DE2819384C3 - Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung der mikrobiologisch hergestellten Lipase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Alcaligenes sp. DSM 1239 in einem Nährkulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11 und bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 4O⁰C aerob kultiviert, und daß man die mikrobiologisch hergestellte Lipase aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das weiterhin ein nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel enthält

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums, ist.

Die Erfindung betrifft eine mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Ein Gegenstand der Erfindung ist eine mikrobiologisch hergestellte Lipase mit folgenden Eigenschaften:

1) einem optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 ±0,5;

2) einer optimalen Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48°C;

3) einer Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird;

4) einer Cholesterin-Esterase-Aktivität und

5) einem Molekulargewicht von etwa 30 χ 10⁴ bis etwa 4OxIO⁴.

Die erfindungsgemäße Lipase hat Eigenschaften, die bislang noch nicht in der Literatur beschrieben worden sind.

Verfahren zur Herstellung von Lipase unter Anwendung von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, sind seit langem bekannt Bei solchen Verfahren werden beispielsweise Mikroorganismen der Art Pseudomonas, Chromobacterium, Achromobacterium, Staphylococcus, Brevibacterium und Corynebacterium verwendet.

Es wurden bereits Untersuchungen durchgeführt, um eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich zu entwickeln, welche durch Gallensalze aktivierbar sein soll. Bei diesen früheren Untersuchungen wurde der Stamm Alcaligenes Sp. PL-266 Meito Strain FERM-P Nr. 3187 (niedergelegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan) entdeckt Es handelt sich hierbei um einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes, der aus der Erde isoliert worden ist Dieser Stamm hat die Fähigkeit, eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich herzustellen, die durch Gallesalze aktiviert werden kann. Dieses Verfahren und die

ίο mikrobiologischen Eigenschaften sowie die enzymatischen Eigenschaften der so hergestellten Lipase sind in der JP-OS 21 387/77 beschrieben.

In weiteren Untersuchungen wurden nun verschiedene Stämme der gleichen Art aus der Erde der Umgebung von Tokio, Japan, isoliert Dabei wurde festgestellt, daß diese Mikroorganismen die Fähigkeit haben, eine Lipase herzustellen, die einen optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich hat und die durch Gallensalze aktiviert werden kann. Bei der neuen Lipase handelt es sich jedoch um eine Lipase von einem unterschiedlichen Typ, die besser geeignet ist als die obenerwähnte bekannte Lipase. Auch die Abtrennung der durch diesen neuen Stamm gebildeten Lipase ist gelungen. Dieser neue Lipasetyp hat zusätzlich zu der Lipase-Aktivität eine Cholesterin-Esterase-Aktivität, die die oben beschriebene Lipase nicht besitzt. Wegen dieser Aktivität ist sie auch als Diagnostikum für verschiedene Zwecke, beispielsweise zur Bestimmung der Cholesterinspiegel, geeignet.

Die Lipasemenge, die durch den neu gefundenen Mikroorganismus erzeugt wird, ist beispielsweise so hoch wie etwa 2000 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe. Diese Menge ist erheblich größer als die Lipasemenge, die durch die Mikroorganismen gemäß der obengenannten Patentanmeldung erzeugt wird. Diese beträgt nämlich nur etwa 320 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe.

Durch die Erfindung wird daher eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich zur Verfügung gestellt. Die neue Lipase wird, wenn sie dem Menschen oder Tieren beispielsweise als Verdauungshilfsmitiel oral verabreicht wird, durch die Galle in dem Darm aktiviert (alkalischer Darmsaft).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der obenerwähnten Lipase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus mit Eigenschaften, die seine Identifizierung als Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito gestatten, in einem Nährkulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11 und bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 4O⁰C aerob kultiviert, und daß man die mikrobiologisch hergestellte Lipase aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt.

Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase verwendete Stamm wurde von der Anmelderin als Alcaligenes sp. PL-679 Meito bezeichnet. Er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 1239 hinterlegt, und er

feo wird hierin als Alcaligenes sp. DSM 1239 bezeichnet. Daneben wurde er noch beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3783 und bei der American Type Culture Collection,

'"' USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31371 hinterlegt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Alcaligenes sp. DSM 1239 sind wie folgt:

A. Morphologische Eigenschaften

Stäbe, 0,5 bis 0,7 χ 1,0 bis 4,0 μπι, die einzeln und gelegentlich in Ketten mit 2 bis 4 Z-jllen auf dem Nähragarmedium oder in der Nährbrühe auftreten.

Nicht-pleomorph.

Sie sind mittels 1 bis 6 um das Mundfeld bewimperter Geiseln beweglich.

Keine Sporenbildung.

Gram-negativ. Üppiges Wachstum und rote KoIonien, die auf Kristallviolettagar gebildet werden.

Nicht säureecht

B. Kultivierungseigenschaften

Nährmittelagarkolonien: kreisförmig, rauh, gefranst, durchscheinend, gelblichbraun, in der Mitte braun; keine Bildung eines diffundierbaren Pigments.

Nährmittelagar-Schrägkultur: ausgebreitet oder stachelig, durchscheinend, harzartig, orange bis gelblichbraun.

Nährbrühe: üppiges Wachstum, gelblichbraun, trübe mit Häutchen und Vorliegen eines Sediments.

Gelatine versuch: Filiform, keine Verflüssigung, üppiges Wachstum, gelblichbraun auf mittlerer Oberfläche.

Lackmusmilch: alkalisch. Keine Peptonisierung.

Kartoffelkultur: üppiges Wachstum, orange, leichtbraunwerdend.

C. Physiologische Eigenschaften

Bildung von Nitriten, aus Nitraten.

