagujace na blekit metylenowy. Wedlug obserwacji mikroskopowych bakteria ta ma rozgalezione konce o ksztaltach polimorficznych, takich jak Y, V lub wygiecia.Kolonie uformowane sposobem plytkowym po¬ dwójnej warstwy maja ksztalt cylindryczny, wy¬ pukly lub soczewkowaty, a kolonie uformowane na dnie tej plytki maja rózne ksztalty. Podczas hodowania w warunkach beztlenowych w srodo¬ wisku cieklej pozywki VL-G w ciagu 72 godzin wytwarzaja kwas octowy, kwas mlekowy w sto¬ sunku molowym 1,6±5 (kwas octowy, kwas mle¬ kowy). Wytworzony w ten sposób w wymienionym cieklym srodowisku kwas mlekowy wykazuje skrecalnosc optyczna nastepujaca: Skrecalnosc wlasciwa: —0,038 Aktywnosc optyczna: L(+)76°/o+EL 24%.Wyniki przeprowadzonych testów sa nastepuja¬ ce: wytwarzanie katalazy (—), wytwarzanie gazo¬ wego dwutlenku wegla (—), cysteinowa s aktyw¬ nosc koagulowania mleka (+), hydroliza zelatyny (—), aktywnosc redukowania azotu (—), wytwa¬ rzanie indolu (—) i wytwarzanie siarkowodoru (—).Powyzsze wyniki testów odpowiadaja definicji rodzaju Bifidobacterium. (2) Optymalna temperatura rozwoju i wartosc pH.Optymalna temperatura rozwoju wynosi 36—38°C.Bakteria ta nie rozwija sie w temperaturze po¬ nizej 25°C lub powyzej 45°C.Optymalna wartosc pH przy której nastepuje rozwój wynosi 6—7.Bakteria ta nie rozwija sie przy wartosci pH ponizej 5,0. (3) Fermentacja cukrowa.Bakteria ta wykazuje dodatnia reakcje fermen¬ tacji w odniesieniu do nastepujacych cukrów: glukozy, fruktozy, laktozy i galaktozy.Bakteria ta wykazuje ujemna reakcje fermen¬ tacji w odniesieniu do nastepujacych cukrów: arabinozy, ksylozy, salicyny, mannozy, mannitolu, melecytozy, cellobiozy, sorbitu, inuliny, trehalozy, ramnozy, maltozy, ribozy i sorbozy.Fermentacja ta koresponduje do tej, która po¬ woduje standardowy szczep bifidobakterii, tj. Bi¬ fidobacterium bifidum E319. (4) Czulosc na dzialanie tlenu i wymagania do¬ tyczace odzywek.Bakterie ta inkubowano w liczbie 107—108/ml w srodowisku tlenowym w temperaturze 37°C w mleku odtluszczonym o zawartosci substancji stalej wynoszacej 12% nie zawierajacym zadnych substancji promotorujacych wzrósl;, nasyconym tle¬ nem w ilosci okolo 6,5 ppm. Po 24 godzinach in- kubowania populacja wynosila ponad 109/nil.Zwykle bakterie bifidus trudno rozwijaja sie w warunkach opisanych powyzej. Populacja ich pozostaje taka sama lufo obniza sie (porównaj z przykladem II).Jak przedstawiono powyzej, taksologicznie nowa bakteria calkowicie koresponduje z Bifidobacte¬ rium bifidum za wyjatkiem tego, ze nowa bakte¬ ria rozwija sie dobrze w srodowisku czystego mleka w warunkach tlenowych, podczas gdy zwy¬ kla bdiffidojbalkiteria nie moze sie rozwijac. Z puriktu widzenia tych wlasciwosci nowy szczep bakteryjny zidentyfikowano jako wariant BMdotoaciterium bi¬ fidum i nazwano „Bifidobacterium bifidum YIT- -4002". Identyfikacje ta zrobiono zgodnie z Ber- gey's Manual z 1974 r. Nowy szczep zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agence of In- dustrial Science and Technology nr 8—1, Inage Higashi-5-chome, Chiba-shi, Chiba-ken, Japonia.Numer depozytowy FERM-P-No 3371. Jak opisano powyzej nowy szczep bifidobacterium ma pozada¬ ne wlasciwosci i z tego wzgledu jest latwo hodo¬ wany bez stosowania specjalnych warunków ho¬ dowania w sposób analogiczny jakie zwykle wy¬ maga kultura bakterii kwasu mlekowego.Zgodnie z powyzszym mozliwe jest