DE2819384C3 - Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
2. Verfahren zur Herstellung der mikrobiologisch hergestellten Lipase nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Alcaligenes sp. DSM 1239 in einem Nährkulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle,
eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11
und bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 4O0C
aerob kultiviert, und daß man die mikrobiologisch hergestellte Lipase aus der resultierenden Kulturbrühe
gewinnt
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das
weiterhin ein nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel enthält
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des nicht-ionogenen
oberflächenaktiven Mittels etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums,
ist.
Die Erfindung betrifft eine mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Ein Gegenstand der Erfindung ist eine mikrobiologisch hergestellte Lipase mit folgenden Eigenschaften:
1) einem optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 ±0,5;
2) einer optimalen Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48°C;
3) einer Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird;
4) einer Cholesterin-Esterase-Aktivität und
5) einem Molekulargewicht von etwa 30 χ 104 bis etwa
4OxIO4.
Die erfindungsgemäße Lipase hat Eigenschaften, die bislang noch nicht in der Literatur beschrieben worden
sind.
Verfahren zur Herstellung von Lipase unter Anwendung von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien,
sind seit langem bekannt Bei solchen Verfahren werden beispielsweise Mikroorganismen der Art
Pseudomonas, Chromobacterium, Achromobacterium, Staphylococcus, Brevibacterium und Corynebacterium
verwendet.
Es wurden bereits Untersuchungen durchgeführt, um eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die
Aktivität im alkalischen Bereich zu entwickeln, welche durch Gallensalze aktivierbar sein soll. Bei diesen
früheren Untersuchungen wurde der Stamm Alcaligenes Sp. PL-266 Meito Strain FERM-P Nr. 3187
(niedergelegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan)
entdeckt Es handelt sich hierbei um einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes, der aus der Erde isoliert
worden ist Dieser Stamm hat die Fähigkeit, eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die Aktivität im
alkalischen Bereich herzustellen, die durch Gallesalze aktiviert werden kann. Dieses Verfahren und die
ίο mikrobiologischen Eigenschaften sowie die enzymatischen
Eigenschaften der so hergestellten Lipase sind in der JP-OS 21 387/77 beschrieben.
In weiteren Untersuchungen wurden nun verschiedene Stämme der gleichen Art aus der Erde der
Umgebung von Tokio, Japan, isoliert Dabei wurde festgestellt, daß diese Mikroorganismen die Fähigkeit
haben, eine Lipase herzustellen, die einen optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich hat
und die durch Gallensalze aktiviert werden kann. Bei der neuen Lipase handelt es sich jedoch um eine Lipase
von einem unterschiedlichen Typ, die besser geeignet ist als die obenerwähnte bekannte Lipase. Auch die
Abtrennung der durch diesen neuen Stamm gebildeten Lipase ist gelungen. Dieser neue Lipasetyp hat
zusätzlich zu der Lipase-Aktivität eine Cholesterin-Esterase-Aktivität,
die die oben beschriebene Lipase nicht besitzt. Wegen dieser Aktivität ist sie auch als
Diagnostikum für verschiedene Zwecke, beispielsweise zur Bestimmung der Cholesterinspiegel, geeignet.
Die Lipasemenge, die durch den neu gefundenen Mikroorganismus erzeugt wird, ist beispielsweise so
hoch wie etwa 2000 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe. Diese Menge ist erheblich größer als die
Lipasemenge, die durch die Mikroorganismen gemäß der obengenannten Patentanmeldung erzeugt wird.
Diese beträgt nämlich nur etwa 320 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe.
Durch die Erfindung wird daher eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich zur
Verfügung gestellt. Die neue Lipase wird, wenn sie dem Menschen oder Tieren beispielsweise als Verdauungshilfsmitiel
oral verabreicht wird, durch die Galle in dem Darm aktiviert (alkalischer Darmsaft).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der obenerwähnten Lipase,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus mit Eigenschaften, die seine Identifizierung
als Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito gestatten, in einem Nährkulturmedium, welches eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11 und
bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 4O0C aerob
kultiviert, und daß man die mikrobiologisch hergestellte Lipase aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt.
Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase verwendete Stamm wurde von der Anmelderin als
Alcaligenes sp. PL-679 Meito bezeichnet. Er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter
der Hinterlegungsnummer DSM 1239 hinterlegt, und er
feo wird hierin als Alcaligenes sp. DSM 1239 bezeichnet.
Daneben wurde er noch beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology,
Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3783 und bei der American Type Culture Collection,
'"' USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31371
hinterlegt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Alcaligenes sp. DSM 1239 sind wie folgt:
A. Morphologische Eigenschaften
Stäbe, 0,5 bis 0,7 χ 1,0 bis 4,0 μπι, die einzeln und
gelegentlich in Ketten mit 2 bis 4 Z-jllen auf dem
Nähragarmedium oder in der Nährbrühe auftreten.
Nicht-pleomorph.
Sie sind mittels 1 bis 6 um das Mundfeld bewimperter Geiseln beweglich.
Keine Sporenbildung.
Gram-negativ. Üppiges Wachstum und rote KoIonien,
die auf Kristallviolettagar gebildet werden.
Nicht säureecht
B. Kultivierungseigenschaften
Nährmittelagarkolonien: kreisförmig, rauh, gefranst,
durchscheinend, gelblichbraun, in der Mitte braun; keine Bildung eines diffundierbaren Pigments.
Nährmittelagar-Schrägkultur: ausgebreitet oder stachelig,
durchscheinend, harzartig, orange bis gelblichbraun.
Nährbrühe: üppiges Wachstum, gelblichbraun, trübe mit Häutchen und Vorliegen eines Sediments.
Gelatine versuch: Filiform, keine Verflüssigung, üppiges Wachstum, gelblichbraun auf mittlerer Oberfläche.
Lackmusmilch: alkalisch. Keine Peptonisierung.
Kartoffelkultur: üppiges Wachstum, orange, leichtbraunwerdend.
C. Physiologische Eigenschaften
Bildung von Nitriten, aus Nitraten.
Keine Bildung von Gas in Nitratbrühe unter anaeroben Bedingungen.
Methylrot-Test negativ.