Keine Bildung von Gas in Nitratbrühe unter anaeroben Bedingungen.

Methylrot-Test negativ.

Voges-Proskauer-Test negativ.

Keine Bildung von Indol.

Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.

Keine Hydrolyse von Stärke.

Citrate werden als einzige Kohlenstoffquellen verwertet (Koser's Agar und Christensen's Agar).

Nitrate und Ammoniumsalze werden als einzige Stickstoffquellen verwertet.

Ein diffundierbares Pigment wird auf Nähragar, Nährgelatine oder Kartoffeldextroseagar nicht gebildet. Ein diffundierbares blaßbraunes Pigment wird auf King-A-Agar und Czapek-Dox-Agar gebildet. Ein diffundierbares blaßgelblichbraunes Pigment wird auf King-B-Agar gebildet.

15

20

25

30 Keine Bildung von Urease.
Oxidase positiv.
Catalase positiv.

pH-Bereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5,5 und 11,0. Kein Wachstum unterhalb 5,0 oder oberhalb 12,0.

Temperaturbereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5 und 40⁰C. Optimales Wachstum zwischen 15 und 35° C.
Aerob.

OF-Test: Sowohl in offenen als auch in geschlossenen Röhrchen wird weder eine Säure noch ein Gas erzeugt

Aus D-Fructose und Glycerin wird Säure (latent), jedoch kein Gas im Oxidations-Fermentations-Medium von Hugh und Leifson in offenen Röhrchen gebildet Weder Säure noch Gas wird aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit oder Stärke in offenen und geschlossenen Röhrchen erzeugt

D. Andere Eigenschaften

Bildung von Lipase.

Keine Bildung von 3-Ketolactose.

Schwache Bildung von Ammoniak aus Arginin.

G + C-Gehalt von DNA: 66,7 Mol-%.

Das taxonomische Status des erfindungsgemäß verwendeten Stammes mit den oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde hinsichtlich der Angaben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974) untersucht Es wurde bestätigt daß der Stamm zu der Art Alcaligenes gehört In Bergey's Manual wird kein bekannter Mikroorganismus der Art Alcaligenes beschrieben, der die obigen mikrobiologischen Eigenschaften hat Weiterhin unterscheidet sich der erfindungsgemäß verwendete Stamm von dem Stamm Alcaligenes sp. PL-266 Meito, der in der obengenannten offengelegten Patentanmeldung beschrieben wird.

In Tabelle I sind die Hauptunterschiede zwischen dem Stamm Alcaligenes DSM 1239, der für die Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase geeignet ist und dem Stamm PL-266 Meito gemäß der obengenannten Patentanmeldung zusammengestellt

Tabelle I

Eigenschaften

Stamm PL-266 Meito Stamm DSM 1239
(erfindungsgemäß verwendet)

Nähragarkolonie

Nähragar-Schrägkultur

Nährbrühe

Gelatine versuch

Lackmusmilch

Nitratreduktion

Schwefelwasserstoffbildung

OF-Test

ganz, grau-weiß oder grau-gelb

grau-weiß oder graugelb

nicht trübe, ohne Häutchen

kraterförmig, wird schichtförmig

Peptonisierung

negativ

positiv (schwach)

oxidierend

gefranst, gelblichbraun oder braun

orange oder gelblichbraun

trübe, mit Häutchen

keine Verflüssigung

keine Peptonisierung

positiv

positiv

nicht-oxidierend und

Fortsetzung	Stamm PL-266 Meito	Stamm DSM 1239
Eigenschaften		(erfindungsgemäß verwendet)
Zuckerassinvlierung	positiv	negativ
L-Arabinose	positiv	negativ
D-Xylose	positiv	negativ
D-Glucose	positiv	negativ
D-Mannose	positiv	negativ
D-Galactose	positiv	negativ
Inosit	positiv	negativ
Maltose	positiv	negativ
Saccharose	positiv	negativ
Lactose	positiv	negativ
Trehalose	positiv	negativ
D-Sorbit	positiv	negativ
Mannit	74,2 MoL-%	66,7 Mol.-%
G+C-Gehalt von DNA

Die bislang in der Literatur noch nicht beschriebene mikrobiologisch hergestellte Lipase mit den Eigenschaften (1) bis (5) kann wie folgt hergestellt werden:

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase wird der Mikroorganismus Alcaligenes sp. DSM 1239 aerob in einem Nährkulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralien enthält, bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 40⁰C, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40⁰C, und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, kultiviert, und die mikrobiologisch hergestellte Lipase wird aus der resultierenden Kulturbrühe gewonnen.

Die Kohlenstoffquelle, die Stickstoffquelle und die Mineralien können alle beliebigen Materialien sein, die üblicherweise zum Züchten von Mikroorganismen verwendet werden.

Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellcn sind Glucose, Fructose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke, Dextrin, Molassen, Glycerin, öle und Fette, Weizenkleie, Lactose und Saccharose. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Sojabohnenpulver, entfettetes Sojabohnenpulver, Baumwollsamenrückstände, Corzarückstände, Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Gluten, Maisquellflüssigkeit, Casaminosäure. Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Mineralien sind Phosphatsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Kaliumsalze, Natriumsalze und Calciumsalze. Gewünschtenfalls können zu dem Kulturmedium verschiedene andere organische oder anorganische Substanzen, die für das Wachstum von Mikroorganismen oder für die Enzymproduktion geeignet sind, z. B. Siliconöle, Schaumverhinderungsmittel, Vitamine und phosphorhaltige Verbindungen, zugesetzt werdea

Durch Einarbeitung eines nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels in das Nährkulturmedium gemäß der Erfindung kann die Menge der mikrobiologisch hergestellten Lipase erheblich erhöht werden. Die Ausbeute der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase kann auch dadurch erhöht werden, daß man Salze, die dazu imstande sind, Eisenionen abzugeben, wie z. B. Eisenchlorid oder Eisensulfat,

zusammen mit Natriumsalzen von organischen Säuren, wie Natriumacetat oder Natriumeitrat, verwendet.