przeprowa¬ dzenie mieszanej hodowli tego szczepu bifidobak¬ terii z bakteriami kwasu mlekowego. W hodowa¬ niu konwencjonalnych bakterii obecnosc srodków redukujacych oraz srodków promotorujacych wzrost107 206 jest absolutnie niezbedna. Natomiast w hodowli nowego szczepu bifidobakterii obecnosc ich nie jest niezbedna.Jakkolwiek w sposobie wedlug wynalazku srod¬ ki promotorujace Wzrost moga byc obecne w celu pelnego promotorowania rozwoju tak dalece, jak to nie jest szkodliwe dla produktu wytwarzanego podczas kultury.W zwyklych warunkach populacja bifidobak¬ terii podczas 18—24 godzin inkubowania wzrasta do maksimum, lecz jezeli proces postepuje wytwa¬ rza sie kwas i obniza sie wartosc pH. Jezeli ho dowla jest nadal kontynuowana populacja zaczy¬ na sie obnizac, lecz wytwarzanie kwasu nada] postepuje, przy czym wytwarzany kwas staje sie nasycony. W zwiazku z powyzszym hodowle za¬ trzymuje sie w odpowiednim etapie zaleznym od uzycia kulturowanego produktu.Kulturowany produkt moze byc stosowany jako produkt spozywczy lub napój zawierajacy zdolne do zycia bftfddoibakterie albo moze byc ewentual¬ nie mieszany z substancjami slodzacymi, sokami owocowymi, woda lub innymi produktami mlecz¬ nymi lub tez kulturowany produkt moze byc sto¬ sowany po wymrazaniu i suszeniu rozpylowym w postaci proszku.Przedmiot wynalazku ilustruja nizej podane przyklady. W przykladach liczbe zywych bakterii mierzono meitoda praerailkaaiia z zastosowaniem ulepszonej pozywki kulturowej Rogosa. „Kwaso¬ wosc" wskazuje ilosc mililitrów 0,1 N wodorotlen¬ ku sody wymagana do zobojetnienia 5 ml roztwo¬ ru. „Wariant" oznacza nowy szczep, tj. „Bifido- bacterium bifidum YIT-4002 (FERM-P-Nr 3371) stosowany w sposobie wedlug wynalazku.Przyklad I. Wariant oraz trzy rodzaje szczepów standardowych typowych bifidobakterii (przyklady porównawcze) hodowano w warunkach beztlenowych.Kulture zarodnikowa wytwarzano przez hodo¬ wanie okreslonej bakterii w ulepszonej pozywce Rogosa (1 ml kwasu pirogronowego oraz 0,2 g zredukowanego glutationu na 1 litr dodaje sie 1 litr cieklej pozywki wolnego od agaru) i su- spenduje hodowane bakterie, zbierane i przemyte w sterylnych warunkach w buforowym roztworze 1/100 M fosforanu o wartosci pH 6,8 z otrzyma¬ niem zawiesiny (OD660 m^i = 1,5).Pozywke stosowana dla glównego rozwoju re¬ dukowano odtluszczonym mlekiem o zawartosci substancji stalej = 12%. Srodowisko sterylizowa¬ no i umieszczano w sloju w warunkach beztleno¬ wych, w którym atmosfere stanowila mieszanina skladajaca sie z 95% gazowego azotu i 5% gazo¬ wego dwutlenku wegla. W momencie rozpoczecia hodowli ilosc tlenu w srodowisku wynosila 0,1 ppm.Wykres 1 wskazuje stosunek miedzy czasem przeprowadzania hodowli i zmiennoscia populacji zywych bifidobakterii, kwasowoscia oraz wartos¬ cia pH.W przypadku wariantu, populacje zywych bifi¬ dobakterii obliczono na 6,5X109/ml w kulturze 24 godzinnej po zaszczepieniu wraz ze wzrostem populacji zdolnych do zycia bifidobakterii, przy czym zauwazono wydzielanie kwasu i w ten spo¬ sób obnizanie wartosci pH srodowiska. Natomiast, w przypadku standardowych szczepów porównaw¬ czych stwierdzono tylko maly wzrost rozwoju i dowiedziono, ze standardowe szczepy porównaw- 5 cze zasadniczo nie rozwijaly sie w srodowisku czystego mleka odtluszczonego w warunkach bez¬ tlenowych.Przyklad II. Hodowle tlenowa przeprowa¬ dzono z zastosowaniem analogicznych kultur isro- 10 dowiska jak w przykladzie I. Po sterylizacji, przez srodowisko przepuszczano gazowy tlen do jego wysycenia, przy czym ilosc rozpuszczonego tlenu wynosila 6,5 ppm... Wyniki hodowli przedstawiono na wykresie 2. 