Kanamycin A ist ein Antibiotikum, welches in Merck Index, 8th Edition, Seiten 597-598 beschrieben ist. Es hat die Formel
EMI1.1
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Abkömmlings des Kanamycins A, nämlich des 1-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycins A der nachfolgenden Formel
EMI1.2
Kanamycin A besitzt vier primäre Aminogruppen, welche an die 1-, 3-, 6'- und 3"-Stellung des Moleküls gebunden sind. Es hat sich erwiesen, dass die Aminogruppe in der 6' Stellung die am meisten reaktionsfähige und dass die Aminogruppe in 1-Stellung die zweitreaktionswillige ist, wenn die Substanz mit einem elektrophilen Agens behandelt wird. Die beiden Aminogruppen in 3- und 3"-Stellung sind dagegen weniger reaktionsfähig als diejenigen in 1- oder 6'-Stellung.
Indessen reagieren sie bei der Acylierung gleichwohl unter Bildung geringer Anteile unerwünschter Acylierungsprodukte.
Demgemäss setzte sich die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein befriedigenderes Herstellungsverfahren zu schaffen, als dies zuvor ausgearbeitet wurde und beschrieben worden ist im US-Patent Nr. 3 781 268, wobei dieses Verfahren in selektiverer Weise darauf gerichtet ist, die Aminogruppe in 1 -Stel- lung zu acylieren als die anderen Aminogruppen im Molekül.
Dieses Ziel wurde erreicht durch das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindung mit der Formel
EMI2.1
wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass Kanamycin A in Lösung bei einer Temperatur unter 50 C acyliert wird mit N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid im Molverhältnis 1 zu höchstens 1 zur Verbindung der Formel
EMI2.2
worauf die so erhaltene Verbindung II mit einem mindestens dreifach-molaren Anteil 4-Nitrobenzaldehyd, Benzaldehyd, 4-Methoxybenzaldehyd oder Pivaldehyd in einem Niederalkanol während mindestens 2 Stunden umgesetzt wird zu einer Verbindung der Formel
EMI3.1
worin Z
EMI3.2
bedeutet,
wonach die erhaltene Verbindung III mit mindestens einem molaren Anteil L-( )-y-Benzyloxycarbonylamino-a- hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 C umgesetzt, anschliessend das Lösungsmittel abgetrennt und der Rückstand in einem aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel bestehenden Gemisch hydriert wird zur Verbindung IV.
Die Acylierung in der ersten Stufe des Verfahrens wird vorzugsweise mit ungefähr einem Mol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid, vorzugsweise in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin oder einem N-(Nieder)-alkylpiperidin bzw.
Gemische dieser Solventien, jedoch besonders bevorzugt in Dimethylformamid bei einer bevorzugten Temperatur unterhalb von 25" C vorgenommen. Als Niederalkanol arbeitet man in der zweiten Stufe vorzugsweise in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol oder Gemischen dieser Solventien bei ungefähr Rückflusstemperatur und während einer Reaktionsdauer von 2 bis 5 Stunden.
In Stufe 3 des Verfahrens arbeitet man vorzugsweise in einem Verhältnis von etwa 1 bis 2 Mol des Esters pro Mol der Verbindung III und insbesondere in einem Molverhältnis von 1,0 bis 1,3 zu 1, verwendet als Lösungsmittel vorzugsweise Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Propylenglykol, Dimethyläther, Äthylenglykol, Dimethyläther oder Dioxan, jedoch besonders bevorzugt Dimethylformamid, vorzugsweise bei Zimmertemperatur, wobei im allgemeinen eine Reaktionsdauer von mindestens 5 Stunden erforderlich ist. Die anschliessende Hydrierung wird vorzugsweise mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, vorzugsweise Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel, jedoch insbesondere Palladium bzw.
Palladium auf Aktivkohle, vorgenommen. Dabei arbeitet man in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol, Dimethyläther, Propylenglykol-dimethyläther oder dergleichen, jedoch vorzugsweise in einem Gemisch von Wasser und Dioxan im Verhältnis 1: 1. Vorzugsweise unternimmt man diesen letzten Verfahrensschritt zur Herstellung der Verbindung der Formel IV in Gegenwart einer katalytisch wirkenden Menge von Eisessig.
Die Verbindung IV, l-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A, besitzt hervorragende antibakterielle Wirksamkeit, welche diejenige des Kanamycins A selbst zu übertreffen scheint. Illustrativ hierfür sind die beiden nachstehenden Tabellen, welche die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Kanamycin A und der Verbindung IVa (BB-K8) gegenüber einer Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien zeigen, erhalten in Versuchen nach der Agar Verdünnungsmethode von Stear (Tabelle I) und der Zweifach-Verdünnungsmethode (Tabelle II). Ein Agarmedium nach Mueller-Hinton wurde für die Untersuchungen gemäss Tabelle I verwendet und Infusions-Nährlösung nach Heart diente für die Versuche gemäss Tabelle II.
Tabelle I (MIC mg/ml) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8198) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4
1. Alk. faecalis A-9423 16 8 2. A A A-20648 > 125 > 125
3. Ent. cloacae A-0656 4 4
4. Ent. species A-20364 > 125 2
5. Ent. hafniae 1 A-20674 1 1
6. E. coli A-0636 2 1
7. E. coli A-20664 16 4
8. E. coli A-20665 > 125 1
9. E. coli A-20507 32 2 10. E. coli A-20520 > 125 4
Tabelle 1 (Fortsetzung) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8198) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4 11.E.coliA-20365 > 125 1 12.E.coliA-20684 2 2 13. E. coli A-20682 > 125 2 14. E. coli A-20683 > 125 8 15. E. coli A-20681 > 125 2 16. E. coli A-15119 4 4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 18. K. species A-20328 > 125 2 19. K. species A-20330 32 32 20. K. species A-20634 > 125 4 21. K. pneumoniae A-20680 > 125 4 22. K. pneumoniae A-0077 1 1 23.
Pr. mirabilis A-9900 2 2 24. Pr. morganii A-15153 2 2 25. Pr. vulgaris A-9555 2 1 26. Pr. rettgeri A-9636 0,25 0,25 27. Pr. mirabilis A-20645 4 4 28. Pr. mirabilis A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 30. Providencia alkalifaciens A-20676 1 1 31. Ps. aeruginosa A-20229 32 2 32. Ps. aeruginosa A-0943A 125 16 33. Ps. aeruginosa A-20653 > 125 32 34. Ps. species A-20601 125, 63 16 35. Ps. species A-20621 > 125 > 125 36. Ps. maltophilia A-20620 32 > 125 37. Sal. enteritidis A-0531 1 0,5 38. Sal. derby A-20087 > 125 1 39. Ser. Marcescens A-20019 2 4 40. Ser. marcescens A-9933 4 8 41. Ser. marcescens A-20460 > 125 4,2 42. Ser. marcescens A-20459 4 16 43. Shig. flexneri A-9684 4 4 44. Aeromonas sp. A-20670 2 2 45. Arizona sp. A-20671 2 1 46. Citrobacter sp. A-20673 4 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48.
Staph. aureus A-9606 1 1 49. Staph. aureus A-4749 0,5 1 50. Staph. aureus A-9537 2 1 51. Staph. aureus A-20610 > 125 2 52. Staph. aureus A-20240 > 125 8 53. Staph. aureus A-15197 1 2
Müller-Hinton-Medium + 4 % Schafsblut 54. Str. faecalis A-9854 63 63 55. Str. faecalis A-9575 125 > 125 56. Str. pyogenes A-20200 32, 16 32 57. Str. pyogenes A-9604 125 125 58. Str. pyogenes A-15040 125 125 59. Str. pyogenes A-20065 125 125 60. D. pneumoniae A-9585 63, 32 63 61. D. pneumoniae A-20159 125 > 125
Tabelle II (MIC mg/ml) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8196) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4
1. D. pneumoniae + 5 % Serum
A-0585 63 63
2. Str. pyrogenes +5% Serum
A-9604 125 125
3. Staph. aureus Smith A-9537 0,5 0,5
4. Staph. aureus A-9497 0,5 0,5
5. Staph. aureus A-20239 125 4
6. Staph. aureus A-20240 125 4
7. Enter.
cloacae A-0656 2 2
8. Enter. species A-20364 125 2
9. K. pneumoniae A-9867 2 4 10. E. coli K-12 ML1410 A-20361 2 4 11. E. coli K-12 ML1630 A-20363 125 2 12. E. coli K-12 A-9632 2 1 13. E. coli A-20664 32 8 14. E. coli A-20665 125 8 15. Pr. mirabilis A-9900 2 16 16. Pr. morganii A-15153 4 16 17. Pr. vulgaris A-9436 1 2 18. Ps. aeruginosa A-20227 4 1 19. Ps.species A-20499 63 4 20. Ps. aeruginosa A-20653 125 4 21. Ps. species A-20621 125 125 22. Ser. marcescens A-20019 2 4 23. Ser. marcescens A-20141 16 16
Die vorstehenden MIC-Daten zeigen, dass die Verbindung IV (BB-K8) dem Kanamycin A in der Wirksamkeit überlegen ist, dies insbesondere gegenüber Organismen, die resistent sind gegen Kanamycin A.