Die Menge des verwendeten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels beträgt etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums. Beispiele für geeignete nicht-ionogene oberflächenaktive Mittel sind

Sorbitalkylester, Polyoxyäthylensorbiialkylesler, Polyoxyäthylenalkyläther, Polyoxyäthylenalkylaryläther, Polyoxyäthylenalkylester, Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Copolymereund Fettsäuremonoglyceride.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt Es kann sowohl eine Tauch- als auch eine Oberflächenkultivierungstechnik angewendet werden. Gewöhnlich ist jedoch eine Tauchkultur geeignet Für den technischen Betrieb ist es vorteilhaft eine Tauchkultivierung unter Belüftung und unter Rühren durchzuführen. Ein geeignetes Vorgehen ist z. B. die Durchführung einer kleindimensionierten Vorkultivierung und die Inokkulierung der resultierenden Kultur-

so brühe in ein Kulturmedium für die Hauptkultivierung.

Die Kultivierungsbedingungen variieren etwas entsprechend beispielsweise dem verwendeten Stamm und der Zusammensetzung des Kulturmediums. Es ist empfehlenswert, Bedingungen auszuwählen, die für die Erzeugung der Lipase als Endprodukt am vorteilhaftesten sind. Die Kultivierungstemperatur beträgt im allgemeinen etwa 5 bis 40⁰C, vorzugsweise etwa 10 bis 40° C Temperaturen von 20 bis 30⁰C werden besonders • bevorzugt Die Kultivierungszeit variiert entsprechend den Bedingungen, beträgt aber gewöhnlich etwa 1 bis etwa 4 Tage. Die Kultivierung kann zu einem Zeitpunkt beendigt werden, wo die Menge der angesammelten Lipase ein Maximum erreicht hat Der pH-Wert des Kulturmediums kann sich zum Zeitpunkt der Herstel lung des Kulturmediums von schwach sauer bis zur Alkalinität erstrecken. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH-Wert extra einzustellen. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen etwa 53 bis

etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, mehr bevorzugt etwa 7 bis etwa 10. Die Kultivierung kann erforderlichenfalls unter Einstellung des pH-Werts auf die vorgenannten Bereiche durchgeführt werden.

Die Gewinnung der mikrobiologisch hergestellten Lipase gemäß der Erfindung aus der resultierenden Kulturbrühe kann durch bekannte Verfahrensweisen geschehen, wie sie zur Trennung und Reinigung von Lipase angewendet werden. Beispielsweise wird im Falle einer Oberflächenkultur die Kulturbrühe mit Wasser oder einem anderen Extraktionsmittel extrahiert, um einen Extrakt zu bilden. Im Falle einer Tauchkultur werden die Mikrobenzellen oder -feststoffe von der Kulturbrühe durch eine bekannte Filtration oder Zentrifugation abgetrennt, um einen Extrakt oder ein Filtrat zu erhalten. Der Extrakt oder das Filtrat kann entweder als solcher oder nach einer Konzentrierung verwendet werden. Durch Behandlung des Extrakts, des Filtrats oder seines konzentrierten Produkts durch bekannte Techniken, wie z. B. eine Ausfällung, ein Sprühtrocknen oder eine Lyophilisierung, kann die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase in Form eines festen Produkts erhalten werden.

Geeignete Ausfällungsmittel für die Ausfällungsmethode sind z. B. lösliche Salze, wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, und hydrophile organische Lösungsmittel, wie Äthanol, Methanol und Aceton. Geeignete Stabilisierungsmittel, dei beim Sprühtrocknen verwendet werden, sind z. B. Maltodextrin, Lactose, Carboxymethylcellulose, Polyäthylenglycol, Magermilch, Kasein, Sorbit und Natriumchlorid.

Das erfindungsgemäße Lipaseprodukt mit der gewünschten Reinheit und Lipasepotenz kann durch eine oder mehrere bekannte Reinigungstechniken gewonnen werden, beispielsweise durch Adsorptions- und EIu-

Tabelle II

tionsmethoden unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, Calciumphosphatgel, Aluminiumoxid oder Bentonit, durch Molekularsiebmethoden mit Sephadex oder Biogel, durch chromatographische Methoden mit Cellulose oder Sephadex-Ionenaustauscher, durch Ausfällungsmethoden unter Verwendung eines Proteinausfällungsmittels, wie Tannin und Calciumsalzen, durch eine isoelektrische Ausfällungsmethode, durch eine Dialysemethode und eine elektrophoretische Methode. Die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase hat folgende Eigenschaften:

(1) einen optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 ±0,5,

(2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48° C,

(3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird,

(4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und

(5) ein Molekulargewicht von etwa 3Ox 10⁴ bis etwa 4OxIO⁴.

Diese Lipase ist bislang in der Literatur noch nicht beschrieben worden. Lipasen (Fraktionen I und II), die in der JP-OS 21 387/77 beschrieben werden, kommen der erfindungsgemäßen Lipase am nächsten. Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase kann von den Lipasen I und II in erster Linie hinsichtlich der oben beschriebenen Eigenschaften (2), (4) und (5) unterschieden werden. Weiterhin zeigt sie auch unterschiedliche Inhibierungseigenschaften für die Aktivität. In Tabelle II sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften der Lipasen I und II gemäß der JP-OS 21 387/77 zusammengestellt.