15 Wariant stosowany w sposobie wedlug wynalazku rozwijal sie w ten sam sposób jak w wyzej wy¬ mienionej hodowli beztlenowej, a populacja zdol¬ nych do zycia bakterii osiagnela po 24 godzinnej hodowli od zaszczepienia 5,0X10*/ml. Natomiast, 20 w przypadku szczepów porównawczych zasadniczo nie stwierdzono rozwoju, a w kilku przypadkach populacji zywotnosc bifidobakterii po zaszczepie¬ niu szybko sie obnizyla.Przyklad III. W przykladzie tym badane 25 róznorodnie warunki hodowania wariamtu silosowa¬ nego w sposobie wedlug wynalazku do wytwarza¬ nia fermentowanego produktu z mleka. (i) Stosunek miedzy iloscia wyjsciowa drobno¬ ustroju i rozwojem. 30 Kulture wyjsciowa wytworzono przez hodowanie w srodowisku mleka odtluszczonego o zawartosci substancji stalej = 8% w ciagu 20 godzin i prze¬ chowywanie w obnizonej temperaturze w ciagu trzech dni. 35 W ten sposób otrzymana kulture wyjsciowa do¬ dawano do odtluszczonego mleka w filosci od 1 do 10% i hodowano w warunkach tlenowych. Pod¬ czas dodawania kultury w ilosci do 3% ilosc wy¬ twarzanego kwasu wzrastala proporcjonalnie do 40 wzrostu ilosci kultury wyjsciowej. Natomiast pod¬ czas dodawania ilosci wiekszych od 3%, ilosc wy¬ dzielanego kwasu byla zasadniczo taka sama.Zgodnie z testem przewodnim, w odniesieniu do ilosci dodawanej kultury wyjsciowej odpowiednia 45 ilosc wynosi 1—2%. Wedlug znanych danych, kul¬ ture stosowano zasadniczo w ilosci 5—10%. W ce¬ lu otrzymania tak duzych ilosci kultury wyjscio¬ wej wieksza ilosc „wyjsciowa" jest niezbedna, (ii) Stosunek miedzy temperatura i rozwojem 50 kultury.Wytwarza sie odtluszczone mleko o zawartosci substancji stalej = 16% i nastepnie srodowisko to sterylizuje sie. Wyjalowione srodowisko chlodzi sie do temperatury 37°C przez piraepuszczanie 55 wyjalowionego powietrza.Do srodowiska wprowadza sie 2% otrzymanej powyzej kultury wyjsciowej i hodowle przepro¬ wadza sie odpowiednio w temperaturze 30°C, 34°C, 37°C, 40°C i 43°C. Rozwój drobnoustroju w tempe- 80 raturze 37°C byl najlepszy, a w temperaturze 34°C i 40°C byl dobry, natomiast w temperaturze 30°C i 43°C byl ograniczony. (iii) Stosunek miedzy utrzymaniem populacji zdolnych do zycia biffiriotoatoterii, a wartoscia pH. 65 Wariantem stosowanym w sposobie wedlug wy-7 107 206 8 nalazku zaszczepiano odpowiednie partie odtlusz¬ czonego mleka o zawartosci substancji stalej = 12% i przeprowadzano hodowle, az wartosc pH kazde¬ go srodowiska wynosila 5,0, 4,6, 4,3 i 4,1. Cztery partie gwaltownie chlodzono do temperatury 5°C Obnizanie populacji zdolnych do zycia bifido- bakterii przy róznym czasie przechowywania w za¬ leznosci od wartosci pH srodowiska. W przypadku srodowiska o wartosci pH 4,3 lub ponizej, w mia¬ re czasu, populacja zdolnych do zycia bifidobak- terii szybko sie obniza. Natomiast w pnzypadlku srodowiska o wartosci pH 4,6 lub powyzej popu¬ lacja zdolnych do zycia bifidobakterii obniza sie nie tak szybko. Powyzszy test przeprowadzono w stosunku do mleka odtluszczonego, lecz analo¬ giczne wyniki uzyskuje sie w przypadku mleka pelnego, odtluszczonego o wiekszej zawartosci sub¬ stancji stalej lub mleka czesciowo odtluszczonego.Przyklad