Voges-Proskauer-Test negativ.
Keine Bildung von Indol.
Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.
Keine Hydrolyse von Stärke.
Citrate werden als einzige Kohlenstoffquellen verwertet (Koser's Agar und Christensen's Agar).
Nitrate und Ammoniumsalze werden als einzige Stickstoffquellen verwertet.
Ein diffundierbares Pigment wird auf Nähragar, Nährgelatine oder Kartoffeldextroseagar nicht
gebildet. Ein diffundierbares blaßbraunes Pigment wird auf King-A-Agar und Czapek-Dox-Agar
gebildet. Ein diffundierbares blaßgelblichbraunes Pigment wird auf King-B-Agar gebildet.
15
20
25
30 Keine Bildung von Urease.
Oxidase positiv.
Catalase positiv.
Oxidase positiv.
Catalase positiv.
pH-Bereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5,5 und 11,0. Kein Wachstum unterhalb 5,0
oder oberhalb 12,0.
Temperaturbereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5 und 400C. Optimales Wachstum
zwischen 15 und 35° C.
Aerob.
Aerob.
OF-Test: Sowohl in offenen als auch in geschlossenen Röhrchen wird weder eine Säure noch ein Gas
erzeugt
Aus D-Fructose und Glycerin wird Säure (latent), jedoch kein Gas im Oxidations-Fermentations-Medium
von Hugh und Leifson in offenen Röhrchen gebildet Weder Säure noch Gas wird aus L-Arabinose,
D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose,
Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit,
Inosit oder Stärke in offenen und geschlossenen Röhrchen erzeugt
D. Andere Eigenschaften
Bildung von Lipase.
Keine Bildung von 3-Ketolactose.
Schwache Bildung von Ammoniak aus Arginin.
G + C-Gehalt von DNA: 66,7 Mol-%.
Das taxonomische Status des erfindungsgemäß verwendeten Stammes mit den oben beschriebenen
mikrobiologischen Eigenschaften wurde hinsichtlich der Angaben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
8. Auflage (1974) untersucht Es wurde bestätigt daß der Stamm zu der Art Alcaligenes gehört In
Bergey's Manual wird kein bekannter Mikroorganismus der Art Alcaligenes beschrieben, der die obigen
mikrobiologischen Eigenschaften hat Weiterhin unterscheidet sich der erfindungsgemäß verwendete Stamm
von dem Stamm Alcaligenes sp. PL-266 Meito, der in der obengenannten offengelegten Patentanmeldung
beschrieben wird.
In Tabelle I sind die Hauptunterschiede zwischen dem Stamm Alcaligenes DSM 1239, der für die Herstellung
der erfindungsgemäßen Lipase geeignet ist und dem Stamm PL-266 Meito gemäß der obengenannten
Patentanmeldung zusammengestellt
Eigenschaften
Stamm PL-266 Meito Stamm DSM 1239
(erfindungsgemäß verwendet)
(erfindungsgemäß verwendet)
Nähragarkolonie
Nähragar-Schrägkultur
Nährbrühe
Gelatine versuch
Lackmusmilch
Nitratreduktion
Schwefelwasserstoffbildung
OF-Test
ganz, grau-weiß oder grau-gelb
grau-weiß oder graugelb
nicht trübe, ohne Häutchen
kraterförmig, wird schichtförmig
Peptonisierung
negativ
positiv (schwach)
oxidierend
gefranst, gelblichbraun oder braun
orange oder gelblichbraun
trübe, mit Häutchen
keine Verflüssigung
keine Peptonisierung
positiv
positiv
nicht-oxidierend und
Fortsetzung | Stamm PL-266 Meito | Stamm DSM 1239 |
Eigenschaften | (erfindungsgemäß verwendet) | |
Zuckerassinvlierung | positiv | negativ |
L-Arabinose | positiv | negativ |
D-Xylose | positiv | negativ |
D-Glucose | positiv | negativ |
D-Mannose | positiv | negativ |
D-Galactose | positiv | negativ |
Inosit | positiv | negativ |
Maltose | positiv | negativ |
Saccharose | positiv | negativ |
Lactose | positiv | negativ |
Trehalose | positiv | negativ |
D-Sorbit | positiv | negativ |
Mannit | 74,2 MoL-% | 66,7 Mol.-% |
G+C-Gehalt von DNA | ||
Die bislang in der Literatur noch nicht beschriebene mikrobiologisch hergestellte Lipase mit den Eigenschaften (1) bis (5) kann wie folgt hergestellt werden:
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase wird der Mikroorganismus Alcaligenes sp. DSM 1239 aerob
in einem Nährkulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralien enthält, bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 400C, vorzugsweise etwa 10
bis etwa 400C, und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis
etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, kultiviert, und
die mikrobiologisch hergestellte Lipase wird aus der resultierenden Kulturbrühe gewonnen.
Die Kohlenstoffquelle, die Stickstoffquelle und die Mineralien können alle beliebigen Materialien sein, die
üblicherweise zum Züchten von Mikroorganismen verwendet werden.
Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellcn sind Glucose, Fructose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke,
Dextrin, Molassen, Glycerin, öle und Fette, Weizenkleie, Lactose und Saccharose. Beispiele für geeignete
Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Sojabohnenpulver, entfettetes Sojabohnenpulver, Baumwollsamenrückstände, Corzarückstände, Peptone, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Gluten, Maisquellflüssigkeit, Casaminosäure. Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Mineralien sind Phosphatsalze,
Magnesiumsalze, Eisensalze, Kaliumsalze, Natriumsalze
und Calciumsalze. Gewünschtenfalls können zu dem Kulturmedium verschiedene andere organische oder
anorganische Substanzen, die für das Wachstum von Mikroorganismen oder für die Enzymproduktion
geeignet sind, z. B. Siliconöle, Schaumverhinderungsmittel, Vitamine und phosphorhaltige Verbindungen,
zugesetzt werdea
Durch Einarbeitung eines nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels in das Nährkulturmedium gemäß
der Erfindung kann die Menge der mikrobiologisch hergestellten Lipase erheblich erhöht werden. Die
Ausbeute der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase kann auch dadurch erhöht werden,
daß man Salze, die dazu imstande sind, Eisenionen abzugeben, wie z. B. Eisenchlorid oder Eisensulfat,
zusammen mit Natriumsalzen von organischen Säuren, wie Natriumacetat oder Natriumeitrat, verwendet.