Die MIC-Daten stimmen ferner gut überein mit den Ergebnissen von in vivo-Verfahren für alle drei Organismen, welche mit Kanamycin A und der Verbindung IV getestet werden. Die Verbindung IV und Kanamycin A erwiesen sich gleichfalls wirksam gegenüber der Infektion von Mäusen, verursacht durch Kanamycin A-sensitive Stämme von E. coli A-15119 und Staph. aureus A-9537. Obgleich die CHs0-Werte (Heilungsdosis bei 50% tödlich infizierter Mäuse) gegenüber Staph. aureus A-9537 zeigen, dass die Verbindung IV geringfügig weniger wirksam ist als Kanamycin A, ist dieser geringfügige Unterschied vermutlich nicht signifikant, da die Dosismengen weit auseinander lagen (5fache Verdünnung).
Gegenüber einem kanamycinresistenten Stamm von E. coli A-20520 erwies sich Kanamycin A erwartungsgemäss nicht als sehr wirksam in vivo, wogegen die Verbindung IV eine ausgesprochene Schutzwirkung ausübte. Die Verbindung IVa war ungefähr zehnmal wirksamer gegenüber diesem Stamm von E. coli, wenn sie in 4facher Verabfolgung gegeben wurde anstelle einer zweifachen Verabfolgung.
Tabelle III
Vergleich der In Vivo- und In Vitro-Wirksamkeit von Verbindung IV und Kanamycin A Verbindung Versuch Staphylococcus aureus Escherichia coli Escberichia coli
Nr. A-9537 A-15119 A-20520
MIC" CDsob MIC CD50 MIC CDso VerbindungIV 1 1 2,0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 c - - 5x4 Kanamycin A 1 2 0,5 x 2 4 4 > < x 2 125 200 x 2
2 - - - - - 200 x 4 MIC = minimale inhibitorische Konzentration (vg/ml). Versuchsdurchführung gemäss Chisholm et al.
(Antimicrob. Agents and Chemotherapy - 1969, p. 244, 1970) unter Verwendung von Müller-Hinten
Agar als Testmedium.
CDs0 = Dosis für 50% Heilung (mg/kg x Anzahl der Gaben). Mäuse wurden subcutan 1 und 4 Stunden nach dem
Infekt behandelt, falls zweifache Verabfolgung erfolgte und 0, 2, 4 und 6 Stunden nach dem
Infekt, falls vierfache Verabfolgung erfolgte. Andere Aspekte dieses Testes wurden ausgeführt wie beschrieben von Price et al. (Journal of Antibiotics 22:1, 1969).
= ¯ = nicht geprüft.
Die Verbindung IV ist ein wertvolles antibakterielles Agens, ein Zusatzmittel für Viehfutter und ein therapeutisches Mittel für Federvieh und Säugetiere sowie für den Menschen und erweist sich als insbesondere wertvoll bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, welche durch grampositive und gramnegative Bakterien verursacht sind.
Oral verabreicht, ist die Verbindung IV ein wirksames Mittel für die präoperative Sterilisation der Eingeweide. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora sprechen auf die Droge an und werden im Verdauungstrakt reduziert. Begleitet von einer geeigneten mechanischen Reinigung, ist die Droge nützlich zur Vorbereitung der Dickdarmchirurgie.
Die Verbindung IV erweist sich wirksam in der Behandlung bakterieller Infektionen des Menschen bei parenteraler Verabfolgung im Dosierungsbereich von 250 bis 3000 mg pro Tag in unterteilten Dosen 3- bis 4mal pro Tag. In der Regel erweist sich die Substanz wirksam, wenn sie verabfolgt wird in einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Herstellungsverfahrens der Verbindung IV umfasst die nachfolgenden Verfahrensschritte:
A. Acylierung eines Mols Kanamycin A mit ungefähr einem Mol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Wasser, Aceton, Pyridin oder einem N-(Nieder)alkylpiperidin bzw. von Gemischen dieser Solventien als Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 250 C. Dabei entsteht die Verbindung II.
B. Behandlung eines Mols der Verbindung II mit 3 bis 6 Molen 4-Nitrobenzaldehyd, Benzaldehyd, 4-Methoxybenzaldehyd oder Pivalaldehyd, in einem Niederalkanol, wie Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek. Butanol, tert.-Butanol oder Gemischen dieser Solventien, bei einer Temperatur im Bereich von 50 C bis zur Rückflusstemperatur des verwendeten Lösungsmittels während einer Dauer von 2 bis 10 Stunden. Dabei entsteht die Verbindung III, worin Z ein Rest der Formeln
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C.
Behandlung eines Mols der Verbindung III mit 1 bis 1,3 Mol L-(- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutter- säure-N-hydroxysuccinimidester in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Propylenglykol-dimethyläther, Äthylenglykol-dimethyläther oder Dioxan, bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 35 C.
Hernach wird das Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie Palladium, Platin, Rhodium, Raneynickel, Ruthenium oder Nickel, hydriert, wobei man in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol, Dimethyläther oder Propylenglykol-dimethyläther, arbeitet und in Gegenwart einer katalytisch wirksamen Menge Eisessig reagieren lässt, wobei die Verbindung IV entsteht.
Bei einer weiteren bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens nimmt man die Umsetzung des Kanamycins A mit N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in molarem Verhältnis in Dimethylformamid bei einer Temperatur im Bereich von 200 C und +10 C vor. Die erhaltene Verbindung II behandelt man im Verhältnis von 1:3,5 bis 4,5 Molen mit Paranitrobenzaldehyd oder Benzaldehyd in absolutem Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol bei ungefähr Rückflusstemperatur während 2 bis 4 Stunden, wobei die Verbindung III entsteht, worin Z einen Rest der Formeln
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bedeutet.
Nachfolgend schliesst sich die Umsetzung der Verbindung III in einem Verhältnis von einem Mol zu 1,1 bis 1,3 Mol L-(- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutter- säure-N-hydroxysuccinimidester an, wobei man in Dimethylformamid als Lösungsmittel bei ungefähr Zimmertemperatur während mindestens 5 Stunden reagieren lässt. Hernach erfolgt die Abtrennung des Lösungsmittels im Vakuum und die Hydrierung des Rückstandes in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in einem Gemisch von Dioxan und Wasser im Verhältnis 1:1 in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig.
Die am meisten bevorzugte Durchführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst die folgenden Verfahrensschritte:
A. Acylierung eines Mols Kanamycin A mit einem Mol N (Benzyloxycarbonyl)-succinimid in Dimethylformamid bei einer Temperatur im Bereich von -20 bis +10 C.
B. Behandlung eines Mols der dabei erhaltenen Verbindung II mit ungefähr 4 Molen p-Nitrobenzaldehyd in absolutem Äthanol bei Rückflusstemperatur während zwei bis vier Stunden, wobei eine Verbindung III entsteht, worin Z ist, und
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C. Behandlung eines Mols der Verbindung III mit ungefähr 1,2 Mol L- (- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxy- buttersäure-N-hydroxysuccinimidester in Dimethylforrnamid bei ungefähr Zimmertemperatur während mindestens 5 Stunden, Abtreiben des Lösungsmittels im Vakuum und Hydrierung des Rückstandes in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in einem Gemisch Dioxan und Wasser im Verhältnis 1:1 in Gegenwart einer katalytisch wirkenden Menge Eisessig. Dabei entsteht die Verbindung IV.