IV. Wytwarzanie fermentowanego produktu z mleka. (1) 160 g odtluszczonego mleka w proszku roz¬ puszcza sie w wodzie do otrzymania 1 litra roz¬ tworu, który sterylizuje sie przez ogrzewanie do temperatury 100°C w ciagu 30 minut. Po ochlo¬ dzeniu do wysterylizowanego roztworu dodaje sie 2% kultury wariantu (uprzednio hodowanego w czystym srodowisku) i inkubuje w temperatu¬ rze 37°C w ciagu 16 godzin. Nastepnie 525 ml in- kubowanego roztworu miesza sie z 475 ml syropu zawierajacego 35 g cukru i 35 g sorbitu. Po czym do mieszaniny dodaje sie wonne przyprawy i mie¬ szanine homogenizuje sie do wytworzenia fermen¬ towanego produktu mlecznego. Otrzymany w ten sposób produkt ma kwasowosc 3,5, wartosc pH = 4,7, przy czym populacja zdolnych do zycia bifidobakterii wynosi 2,9X109/ml. (2) Odtluszczone mleko w proszku dodaje sie do mleka pelnego, otrzymujac mieszanine o za¬ wartosci substancja stalej — nietkuszczowej = 16%.Mieszanine te sterylizuje sie przez ogrzewanie.Do mieszaniny dodaje sie 5% kultury Lactobacil- lus acidophilus oraz 1% kultury wariantu i inku- i przechowywano dla okreslenia wariantów popu¬ lacji zdolnej do zycia bifidobakterii wedlug czasu przezycia. Wyniki przedstawiono w tablicy 1.Liczba wartosci oznacza populacje zdolnych do 5 zycia bifidobakterii w 1 ml kultury. buje w temperaturze 37°C w ciagu 37 godzin. Po inkubacji 525 ml roztworu miesza sie z 472 ml syropu zawierajacego 20 g glukozy i 35 g fruktozy.Po dodaniu wonnej przyprawy, mieszanine homo¬ genizuje sie, otrzymujac fermentowany produkt mleczny. Wytworzony w ten sposób produkt ma kwasowosc 3,3 i wartosc pH 4,8. Populacja zdol¬ nych do zycia bifidobakterii wariantu wynosila l,9X109/ml, a bakterii acidophilus — 5,0Xl08/ml. (3) 100 g odtluszczonego mleka w proszku i 60 g pelnego mleka w proszku rozpuszcza sie w wodzie do otrzymania 1 litra roztworu. Po sterylizacji do roztworu dodaje sie 3% kultury wariantu i inku¬ buje w temperaturze 37°C w ciagu 12 godzin. Po inkubowaniu 525 ml roztworu miesza sie z syro¬ pem zawierajacym 100 g soku owocowego man¬ darynkowego i jablkowego, 40 g cukru i 35 g sorbitu. Nastepnie do mieszaniny dodaje sie wonne przyprawy i mieszanine homogenizuje sie, otrzy¬ mujac fermentowany produkt mleczny. Otrzyma¬ ny w ten sposób produkt ma kwasowosc 4,0 oraz wartosc pH = 4,6, a populacja zdolnych do zycia bifidobakterii wynosi l,5Xl09/rnl« Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania fermentowanego produk¬ tu z mleka zawierajacego zdolne do zycia bifido- bakterie przez hodowanie wariantu bifidobakterii w srodowisku mleka, znamienny tym, ze stosuje sie wariant bifidobakterii, który moze rozwijac sie w warunkach tlenowych w srodowisku czy¬ stego mleka, które nie zawiera substancji promo¬ torujacyeh wzrost. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wariant bifidobakterii stosuje sie Bifidobac- terium bifidum YIT-4002 nr FERM-P 3371.Tablica 1 PH 5,0 4,6 4,3 4,1 Kwasowosc 9,0 9,8 11,5 13,4 Czas przechowywania 0 4,4X109 5,4X10° 3,0 X109 6,0X108 3 3,2X109 7,2X108 1,7 Xl 07 8,5X105 5 9,6X108 2,3X108 5,7 X105 4,7X108 n i 4,2X108 8,0 X107 2,6X10* 101 10 6,8X107 1,2X107 1,5X101 101 Xl Xl Xl Xl 25 30 35 40 50 55107 206 Wyjkres SZCZEP WARIANTU STOSOWANY WG WYNA- 1 LAZKU | PORÓWNAWCZE 24 48 CZAS iNKUBOWANiA 72 Wijkrei SZCZEP WARIANTU STOSOWANY WG WY I NALAZKU \ PORÓWNAWCZE 24 48 CZAS iNKUBOWANiA 72 PL