Die Menge des verwendeten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels beträgt etwa 0,01 bis etwa 2
Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums. Beispiele für geeignete nicht-ionogene oberflächenaktive Mittel sind
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt Es kann sowohl eine Tauch- als auch eine
Oberflächenkultivierungstechnik angewendet werden. Gewöhnlich ist jedoch eine Tauchkultur geeignet Für
den technischen Betrieb ist es vorteilhaft eine Tauchkultivierung unter Belüftung und unter Rühren
durchzuführen. Ein geeignetes Vorgehen ist z. B. die
Durchführung einer kleindimensionierten Vorkultivierung und die Inokkulierung der resultierenden Kultur-
so brühe in ein Kulturmedium für die Hauptkultivierung.
Die Kultivierungsbedingungen variieren etwas entsprechend beispielsweise dem verwendeten Stamm und
der Zusammensetzung des Kulturmediums. Es ist empfehlenswert, Bedingungen auszuwählen, die für die
Erzeugung der Lipase als Endprodukt am vorteilhaftesten sind. Die Kultivierungstemperatur beträgt im
allgemeinen etwa 5 bis 400C, vorzugsweise etwa 10 bis
40° C Temperaturen von 20 bis 300C werden besonders
• bevorzugt Die Kultivierungszeit variiert entsprechend
den Bedingungen, beträgt aber gewöhnlich etwa 1 bis
etwa 4 Tage. Die Kultivierung kann zu einem Zeitpunkt beendigt werden, wo die Menge der angesammelten
Lipase ein Maximum erreicht hat Der pH-Wert des Kulturmediums kann sich zum Zeitpunkt der Herstel
lung des Kulturmediums von schwach sauer bis zur
Alkalinität erstrecken. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH-Wert extra einzustellen. Der pH-Wert des
Kulturmediums beträgt im allgemeinen etwa 53 bis
etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, mehr bevorzugt etwa 7 bis etwa 10. Die Kultivierung kann
erforderlichenfalls unter Einstellung des pH-Werts auf die vorgenannten Bereiche durchgeführt werden.
Die Gewinnung der mikrobiologisch hergestellten Lipase gemäß der Erfindung aus der resultierenden
Kulturbrühe kann durch bekannte Verfahrensweisen geschehen, wie sie zur Trennung und Reinigung von
Lipase angewendet werden. Beispielsweise wird im Falle einer Oberflächenkultur die Kulturbrühe mit
Wasser oder einem anderen Extraktionsmittel extrahiert, um einen Extrakt zu bilden. Im Falle einer
Tauchkultur werden die Mikrobenzellen oder -feststoffe von der Kulturbrühe durch eine bekannte Filtration
oder Zentrifugation abgetrennt, um einen Extrakt oder ein Filtrat zu erhalten. Der Extrakt oder das Filtrat kann
entweder als solcher oder nach einer Konzentrierung verwendet werden. Durch Behandlung des Extrakts, des
Filtrats oder seines konzentrierten Produkts durch bekannte Techniken, wie z. B. eine Ausfällung, ein
Sprühtrocknen oder eine Lyophilisierung, kann die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase in
Form eines festen Produkts erhalten werden.
Geeignete Ausfällungsmittel für die Ausfällungsmethode sind z. B. lösliche Salze, wie Natriumchlorid,
Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, und hydrophile organische Lösungsmittel, wie Äthanol, Methanol und
Aceton. Geeignete Stabilisierungsmittel, dei beim Sprühtrocknen verwendet werden, sind z. B. Maltodextrin,
Lactose, Carboxymethylcellulose, Polyäthylenglycol, Magermilch, Kasein, Sorbit und Natriumchlorid.
Das erfindungsgemäße Lipaseprodukt mit der gewünschten Reinheit und Lipasepotenz kann durch eine
oder mehrere bekannte Reinigungstechniken gewonnen werden, beispielsweise durch Adsorptions- und EIu-
tionsmethoden unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, Calciumphosphatgel, Aluminiumoxid oder
Bentonit, durch Molekularsiebmethoden mit Sephadex oder Biogel, durch chromatographische Methoden mit
Cellulose oder Sephadex-Ionenaustauscher, durch Ausfällungsmethoden
unter Verwendung eines Proteinausfällungsmittels, wie Tannin und Calciumsalzen, durch
eine isoelektrische Ausfällungsmethode, durch eine Dialysemethode und eine elektrophoretische Methode.
Die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase hat folgende Eigenschaften:
(1) einen optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 ±0,5,
(2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48° C,
(3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird,
(4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und
(5) ein Molekulargewicht von etwa 3Ox 104 bis etwa
4OxIO4.
Diese Lipase ist bislang in der Literatur noch nicht beschrieben worden. Lipasen (Fraktionen I und II), die
in der JP-OS 21 387/77 beschrieben werden, kommen der erfindungsgemäßen Lipase am nächsten. Die
erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase kann von den Lipasen I und II in erster Linie hinsichtlich
der oben beschriebenen Eigenschaften (2), (4) und (5) unterschieden werden. Weiterhin zeigt sie auch
unterschiedliche Inhibierungseigenschaften für die Aktivität. In Tabelle II sind die Eigenschaften der
erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften der Lipasen I und
II gemäß der JP-OS 21 387/77 zusammengestellt.