Eigenschaften

Erfindungsgemäße Lipase

Lipase gemäß der JP-OS 21 387/77 Lipase I Lipase II

Lipase-Aktivität
Cholesterin-Esterase-Aktivität
Lipoprotein-Lipase-Aktivität
Optimaler pH-Wert für die Aktivität Optimale Temperatur fur die Aktivität Molekulargewicht

Aktivieningsinhibierung durch Hg⁺⁺, Fe⁺⁺, Zn⁺⁺, Sn⁺⁺, Cd⁺⁺ oder Cr⁺⁺⁺ (Konzentration, 10~^} Mol)

Aktivitätsinhibierung durch
Natriinnascorbat (Konzentration,
10"² Mol) -

Aktivitätsinhibierung durch Monojodessigsäure (Konzentration, 10"³ Mol)

9 ±0,5

40 bis 48^CC

34X10⁴-37X10⁴

Inhibierung

(mehr als 50%)

Inhibierung (mehr als 50%)

Inhibierung (mehr als 50%) 9 ±0,5

70 bis 75^CC

18±1X1O⁴

keine Inhibierung

keine Inhibierung

10 ±0,5 70 bis 80^cC 3,2 X 10⁴-3,7 X10" Inhibierung durch Cd⁺ "* (10 bis 20%), jedoch nicht durch die anderen Metallionen keine Inhibierung

keine Inhibierung keine Inhibierung

Die enzymologischen Eigenschaften der erfindungsgemäBen mikrobiologisch hergestellten Lipase werden nachstehend genauer beschrieben.

Herstellung der Proben

Die Mycelien und andere Feststoffe werden durch Filtration von der Kulturbrühe abgetrennt. Das Filtrat wird auf etwa 5° C abgekühlt und Ammoniumsulfat wird unter Rühren zu dem Filtrat bis zu einer Sättigung von 40% gegeben. Das Gemisch wird 24 h lang bei etwa 5° C stehengelassen. Das ausgefällte Enzym wird gesammelt und in fließendem Wasser bei etwa 18° C 2 Tage lang unter Verwendung einer dialytischen CeUophanmembran dialysiert Das Dialysat wird sodann 24 h bei etwa 5° C gegen eine Tris-Pufferlösung (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) weiter dialysiert Die dialysierte Enzymlö-

sung wird mit etwa 5° C auf eine Säule von DEAE-Celluloseionenaustauscher aufgebracht, der genügend mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Säule wird sodann mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) gewaschen und mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) eluiert, wobei die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer allmählich auf 0,4 Mol erhöht wird. Die Aktivität des Abstroms wird gemessen und aktive Fraktionen werden gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden sodann in eine dialytische Cellophanmembrane gebracht und unter Verwendung von Polyäthylenglycolpulver konzentriert. Das Konzentrat wird in fließendem Wasser von etwa 18° C 24 h lang in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, dialysiert. Sodann wird es weiter gegen einen Tris-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird erneut chromatographiert und die resultierenden aktiven Fraktionen werden erneut, wie oben beschrieben, konzentriert. Das Konzentrat wird sodann zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen. Die erhaltene Enzymlösung wird gelfiltriert, indem sie durch eine Säule mit Sephadex G-200 geleitet wird, wobei der gleiche Tris-Puffer wie oben verwendet wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die resultierenden aktiven Fraktionen werden wie oben konzentriert und zentrifugiert. Die resultierende Enzymlösung wird in der gleichen Weise wie oben gelfiltriert, wobei eine Säule mit Sepharose 4B verwendet wird. Auf diese Weise wird eine gereinigte Probe erhalten.

Unter Verwendung der gereinigten Probe werden die Eigenschaften (1) bis (7) gemessen. Die Bestimmung erfolgt nach folgenden Methoden.

(4) Cholesterin-Esterase-Aktivität

Die Messung der Cholesterin-Esterase-Aktivität erfolgt nach der Verfahrensweise, beschrieben von Leschroue et al. in Z. KHn. Chem. Klim. Biochem., 12,403 (1974).

(5) Molekulargewicht

Die Messung und die Errechnung des Molekulargewichts werden von der von P. Andrews in Biochem. J. 91, 222 (1964) beschriebenen Methode durchgeführt Eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 100 cm wird mit einem Gel von Sephadex G-200 bepackt. Als Standardsubstanz werden Katalyse (Molekulargewicht 240 000) und Ferritin (Molekulargewicht 540 000) verwendet. Ein 1/lOOM-Tris-HCl-Puffer (pH 8,7) wird als Elutionspuffer verwendet

(6) Lipoprotein-Lipase-Aktivität

Die Lipoprotein-Lipase-Aktivität wird nach der Methode von Saiki et al. (Agr. Biol. Chem. 32, 1459 [1968]) bestimmt Als Humanserum wird frisches lyophilisiertes Humanplasma (Miles Laboratories, Inc.) verwendet Fatgen (Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd.) wird als öl und Fett verwendet

(7) Aktivitätsinhibierung des Natriumascorbats
und der Monojodessigsäure

Eine wäßrige Lösung der Lipaseprobe (etwa 3 Einheiten/ml) wird 10 min lang mit den einzelnen Inhibierungsmitteln bei 37° C in Kontakt gebracht Die Lipase-Aktivität wird gemessen. Die Konzentration von Natriumascorbat beträgt 10~² Mol und die Konzentration von Monojodessigsäure beträgt 10~³ MoL

Die Bestimmung der charakteristischen Eigenschaften (1), (2) und (3) bezüglich der enzymologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase erfolgt auf die nachfolgend beschriebene Weise.