In der vorstehenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck Niederalkyl einen Alkylrest, geradlinig oder verzweigt, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Niederalkanol ist ein gesättigter Alkohol mit gerader oder verzweigter Kette und mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Beispiel 1
Herstellung von L-(- )-v-Benzyloxycarbonylamino-o:- hydroxybuttersäure (VI)
7,4 g = 0,062 Mol L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurden hinzugefügt zu einer Lösung von 5,2 g = 0,13 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise bei 0 bis 5" C im Verlauf von einer halben Stunde 11,7 g = 0,068 Mol Carbobenzoxychlorid hinzugefügt, worauf eine weitere Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemenge wurde gewaschen mit 50 ml Äther, sein pH-Wert auf 2 eingestellt mit verdünnter Salzsäure, wonach viermal mit je 80 ml Äther extrahiert wurde. Die Ätherextrakte wurden vereinigt, gewaschen mit einem geringen Anteil gesättigter Kochsalzlösung, getrocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert.
Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der erhaltene Rückstand auskristallisiert aus Benzol. Dabei wurden 11,6 g (74%) farbloser Plättchen erhalten. Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5" C. [a] =4,5" (c= 2, CH3OH). Die IR-Analyse (KBr) zeigte: vCO = 1740, 1690 cm-l. Die NMR-Analyse (Aceton-d6) Ï (in ppm aus TMS) ergab: 2,0 (2 H, m), 3,29 (2 H, d-d, J = 6,7 und 12 Hz), 4,16 (1 H, d-d, J=4,5 und 8 Hz), 4,99 (2 H, s), 6,2 (2 H, breit), 7,21 (5 H, s).
Analyse für C12H15NO5: berechnet: C 56,91 H 5,97 N 5,53 gefunden: C 56,66 H 5,97 N 5,47
Beispiel 2
N-Hydroxysuccinimidester von L-(- )-y-Benzyloxy- carbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VII)
Eine Lösung von 10,6 g= 0,042 Mol der Substanz VI und 4,8 g= 0,042 Mol N-Hydroxysuccinimid1) in 200 ml Äthylacetat wurde abgekühlt auf 0 C, wonach 8,6 g 0,042 Mol Di1) G. W. Anderson et al., Journal of American Chemical Society, 86, 1839 (1964).
cyclohexylcarbodiimid hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Hernach wurde der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat auf ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Dabei entstanden farblose Kristalle der Substanz VII.
Sie wurden abfiltriert und ergaben 6,4 g; Schmelzpunkt 121 bis 122,5" C. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand gewaschen mit 20 ml Benzol-n-hexan, wobei eine weitere Menge der Substanz VII entstand. Die totale Ausbeute betrug 13,4 g (92%). [a] = 1,5 (c= 2, CHCl3). IR (KBr)vco=1810, 1755, 1740, 1680 cm-1.
NMR (Aceton-d6) (3 (in ppm aus TMS) 2,0 (2 H, m), 2,83 (4 H, s), 3,37 (2 H, d-d, J= 6,5 und 12,5 Hz), 4,56 (1 H, m), 4,99 (2 H, s), 6,3 (2 H, breit), 7,23 (5 H, s).
Analyse für C16H18N207: berechnet: C 54,85 H 5,18 N 8,00 gefunden: C 54,79 H 5,21 N 8,14 C 54,70 H 5,20 N 8,12
Beispiel 3
Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid
23 g= 0,2 Mol N-Hydroxysuccinimid wurden gelöst in einer Lösung von 9 g= 0,22 Mol Natriumhydroxid in 200 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise 34 g= 0,2 Mol Carbobenzoxychlorid unter Wasserkühlung hinzugefügt, wonach das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt wurde zwecks Ausscheidung des Carbobenzoxyderivates, welches nachfolgend abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet wurde. Ausbeute 41,1 g (82%). Umkristallisieren aus Benzol-n-hexan (10:1) ergab farblose Prismen mit dem Schmelzpunkt 78 bis 79" C.
Beispiel 4
Herstellung von 6'-Carbobenzoxykanamycin A
Eine Lösung von 42,5 g= 90 mMol Kanamycin A in Form der freien Base in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid wurde auf unter 0 C abgekühlt und kräftig gerührt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von ungefähr zwei Stunden eine Lösung von 22,4 g= 90 mMol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in 500 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei -10 bis 0 C über Nacht gerührt und hernach weiter gerührt bei Zimmertemperatur während eines Tages. Das Reaktionsgemenge wurde unter vermindertem Druck und unterhalb 50 C eingedampft.
Der ölige Rückstand wurde aufgelöst in einem Gemisch von 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, wonach das Gemenge filtriert wurde zwecks Entfernung unlöslicher Anteile und anschliessend in zwei Schichten trennengelassen wurde. Die Butanolschicht und die wässrigen Schichten wurden behandelt mit butanolgesättigtem Wasser (2 x 500 ml) und mit wassergesättigtem Butanol (2 x 500 ml) unter Verwendung einer Technik ähnlich derjenigen der Gegenstromverteilung. Die drei wässrigen Schichten wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Sie hinterliessen einen öligen Rückstand, von welchem ein Teil beim Stehen bei Zimmertemperatur kristallisierte. Zu diesem Rückstand, zusammen mit den Kristallen, wurden ungefähr 100 ml Methanol hinzugefügt, welcher das Öl auflöste und von den Kristallen abtrennte.
Nach Zugabe von ungefähr 300 ml Äthanol wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nach stehengelassen und ergab eine kristalline Masse, welche abfiltriert wurde. Sie wog 44 g. Das Produkt enthielt einen geringen Anteil Kanamycin A, nachgewiesen vermittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin Essigsäure-Wasser (15 :10:3 :12) als Lösungsmittelsystem sowie von Ninhydrin als Sprühreagens.
Das Rohprodukt wurde aufgelöst in 300 ml Wasser und chromatographiert an einer Säule (300 mm Durchmesser) von CG-50 Ionenaustauschharz (NH4+-Typ, 500 ml). Die Säule wurde perkoliert mit 0,1n Ammoniumhydroxid-Lösung und das Eluat gesammelt in Fraktionen von je 10 ml. Das erwünschte Produkt war enthalten in den Fraktionen 10 bis 100, wogegen Kanamycin A in den langsamer laufenden Fraktionen und das oder die Isomeren des Produktes in den schneller laufenden Fraktionen zugegen zu sein schien. Die Fraktionen 10 bis 110 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Erhalten wurden daraus 24,6 g (45 Wo) farbloses 6-Carbobenzoxykanamycin A (II) (6'-Cbz Kanamycin A), welches bei 204 C zu schmelzen und sich zu verfärben begann und sich bei 212 C unter Gasentwicklung zersetzte. [a]D =f106" (c = 2, H2O).
Dünnschichtchromatographie auf Silicagel F 254 , Ninhydrin Lösungsmittelsystem Rf-Wert
6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A n-PrOH-Pyridin-AcOH-H2O (15:10:3:12) 0,42 0,33 0,15 0,04 (Hauptanteil) (Nebenanteil) Aceton-AcOH-H2O (20:6:74) 0,24 0,14 CHCl3-MeOH-CNH4OH-H2O (1:4:2:1) 0,76 0,50 AcOMe-n-PrOH-C-NH4OH (45:105:60) 0,22: 0,04 * nachgewiesen mit Anthron-Schwefelsäure.
Das Endprodukt enthielt gemäss der dünnschichtchromatographischen Prüfung mit einem der Lösungsmittelsysteme zwei Komponenten in geringeren Anteilen. Es wurde indessen ohne weitere Reinigung für die Herstellung von BB-K8 (I) benutzt.
Beispiel 5
Herstellung von L-(- )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B bzw. aus Gemischen davon
5,0 g Ambutyrosin A (US-Patent Nr. 3 541 078, veröffentlicht 17. November 1970) wurde am Rückfluss eine Stunde lang mit 160 ml 0,5n Natriumhydroxid gekocht. Das Hydrolysat wurde neutralisiert mit 6n HCl und chromatographiert an einer Säule von CG-50 (NH4+-Typ). Die erwünschte L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurde isoliert durch Entwickeln der Kolonne mit Wasser und Abtrennung des Wassers vermittels Gefriertrocknung. Die L-(-)-y-Amino-ahydroxybuttersäure ist ein kristallines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5 C (Kolonne 2, Zeilen 31 bis 38, US-Patent Nr. 3 541 078).
Beispiel 6
Herstellung von L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus DL-a-Hydroxy-i-phthalimidobuttersäure
A. Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-y- phthalimidobutyrat
Zu einer Lösung von 25 g = 0,1 Mol 2-Hydroxy-y-phthal imidobuttersäure1) in 200 ml Äthanol wurde eine Lösung von 29 g=0,1 Mol Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol hinzugefügt. Die Lösung wurde kräftig geschüttelt während einer Minute und dann 5 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen, während welcher Zeit keine Nadeln auskristallisierten. Die Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 50 ml Äthanol und an Luft getrocknet. Erhalten wurden 30,1 g (56 %) eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes.
Schmelzpunkt 93 bis 94" C. [a]D24 = + 150 (c. 2,5, MeOH).
Umkristallisieren aus 300 ml Äthanol ergab 23,2 g (43 Wo des reinen Produktes). Schmelzpunkt 94 bis 95 " C [a]D24 = + 10,8 (c. 2,5, MeOH). Weitere Umkristallisationen änderten den Schmelzpunkt und die spezifische Drehung nicht.
Analyse für C32H42N2O5 H2O: berechnet: C 69,54 H 8,02 N 5,07 gefunden: C 69,58 H 8,08 N 5,07 y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.
B. L-(- )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure
Zu einer Lösung von 1,5 g= 0,014 Mol Natriumcarbonat in 40 ml Wasser wurden 5,3 g= 0,01 Mol Dehydroabietylam monium-l-a-hydroxy-y-phthalimidob utyrat und 60 ml Äther hinzugefügt. Das Gemisch wurde kräftig geschüttelt, bis sich alle feste Substanz gelöst hatte. Die Ätherschicht wurde abgetrennt. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äther gewaschen und eingedampft auf 15 ml unter vermindertem Druck. Zu diesem Konzentrat wurden 10 ml konzentrierte Salzsäure hinzugefügt und das Gemenge am Rückfluss 10 Stunden lang gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die abgeschiedene Phthalsäure abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und die Lösung zur Trockne eingedampft.
Diese Operation wurde zweimal wiederholt, um überschüssige Salzsäure abzutrennen. Der zurückgebliebene Sirup wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und die Lösung filtriert zur Entfernung einer geringen Menge unlöslicher Phthalsäure. Das Filtrat wurde absorbiert an einer Säule von IR-120 (H+, 1 x 35 cm).
Die Säule wurde gewaschen mit 300 ml Wasser und eluiert mit 1n Ammoniumhydroxidlösung. Das Eluat wurde unterteilt und gesammelt in Fraktionen von je 15 ml. Die Ninhydrinpositiven Fraktionen 10 bis 15 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Zurück blieb ein Sirup, welcher allmählich kristallisierte. Die Kristalle wurden zerrieben mit Methanol, filtriert und getrocknet in einem Vakuumexsikkator und ergaben 0,78 g (66 9wo) L-(-)-y-Amino-a-hy- droxybuttersäure. Schmelzpunkt 206 bis 207 C. [a]D24 = -29" (c. 2,5, H20). Das IR-Spektrum erwies sich identisch mit denjenigen einer authentischen Probe, die erhalten worden war aus Ambutyrosin.
Beispiel 7
Herstellung von 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-p nitrobenzalkanamycin A (III)
9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24 C, worauf 8,7945 g = 58,2 mMol p-Nitrobenzaldehyd hinzugefügt wurden.
Das Gemenge wurde am Rückfluss erhitzt. Dabei veränderte sich das Gemisch zu einer klaren gelben Lösung, jedoch begann bei Rückflusstemperatur sich rasch eine weisse feste Substanz zu bilden. Das Gemisch wurde am Rückfluss drei Stunden lang siedengelassen, hernach abgekühlt und die ausgefallene Substanz abfiltriert. Sie wurde gewaschen mit ein wenig absolutem Äthanol. Die Ausbeute betrug 14,0 g (94,5 %) einer weissen kristallinen festen Substanz. Schmelzpunkt 233 bis 234 C (unkorrigiert). Es handelt sich um das im Titel genannte Produkt III.
Analyse für C47H51N7O19: berechnet: C 55,46 H 5,05 N 9,63 gefunden: C 55,39 H 5,08 N 9,60
Beispiel 8
Herstellung von 1 -[L- (-)-y-Amino-o-hydroxybutyryl]- kanamycin A (IV)
5,0 g = 4,91 mMol 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-p-nitro- benzalkanamycin A wurden gelöst in 50 ml Dimethylformamid bei 24" C. Nun wurden 2,064 g=5,895 mMol L-(-)-y- Benzyloxycarbonylamino-a -hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester aufgelöst in 20 ml Dimethylformamid bei 24 0C und die Lösung langsam unter kräftigem Rühren hinzugefügt zur Lösung der Schiffschen Base III im Verlauf von 75 Minuten. Die Lösung wurde bei 24 C über Nacht gerührt.
Unter Verwendung eines Dampfstrahlvakuums wurde die Lösung bei ungefähr 40 C zur Trockne gebracht. Weiterhin wurde wiederholt getrocknet durch Behandlung mit 100 ml Methanol, wobei ein viskoses Öl entstand. Das Öl wurde aufgelöst in 100 ml Dioxan-Wasser (1:1), wonach 10 ml Eisessig hinzugegeben wurden. Die Lösung wurde eingebracht in einen Parr-Kolben zusammen mit 2,5 g 5 %igem Palladium auf Aktivkohle und reduziert bei 3,1 kp/cm2 während 4 Stunden bei 24 C. Der gesamte Druckabfall in dieser Zeit (geschlossener Kolben) betrug 6,1 kp/cm2 unter Einschluss der periodischen Druckerneuerungen. Das Gemisch wurde filtriert durch ein Bett von Diatomeenerde, die nachher gewaschen wurde mit 3mal je 50 ml 50 XOigem wässrigem Dioxan.
Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockne gebracht und azeotrop destilliert mit 100 ml n-Butanol. Schliesslich wurde wiederholt mit Methanol behandelt, wobei ein viskoses Öl entstand. Es wurde aufgelöst in 30 ml Methanol und langsam eingegossen in 1000 ml kaltem (5-10 ) Diäthyläther unter kräftigem Rühren. Nachdem die erhaltene Suspension-eine halbe Stunde lang in einem Eisbad gerührt worden war, wurde die Fällung abfiltriert und unmittelbar in einem Vakuumexsikkator über P2Os getrocknet. Das erhaltene Gemenge wog 4,9620 g.
Dünnschichtchromatographie erwies, dass es zur Hauptsache aus der Verbindung IV, Kanamycin A und einigen Spuren diund trisubstituertem Kanamycin A bestand, unter Einschluss von 4-Amino-2-hydroxybuttersäure.
Die verschiedenen Fraktionen wurden getrennt unter Verwendung einer Glaskolonne 40 x 100 mm, gefüllt mit Amberlite IRC-40 (NH4+-Form, Typ I 0,15-0,075 mm).
Die Säuie wurde beladen mit 4,600 g des Rohgemisches, aufgelöst in 15 ml Wasser. Danach wurde die Säule eluiert mit wässriger Ammoniaklösung, deren Konzentration von 0- bis 2n anstieg. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von je 15 ml. Gesammelt wurden 295 Fraktionen, wonach die Säule gewaschen wurde mit 1,5 Liter 3n NH40H. Die Fraktionen wurden vereinigt auf der Basis ihrer optischen Drehungen. Die festen Anteile daraus wurden isoliert durch Lyophylisation.
Fraktion Zusammensetzung Gewicht Korrektion auf Biotest % Ausbeute Nr. Gramm Gesamtgewicht
Rohgewicht g 120-150 kana A 1,1654 1,257 809 42,6 201-224 BB-K29 0,4000 0,430 228-241 BB-K8 0,6523 0,7036 786 + 101 ' 19,2 Mittel von 4 Plattentests, 5: Standardabweichung.
Falls das zurückgewonnene Kanamycin A berücksichtigt wird, beträgt die Umwandlung in BB-K8 (IV) 33,5 %.
In diesem Durchlauf betrug das Verhältnis von BB-K8 zu Kana A 0,45.
Die nach diesem Verfahren gewonnene Verbindung IV ist identisch mit dem authentischen Produkt, erhalten gemäss der Methode, die in der US-Patentschrift Nr. 3 781 268 beschrieben ist. Schmelzpunkt 194" C (Zersetzung). [a]D21 = +850 (c = 2, H2O). Die relative Wirksamkeit gegenüber B. subtilis (Agar-Plattentest) 960 mcg/mg. Standard: Kanamycin A als freie Base.
Analyse für C22H43N5O13 - 2 H2CO3: berechnet: C 40,62 H 6,68 N 9,87 gefunden: C 40,21 H 6,96 N 9,37
C 39,79 H 6,87 N 9,49
Beispiel 9
Herstellung des Monosulfats von 1-[L-(-)-y-Amino-a- hydroxybutyryl]-kanamycin A
1 Mol 1 -[L-(- )-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A wird aufgelöst in 1 bis 3 Litern Wasser. Die Lösung wird filtriert zwecks Abtrennung unlöslicher fester Anteile. Zu der gekühlten und gerührten Lösung wird 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser, hinzugefügt. Das Gemisch wird 30 Minuten lang gerührt, wonach kaltes Äthanol hinzugefügt wird, bis sich eine Fällung zu bilden beginnt. Die festen Substanzen werden abgetrennt und erweisen sich als das erwünschte Monosulfat.
Beispiel 10
Herstellung des Disulfats von 1-[L-(-)-y-Amino-a- hydroxybutyryl]-kanamycin A (BB-K8 - 2 H2SO4)
35 g 1-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (als Monobicarbonat-trihydrat) wurden aufgelöst in 125 ml entionisiertem Wasser. Dabei ergab sich ein pH-Wert von ungefähr 9,0. Der pH-Wert wurde gesenkt durch Zugabe von 50%iger Schwefelsäure auf 7 bis 7,5.
Zum Gemisch wurden 8,5 g Darco G-60 (Aktivkohle) hinzugefügt und die Aufschlämmung bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang durchgeschüttelt. Die Kohle wurde in geeigneter Weise abfiltriert und gewaschen mit 40 ml Wasser.
Die Waschlösung wurde zum Filtrat zugefügt.
Die vereinigten Lösungen wurden auf den pH-Wert 2 bis 2,6 eingestellt mit 50%iger Schwefelsäure. Ein grosser Anteil Kohlendioxid entwickelte sich dabei. Die Lösung wurde am Vakuum unter Rühren während 20 Minuten stehengelassen zwecks Entfernung weiteren Kohlendioxids.
Zur entgasten Lösung wurden 8,5 g Darco G-60 hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang durchgeschüttelt. Anschliessend wurde die Kohle in geeigneter Weise abfiltriert und gewaschen mit 35 ml entionisiertem Wasser. Das Wasser wurde zum Filtrat hinzugegeben.
Die vereinigten Lösungen wurden mit 50 %iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wurde hernach unter raschem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3- bis 4faches Volumen an Methanol) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang beim pH-Wert 1 bis 1,3 gerührt und hernach passierengelassen durch ein Sieb mit 0,15 mm Maschenweite. Anschliessend wurde 2 Minuten gerührt und 5 Minuten absitzengelassen. Der Hauptanteil der überstehenden Flüssigkeit wurde dekantiert. Die verbliebene Aufschlämmung wurde filtriert, der Rückstand gewaschen mit 200 ml Methanol und am Vakuum bei 50 C während 24 Stunden getrocknet.
Die Ausbeute an amorphem BB-K8 (Dihydrogensulfat)2 betrug 32 bis 34 g [a]D22 in H20 = +74,75", Zersetzung bei 220 bis 223" C.
Analyse (bezogen auf Trockensubstanz') gefunden theoretisch 32,70; 33,50; 32,30; 33,50 Yo N 8,78; 8,70; 8,20; 8,80; 8,97 % 5 8,75; 8,90; 7,80; 8,85; 8,20 ',tc Asche nil
Kanamycin A is an antibiotic which is described in Merck Index, 8th Edition, pages 597-598. It has the formula
EMI1.1
The present invention relates to a process for the preparation of a new derivative of kanamycin A, namely 1- [L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl] -kanamycin A of the formula below
EMI1.2
Kanamycin A has four primary amino groups attached to the 1, 3, 6 'and 3 "positions of the molecule. It has been found that the amino group in the 6' position is the most reactive and that the amino group in the 1-position is the second reactive when the substance is treated with an electrophilic agent. The two amino groups in the 3 "and 3" position, on the other hand, are less reactive than those in the 1 or 6 'position.
However, in the acylation they nevertheless react with the formation of small amounts of undesired acylation products.
Accordingly, it was an object of the present invention to provide a more satisfactory manufacturing process than that previously worked out and described in U.S. Patent No. 3,781,268, which process is more selectively directed to removing the amino group in the 1st position - to acylate than the other amino groups in the molecule.
This object was achieved by the process according to the invention for preparing the compound having the formula
EMI2.1
this process being characterized in that kanamycin A in solution at a temperature below 50 C is acylated with N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in a molar ratio of 1 to at most 1 to the compound of the formula
EMI2.2
whereupon the compound II thus obtained is reacted with at least a three-fold molar proportion of 4-nitrobenzaldehyde, benzaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde or pivaldehyde in a lower alkanol for at least 2 hours to give a compound of the formula
EMI3.1
where Z
EMI3.2
means
after which the compound III obtained is reacted with at least one molar proportion of L- () -y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ester in an organic solvent at a temperature between 0 and 50 ° C., then the solvent is separated off and the residue in one off Water and a water-soluble organic solvent mixture is hydrogenated to give compound IV.
The acylation in the first stage of the process is preferably carried out with approximately one mole of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide, preferably in a solvent such as dimethylformamide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, dioxane, 1,2-dimethoxyethane, methanol, ethanol, water, acetone, pyridine or an N- (lower) -alkylpiperidine or
Mixtures of these solvents, but particularly preferably made in dimethylformamide at a preferred temperature below 25 ° C. The lower alkanol in the second stage is preferably absolute ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol or mixtures of these solvents at approximately the reflux temperature and for a reaction time of 2 to 5 hours.
Step 3 of the process is preferably carried out in a ratio of about 1 to 2 moles of the ester per mole of compound III and in particular in a molar ratio of 1.0 to 1.3 to 1, the solvent used is preferably dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, Propylene glycol, dimethyl ether, ethylene glycol, dimethyl ether or dioxane, but particularly preferably dimethylformamide, preferably at room temperature, a reaction time of at least 5 hours generally being required. The subsequent hydrogenation is preferably carried out with hydrogen in the presence of a metal catalyst, preferably palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium or nickel, but in particular palladium or nickel.
Palladium on activated carbon. It works in a solvent mixture of water with a water-soluble organic solvent, such as dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol, dimethyl ether, propylene glycol dimethyl ether or the like, but preferably in a mixture of water and dioxane in a ratio of 1: 1. This last step is preferred for the preparation of the compound of the formula IV in the presence of a catalytically active amount of glacial acetic acid.
Compound IV, 1- [L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl] kanamycin A, has excellent antibacterial activity which seems to surpass that of kanamycin A itself. Illustrative of this are the two tables below, which show the minimum inhibitory concentrations (MIC) of kanamycin A and the compound IVa (BB-K8) against a large number of gram-positive and gram-negative bacteria, obtained in experiments using the agar dilution method from Stear (Table I. ) and the two-fold dilution method (Table II). An agar medium according to Mueller-Hinton was used for the tests according to Table I and infusion nutrient solution according to Heart was used for the tests according to Table II.
Table I (MIC mg / ml) Organism Kanamy connection in A dung IV (6-8198) (BB-K8)
approach
No. 4
1. Alk. Faecalis A-9423 16 8 2. A A A-20648> 125> 125
3. Ent. cloacae A-0656 4 4
4. Ent. species A-20364> 125 2
5. Ent. hafniae 1 A-20674 1 1
6. E. coli A-0636 2 1
7. E. coli A-20664 16 4
8. E. coli A-20665> 125 1
9. E. coli A-20507 32 2 10. E. coli A-20520> 125 4
Table 1 (continued) Organism Kanamy connec tion IV (6-8198) (BB-K8)
approach
No. 4 11. E. coliA-20365> 125 1 12.E. coliA-20684 2 2 13. E. coli A-20682> 125 2 14. E. coli A-20683> 125 8 15. E. coli A -20681> 125 2 16. E. coli A-15119 4 4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 18. K. species A-20328> 125 2 19. K. species A-20330 32 32 20. K. species A-20634> 125 4 21. K. pneumoniae A-20680> 125 4 22. K. pneumoniae A-0077 1 1 23.
Pr. Mirabilis A-9900 2 2 24. Pr. Morganii A-15153 2 2 25. Pr. Vulgaris A-9555 2 1 26. Pr. Rettgeri A-9636 0.25 0.25 27. Pr. Mirabilis A-20645 4 4 28. Pr. Mirabilis A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 30. Providencia alkalifaciens A-20676 1 1 31. Ps. Aeruginosa A-20229 32 2 32. Ps. Aeruginosa A-0943A 125 16 33. Ps. Aeruginosa A-20653> 125 32 34. Ps. Species A-20601 125, 63 16 35. Ps. Species A-20621> 125> 125 36. Ps. Maltophilia A-20620 32> 125 37. Sal. enteritidis A-0531 1 0.5 38. Sal. derby A-20087> 125 1 39. Ser. Marcescens A-20019 2 4 40. Ser. marcescens A-9933 4 8 41. Ser. marcescens A-20460> 125 4.2 42. Ser. marcescens A-20459 4 16 43. Shig. flexneri A-9684 4 4 44. Aeromonas sp. A-20670 2 2 45. Arizona sp. A-20671 2 1 46. Citrobacter sp. A-20673 4 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48.
Staph. aureus A-9606 1 1 49. Staph. aureus A-4749 0.5 1 50. Staph. aureus A-9537 2 1 51. Staph. aureus A-20610> 125 2 52. Staph. aureus A-20240> 125 8 53. Staph. aureus A-15197 1 2
Muller-Hinton medium + 4% sheep blood 54th St. faecalis A-9854 63 63 55. St. faecalis A-9575 125> 125 56. St. pyogenes A-20200 32, 16 32 57. St. pyogenes A-9604 125 125 58. St. pyogenes A-15040 125 125 59. St. pyogenes A-20065 125 125 60. D. pneumoniae A-9585 63, 32 63 61. D. pneumoniae A-20159 125> 125
Table II (MIC mg / ml) Organism Kanamy connection in A dung IV (6-8196) (BB-K8)
approach
No. 4
1. D. pneumoniae + 5% serum
A-0585 63 63
2nd St. Pyrogenic + 5% Serum
A-9604 125 125
3rd staph. aureus Smith A-9537 0.5 0.5
4th staph. aureus A-9497 0.5 0.5
5th staph. aureus A-20239 125 4
6th staph. aureus A-20240 125 4
7. Enter.
cloacae A-0656 2 2
8. Enter. species A-20364 125 2
9. K. pneumoniae A-9867 2 4 10. E. coli K-12 ML1410 A-20361 2 4 11. E. coli K-12 ML1630 A-20363 125 2 12. E. coli K-12 A-9632 2 1 13. E. coli A-20664 32 8 14. E. coli A-20665 125 8 15. Pr. Mirabilis A-9900 2 16 16. Pr. Morganii A-15153 4 16 17. Pr. Vulgaris A-9436 1 2 18. Ps. Aeruginosa A-20227 4 1 19. Ps.species A-20499 63 4 20. Ps. Aeruginosa A-20653 125 4 21. Ps. Species A-20621 125 125 22. Ser. marcescens A-20019 2 4 23. Ser. marcescens A-20141 16 16
The above MIC data show that compound IV (BB-K8) is superior to kanamycin A in terms of potency, especially against organisms that are resistant to kanamycin A.
The MIC data are also in good agreement with the results of in vivo procedures for all three organisms tested with kanamycin A and compound IV. Compound IV and kanamycin A were also found to be effective against infection of mice caused by kanamycin A sensitive strains of E. coli A-15119 and Staph. aureus A-9537. Although the CHs0 values (healing dose in 50% fatally infected mice) compared to Staph. aureus A-9537 show that compound IV is slightly less effective than kanamycin A, this slight difference is presumably not significant since the dose levels were far apart (5-fold dilution).
As expected, kanamycin A was not found to be very effective in vivo against a kanamycin-resistant strain of E. coli A-20520, whereas compound IV exerted a pronounced protective effect. Compound IVa was approximately ten times more effective against this strain of E. coli when given in quadruple doses instead of two doses.
Table III
Comparison of the In Vivo and In Vitro Effectiveness of Compound IV and Kanamycin A Compound Experiment Staphylococcus aureus Escherichia coli Escberichia coli
No. A-9537 A-15119 A-20520
MIC "CDsob MIC CD50 MIC CDso connection IV 1 1 2.0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 c - - 5x4 Kanamycin A 1 2 0.5 x 2 4 4> <x 2 125 200 x 2
2 - - - - - 200 x 4 MIC = minimum inhibitory concentration (vg / ml). Test execution according to Chisholm et al.
(Antimicrob. Agents and Chemotherapy - 1969, p. 244, 1970) using Müller-Hinten
Agar as a test medium.
CDs0 = dose for 50% healing (mg / kg x number of doses). Mice were subcutaneously 1 and 4 hours after the
Treated infection if twice administered and 0, 2, 4 and 6 hours after
Infection if administered four times. Other aspects of this test were carried out as described by Price et al. (Journal of Antibiotics 22: 1, 1969).
= ¯ = not checked.
Compound IV is a valuable antibacterial agent, an additive for cattle feed and a therapeutic agent for poultry and mammals as well as for humans and proves to be particularly valuable in the treatment of infectious diseases caused by gram-positive and gram-negative bacteria.
When administered orally, Compound IV is an effective agent for preoperative sterilization of the intestines. Both the aerobic and anaerobic flora are responsive to the drug and are reduced in the digestive tract. Accompanied by suitable mechanical cleaning, the drug is useful in preparation for colon surgery.
Compound IV is found to be effective in the treatment of bacterial infections in humans when administered parenterally in the dosage range of 250 to 3000 mg per day in divided doses 3 to 4 times per day. In general, the substance is found to be effective when administered in a dosage of approximately 5.0 to 7.5 mg / kg body weight every 12 hours.
A preferred embodiment of the process for preparing compound IV according to the invention comprises the following process steps:
A. Acylation of one mole of Kanamycin A with approximately one mole of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in dimethylformamide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, dioxane, 1,2-dimethoxyethane, methanol, water, acetone, pyridine or an N- (lower) alkylpiperidine or of mixtures of these solvents as solvents at a temperature below 250 C. This produces compound II.
B. Treatment of one mole of compound II with 3 to 6 moles of 4-nitrobenzaldehyde, benzaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde or pivalaldehyde, in a lower alkanol such as ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec. Butanol, tert-butanol or mixtures of these solvents, at a temperature in the range from 50 ° C. to the reflux temperature of the solvent used for a period of 2 to 10 hours. This gives the compound III, where Z is a radical of the formulas
EMI5.1
C.
Treatment of one mole of compound III with 1 to 1.3 moles of L - (-) -y-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ester in a solvent such as dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, propylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether or dioxane, at a temperature in the range of 10 to 35 C.
The solvent is then driven off in vacuo and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen in the presence of a metal catalyst such as palladium, platinum, rhodium, Raney nickel, ruthenium or nickel, being carried out in a mixture of water and a water-miscible solvent such as dioxane , Tetrahydrofuran, ethylene glycol, dimethyl ether or propylene glycol dimethyl ether, works and can react in the presence of a catalytically effective amount of glacial acetic acid, whereby the compound IV is formed.
In a further preferred embodiment of the process according to the invention, the reaction of kanamycin A with N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide is carried out in a molar ratio in dimethylformamide at a temperature in the range from 200.degree. C. to +10.degree. The compound II obtained is treated in a ratio of 1: 3.5 to 4.5 moles with paranitrobenzaldehyde or benzaldehyde in absolute methanol, ethanol, n-propanol or isopropanol at approximately the reflux temperature for 2 to 4 hours, the compound III being formed in which Z is a remainder of the formulas
EMI5.2
means.
This is followed by the reaction of the compound III in a ratio of one mol to 1.1 to 1.3 mol of L - (-) -y-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ester, dimethylformamide being used as the solvent allowed to react at about room temperature for at least 5 hours. The solvent is then removed in vacuo and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen in the presence of palladium on activated carbon in a mixture of dioxane and water in a ratio of 1: 1 in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid.
The most preferred embodiment of the method according to the invention comprises the following method steps:
A. Acylation of one mole of kanamycin A with one mole of N (benzyloxycarbonyl) succinimide in dimethylformamide at a temperature in the range from -20 to +10 C.
B. Treatment of one mole of the compound II obtained in this way with approximately 4 moles of p-nitrobenzaldehyde in absolute ethanol at reflux temperature for two to four hours, a compound III being formed in which Z is, and
EMI6.1
C. Treating one mole of compound III with about 1.2 moles of L- (-) -y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxy-butyric acid N-hydroxysuccinimide ester in dimethylformamide at about room temperature for at least 5 hours, stripping off the solvent in vacuo and hydrogenating of the residue in situ with hydrogen in the presence of palladium on activated carbon in a mixture of dioxane and water in a ratio of 1: 1 in the presence of a catalytically active amount of glacial acetic acid. This creates compound IV.
In the above description, the term lower alkyl means an alkyl radical, straight or branched, having 1 to 6 carbon atoms. Lower alkanol is a saturated straight or branched chain alcohol with 1 to 6 carbon atoms.
example 1
Production of L - (-) -v-Benzyloxycarbonylamino-o: - hydroxybutyric acid (VI)
7.4 g = 0.062 mol of L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyric acid were added to a solution of 5.2 g = 0.13 mol of sodium hydroxide in 50 ml of water. 11.7 g = 0.068 mol of carbobenzoxychloride were added dropwise to the stirred solution at 0 to 5 ° C. over half an hour, followed by stirring for a further hour at the same temperature. The reaction mixture was washed with 50 ml of ether to its pH -Value adjusted to 2 with dilute hydrochloric acid, after which it was extracted four times with 80 ml of ether each time The ether extracts were combined, washed with a small amount of saturated sodium chloride solution, dried with anhydrous sodium sulfate and filtered.
The filtrate was evaporated in vacuo and the residue obtained was crystallized from benzene. 11.6 g (74%) of colorless flakes were obtained. Melting point 78.5 to 79.5 "C. [a] = 4.5" (c = 2, CH3OH). The IR analysis (KBr) showed: vCO = 1740, 1690 cm-l. The NMR analysis (acetone-d6) Ï (in ppm from TMS) gave: 2.0 (2 H, m), 3.29 (2 H, dd, J = 6.7 and 12 Hz), 4.16 (1H, dd, J = 4.5 and 8 Hz), 4.99 (2H, s), 6.2 (2H, broad), 7.21 (5H, s).
Analysis for C12H15NO5: Calculated: C 56.91 H 5.97 N 5.53 Found: C 56.66 H 5.97 N 5.47
Example 2
N-hydroxysuccinimide ester of L - (-) -y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutyric acid (VII)
A solution of 10.6 g = 0.042 mol of substance VI and 4.8 g = 0.042 mol of N-hydroxysuccinimide1) in 200 ml of ethyl acetate was cooled to 0 ° C., after which 8.6 g of 0.042 mol of Di1) GW Anderson et al., Journal of American Chemical Society, 86, 1839 (1964).
cyclohexylcarbodiimide were added. The mixture was stored in a refrigerator overnight. The precipitated dicyclohexylurea was then filtered off and the filtrate was concentrated to about 50 ml under reduced pressure. This produced colorless crystals of substance VII.
They were filtered off to give 6.4 g; Melting point 121 to 122.5 "C. The filtrate was evaporated to dryness in vacuo and the crystalline residue was washed with 20 ml of benzene-n-hexane, resulting in a further amount of substance VII. The total yield was 13.4 g (92%) %). [a] = 1.5 (c = 2, CHCl3). IR (KBr) vco = 1810, 1755, 1740, 1680 cm-1.
NMR (acetone-d6) (3 (in ppm from TMS) 2.0 (2 H, m), 2.83 (4 H, s), 3.37 (2 H, dd, J = 6.5 and 12 , 5 Hz), 4.56 (1H, m), 4.99 (2H, s), 6.3 (2H, broad), 7.23 (5H, s).
Analysis for C16H18N207: Calculated: C 54.85 H 5.18 N 8.00 found: C 54.79 H 5.21 N 8.14 C 54.70 H 5.20 N 8.12
Example 3
Preparation of N- (Benzyloxycarbonyloxy) succinimide
23 g = 0.2 mol of N-hydroxysuccinimide were dissolved in a solution of 9 g = 0.22 mol of sodium hydroxide in 200 ml of water. 34 g = 0.2 mol of carbobenzoxychloride were added dropwise to the stirred solution while cooling with water, after which the mixture was stirred at room temperature overnight for the purpose of precipitating the carbobenzoxy derivative, which was subsequently filtered off, washed with water and air-dried. Yield 41.1g (82%). Recrystallization from benzene-n-hexane (10: 1) gave colorless prisms with a melting point of 78 to 79 "C.
Example 4
Preparation of 6'-carbobenzoxykanamycin A
A solution of 42.5 g = 90 mmol of kanamycin A in the form of the free base in 450 ml of water and 500 ml of dimethylformamide was cooled to below 0 ° C. and stirred vigorously. To this solution, a solution of 22.4 g = 90 mmol of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in 500 ml of dimethylformamide was added dropwise over a period of about two hours. The mixture was stirred at -10 to 0 ° C. overnight and then further stirred at room temperature for a day. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure and below 50.degree.
The oily residue was dissolved in a mixture of 500 ml of water and 500 ml of butanol, after which the mixture was filtered to remove insolubles and then allowed to separate into two layers. The butanol layer and the aqueous layers were treated with butanol-saturated water (2 x 500 ml) and with water-saturated butanol (2 x 500 ml) using a technique similar to that of countercurrent distribution. The three aqueous layers were combined and evaporated to dryness under reduced pressure. They left an oily residue, some of which crystallized on standing at room temperature. To this residue, together with the crystals, about 100 ml of methanol was added, which dissolved the oil and separated it from the crystals.
About 300 ml of ethanol were added and the mixture was left to stand at room temperature overnight and gave a crystalline mass which was filtered off. She weighed 44 g. The product contained a small proportion of kanamycin A, detected by means of thin layer chromatography using n-propanol-pyridine acetic acid-water (15: 10: 3: 12) as the solvent system and of ninhydrin as the spray reagent.
The crude product was dissolved in 300 ml of water and chromatographed on a column (300 mm diameter) of CG-50 ion exchange resin (NH4 + type, 500 ml). The column was percolated with 0.1N ammonium hydroxide solution and the eluate was collected in fractions of 10 ml each. The desired product was contained in fractions 10 to 100, whereas kanamycin A was in the slower-running fractions and the isomer or isomers of the product in the faster moving factions seemed to be present. Fractions 10 to 110 were combined and evaporated to dryness under reduced pressure.
This gave 24.6 g (45 weeks) of colorless 6-carbobenzoxykanamycin A (II) (6'-Cbz kanamycin A), which began to melt and discolor at 204 ° C. and decomposed at 212 ° C. with evolution of gas. [a] D = f106 "(c = 2, H2O).
Thin layer chromatography on silica gel F 254, ninhydrin solvent system Rf value
6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A n-PrOH-Pyridine-AcOH-H2O (15: 10: 3: 12) 0.42 0.33 0.15 0.04 (major part) (minor part) acetone-AcOH-H2O (20: 6: 74) 0.24 0.14 CHCl3-MeOH-CNH4OH-H2O (1: 4: 2: 1) 0.76 0.50 AcOMe-n-PrOH-C-NH4OH (45: 105: 60 ) 0.22: 0.04 * detected with anthrone sulfuric acid.
According to the thin-layer chromatographic test with one of the solvent systems, the end product contained two components in smaller proportions. However, it was used for the production of BB-K8 (I) without further purification.
Example 5
Production of L - (-) -y-amino-a-hydroxybutyric acid from ambutyrosine A or B or from mixtures thereof
5.0 grams of ambutyrosin A (U.S. Patent No. 3,541,078, issued November 17, 1970) was refluxed for one hour with 160 ml of 0.5N sodium hydroxide. The hydrolyzate was neutralized with 6N HCl and chromatographed on a column of CG-50 (NH4 + type). The desired L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyric acid was isolated by developing the column with water and separating off the water by freeze-drying. The L - (-) - γ-amino-ahydroxybutyric acid is a crystalline product with a melting point of 212.5 to 214.5 C (column 2, lines 31 to 38, US Pat. No. 3,541,078).
Example 6
Production of L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid from DL-a-hydroxy-i-phthalimidobutyric acid
A. Dehydroabietylammonium L-a-hydroxy-y-phthalimidobutyrate
A solution of 29 g = 0.1 mol of dehydroabietylamine in 130 ml of ethanol was added to a solution of 25 g = 0.1 mol of 2-hydroxy-y-phthalimidobutyric acid1) in 200 ml of ethanol. The solution was shaken vigorously for one minute and then allowed to stand for 5 hours at room temperature, during which time no needles crystallized out. The crystals were filtered off, washed with 50 ml of ethanol and dried in air. 30.1 g (56%) of a diastereomer of the dehydroabietylamine salt were obtained.
Melting point 93 to 94 "C. [a] D24 = +150 (c. 2.5, MeOH).
Recrystallization from 300 ml of ethanol gave 23.2 g (43 weeks of the pure product). Melting point 94 to 95 "C [a] D24 = + 10.8 (c. 2.5, MeOH). Further recrystallizations did not change the melting point and the specific rotation.
Analysis for C32H42N2O5 H2O: Calculated: C 69.54 H 8.02 N 5.07 found: C 69.58 H 8.08 N 5.07 y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.
B. L - (-) -y-amino-α-hydroxybutyric acid
To a solution of 1.5 g = 0.014 mol of sodium carbonate in 40 ml of water, 5.3 g = 0.01 mol of dehydroabietylammonium-1-a-hydroxy-y-phthalimidobutyrate and 60 ml of ether were added. The mixture was shaken vigorously until all solid matter had dissolved. The ether layer was separated. The aqueous solution was washed twice with 20 ml of ether and evaporated to 15 ml under reduced pressure. 10 ml of concentrated hydrochloric acid were added to this concentrate and the mixture was refluxed for 10 hours. After cooling, the separated phthalic acid was filtered off. The filtrate was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in 10 ml of water and the solution was evaporated to dryness.
This operation was repeated twice to remove excess hydrochloric acid. The remaining syrup was dissolved in 10 ml of water and the solution filtered to remove a small amount of insoluble phthalic acid. The filtrate was absorbed on a column of IR-120 (H +, 1 x 35 cm).
The column was washed with 300 ml of water and eluted with 1N ammonium hydroxide solution. The eluate was divided and collected into fractions of 15 ml each. The ninhydrin-positive fractions 10 to 15 were combined and evaporated under reduced pressure. What remained was a syrup which gradually crystallized. The crystals were triturated with methanol, filtered and dried in a vacuum desiccator to give 0.78 g (66%) of L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyric acid. Melting point 206-207 C. [a] D24 = -29 "(c. 2.5, H20). The IR spectrum was found to be identical to that of an authentic sample obtained from ambutyrosine.
Example 7
Preparation of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri-p nitrobenzalkanamycin A (III)
9.0 g = 14.5 mmol of 6'-carbobenzoxykanamycin A were suspended in 500 ml of absolute ethanol at 24 ° C., whereupon 8.7945 g = 58.2 mmol of p-nitrobenzaldehyde were added.
The mixture was refluxed. The mixture changed to a clear yellow solution, but a white solid substance quickly began to form at the reflux temperature. The mixture was refluxed for three hours, then cooled and the precipitated substance was filtered off. It was washed with a little absolute ethanol. The yield was 14.0 g (94.5%) of a white crystalline solid substance. Melting point 233 to 234 C (uncorrected). It is the product III mentioned in the title.
Analysis for C47H51N7O19: Calculated: C 55.46 H 5.05 N 9.63 found: C 55.39 H 5.08 N 9.60
Example 8
Preparation of 1 - [L- (-) - y-amino-o-hydroxybutyryl] - kanamycin A (IV)
5.0 g = 4.91 mmol of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri-p-nitrobenzalkanamycin A were dissolved in 50 ml of dimethylformamide at 24" C. Now 2.064 g = 5.895 mmol of L- ( -) - y- Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ester dissolved in 20 ml of dimethylformamide at 24 ° C. and the solution slowly added to the solution of the Schiff base III in the course of 75 minutes with vigorous stirring. The solution was stirred at 24 ° C. overnight.
Using a steam jet vacuum, the solution was brought to dryness at approximately 40 ° C. Furthermore, it was repeatedly dried by treatment with 100 ml of methanol, a viscous oil being formed. The oil was dissolved in 100 ml of dioxane-water (1: 1), after which 10 ml of glacial acetic acid were added. The solution was placed in a Parr flask together with 2.5 g of 5% palladium on activated carbon and reduced at 3.1 kp / cm2 for 4 hours at 24 C. The total pressure drop during this time (closed flask) was 6, 1 kp / cm2 including the periodic pressure renewals. The mixture was filtered through a bed of diatomaceous earth, which was then washed with 3 times 50 ml of 50% aqueous dioxane each time.
The combined filtrates were brought to dryness and azeotropically distilled with 100 ml of n-butanol. Finally, it was treated repeatedly with methanol, a viscous oil being formed. It was dissolved in 30 ml of methanol and slowly poured into 1000 ml of cold (5-10) diethyl ether with vigorous stirring. After the suspension obtained had been stirred for half an hour in an ice bath, the precipitate was filtered off and immediately dried over P2Os in a vacuum desiccator. The resulting mixture weighed 4.9620 g.
Thin layer chromatography showed that it consisted mainly of compound IV, kanamycin A and some traces of di- and tri-substituted kanamycin A, including 4-amino-2-hydroxybutyric acid.
The various fractions were separated using a 40 x 100 mm glass column filled with Amberlite IRC-40 (NH4 + form, Type I 0.15-0.075 mm).
The column was loaded with 4.600 g of the crude mixture dissolved in 15 ml of water. The column was then eluted with aqueous ammonia solution, the concentration of which increased from 0 to 2n. The eluates were collected in fractions of 15 ml each. 295 fractions were collected, after which the column was washed with 1.5 liters of 3N NH40H. The fractions were pooled on the basis of their optical rotations. The solid fractions therefrom were isolated by lyophilization.
Fraction Composition Weight Correction to Biotest% Yield No. grams total weight
Gross weight g 120-150 kana A 1.1654 1.257 809 42.6 201-224 BB-K29 0.4000 0.430 228-241 BB-K8 0.6523 0.7036 786 + 101 '19.2 Mean of 4 plate tests, 5th : Standard deviation.
If the recovered kanamycin A is taken into account, the conversion to BB-K8 (IV) is 33.5%.
In this run, the ratio of BB-K8 to Kana A was 0.45.
Compound IV obtained by this process is identical to the authentic product obtained according to the method described in US Pat. No. 3,781,268. Melting point 194 "C (decomposition). [A] D21 = +850 (c = 2, H2O). The relative effectiveness against B. subtilis (agar plate test) 960 mcg / mg. Standard: Kanamycin A as free base.
Analysis for C22H43N5O13-2 H2CO3: Calculated: C 40.62 H 6.68 N 9.87 found: C 40.21 H 6.96 N 9.37
C 39.79 H 6.87 N 9.49
Example 9
Preparation of the monosulfate of 1- [L - (-) - γ-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A
1 mol of 1 - [L - (-) -y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A is dissolved in 1 to 3 liters of water. The solution is filtered to separate insoluble solid components. 1 mol of sulfuric acid dissolved in 500 ml of water is added to the cooled and stirred solution. The mixture is stirred for 30 minutes, after which cold ethanol is added until a precipitate begins to form. The solid substances are separated and turn out to be the desired monosulfate.
Example 10
Preparation of the disulfate of 1- [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A (BB-K8 - 2 H2SO4)
35 g of 1- [L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl] -kanamycin A (as monobicarbonate trihydrate) was dissolved in 125 ml of deionized water. The result was a pH of approximately 9.0. The pH was lowered to 7 to 7.5 by adding 50% sulfuric acid.
To the mixture was added 8.5 grams of Darco G-60 (activated carbon) and the slurry was shaken at room temperature for half an hour. The charcoal was suitably filtered off and washed with 40 ml of water.
The washing solution was added to the filtrate.
The combined solutions were adjusted to pH 2 to 2.6 with 50% sulfuric acid. A large proportion of carbon dioxide developed in the process. The solution was left to stand in vacuo with stirring for 20 minutes to remove additional carbon dioxide.
8.5 g Darco G-60 were added to the degassed solution. The mixture was shaken at room temperature for half an hour. The charcoal was then filtered off in a suitable manner and washed with 35 ml of deionized water. The water was added to the filtrate.
The combined solutions were adjusted to pH 1 to 1.3 with 50% strength sulfuric acid. This solution was then added to 600 to 800 ml of methanol (3 to 4 times the volume of methanol) over a period of 10 minutes with rapid stirring. The mixture was stirred for 5 minutes at pH 1 to 1.3 and then passed through a sieve with a mesh size of 0.15 mm. The mixture was then stirred for 2 minutes and allowed to settle for 5 minutes. Most of the supernatant liquid was decanted. The remaining slurry was filtered, the residue washed with 200 ml of methanol and dried in vacuo at 50 ° C. for 24 hours.
The yield of amorphous BB-K8 (dihydrogen sulfate) 2 was 32 to 34 g of [a] D22 in H20 = +74.75 ", decomposition at 220 to 223" C.
Analysis (based on dry matter) found theoretically 32.70; 33.50; 32.30; 33.50 Yo N 8.78; 8.70; 8.20; 8.80; 8.97% 5 8.75; 8.90; 7.80; 8.85; 8.20 ', tc ash nil