Eigenschaften
Erfindungsgemäße Lipase
Lipase gemäß der JP-OS 21 387/77 Lipase I Lipase II
Lipase-Aktivität
Cholesterin-Esterase-Aktivität
Lipoprotein-Lipase-Aktivität
Optimaler pH-Wert für die Aktivität Optimale Temperatur fur die Aktivität Molekulargewicht
Cholesterin-Esterase-Aktivität
Lipoprotein-Lipase-Aktivität
Optimaler pH-Wert für die Aktivität Optimale Temperatur fur die Aktivität Molekulargewicht
Aktivieningsinhibierung durch Hg++,
Fe++, Zn++, Sn++, Cd++ oder Cr+++
(Konzentration, 10~} Mol)
Aktivitätsinhibierung durch
Natriinnascorbat (Konzentration,
10"2 Mol) -
Natriinnascorbat (Konzentration,
10"2 Mol) -
Aktivitätsinhibierung durch Monojodessigsäure (Konzentration, 10"3 Mol)
9 ±0,5
40 bis 48CC
34X104-37X104
Inhibierung
(mehr als 50%)
Inhibierung (mehr als 50%)
Inhibierung (mehr als 50%) 9 ±0,5
70 bis 75CC
18±1X1O4
keine Inhibierung
keine Inhibierung
10 ±0,5 70 bis 80cC 3,2 X 104-3,7 X10"
Inhibierung durch Cd+ "* (10 bis 20%), jedoch
nicht durch die anderen Metallionen keine Inhibierung
keine Inhibierung keine Inhibierung
Die enzymologischen Eigenschaften der erfindungsgemäBen
mikrobiologisch hergestellten Lipase werden nachstehend genauer beschrieben.
Herstellung der Proben
Die Mycelien und andere Feststoffe werden durch Filtration von der Kulturbrühe abgetrennt. Das Filtrat
wird auf etwa 5° C abgekühlt und Ammoniumsulfat wird unter Rühren zu dem Filtrat bis zu einer Sättigung von
40% gegeben. Das Gemisch wird 24 h lang bei etwa 5° C
stehengelassen. Das ausgefällte Enzym wird gesammelt und in fließendem Wasser bei etwa 18° C 2 Tage lang
unter Verwendung einer dialytischen CeUophanmembran dialysiert Das Dialysat wird sodann 24 h bei etwa
5° C gegen eine Tris-Pufferlösung (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) weiter dialysiert Die dialysierte Enzymlö-
sung wird mit etwa 5° C auf eine Säule von DEAE-Celluloseionenaustauscher aufgebracht, der genügend
mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die
Säule wird sodann mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) gewaschen und mit einem
Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) eluiert, wobei die Konzentration von Natriumchlorid in dem
Puffer allmählich auf 0,4 Mol erhöht wird. Die Aktivität des Abstroms wird gemessen und aktive Fraktionen
werden gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden sodann in eine dialytische Cellophanmembrane gebracht
und unter Verwendung von Polyäthylenglycolpulver konzentriert. Das Konzentrat wird in fließendem
Wasser von etwa 18° C 24 h lang in der gleichen Weise,
wie oben beschrieben, dialysiert. Sodann wird es weiter gegen einen Tris-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird
erneut chromatographiert und die resultierenden aktiven Fraktionen werden erneut, wie oben beschrieben,
konzentriert. Das Konzentrat wird sodann zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen. Die
erhaltene Enzymlösung wird gelfiltriert, indem sie durch eine Säule mit Sephadex G-200 geleitet wird, wobei der
gleiche Tris-Puffer wie oben verwendet wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die resultierenden
aktiven Fraktionen werden wie oben konzentriert und zentrifugiert. Die resultierende Enzymlösung wird
in der gleichen Weise wie oben gelfiltriert, wobei eine Säule mit Sepharose 4B verwendet wird. Auf diese
Weise wird eine gereinigte Probe erhalten.
Unter Verwendung der gereinigten Probe werden die Eigenschaften (1) bis (7) gemessen. Die Bestimmung
erfolgt nach folgenden Methoden.
(4) Cholesterin-Esterase-Aktivität
Die Messung der Cholesterin-Esterase-Aktivität erfolgt nach der Verfahrensweise, beschrieben von
Leschroue et al. in Z. KHn. Chem. Klim. Biochem., 12,403
(1974).
(5) Molekulargewicht
Die Messung und die Errechnung des Molekulargewichts werden von der von P. Andrews in Biochem. J. 91,
222 (1964) beschriebenen Methode durchgeführt Eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 100 cm wird mit
einem Gel von Sephadex G-200 bepackt. Als Standardsubstanz werden Katalyse (Molekulargewicht 240 000)
und Ferritin (Molekulargewicht 540 000) verwendet. Ein 1/lOOM-Tris-HCl-Puffer (pH 8,7) wird als Elutionspuffer
verwendet
(6) Lipoprotein-Lipase-Aktivität
Die Lipoprotein-Lipase-Aktivität wird nach der Methode von Saiki et al. (Agr. Biol. Chem. 32, 1459
[1968]) bestimmt Als Humanserum wird frisches lyophilisiertes Humanplasma (Miles Laboratories, Inc.)
verwendet Fatgen (Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd.) wird als öl und Fett verwendet
(7) Aktivitätsinhibierung des Natriumascorbats
und der Monojodessigsäure
und der Monojodessigsäure
Eine wäßrige Lösung der Lipaseprobe (etwa 3 Einheiten/ml) wird 10 min lang mit den einzelnen
Inhibierungsmitteln bei 37° C in Kontakt gebracht Die Lipase-Aktivität wird gemessen. Die Konzentration von
Natriumascorbat beträgt 10~2 Mol und die Konzentration von Monojodessigsäure beträgt 10~3 MoL
Die Bestimmung der charakteristischen Eigenschaften (1), (2) und (3) bezüglich der enzymologischen
Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase erfolgt auf die nachfolgend beschriebene Weise.
(1) Wirkungsweise
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte
Lipase ist ein Enzym, das öle und Fette zu Glycerin und
Fettsäuren hydrolysiert, wobei große Mengen von Monoglyceriden als Zwischenprodukte während der
ίο Hydrolyse erhalten werden.
(2) Substratspezifizität
Die Lipase-Aktivitäten der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase gegenüber ölen und
Fetten und verschiedenen Estern sind in Tabelle III, ausgedrückt als prozentuale Aktivität, bezogen auf die
Aktivität gegenüber Olivenöl, angegeben.