(1) Wirkungsweise

Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte

Lipase ist ein Enzym, das öle und Fette zu Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert, wobei große Mengen von Monoglyceriden als Zwischenprodukte während der

ίο Hydrolyse erhalten werden.

(2) Substratspezifizität

Die Lipase-Aktivitäten der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase gegenüber ölen und Fetten und verschiedenen Estern sind in Tabelle III, ausgedrückt als prozentuale Aktivität, bezogen auf die Aktivität gegenüber Olivenöl, angegeben.

Tabelle III

Substrat

relative Aktivität

Olivenöl	100
25 Methyl-n-butyrat	1
Methyl-n-ceproat	3
Methyl-n-caprylat	6
Methyl-n-caprat	6
Methyllaurat	6
30 Methylmyristat	7
Methylpalmitat	34
Methylstearat	33
Methyloleat	18
Tributyrin	60
35 Tricaproin	52
Tricaprylin	123
Tricaprin	100
Triolein	141
Monolein	86
40 Monolaurin	40
Dilaurin	75
Trilaurin	128
Span 85	29
Tween 85	20
45 Rizinusöl	85
Pufferten	53

Aus Tabelle III wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase nicht nur auf so Glycerinester von höheren Fettsäuren, wie natürliche öle und Fette, einwirkt, sondern auch auf wasserlösliche Ester, wie Tween 85.

Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase wirkt auch auf Cholesterinester von Fettsäuren und wandelt sie in Fettsäuren und Cholesterin um.

(3) Optimaler pH-Bereich für die Stabilität
[Bestimmung der Eigenschaft (I)]

Die erfindungsgemäße Lipase wird mit einer Konzentration von 2$ bis 5 E/ml aufgelöst und der optimale pH-Wert wird bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt, welche ergibt, daß die maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 9 ± 03 erhalten wird.

Die erfindungsgemäße Lipase wird in einer Konzentration von 50 bis 100 E/ml in Puffern von verschiedenen pH-Werten bei 5° C 24 st lang gehalten. Sodann wird der pH-Wert mit einem Glycinpuffer auf 8,6

eingestellt. Die restliche Lipase-Aktivität wird gemessen. Die Werte sind in F i g. 2 dargestellt. Es zeigt sich somit, daß die Lipase bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 10,5 im wesentlichen stabil ist. Ein Mcllvaine-Puffer (VioM-Zitronensäure, '/5M-Na₂HPO₄) wird für den pH-Bereich von 2,5 bis 8,0, ein '/sM-Trismaleatpuffer für den pH-Bereich von 5,5 bis 8,5, ein '/10M-Na₂CO₃-H₃BO₄-KCl-Puffer für den pH-Bereich von 8,0 bis 10,5 und ein '/5-Na₂HPO₄-NaOH-Puffer für den pH-Bereich von 11 bis 12 verwendet.

(4) Geeignete Aktivitätstemperatur
[Bestimmung der Eigenschaft (2)]

Der geeignete Aktivitätstemperaturbereich der erfindungsgemäßen Lipase ist in Fig.3 dargestellt. Der optimale Temperaturbereich beträgt etwa 40 bis etwa 48°C. Die Bestimmung erfolgt nach folgender Methode:

Das bei der Aktivitätsuntersuchungsmethode verwendete Reaktionssubstrat wird 10 min lang auf verschiedene Temperaturen vorerhitzt. 1 ml einer Enzymlösung (Konzentration 0,01 mg/ml) wird zugesetzt und es wird 10 min lang bei der Temperatur des Vorerhitzens umgesetzt. Die Aktivitäten bei den verschiedenen Temperaturen werden als prozentuale Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität der Lipase bei 45°C, ausgedrückt.

(5) Inaktivierung durch pH- und Temperaturbedingungen

Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 4 E/ml aufgelöst und die Lösung wird bei einer Temperatur von 70 bis 80° C gehalten. Veränderungen der Aktivität der Lipase werden periodisch durch die nachstehend beschriebene Analysenmethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt. Es wird ersichtlich, daß durch 30minütige Wärmebehandlung bei 8O⁰C die Lipase fast vollständig inaktiviert wird.

Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 25 bis 50 E/ml aufgelöst und mit einer gleichen Menge eines Mcllvaine-Puffers (pH 3,0) bzw. eines i/4-Na₂HPO₄-NaOH-Puffers (pH 12,0) vermischt Die erhaltenen Gemische werden bei 37° C gehalten und sodann werden zu vorbestimmten Zeiten Proben abgenommen. Die Probengemische werden jeweils mit einem lM-Glycin-Puffer (pH 8,7) auf das 5fache verdünnt und die Aktivität der Lipase wird gemessen. Bei einem pH-Wert von 3,0 gehen mehr als 95% der Lipase-Aktivität in 10 min verloren. Bei einem pH-Wert von 12,0 gehen mehr als 95% der Lipase-Aktivität in 120 min verloren.

(6) InhibieruQg

Die Lipase wird mit einer Konzentration von etwa 3 E/ml 10 min lang mit verschiedenen Inhibierungsreagentien bei 37° C kontaktiert. Sodann wird die Lipase-Aktivität gemessen. Wenn die Konzentration des Inhibierungsreagenses 10~³ Mol beträgt, dann wird festgestellt, daß die Lipase-Aktivität mehr als 50% durch Hg++, Fe+++, Zn++, Sn++, Cd++ und Cr+ + + inhibiert wird.

Die Inhibierung beträgt mehr als 50% mit 10~² Mol Natriumascorbat, etwa 100% mit IO-³ Mol Monojodessigsäure, etwa 10 bis etwa 20% mit 10~² Mol Kalhimferricyanid, Pyrophosphatsalzen, Natriumazid und Natriumäthylendiamintetraacetat, etwa 95% mit 10-² Mol Jod und etwa 70% mit 10~² Mol Äthoxyameisensäureanhydrid

Tabelle IV	Konzentration	0,4	des Gallensalzes	0,8
Gallensalze	0,2	229	0,6	226
	221	221	224	224
Taurocholat	218	221	232	229
Glycocholat	197	300	211	303
Cholat	289		305
Desoxycholat

(7) Aktivierung [Bestimmungsmethode der Eigenschaft (3)]

Bei der unten unter (8) beschriebenen Bestimmungsmethode für Lipase-Aktivität werden verschiedene Gallensalze in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lipase-Aktivität wird gemessen. Wie in Tabelle IV gezeigt wird, wird die erfindungsgemäße Lipase offensichtlich durch Gallensalze aktiviert.

Die in der obigen Tabelle gezeigten Aktivitäten sind prozentuale Aktivitäten, die auf die Lipase-Aktivität in Abwesenheit eines Gallensalzes bezogen sind

(8) Bestimmung der Aktivität (a) Zusammensetzung des Reaktionsgemisches

Enzymlösung 1,0 ml

Glycinpuffer (1 Mol, pH 8,7) 2,0 ml

Olivenölemulsion 2£ ml

destilliertes Wasser 0,5 ml

j5 Die Olivenölemuision wird in der Weise hergestellt, daß 20 g Olivenöl zu 180 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Gummi arabikum gegeben werden, daß das Gemisch bei 11 000 UpM 15 min lang homogenisiert wird, während es auf 5 bis 10° C abgekühlt wird, und daß der pH-Wert des homogenisierten Gemisches auf 8,7 eingestellt wird.

(b) Verfahrensweise

Das Reaktionsgemisch wird in einem 25-ml-Glasstöpselröhrchen eingebracht und genau 10 min lang bei 37° C umgesetzt Sodann wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 2N-Schwefelsäure abgebrochen und 15 ml eines Gemisches aus n-Heptan und Isopropanol im Verhältnis von 11:4 werden zugesetzt Das Gemisch wird 30 see lang heftig geschüttelt und mehr als 30 min stehengelassen. 5 ml der oberen Schicht werden gesammelt und unter Stickstoff gas mit einer 0,01 N-äthanoiischen Kaihimhydroxidiösung titriert, wobei Thymoiblau als Indikator verwendet wird Eine 2N-Schwefelsäurelösung wird zu einem Reaktionsgemisch mit der gleichen Zusammensetzung wie oben gegeben und hierauf wird die Enzymlösung zugefügt Das Gemisch wird in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, behandelt und das resultierende Produkt wird mit einer Kaliumhydroxidlösung titriert Der erhaltene Meßwert wird von dem oben erhaltenen Meßwert abgezogen. Die Menge der freigesetzten Fettsäure wird aus dem resultierenden Titrationswert anhand einer Eichlinie errechnet, die unter Verwendung einer bekannten Menge von Palmitinsäure aufgestellt worden ist

Eine Lipaseeinheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, die 1 μΜοΙ Fettsäure in 1 min bei den oben beschriebenen Versuchsbedingungen freisetzt.

28 19	13	(0C)	384	14
(9) Reinigungimethode	Chromo- 7,0 65 1,5	und der Aktivierung mit Gallensalzen. Die erfindungsgemäße Lipase hat auch die Fähigkeit,
Die erfindungsgernäße LJpase kann durch Aussalzen,	bacterium	Cholesterinester zu zersetzen (d.h. eine Cholesterin-
durch eine Celluloseionenaustauscherchromatographie	viscosum var.	Esterase-Aktivität). Es ist bislang noch nicht bekannt
und Gelfiltration gereinigt werden, wobei auch geeigne- 5	paralipolytica	gewesen, daß eine Lipase mit solcher Eigenschaft durch
te Kombinationen dieser Maßnahmen angewendet		einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes erzeugt
werden können. Eine Ausführungsform ist im Beispiel 5		wird.
dargestellt		In Tabelle V sind die Eigenschaften der erfindungsge
Wie bereits ausgeführt, sind die Eigenschaften der	Pseudomonas 9 bis 9,5 - 6 bis 10	mäßen Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften von
erfindungsgemäßen LJpase sehr ähnlich wie diejenigen io	stutzen (ATCC	bekannten mikrobiologisch hergestellten Lipasen, die
einer Pankreaslipase eines Tieres hinsichtlich des	19154)	mit Gallensalzen aktiviert werden können, zusammen
optimalen pH-Wertes (in Alkalinität) für die Aktivität	Phycomyces sp. 6 bis 7 40 2 -	gestellt
Tabelle V
Mikxo- Optimaler Optimale Aktivie- Choleste-		Molekular- Lipopro- Inhibierung Literatur
organismus pH-Wert Tempe- rungsfaktor rin-Este-		gewicht tein- durch referenzen
ratur durch rase		Lipase Reagentien
Gallensalze
	120000 nein - Agr. Biol.
	30000 Chem. 37, 999
	(1973);
	JA-PS 29 787/71
	und J. Biochem.
	81, 1639 (1977)
	JP-PS 10754/69
	- - - JP-PS 17559/75;
	Zusammen
	fassung der
Mucor 7,0 - 2 bis 5	26 500 ja - Niederschriften
javanicus	±500 des jährlichen
	Treffens der
	Agricultural
	Chemical So
	ciety of Japan
	im Jahre 1974;
	Zusammen
	fassungen der
Alcaligenes 18,5-9,5 70-75 2 nein	Niederschriften
sp. PL-266	des Treffens dei
Meito 119,5-10,5 70-80 2 nein	Western Divi
	sions of the
	Agricultural
Alcaligenes 8,5-9,5 40-48 2 ja	Chemical So
sp. PL-679	ciety of Japan
Meito	im Jahre 1977
(erfindungs	- - - Yakuzaigaku
gemäß	(»Pharma
verwendet)	ceutical
Science«) 27,
314 (1967);
Eisei Kagaku
(»Hygienic
Chemistry«), 13
257 (1967)
180000 ja keine JP-OS" 21387/77
± 10 000 Inhibierung
32 000- durch Ascorbin-
37 000 säure und Mono-
jodessigsäure
300000 ja Inhibierung
400 000 durch Ascorbin
säure und
Monojodessig-
säure

Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, ist Lipase, hergestellt von Chromobacterium viscosum, Phycomycessp. und Mucor javanicus, der erfindungsgemäßen Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze ähnlich, jedoch liegen die optimalen s pH-Werte für diese Lipasen im neutralen Bereich und unterscheiden sich somit von den entsprechenden Werten für die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte lipase. Die durch Pseudomonas stutzen hergestellte lipase unterscheidet sich von der erfindungsgemäßen Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze und ihre optimale pH-Kurve unterscheidet sich erheblich von derjenigen der erfindungsgemäßen Lipase (vgL F i g. 1).

Die erfindungsgemäße Lipase unterscheidet sich auch von der Lipase, die durch Alcaligenes sp. PL-266 Meito erzeugt wird, hinsichtlich der optimalen Temperatur für die Aktivität und dadurch, daß sie eine Cholesterin-Esterase-Aktivität besitzt Wie in Tabelle II gezeigt wird, liegen auch Unterschiede beispielsweise der Molekulargewichte und der Inhibierung durch Metallionen vor.

Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase kann für eine weite Vielzahl von Anwendungszwecken verwendet werden, beispielsweise als Arzneimittel und Diagnostika. Sie kann weiterhin zur Herstellung von Fettsäuren, Glycerin und Monoglyceriden, zur Verstärkung des Milcharomas, zur Verbesserung der Qualität vdn Brot und Keksen und dergleichen, zur Anwendung bei der Abwasserbehandlung und weiterhin auch der Ledergerbmittel, Haarspülmittel, Badezubereitungen, Waschzubereitungen für das Gesicht und für Nahrungsmittel verwendet werden.

Da die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte lipase einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich hat und da sie durch Gallensalze aktiviert wird, hat sie den Vorteil, daß wenn sie beispielsweise oral als Verdauungshilfsmittel verabreicht wird, durch die Gallensalze im Darmsaft aktiviert wird, und eine erhöhte Aktivität zeigt Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase zersetzt Lipoprotein in Nahrungsmitteln, da sie eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität besitzt Wenn die erfindungsgemäße Lipase als Verdauungshilfsmittel verwendet wird, kann sie oral in einer Dosis von beispielsweise 1000 bis 8000 E/Tag verabreicht werden. Bei Verwendung als Diagnostikum kann der Cholesterinspiegel des Bluts unter Verwendung von 0,1 bis 2,0 E Cholesterin-Esterase in einem Einzeltest bestimmt werden. Weiterhin kann durch Verwendung von 100 bis 1000 E Lipoprotein-Lipase in einem Einzeltest der Triglyceridspiegel des Bluts bestimmt werden.

Als die erfindungsgemäße Lipase Ratten mit einer Dosis von 2,5 bzw. 5,0 g/kg 1 Monat lang und einer Dosis von 2,5 g/kg 3 Monate lang durch natürliche Aufnahme verabreicht wurde, um die subakute Toxizität zu bestimmen, wurden keine Veränderungen des allgemeinen Verhaltens, der Fttces, des Urins, der Blutzusammensetzung, durch Autopsiebefunden und des Gewichts der Organe festgestellt. Auch bei der histologischen Untersuchung wurden keine signifikanten Veränderungen festgestellt

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

Schüttelkolben mit 500 ml wurden jeweils mit 50 ml eines flüssigen Kulturmediums gefüllt, das 3% Sojabohnenpulver, 1% entfettetes Sojabohnenpulver, 1% Maisquellwasser, 0,5% Dikaliumphosphat und 0,25% Natriumnitrat enthielt Es wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und das Kulturmedium wurde 15 min lang mit Dampf bei 120° C sterilisiert

Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in die Medien einokkuliert Es wurde 40 h lang unter Schütteln bei 30⁰C kultiviert Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen und es wurde festgestellt, daß sie 50 E/ml betrug. Ammoniumsulfat wurde zu einer Sättigung von 50% zu 100 ml der Kulturbrühe zugesetzt Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wodurch 1,5 g rohes Enzympulver mit einer Lipase-Aktivität von 2560 E/g erhalten wurden.

Beispiel 2

Es wurde wie im Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß 0,5% Sorbitoleylester zu dem im Beispiel 1 beschriebenen Kulturmedium gegeben wurden. Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe betrug 351 E/ml.

Ein Enzympulver in einer Menge von 1,4 g wurde wie im Beispiel aus der resultierenden Kulturbrühe gesammt. Die Lipase-Aktivität des Pulvers betrug 16 000 E/g.