Substrat
relative Aktivität
Olivenöl | 100 |
25 Methyl-n-butyrat | 1 |
Methyl-n-ceproat | 3 |
Methyl-n-caprylat | 6 |
Methyl-n-caprat | 6 |
Methyllaurat | 6 |
30 Methylmyristat | 7 |
Methylpalmitat | 34 |
Methylstearat | 33 |
Methyloleat | 18 |
Tributyrin | 60 |
35 Tricaproin | 52 |
Tricaprylin | 123 |
Tricaprin | 100 |
Triolein | 141 |
Monolein | 86 |
40 Monolaurin | 40 |
Dilaurin | 75 |
Trilaurin | 128 |
Span 85 | 29 |
Tween 85 | 20 |
45 Rizinusöl | 85 |
Pufferten | 53 |
Aus Tabelle III wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase nicht nur auf
so Glycerinester von höheren Fettsäuren, wie natürliche öle und Fette, einwirkt, sondern auch auf wasserlösliche
Ester, wie Tween 85.
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase wirkt auch auf Cholesterinester von Fettsäuren
und wandelt sie in Fettsäuren und Cholesterin um.
(3) Optimaler pH-Bereich für die Stabilität
[Bestimmung der Eigenschaft (I)]
[Bestimmung der Eigenschaft (I)]
Die erfindungsgemäße Lipase wird mit einer Konzentration
von 2$ bis 5 E/ml aufgelöst und der optimale
pH-Wert wird bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt, welche ergibt, daß die
maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 9 ± 03
erhalten wird.
Die erfindungsgemäße Lipase wird in einer Konzentration von 50 bis 100 E/ml in Puffern von verschiedenen
pH-Werten bei 5° C 24 st lang gehalten. Sodann wird der pH-Wert mit einem Glycinpuffer auf 8,6
eingestellt. Die restliche Lipase-Aktivität wird gemessen.
Die Werte sind in F i g. 2 dargestellt. Es zeigt sich somit, daß die Lipase bei einem pH-Wert im Bereich
von etwa 6,5 bis etwa 10,5 im wesentlichen stabil ist. Ein Mcllvaine-Puffer (VioM-Zitronensäure, '/5M-Na2HPO4)
wird für den pH-Bereich von 2,5 bis 8,0, ein '/sM-Trismaleatpuffer für den pH-Bereich von 5,5 bis
8,5, ein '/10M-Na2CO3-H3BO4-KCl-Puffer für den
pH-Bereich von 8,0 bis 10,5 und ein '/5-Na2HPO4-NaOH-Puffer
für den pH-Bereich von 11 bis 12 verwendet.
(4) Geeignete Aktivitätstemperatur
[Bestimmung der Eigenschaft (2)]
[Bestimmung der Eigenschaft (2)]
Der geeignete Aktivitätstemperaturbereich der erfindungsgemäßen Lipase ist in Fig.3 dargestellt. Der
optimale Temperaturbereich beträgt etwa 40 bis etwa 48°C. Die Bestimmung erfolgt nach folgender Methode:
Das bei der Aktivitätsuntersuchungsmethode verwendete Reaktionssubstrat wird 10 min lang auf
verschiedene Temperaturen vorerhitzt. 1 ml einer Enzymlösung (Konzentration 0,01 mg/ml) wird zugesetzt
und es wird 10 min lang bei der Temperatur des Vorerhitzens umgesetzt. Die Aktivitäten bei den
verschiedenen Temperaturen werden als prozentuale Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität der Lipase bei
45°C, ausgedrückt.
(5) Inaktivierung durch pH- und Temperaturbedingungen
Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 4 E/ml aufgelöst und die Lösung wird bei einer
Temperatur von 70 bis 80° C gehalten. Veränderungen der Aktivität der Lipase werden periodisch durch die
nachstehend beschriebene Analysenmethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt. Es
wird ersichtlich, daß durch 30minütige Wärmebehandlung bei 8O0C die Lipase fast vollständig inaktiviert wird.
Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 25 bis 50 E/ml aufgelöst und mit einer gleichen
Menge eines Mcllvaine-Puffers (pH 3,0) bzw. eines i/4-Na2HPO4-NaOH-Puffers (pH 12,0) vermischt Die
erhaltenen Gemische werden bei 37° C gehalten und sodann werden zu vorbestimmten Zeiten Proben
abgenommen. Die Probengemische werden jeweils mit einem lM-Glycin-Puffer (pH 8,7) auf das 5fache
verdünnt und die Aktivität der Lipase wird gemessen. Bei einem pH-Wert von 3,0 gehen mehr als 95% der
Lipase-Aktivität in 10 min verloren. Bei einem pH-Wert von 12,0 gehen mehr als 95% der Lipase-Aktivität in
120 min verloren.
(6) InhibieruQg
Die Lipase wird mit einer Konzentration von etwa 3 E/ml 10 min lang mit verschiedenen Inhibierungsreagentien
bei 37° C kontaktiert. Sodann wird die Lipase-Aktivität gemessen. Wenn die Konzentration
des Inhibierungsreagenses 10~3 Mol beträgt, dann wird
festgestellt, daß die Lipase-Aktivität mehr als 50% durch Hg++, Fe+++, Zn++, Sn++, Cd++ und Cr+ + +
inhibiert wird.
Die Inhibierung beträgt mehr als 50% mit 10~2 Mol
Natriumascorbat, etwa 100% mit IO-3 Mol Monojodessigsäure,
etwa 10 bis etwa 20% mit 10~2 Mol Kalhimferricyanid, Pyrophosphatsalzen, Natriumazid
und Natriumäthylendiamintetraacetat, etwa 95% mit 10-2 Mol Jod und etwa 70% mit 10~2 Mol Äthoxyameisensäureanhydrid
Tabelle IV | Konzentration | 0,4 | des Gallensalzes | 0,8 |
Gallensalze | 0,2 | 229 | 0,6 | 226 |
221 | 221 | 224 | 224 | |
Taurocholat | 218 | 221 | 232 | 229 |
Glycocholat | 197 | 300 | 211 | 303 |
Cholat | 289 | 305 | ||
Desoxycholat | ||||
(7) Aktivierung [Bestimmungsmethode der Eigenschaft (3)]
Bei der unten unter (8) beschriebenen Bestimmungsmethode für Lipase-Aktivität werden verschiedene
Gallensalze in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lipase-Aktivität wird gemessen. Wie in Tabelle IV
gezeigt wird, wird die erfindungsgemäße Lipase offensichtlich durch Gallensalze aktiviert.
Die in der obigen Tabelle gezeigten Aktivitäten sind prozentuale Aktivitäten, die auf die Lipase-Aktivität in
Abwesenheit eines Gallensalzes bezogen sind
(8) Bestimmung der Aktivität (a) Zusammensetzung des Reaktionsgemisches
Enzymlösung 1,0 ml
Glycinpuffer (1 Mol, pH 8,7) 2,0 ml
Olivenölemulsion 2£ ml
destilliertes Wasser 0,5 ml
j5 Die Olivenölemuision wird in der Weise hergestellt,
daß 20 g Olivenöl zu 180 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Gummi arabikum gegeben werden, daß das
Gemisch bei 11 000 UpM 15 min lang homogenisiert wird, während es auf 5 bis 10° C abgekühlt wird, und daß
der pH-Wert des homogenisierten Gemisches auf 8,7 eingestellt wird.
(b) Verfahrensweise
Das Reaktionsgemisch wird in einem 25-ml-Glasstöpselröhrchen
eingebracht und genau 10 min lang bei 37° C umgesetzt Sodann wird die Reaktion durch
Zugabe von 1 ml 2N-Schwefelsäure abgebrochen und 15 ml eines Gemisches aus n-Heptan und Isopropanol
im Verhältnis von 11:4 werden zugesetzt Das Gemisch wird 30 see lang heftig geschüttelt und mehr als 30 min
stehengelassen. 5 ml der oberen Schicht werden gesammelt und unter Stickstoff gas mit einer 0,01 N-äthanoiischen
Kaihimhydroxidiösung titriert, wobei Thymoiblau
als Indikator verwendet wird Eine 2N-Schwefelsäurelösung wird zu einem Reaktionsgemisch mit der
gleichen Zusammensetzung wie oben gegeben und hierauf wird die Enzymlösung zugefügt Das Gemisch
wird in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, behandelt und das resultierende Produkt wird mit einer
Kaliumhydroxidlösung titriert Der erhaltene Meßwert wird von dem oben erhaltenen Meßwert abgezogen.
Die Menge der freigesetzten Fettsäure wird aus dem resultierenden Titrationswert anhand einer Eichlinie
errechnet, die unter Verwendung einer bekannten Menge von Palmitinsäure aufgestellt worden ist
Eine Lipaseeinheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, die 1 μΜοΙ Fettsäure in 1 min bei den oben
beschriebenen Versuchsbedingungen freisetzt.
28 19 | 13 | (0C) | 384 | 14 |
(9) Reinigungimethode | Chromo- 7,0 65 1,5 | und der Aktivierung mit Gallensalzen. Die erfindungsgemäße Lipase hat auch die Fähigkeit, |
||
Die erfindungsgernäße LJpase kann durch Aussalzen, | bacterium | Cholesterinester zu zersetzen (d.h. eine Cholesterin- | ||
durch eine Celluloseionenaustauscherchromatographie | viscosum var. | Esterase-Aktivität). Es ist bislang noch nicht bekannt | ||
und Gelfiltration gereinigt werden, wobei auch geeigne- 5 | paralipolytica | gewesen, daß eine Lipase mit solcher Eigenschaft durch | ||
te Kombinationen dieser Maßnahmen angewendet | einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes erzeugt | |||
werden können. Eine Ausführungsform ist im Beispiel 5 | wird. | |||
dargestellt | In Tabelle V sind die Eigenschaften der erfindungsge | |||
Wie bereits ausgeführt, sind die Eigenschaften der | Pseudomonas 9 bis 9,5 - 6 bis 10 | mäßen Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften von | ||
erfindungsgemäßen LJpase sehr ähnlich wie diejenigen io | stutzen (ATCC | bekannten mikrobiologisch hergestellten Lipasen, die | ||
einer Pankreaslipase eines Tieres hinsichtlich des | 19154) | mit Gallensalzen aktiviert werden können, zusammen | ||
optimalen pH-Wertes (in Alkalinität) für die Aktivität | Phycomyces sp. 6 bis 7 40 2 - | gestellt | ||
Tabelle V | ||||
Mikxo- Optimaler Optimale Aktivie- Choleste- | Molekular- Lipopro- Inhibierung Literatur | |||
organismus pH-Wert Tempe- rungsfaktor rin-Este- | gewicht tein- durch referenzen | |||
ratur durch rase | Lipase Reagentien | |||
Gallensalze | ||||
120000 nein - Agr. Biol. | ||||
30000 Chem. 37, 999 | ||||
(1973); | ||||
JA-PS 29 787/71 | ||||
und J. Biochem. | ||||
81, 1639 (1977) | ||||
JP-PS 10754/69 | ||||
- - - JP-PS 17559/75; | ||||
Zusammen | ||||
fassung der | ||||
Mucor 7,0 - 2 bis 5 | 26 500 ja - Niederschriften | |||
javanicus | ±500 des jährlichen | |||
Treffens der | ||||
Agricultural | ||||
Chemical So | ||||
ciety of Japan | ||||
im Jahre 1974; | ||||
Zusammen | ||||
fassungen der | ||||
Alcaligenes 18,5-9,5 70-75 2 nein | Niederschriften | |||
sp. PL-266 | des Treffens dei | |||
Meito 119,5-10,5 70-80 2 nein | Western Divi | |||
sions of the | ||||
Agricultural | ||||
Alcaligenes 8,5-9,5 40-48 2 ja | Chemical So | |||
sp. PL-679 | ciety of Japan | |||
Meito | im Jahre 1977 | |||
(erfindungs | - - - Yakuzaigaku | |||
gemäß | (»Pharma | |||
verwendet) | ceutical | |||
Science«) 27, | ||||
314 (1967); | ||||
Eisei Kagaku | ||||
(»Hygienic | ||||
Chemistry«), 13 | ||||
257 (1967) | ||||
180000 ja keine JP-OS" 21387/77 | ||||
± 10 000 Inhibierung | ||||
32 000- durch Ascorbin- | ||||
37 000 säure und Mono- | ||||
jodessigsäure | ||||
300000 ja Inhibierung | ||||
400 000 durch Ascorbin | ||||
säure und | ||||
Monojodessig- | ||||
säure | ||||
Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, ist Lipase, hergestellt von Chromobacterium viscosum, Phycomycessp. und Mucor javanicus, der erfindungsgemäßen
Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze ähnlich, jedoch liegen die optimalen s
pH-Werte für diese Lipasen im neutralen Bereich und unterscheiden sich somit von den entsprechenden
Werten für die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte lipase. Die durch Pseudomonas stutzen
hergestellte lipase unterscheidet sich von der erfindungsgemäßen Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze und ihre optimale pH-Kurve
unterscheidet sich erheblich von derjenigen der erfindungsgemäßen Lipase (vgL F i g. 1).