Beispiel 3

Ein flüssiges Kulturmedium, enthaltend 3% Sojabohnenpulver, 0,5% entfettetes Sojabohnenpulver, 0,5% Maisquellwasser, 0,1% Weizenstärke, 0,2% Dikaliumphosphat, 0,5% Polyäthylenstearyläther, 1,0% Natriumnitrat und 0,075% Silicon, wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt 50 ml des Kulturmediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang bei 120° C dampf sterilisiert Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde inokkuliert Es wurde 40 h lang bei 30° C kultiviert Die Kulturbrühe wurde filtriert Das Filtrat hatte eine Lipase-Aktivität von 500 E/ml, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 3,7 E/ml und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 155 E/ml. Zu 500 ml Filtrat wurde kaltes Aceton bis zu einer Konzentration von 80% zugegeben. Der Niederschlag wurde gesammelt, mit kaltem Aceton gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 12,5 g eines rohen Enzympulvers erhalten wurden. Das Pulver hatte eine Lipase-Aktivität von 13 200 E/g, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 99 E/g und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 4100 E/g.

Beispiel 4

Zu 151 des im Beispiel 3 beschriebenen Kulturmediums wurden 0,4% Natriumeitrat und 0,028% Eisen(II)-sulfat gegeben und das Gemisch wurde in einen 30-1-Becherfermentator gegeben. Als Antischaummittel wurden 5 g Siliconöl zugesetzt und das Gemisch wurde dampfsterilisiert.

Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in das so hergestellte Kulturmedium einokkuliert Es wurde 38 h unter Belüften und Rühren bei 24° C kultiviert Die Kulturbrühe wurde filtriert, wodurch 12,01 eines Filtrats mit einer Lipase-Aktivität von 800 E/ml erhalten wurden. Die Absorption dieses Filtrats bei 280 nm betrug 100. Das Filtrat hatte eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6 E/ml und eine Lipoprotein-.Upase-Aktivität von 250 E ml.

Ammoniumsulfat wurde zu 2,4 1 dieses Filtrats bis zu einer Sättigung von 40% gegeben und das Gemisch wurde 24 h lang bei 5°C stehengelassen. Die überste-

hende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Niederschlag wurde durch Zentrifugiertrennung gesammelt Etwa 73% der Lipase-Aktivität wurden in dem Niederschlag wiedergewonnen, der durch die Zugabe von Ammoniumsulfat gebildet worden war.

Beispiel 5

Der im Beispiel 4 durch die Zugabe von Ammoniumsulfat erhaltene Niederschlag wurde in ein Cellophanrohr gegeben und 2 Tage lang in fließendem Wasser und ι ο sodann weiterhin 24 h bei 5° C gegen einen 0,01M-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 dialysiert Die Filtration des Dialysats lieferte 1,31 einer Enzymlösung mit einer Lipase-Aktivität von 1020 E/ml und einer Absorption bei 280 nm von 28,5.

Die Enzymlösung wurde auf eine Säule eines DEAE-Celluloseionenaustauschers aufgebracht, der genügend mit einem Ο,ΟΙΜ-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die adsorbierte Enzymlösung wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit einem Tris-Puffer (0,01 Mol, pH 9,0) eluiert, wobei allmählich die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer auf 0,4 Mol erhöht wurde. Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden eluiert, als die Konzentration von NaQ sich im Bereich von 0,05 bis 0,2 Mol befand. Ihre Aktivitäten wurden gemessen und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt Die gesammelten Fraktionen wurden konzentriert und durch Sephadex G-200 und Sepharose4B in dieser Reihenfolge gelfiltriert Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt

Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden erneut dialysiert und auf einer Säule von DEAE-Cellulose rechromatographiert Die aktiven Fraktionen wurden nach der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von Natriumchlorid eluiert Die Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden konzentriert und lyophilisiert, wodurch 293 g eines gereinigten Lipase- Pulvers erhalten wurden. Eine 0,l%ige wäßrige Lösung des gereinigten Enzympulvers hatte eine Absorption bei 280 nm von 0,43. Das Enzympulver hatte eine Lipase-Aktivität von 890 E/mg, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6,6 E/mg und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 275 E/mg. Die Lipase hatte uinen optimalen pH-Bereich von etwa 9 ±0,5 und eine optimale Temperatur von etwa 45° C Sie konnte mit 0,2% Natriumtaurocholat auf das 2fache ihrer ursprünglichen Aktivität potentiiert werden. Das Molekulargewicht betrug etwa 35XlO⁴. Die Aktivitätsinhibierung der Lipase durch Natriumascorbat betrug etwa 52% und durch Monojodessigsäure etwa 98%.

Beispiel 6

50 ml eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 3% Sojabohnenpulyer, 1% Fructose, 0,2% Kaliumphosphat, 1% Natriumnitrat; 0,6% Natriumeitrat, 0,03% FeSO₄ · 7 H₂0,0,5% Polyäthylenglycolstearylätherund 0,2% eines Antischaummittels, wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang bei 120⁰C dampf sterilisiert

Der Stamm Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in das sterilisierte Kulturmedium einokkuliert und es wurde 42 h lang unter Schütteln bei 25° C kultiviert Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert und die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Es wurde festgestellt, daß die Lipase-Aktivität 2000 E/ml, die Cholesterin-Esterase-Aktivität 15 E/ml und die Lipoprotein-Lipase-Aktivität 625 E/ml betrug. Zu 100 ml der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurden 400 ml kaltes Aceton gegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und mit Aceton entwässert sowie bei 25° C vakuumgetrocknet, wodurch 1,8 g eines Enzympulvers mit einer Lipase-Aktivität von 77 000 E/g, einer Cholesterin-Esterase-Aktivität von 585 E/g und einer Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 24 000 E/g erhalten wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Mikrobiologisch hergestellte Lipase mit folgenden Eigenschaften:

1) einem optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 ±0,5;

2) einer optimalen Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48° C;

3) einer Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiert wird;

4) einer Cholesterin-Esterase-Aktivität und

5) einem Molekulargewicht von etwa 30x 10⁴ bis etwa 40 χ 10⁴.