Die erfindungsgemäße Lipase unterscheidet sich auch von der Lipase, die durch Alcaligenes sp. PL-266 Meito
erzeugt wird, hinsichtlich der optimalen Temperatur für die Aktivität und dadurch, daß sie eine Cholesterin-Esterase-Aktivität besitzt Wie in Tabelle II gezeigt wird,
liegen auch Unterschiede beispielsweise der Molekulargewichte und der Inhibierung durch Metallionen vor.
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte
Lipase kann für eine weite Vielzahl von Anwendungszwecken verwendet werden, beispielsweise als Arzneimittel und Diagnostika. Sie kann weiterhin zur
Herstellung von Fettsäuren, Glycerin und Monoglyceriden, zur Verstärkung des Milcharomas, zur Verbesserung der Qualität vdn Brot und Keksen und dergleichen,
zur Anwendung bei der Abwasserbehandlung und weiterhin auch der Ledergerbmittel, Haarspülmittel,
Badezubereitungen, Waschzubereitungen für das Gesicht und für Nahrungsmittel verwendet werden.
Da die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte lipase einen optimalen pH-Wert im alkalischen
Bereich hat und da sie durch Gallensalze aktiviert wird, hat sie den Vorteil, daß wenn sie beispielsweise oral als
Verdauungshilfsmittel verabreicht wird, durch die Gallensalze im Darmsaft aktiviert wird, und eine
erhöhte Aktivität zeigt Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase zersetzt Lipoprotein in
Nahrungsmitteln, da sie eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität besitzt Wenn die erfindungsgemäße Lipase als
Verdauungshilfsmittel verwendet wird, kann sie oral in einer Dosis von beispielsweise 1000 bis 8000 E/Tag
verabreicht werden. Bei Verwendung als Diagnostikum kann der Cholesterinspiegel des Bluts unter Verwendung von 0,1 bis 2,0 E Cholesterin-Esterase in einem
Einzeltest bestimmt werden. Weiterhin kann durch Verwendung von 100 bis 1000 E Lipoprotein-Lipase in
einem Einzeltest der Triglyceridspiegel des Bluts bestimmt werden.
Als die erfindungsgemäße Lipase Ratten mit einer Dosis von 2,5 bzw. 5,0 g/kg 1 Monat lang und einer
Dosis von 2,5 g/kg 3 Monate lang durch natürliche Aufnahme verabreicht wurde, um die subakute Toxizität
zu bestimmen, wurden keine Veränderungen des allgemeinen Verhaltens, der Fttces, des Urins, der
Blutzusammensetzung, durch Autopsiebefunden und des Gewichts der Organe festgestellt. Auch bei der
histologischen Untersuchung wurden keine signifikanten Veränderungen festgestellt
Schüttelkolben mit 500 ml wurden jeweils mit 50 ml eines flüssigen Kulturmediums gefüllt, das 3% Sojabohnenpulver, 1% entfettetes Sojabohnenpulver, 1%
Maisquellwasser, 0,5% Dikaliumphosphat und 0,25%
Natriumnitrat enthielt Es wurde auf einen pH-Wert von
8,0 eingestellt und das Kulturmedium wurde 15 min lang mit Dampf bei 120° C sterilisiert
Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in die Medien einokkuliert Es wurde 40 h lang unter Schütteln bei
300C kultiviert Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert
Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen und es wurde festgestellt, daß sie
50 E/ml betrug. Ammoniumsulfat wurde zu einer Sättigung von 50% zu 100 ml der Kulturbrühe
zugesetzt Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wodurch 1,5 g rohes
Enzympulver mit einer Lipase-Aktivität von 2560 E/g erhalten wurden.
Es wurde wie im Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß 0,5% Sorbitoleylester zu dem im
Beispiel 1 beschriebenen Kulturmedium gegeben wurden. Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe betrug 351 E/ml.
Ein Enzympulver in einer Menge von 1,4 g wurde wie im Beispiel aus der resultierenden Kulturbrühe gesammt. Die Lipase-Aktivität des Pulvers betrug
16 000 E/g.
Ein flüssiges Kulturmedium, enthaltend 3% Sojabohnenpulver, 0,5% entfettetes Sojabohnenpulver, 0,5%
Maisquellwasser, 0,1% Weizenstärke, 0,2% Dikaliumphosphat, 0,5% Polyäthylenstearyläther, 1,0% Natriumnitrat und 0,075% Silicon, wurde auf einen pH-Wert von
9,5 eingestellt 50 ml des Kulturmediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang
bei 120° C dampf sterilisiert Alcaligenes sp. DSM 1239
wurde inokkuliert Es wurde 40 h lang bei 30° C kultiviert Die Kulturbrühe wurde filtriert Das Filtrat
hatte eine Lipase-Aktivität von 500 E/ml, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 3,7 E/ml und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 155 E/ml. Zu 500 ml Filtrat
wurde kaltes Aceton bis zu einer Konzentration von 80% zugegeben. Der Niederschlag wurde gesammelt,
mit kaltem Aceton gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 12,5 g eines
rohen Enzympulvers erhalten wurden. Das Pulver hatte eine Lipase-Aktivität von 13 200 E/g, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 99 E/g und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 4100 E/g.
Zu 151 des im Beispiel 3 beschriebenen Kulturmediums wurden 0,4% Natriumeitrat und 0,028% Eisen(II)-sulfat gegeben und das Gemisch wurde in einen
30-1-Becherfermentator gegeben. Als Antischaummittel wurden 5 g Siliconöl zugesetzt und das Gemisch wurde
dampfsterilisiert.
Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in das so hergestellte Kulturmedium einokkuliert Es wurde 38 h
unter Belüften und Rühren bei 24° C kultiviert Die Kulturbrühe wurde filtriert, wodurch 12,01 eines Filtrats
mit einer Lipase-Aktivität von 800 E/ml erhalten wurden. Die Absorption dieses Filtrats bei 280 nm
betrug 100. Das Filtrat hatte eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6 E/ml und eine Lipoprotein-.Upase-Aktivität von 250 E ml.
Ammoniumsulfat wurde zu 2,4 1 dieses Filtrats bis zu einer Sättigung von 40% gegeben und das Gemisch
wurde 24 h lang bei 5°C stehengelassen. Die überste-
hende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Niederschlag wurde durch Zentrifugiertrennung gesammelt
Etwa 73% der Lipase-Aktivität wurden in dem Niederschlag wiedergewonnen, der durch die Zugabe
von Ammoniumsulfat gebildet worden war.
Der im Beispiel 4 durch die Zugabe von Ammoniumsulfat erhaltene Niederschlag wurde in ein Cellophanrohr gegeben und 2 Tage lang in fließendem Wasser und ι ο
sodann weiterhin 24 h bei 5° C gegen einen 0,01M-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 dialysiert Die
Filtration des Dialysats lieferte 1,31 einer Enzymlösung
mit einer Lipase-Aktivität von 1020 E/ml und einer Absorption bei 280 nm von 28,5.
Die Enzymlösung wurde auf eine Säule eines DEAE-Celluloseionenaustauschers aufgebracht, der genügend mit einem Ο,ΟΙΜ-Tris-Puffer mit einem
pH-Wert von 9,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die adsorbierte Enzymlösung wurde mit dem
gleichen Puffer gewaschen und mit einem Tris-Puffer (0,01 Mol, pH 9,0) eluiert, wobei allmählich die
Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer auf 0,4 Mol erhöht wurde. Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden eluiert, als die Konzentration von NaQ sich
im Bereich von 0,05 bis 0,2 Mol befand. Ihre Aktivitäten wurden gemessen und die aktiven Fraktionen wurden
gesammelt Die gesammelten Fraktionen wurden konzentriert und durch Sephadex G-200 und Sepharose4B in dieser Reihenfolge gelfiltriert Die aktiven
Fraktionen wurden gesammelt
Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden erneut dialysiert und auf einer Säule von DEAE-Cellulose
rechromatographiert Die aktiven Fraktionen wurden
nach der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von Natriumchlorid eluiert Die Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden konzentriert und
lyophilisiert, wodurch 293 g eines gereinigten Lipase-
Pulvers erhalten wurden. Eine 0,l%ige wäßrige Lösung
des gereinigten Enzympulvers hatte eine Absorption bei 280 nm von 0,43. Das Enzympulver hatte eine
Lipase-Aktivität von 890 E/mg, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6,6 E/mg und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 275 E/mg. Die Lipase hatte uinen
optimalen pH-Bereich von etwa 9 ±0,5 und eine optimale Temperatur von etwa 45° C Sie konnte mit
0,2% Natriumtaurocholat auf das 2fache ihrer ursprünglichen Aktivität potentiiert werden. Das Molekulargewicht betrug etwa 35XlO4. Die Aktivitätsinhibierung
der Lipase durch Natriumascorbat betrug etwa 52% und durch Monojodessigsäure etwa 98%.
50 ml eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 3%
Sojabohnenpulyer, 1% Fructose, 0,2% Kaliumphosphat, 1% Natriumnitrat; 0,6% Natriumeitrat, 0,03%
FeSO4 · 7 H20,0,5% Polyäthylenglycolstearylätherund
0,2% eines Antischaummittels, wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang bei
1200C dampf sterilisiert
Der Stamm Alcaligenes sp. DSM 1239 wurde in das
sterilisierte Kulturmedium einokkuliert und es wurde 42 h lang unter Schütteln bei 25° C kultiviert Die
Kulturbrühe wurde zentrifugiert und die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Es
wurde festgestellt, daß die Lipase-Aktivität 2000 E/ml,
die Cholesterin-Esterase-Aktivität 15 E/ml und die Lipoprotein-Lipase-Aktivität 625 E/ml betrug. Zu
100 ml der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurden 400 ml kaltes Aceton gegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und mit Aceton
entwässert sowie bei 25° C vakuumgetrocknet, wodurch
1,8 g eines Enzympulvers mit einer Lipase-Aktivität von 77 000 E/g, einer Cholesterin-Esterase-Aktivität von
585 E/g und einer Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 24 000 E/g erhalten wurden.
Claims (5)
1. Mikrobiologisch hergestellte Lipase mit folgenden Eigenschaften:
1) einem optimalen pH-Wert für die Aktivität von
etwa 9 ±0,5;
2) einer optimalen Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 48° C;
3) einer Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiert wird;
4) einer Cholesterin-Esterase-Aktivität und
5) einem Molekulargewicht von etwa 30x 104 bis
etwa 40 χ 104.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2819384A DE2819384C3 (de) | 1978-05-03 | 1978-05-03 | Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2819384A DE2819384C3 (de) | 1978-05-03 | 1978-05-03 | Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2819384A1 DE2819384A1 (de) | 1979-11-08 |
DE2819384B2 DE2819384B2 (de) | 1980-06-26 |
DE2819384C3 true DE2819384C3 (de) | 1981-05-07 |
Family
ID=6038570
Family Applications (1)
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Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2819384C3 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5991898A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-26 | Toyo Jozo Co Ltd | リパ−ゼ活性測定用組成物 |
DE4009806C1 (en) * | 1990-03-27 | 1991-11-14 | Gruenbeck Wasseraufbereitung Gmbh, 8884 Hoechstaedt, De | Removing fat and oil in commercial kitchen - by reacting with lipollastic bacteria and pptn. with cation |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4629787B1 (de) * | 1968-07-02 | 1971-08-30 |
-
1978
- 1978-05-03 DE DE2819384A patent/DE2819384C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2819384A1 (de) | 1979-11-08 |
DE2819384B2 (de) | 1980-06-26 |
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GB2134116A (en) | Production of bilirubin oxidase |
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Date | Code | Title | Description |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |