CH495956A - Verfahren zur gesteuerten Herstellung von Peptiden - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur gesteuerten Herstellung von Peptiden
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur gesteuerten schrittweisen Herstellung von Peptiden, bei dem mehrere aufeinanderfolgende Stufen ohne Isolierung von Zwischen-Peptiden durchgeführt werden.



   Peptide bilden eine grosse Klasse chemischer Verbindungen, die Dipeptide, Tripeptide, Tetrapeptide und höhere Peptide umfasst, bei denen Aminosäuren durch   Amidbindungen    (Peptidbindungen) miteinander verbunden sind. Eine sehr grosse Anzahl davon ist durch Teilhydrolyse von Proteinen isoliert worden. Einige Peptide mit einem hohen Molekulargewicht sind chemisch hergestellt worden. Es sind auch viele Peptide mit einem verhältnismässig niedrigen Molekulargewicht, die zum Beispiel bis zu 6-8 Aminosäuren enthalten, hergestellt worden. Proteine sind weitgehend Peptide, die gewöhnlich 100 oder mehr aneinandergebundene Aminosäuresegmente aufweisen.



   Peptide sind nicht nur als Stufen bei der Synthese von Proteinen nützlich, sondern auch weil gewisse von ihnen therapeutisch wirksam sind. Sie sind ferner bei der Untersuchung und Analyse von Proteinen von Nutzen. Eine der erfolgreichsten Arten, an das Studium der Protein struktur heranzugehen, hat in der Teilanalyse des Proteins mit nachfolgender Isolierung und Analyse der erzeugten Polypeptidfragmente bestanden. Solche Verfahren liefern jedoch eine sehr beschränkte Auskunft über die strukturell-funktionellen Verhältnisse und Erfordernisse bei Polypeptiden und Proteinen. Eine genaue Auskunft dieser Art könnte durch eine gesteuerte schrittweise Synthese von Polypeptiden erhalten werden.



   Eines der interessantesten Probleme der modernen Biologie besteht darin, neue Einsicht in die Wirkungsweise von Enzymen, Hormonen und andern physiologisch wirksamen Proteinen zu erlangen. Man weiss ver   hältnismässig    wenig über das Verhältnis zwischen der chemischen Struktur und der biologischen Wirkung dieser wichtigen Substanzen. Man weiss zum Beispiel wenig über spezifische Wirkungsstellen bei Enzymen, den Grund für die spezifische Wirkung und die Funktionen der Enzymteile, die bei enzymatischen Reaktionen scheinbar keine Rolle spielen. Kein einziges Enzym ist je auf chemischem Weg synthetisch hergestellt worden.



  Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Verfahren sind vollständig unzulänglich, um in diese Probleme der chemischen Struktur und der biologischen Wirkung Einsicht zu erlangen, da sie ohne den Aufwand mehrjähriger Arbeit zur Zubereitung der vielen verschiede nen Analoga natürlich vorkommender physiologisch wirksamer Substanzen, die zur Erlangung einer solchen Einsicht nötig wären, nicht hergestellt werden können. Dank einer solchen Einsicht könnte die Behandlung von Krankheiten auf eine rationellere Basis   abge-    bracht werden.



   Obwohl eine Anzahl synthetischer Verfahren vorgeschlagen wurde, ist bis anhin kein ideales Verfahren zur Herstellung von Peptiden entdeckt worden. Es ist kein erfolgreiches Herstellungsverfahren entwickelt worden, das die Bildung aufeinanderfolgender   Peptidbin-    dungen in einer wachsenden Peptidkette ermöglicht und die oft schwierige Stufe des selektiven Entfernens der Schutzgruppe ohne die Notwendigkeit der Isolierung von Zwischenprodukten bei jeder aufeinanderfolgenden Stufe vermeidet. Die bis anhin verwendeten Verfahren waren langwierig, kostspielig und zeitraubend.

  Zur Bildung eines einfachen Dipeptids durch Umsetzung zwischen zwei verschiedenen Aminosäuren war es bei den bekanntesten bisherigen Verfahren erforderlich, die Aminogruppe der einen Aminosäure und die Carboxylgruppe der andern Aminosäure zu sperren, so dass eine selektive Umsetzung zur Bildung des alleinigen erwünschten Dipeptids unter den vier möglichen Produkten stattfindet. Dazu ist die Aktivierung der zu  reagierenden Carboxylgruppe im allgemeinen durch Umwandlung in ein Säurehalogenid oder in eine andere Modifikation, die reaktionsfähiger als die Carboxylgruppe ist, erforderlich. Die beiden Moleküle werden dann zur Bildung des Dipeptids kondensiert, und schliesslich werden die Sperrgruppen entfernt.

  Die Umsetzungen erfordern dann, dass (1) die Sperrgruppen angebracht werden, (2) die Carboxylgruppe aktiviert wird, (3) eine Kondensation stattfindet und (4) die Sperrgruppen entfernt werden. Das ganze Verfahren muss wiederholt werden, um eine einzige weitere Aminosäure zum Dipeptid hinzuzufügen, und muss für jede weitere Aminosäure nochmals wiederholt werden. Um Polypeptide für eine wirklich bedeutungsvolle Untersuchung herzustellen, ist es darüber hinaus im allgemeinen notwendig, eine Razemisierung der Aminosäuren und Peptide während dieser Umsetzungen zu vermeiden, damit man optisch reine Produkte erhält.

  In Anbetracht dieses Razemisierungsproblems und der Tatsache, dass die Gesamtausbeute bei der Peptidsynthese sehr niedrig ist und dass es über   106    mögliche Polypeptide mit nur 20 verschiedenen   Aminosäuresegmenten    gibt, so ist es kaum erstaunlich, dass trotz der anerkannten Wichtigkeit solcher Produkte nur sehr wenig   grosse    Peptide und einfache Proteine tatsächlich hergestellt worden sind. Die bis anhin erzeugten Produkte haben mehrere Jahre Arbeit erfordert. Mehrere Forschergruppen in der ganzen Welt haben am Insulin gearbeitet, und dessen erfolgreiche Synthese war das Ergebnis von zehn Jahren Anstrengungen seitens einer dieser Gruppen.



   Ein Verfahren, dem zur nicht gesteuerten Synthese von Homopolymeren, wie zum Beispiel   Poiyalanin    und Polyglutaminsäure, von verschiedenen Molekulargewichten und zur nicht gesteuerten Synthese von   Hetero-    polymeren mit willkürlich angeordneten Aminosäuresegmenten grosse Beachtung geschenkt worden ist, ist das N-Carboxyanhydrid-Verfahren, das wir hierin als das NCA-Verfahren bezeichnen. Diese Polymerisationsumsetzungen sind unter Verwendung katalytischer Mengen an Base in organischen Lösungsmitteln durchgeführt worden.

  Die erzeugten Produkte weisen eine oberflächliche   Shnlichkeit,    was gewisse ihrer physikalischen Eigenschaften betrifft, mit natürlichen Proteinen auf, doch sind sie für das Studium der chemischen und physiologischen Eigenschaften der Proteine kaum von Wert. Übrigens lassen sich diese Verfahren nicht zur Erstellung von Heteropeptiden von bekannter Struktur und bekanntem Molekulargewicht, die spezifisch angegebene Aminosäuren in vorbestimmten Stellungen in der Peptidkette aufweisen, verwenden.



   Infolge der Leichtigkeit, mit der Homopeptide gebildet werden, haben andere angenommen, dass das NCA-Verfahren sich zur gesteuerten stufenweisen Synthese von Heteropeptiden verwenden lassen könnte.



   Tatsächlich wurden schon früh Versuche unternommen, um das Verfahren der Synthese von Heteropeptiden von niedrigem Molekulargewicht in organischen Lösungsmitteln   anzuparsen.    Das Verfahren ist nie in einem wässerigen Milieu zu gesteuerten stufenweisen Synthese von Heteropeptiden, bei der zwei oder mehr Aminosäuren in aufeinanderfolgenden Stufen einer wachsenden Peptidkette beigefügt worden, verwendet worden.



   Die Schlussfolgerung derjenigen, die solche aufeinanderfolgende Umsetzungen vorschlugen, war, dass die stufenweise Synthese von Polypeptiden nach dem NCA Verfahren unmöglich sei, da die verhältnismässigen Geschwindigkeiten der Hauptumsetzung und der Nebenreaktionen nicht gesteuert werden können.



   Es hat sich nun herausgestellt, dass es möglich ist, das NCA-Verfahren zur Herstellung von Heteropeptiden zu verwenden. Bei diesem Verfahren wird eine Ausgangs aminosäure zuerst in ein N-Carboxyaminosäureanhydrid umgewandelt. Diese Umwandlung weist zwei Vorteile auf. Sie sperrt die Aminogruppe und aktiviert zugleich die Carboxylgruppe. Das Anhydrid wird dann mit einer andern Aminosäure oder einem andern Peptid zur Bildung eines N-Carboxydipeptids oder eines höheren Peptids umgewandelt, das durch die Carboxylierung in die gewünschte Verbindung umgewandelt wird. In organischen Lösungsmitteln findet eine solche Decarboxylierung in Gegenwart einer Base so leicht statt, dass die Umsetzungen nicht gesteuert werden können, was zur Bildung von Polymeren und andern unerwünschten Produkten führt. Es wurde nun gefunden, dass in Wasser eine solche ungesteuerte Umsetzung vermieden werden kann.



   Die Verwendung eines wässerigen Milieus würde sich aus verschiedenen Gründen in idealer Weise zur gesteuerten stufenweisen Synthese von Polypeptiden eignen. Ein Hauptgrund ist der, dass Aminosäuren und Peptide im allgemeinen in einem wässerigen Milieu löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, da sie   Ionenarten    bilden und im Fall von Peptiden hydrophile Amidgruppen enthalten. Ferner fördern organische Lösungsmittel oft die Razemisierung bei der Synthese von Peptiden und können höhere Peptide denaturieren. Wir machen übrigens darauf aufmerksam, dass in der Natur vorkommende Peptide und Proteine sich fast immer in einem wässerigen Milieu befinden.



   Die Steuerung des NCA-Verfahrens in einem wässerigen Milieu ist derart schwierig, dass kein Versuch je unternommen worden ist, um es zur stufenweisen Synthese von Heteropeptiden in einem solchen Milieu zu verwenden. Die Hauptfaktoren, die die Steuerung erschweren, sind (1) die Polymerisation, (2) die   Über-    reaktion, (3) die Hydrolyse von NCA und (4) die Beeinflussung der Umsetzung durch befreites Kohlendioxyd. Die Polymerisation und die Überreaktion rühren von einer vorzeitigen Decarboxylierung der N-Carboxy Zwischenverbindung her, so dass das erzeugte Produkt vorliegt, um mit dem ausgewählten Ausgangsstoff um Reaktion mit dem N-Carboxyanhydrid-Reaktionsteil- nehmer zu konkurrieren. Ähnlich führt die Hydrolyse des Ausgangsanhydrids zu einer Unvollständigkeit der Umsetzung infolge von ungenügendem Ausgangsanhydrid.

  Das aus irgendeinem der   Zwischenverbindungen    befreite Kohlendioxyd kann vorzugsweise mit dem Ausgangsstoff reagieren und es inaktiv machen, was eine Unvollständigkeit der Umsetzung bewirkt.

 

   Eine andere Schwierigkeit, die sich bei der Anwendung des NCA-Verfahrens zur stufenweisen Synthese ergibt, ist in Tat und Wahrheit eine andere Form des Problems der Steuerung. Es ist dies die Schwierigkeit der Reinigung. Wenn bei der Peptidsynthese nicht jede aufeinanderfolgende Stufe so durchgeführt wird, dass die Polymerisation, die Unvollständigkeit der Umsetzung und die   Überrealttion    gesteuert werden, wird das Reaktionsmedium von unerwünschten Nebenprodukten unterminiert, einschliesslich Reaktionsprodukte von geringerem oder grösserem Molekulargewicht, insbesondere solche, die sich vom gewünschten Peptidprodukt nur durch ein oder zwei Aminosäuren unterscheiden. Eine Verunreinigung kann auch  von der Herstellung von Peptiden herrühren, die dasselbe Molekulargewicht wie das gewünschte Peptidprodukt, jedoch eine falsche Reihenfolge aufweisen.

  Die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Nebenprodukte sind denen des gewünschten Produktes zu ähnlich, dass eine Trennung äusserst schwierig und oft unmöglich ist.



   Natürlich können gewisse Verunreinigungen toleriert werden, insbesondere diejenigen, die infolge von Unterschieden in den physikalischen und chemischen Eigenschaften vom gewünschten Produkt leicht getrennt werden können. Unlösliche Polymere lassen sich durch Filtrieren leicht trennen.



   Trotz der bis anhin erzielten entmutigenden Ergebnisse und der davon abgeleiteten ungünstigen Schlussfolgerungen hat man nun gefunden, dass das NCA Verfahren verwendet werden kann, um eine gesteuerte stufenweise Peptidsynthese in Wasser einfach und rasch mit oder ohne Isolierung von Peptid-Zwischenprodukten zur Bildung von Polypeptid, wie zum Beispiel Oxytocin, Vasopressin, Angiotensin oder Bradykinin, und eiweissartigen Substanzen, wie zum Beispiel Adrenocorticotropin und Insulin, zu erzielen. Ferner ermöglicht das vorliegende erfindungsgemässe Verfahren die Synthese für Peptide und Proteine, einschliesslich Enzyme und Hormone, die nach bis anhin verwendeten Verfahren nicht hergestellt werden konnten.



   Das erfindungsgemässe Grundverfahren zur gesteuerten Synthese von Peptiden und deren Derivaten mit mindestens zwei Amidbindungen in der Peptidkette besteht darin, als Ausgangsstoff eine Aminoverbindung der aus Aminosäuren, Peptiden und deren Derivaten, die eine freie Aminogruppierung enthalten, bestehenden Gruppe mit einem N-Carboxyaminosäureanhydrid oder einem Derivat davon umzusetzen, indem die Reaktionsteilnehmer in einem wässerigen Medium unter solchen gesteuerten Bedingungen zusammengebracht werden, dass die einzige Aminogruppe, die im Verlauf der Umsetzung in örtlicher Konzentration in reaktionsfähiger Form vorliegt, die Aminogruppe der Aminosäure, des Peptids oder dessen Derivats ist, die zur Bildung des gewünschten Produktes reagieren soll, und dass keine andere vorhandene Aminogruppe, einschliesslich derjenigen im erzeugten Peptidprodukt, in einer solchen Konzentration vorliegt.

  Unter den sorgfältig gesteuerten Bedingungen der vorliegenden Erfindung geht die Umsetzung zwischen dem Anhydrid und der Amino säure, dem Peptid oder einem Derivat davon bei jeder Stufe der Synthese mit einer minimalen Bildung von Nebenprodukten vor sich, die die nächste Anhydridumsetzung oder die Reinigung des gewünschten Produkts stören würde. Unter den gesteuerten Bedin gungen wird die N-Carboxy-Zwischenverbindung vor einer Decarboxylierung bewahrt oder, wenn die Decarb oxylierung tatsächlich stattfindet, wird die erzielte
Aminogruppe durch Protonierung geschützt, bis sich der im wesentlichen ganze Ausgangsstoff mit dem An hydrid umgesetzt hat.

  Das Ergebnis dieser sorgfältigen
Steuerung besteht darin, dass die schnellste Umsetzung diejenige ist, die das gewünschte Produkt bildet, und die Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte, insbeson dere derjenigen, die von einer   Überreaktion    und Polymerisation herrühren, in einem solchen Rahmen gehalten wird, dass sie die nachfolgenden Stufen der gesteuerten Synthese nicht stört. Nach der Zersetzung der N-Carboxy-Zwischenverbindungen und von allfällig nicht umgesetztem Anhydrid kann das auf diese Weise erzeugte Peptidprodukt unter gleichen   Reaktionsbedin-    gungen ohne Isolierung von Zwischenprodukten mit einem anderen Anhydrid weiter umgesetzt werden.

  Die vorliegende Erfindung lässt sich zur Herstellung von Dipeptiden bei einer Ausbeute, die normalerweise 95 bis   98 S    beträgt und oft im wesentlichen quantitativ ist, sowie zur Herstellung von Polypeptiden und Proteinen von vorbestimmter Struktur verwenden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden ist nun dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einem N-Carboxyaminosäure-anhydrid (A) oder einem N-Thiocarboxy-aminosäure-anhydrid (B) der Formeln:
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 worin R ein Aminosäurerest ist, in einem wässerigen Medium unter derartigen pH- und Temperaturbedingungen sowie bei solcher Rührgeschwindigkeit umsetzt, dass nur die gewünschte Aminogruppe der Aminosäure bzw. des Peptids in brauchbarer Konzentration zur Reaktion gelangt und alle anderen gegebenenfalls vorhandenen Aminogruppen vergleichbarer Basizität blokkiert sind und die Umsetzung mit der höchsten Geschwindigkeit jene ist, die zum gewünschten Peptid führt und das erhaltene Zwischenprodukt decarboxyliert.



   Im Reaktionsgemisch zur erfindungsgemässen Herstellung eines Peptids können zusätzlich zur Aminogruppe, die zur Bildung des gewünschten Produktes reagieren muss, eine oder mehrere Aminogruppen vorhanden sein. Dazu können zum Beispiel weitere basische Gruppen am Anhydrid, wie zum Beispiel die Omega-Aminogruppe von Lysin, die Guanadin-Gruppe von Arginin oder die Imido-Gruppe von Tryptophan, gehören. Sie können auch Aminogruppen der als Ausgangsstoff verwendeten Aminosäure oder des als Ausgangsstoff verwendeten Peptids umfassen. Die Aminogruppe des Produkts, d. h. die durch Decarboxylierung des Carbamat-Zwischenprodukts erzeugte Aminogruppe, muss auch   in    Betracht gezogen werden. Jede dieser Gruppen oder alle zusammen sind potentiell fähig, durch Wetteifern um das Ausgangsreagens, d. h. das N-Carboxyanhydrid, den Verlauf der gewünschten Umsetzung zu stören. 

  Es geht daraus hervor, dass die Konzentration dieser potentiellen Störungsgruppen in ihren reaktionsfähigen Formen als freie Amine auf ein Minimum beschränkt werden muss.



   Der Einfachheit halber beschränken wir die vorliegende Erläuterung auf nur zwei Aminogruppen, A und B. Die Aminogruppe A ist die Gruppe, die zur Bildung des gewünschten Produkts reagieren soll, während die Aminogruppe B die potentielle Störungsgruppe ist. Je nach der verhältnismässigen Basizität der beiden Gruppen können verschiedene Situationen entstehen. Ist B eine viel stärkere Base als A, so kann die Umsetzung bei einem pH stattfinden, bei dem der Grossteil von B durch Protonierung geschützt und der Grossteil von A nicht protoniert und deshalb reaktionsfähig ist. Der pH muss jedoch hoch genug sein, um das Carbamat zu stabilisieren.

  Aus demselben Grund sollte, wenn die  bei Decarboxylierung des Carbamats erzeugte Aminogruppe des gebildeten Produkts wesentlich basischer als die Aminogruppe des Ausgangsstoffs ist, die Umsetzung bei einem derartigen pH durchgeführt werden, dass die Aminogruppe des Produkts und die Aminogruppe B durch Protonierung geschützt und die Aminogruppe A nicht geschützt ist.



   Weisen A und B eine im wesentlichen gleiche Basis zität auf, so ist es im allgemeinen nicht möglich, die Konzentration der Aminogruppe A in bezug auf die Aminogruppe B durch Einstellen des pH-Werts zu erhöhen, und B muss durch eine Sperrgruppe, zweckmässig eine Carbobenzoxygruppe, geschützt werden. Der pH der Umsetzung muss jedoch immer noch so gewählt werden, dass andere potentiell konkurrierende Aminogruppen durch Protonierung geschützt werden.



   Ist A eine wesentlich stärkere Base als B, so wird die Umsetzung zweckmässig bei einem hohen pH, z. B.



  9-11, durchgeführt. Unter diesen Bedingungen ist die Gruppe A eine wesentliche Konzentration als freies Amin. Auch wenn B als freies Amin vorliegt, ist das erzeugte Produkt das durch Umsetzung mit der Aminogruppe A gebildete Produkt, das man zu erzielen wünscht.



   In den beiden letzteren Fällen soll der pH hoch genug sein, um das Carbamat zu stabilisieren. Der pH muss im allgemeinen unter etwa 11 gehalten werden.



  Die Steuerung des pH-Wertes ist jedoch wesentlich, da über einem pH von etwa 11 die Konzentration an Hydroxylionen hoch genug ist, so dass eine konkurrierende Umsetzung mit dem N-Carboxyanhydrid erfolgt.



   In gewissen Fällen ist es nicht notwendig, die Aminogruppe B zu schützen.   Dies    ist oft bei Polypeptiden von hohem Molekulargewicht der Fall, bei denen eine potentiell störende Gruppe infolge von sterischen Faktoren nicht reaktionsfähig ist.



   Die Umsetzung wird bei einem schützenden pH durchgeführt. Der Ausdruck  schützender   pH     umfasst die Wasserstoffionenkonzentration, bei der die zu reagierende Aminogruppe in merklicher Konzentration in reaktionsfähiger Form, d. h. in Form einer freien Aminogruppe, die mit Acylierungsmitteln reaktionsfähig ist, vorliegt, potentiell störende Aminogruppen geschützt sind, die Carbamat-Zwischenverbindung stabilisiert oder die von deren Carboxylierung herrührende Aminogruppe protoniert ist. Der Ausdruck umfasst auch die Steuerung des pH-Werts, so dass die Hydrolyse des N-Carboxyaminosäureanhydrids auf ein Minimum beschränkt ist.



   Es gibt für jede Umsetzung einen optimalen schützenden pH. Je nach der jeweiligen Umsetzung kann dieser pH   4-11    betragen. Bei Umsetzungen, bei denen das Carbamat die schützende Gruppe ist, liegt der optimale schützende pH auf der alkalischen Seite und beträgt gewöhnlich 8-10,5, vorzugsweise im Bereich von 10,0-10,5. Im Fall von   Peptid-Reaktionsteilneh    mern kann der schützende pH für eine im wesentlichen vollständige Umsetzung wesentlich niedriger als bei Aminosäuren-Reaktionsteilnehmern sein. Ist das Produkt ein solches, bei dem die Aminogruppe durch Protonierung geschützt wird, so liegt der optimale schützende pH auf der Säureseite und beträgt gewöhnlich etwa 4-6. Wenn dies bestimmt ist, soll die Umsetzung unter Bedingungen ausgeführt werden, bei denen der pH so nahe wie möglich beim optimalen schützenden Wert gehalten wird.

  Abweichungen des pH-Werts können durch eine schnell reagierende Elektrode verfolgt werden, und es ist zweckmässig, den pH durch automatisches Titrieren oder durch äusseren Zusatz eines neutralisierenden Reagens zu steuern.



  Selbst   rnit    diesen Vorsichtsmassnahmen ist es infolge der hohen Reaktionsgeschwindigkeit oft schwierig, den pH beim genauen optimalen schützenden Wert zu halten. Eine gewisse Abweichung vom optimalen schützenden pH ist   annehmbar.    Vorzugsweise soll der pH jedoch nicht um mehr als 0,2 Einheiten vom optimalen schützenden Wert abweichen, obwohl Abweichungen von bis zu 0,5 Einheiten vom schützenden pH toleriert werden können.



   Probereaktionen können   vorgenorunen    werden, um den schützenden pH und die optimalen Bedingungen hinsichtlich der Konzentration, der Temperatur, der Dauer und des molaren Überschusses an Anhydrid, die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens nützlich sind, zu bestimmen. Zum Beispiel können bei der Herstellung eines Polypeptids Probeumsetzungen mit Teilmengen des Reaktionsgemisches zur Erzeugung des nächsthöheren Glieds einer Reihe bei einer Anzahl verschiedenen pH-Wert, Konzentration, Temperaturen, Reaktionsdauern und molarer   Uber-    schüsse an Anhydrid durchgeführt werden.

  Die Ergebnisse werden durch Bestimmung der Ninhydrinfarbe der Verwendung herkömmlicher   Dünnschichlchromat    graphie- und Papierchromatographie-Verfahren mit verschiedenen Lösungsmittelkombinationen, wie zum Beispiel   n-Butanol-EssigsäureWasser,    sek. Butanol-Essigsäure-Wasser, Pyridin-Isoamylalkohol-Wasser, Phenol Wasser und Isoamylalkohol-Wasser, geschätzt. Das Produkt kann unter Verwendung einer von verschiedenen Farbreaktionen, z. B. der Ninhydrinreaktion, lokalisiert werden. Es ist ebenfalls zweckmässig, bei der Analyse von Versuchsreaktionen radioaktive Indikatorverfahren zu verwenden. Solche Verfahren ermöglichen eine leichte Bestimmung des Rt-Werts für jedes neue Produkt sowie eine Schätzung der Ausbeute an Produkt und der prozentualen Kontaminierung durch Nebenprodukte.

  Zum Beispiel kann bei der Herstellung eines Polypeptids von hohem Molekulargewicht unter Verwendung eines radioaktiven Verfahrens jedes neue radioaktive Produkt der nächsten Stufe der Synthese unterzogen werden und aufgrund der radioaktiven Messungen die Ausbeute in dieser nächsten Stufe unter verschiedenen Reaktionsbedingungen bestimmt werden.



  Aus diesem Grunde werden radioaktive N-Carboxyaminosäureanhydride jeder der gewöhnlich verwendeten Aminosäuren hergestellt und in Versuchsreaktionen verwendet. Eine zweckmässige Versuchsmenge für die Versuchsreaktion ist 1,0 Millimol Reaktionsteilnehmer pro 15 ml wässeriges Gemisch. Es ist besonders nützlich, eine Reihe von mit Radioisotopen versetzten Verbindungen für jede mit   C14-Kohlenstoff,    Deuterium und beiden Isotopenelementen indizierte Aminosäure herzustellen. Diese Isotopen können nach bekannten   Verfah    ren differenziert gemessen werden. Dieser Faktor gestattet eine genaue Identifizierung des Produkts.

 

   Die Reaktion erfolgt recht rasch und ist im wesentlichen in einer Minute oder weniger vollständig.



  Es ist selten nötig, die Umsetzung mehr als 5 Minuten durchzuführen. Wenn erwünscht, kann der Verlauf der Umsetzung verfolgt werden, indem kleine Mengen dem bekannten Hydroxyaminsäureversuch unterzogen werden; die Umsetzung kann fortgesetzt werden, bis der Versuch negativ ausfällt, was zeigt, dass im we  sentlichen das gesamte N-Carboxyanhydrid umgesetzt ist.



   Unter den für die vorliegende Erfindung wesentlichen   Steuerungsbedingungen    haben wir entdeckt, dass, indem jede Umsetzung unter Bedingungen von innigem Mischen, z.B. unter raschem Schütteln, so dass Durchwirbelung erfolgt, durchgeführt wird, Nebenreaktionen weitgehend eleminiert werden können, wodurch die Ausbeute im wesentlichen quantitativ wird. Dazu wird durch schnelles Mischen gewährleistet, dass das N-Carboxyanhydrid nicht an Stellen, wo es an Ausgangsmaterial fehlt, hydrolysiert oder polymerisiert wird.   Sol-    che unerwünschten Nebenreaktionen sind bei einer Dauer, die über die oben erwähnte hinaus geht, beträchtlich.



  Ähnlich verkürzt ein rasches Mischen durch Erleichterung der Auflösung des N-Carboxyanhydrids die Reaktionsdauer und vermeidet eine Zersetzung des Carbamat-Produkts, eine unerwünschte Nebenreaktion, die sowohl zu einer   Überreaktion    als auch zu einer Inaktivierung vom Ausgangsstoff führt.



   Die Umsetzung wird normalerweise bei einer Temperatur von unter 100 C und vorzugsweise von -5 bis   5  C    durchgeführt. Dies ist ein wichtiger Faktor der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung erforderlichen Steuerung. Der pK-Wert von Wasser nimmt mit abnehmender Temperatur ab. Bei   0     C beträgt der pK Wert von Wasser   10-15.    Es ist offensichtlich, dass, wenn man bei etwa   0  C    arbeitet, die Hydroxylionenkonzentration ohne gleichzeitige Zunahme der Wasserstoffionenkonzentration abnimmt. Dieses wichtige Merkmal der Steuerung der Umsetzung trägt dazu bei, die Hydrolyse des N-Carboxyanhydrid-Ausgangsstoffs und die Decarboxylierung des Carbamat-Zwischenprodukts auf ein Minimum zu beschränken.



   Oft können äquimolare Mengen Reaktionsteilnehmer verwendet werden. Wenn das NCA durch Hydrolyse teilweise aufgebraucht ist, wird es oft vorgezogen, überschüssiges Anhydrid zu verwenden, um eine vollständige Umwandlung des Aminosäure- oder Peptid-Ausgangsprodukts in das gewünschte Produkt zu gewährleisten. Der optimale Überschuss kann durch Versuchsreaktionen bestimmt werden. Das Ausmass des Überschusses, das innerhalb weiter Grenzen variieren kann, wird zweckmässig aufgrund solcher Faktoren wie der Typus des Anhydrids, das Molekulargewicht und die Basizität des Peptids oder eines äquivalenten Reaktionsteilnehmers bestimmt.

  Mit zunehmendem Molekulargewicht des Peptid-Produkts wird die Verwendung von überschüssigem Anhydrid weniger wichtig, da die physikalischen und chemischen Eigenschaften des gewünschten Produkts sich von denen, die von einer Hydrolyse des überschüssigen Anhydrids herrühren, merklich unterscheiden, so dass eine Isolierung und Reinigung des Polypeptid-Produkts leicht erfolgen kann.



   Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist die Leichtigkeit, mit der die Schutzgruppe entfernt werden kann. So erfolgt die Decarboxylierung spontan, wenn die Umsetzung bei einem solchen pH durchgeführt wird, dass das Produkt durch Protonierung geschützt wird. Ein unter alkalischen Bedingungen beständiges Carbamat wird ohne weiteres decarboxyliert, indem der pH durch Zusatz von Säuren herabgesetzt wird.



   Erfordert das Zwischenprodukt eine Decarboxylierung, so erfolgt diese am zweckmässigsten, indem die Wasserstoffionenkonzentration des Reaktionsmilieus auf ein saures pH, z.B. etwa 3-5, gebracht wird. In einer Alternative kann die Decarboxylierung durchgeführt werden, indem man das Gemisch stehenlässt, leicht erhitzt oder gefriertrocknet. Infolge der dabei erforderlichen Zeitdauer werden diese Verfahren jedoch nicht vorgezogen.



   Das Durchleiten eines inerten Gases, wie z. B. Stickstoff, durch das Gemisch während der Decarboxylierung trägt zum vollständigen Entfernen von Kohlenstoffdioxyd bei dessen Bildung bei.



   Nach der Decarboxylierung kann eine zusätzliche Aminosäure oder ein Derivat davon der Peptidkette beigefügt werden, indem das oben beschriebene Verfahren wiederholt wird.



   Es gibt eine ganze Anzahl Verfahren, die verwendet werden können, um zur Steuerung des pH-Werts beizutragen. Zum Beispiel kann die Umsetzung in einem Puffer durchgeführt werden. Es kann irgendeines einer Anzahl von Puffersystemen verwendet werden, wobei die Wahl eines bestimmten Puffers durch den in der Versuchsreaktion bestimmten schützenden pH bestimmt wird. Es können Borat- und Phosphatpuffer verwendet werden. Kaliumborat ist besonders nützlich, um einen alkalischen pH beizubehalten.



   Die Umsetzung kann in einer Magnesiumhydroxyd Aufschlämmung durchgeführt werden, um einen pH von 10 beizubehalten.



   Bariumhydroxyd ist eine zweckmässige Base zur pH Steuerung, da das Barium sich durch Fällen mit einer Säure, wie z.B. Schwefelsäure, leicht aus dem Reaktionsgemisch entfernen lässt. Ein Vorteil dieses Ver   fahrens    besteht darin, dass ein grosser Teil der anorganischen Salze entfernt wird, so dass diese sich nicht im Verlauf verschiedener aufeinanderfolgender Stufen anhäufen und somit die Reinigung des Endproduktes erschweren.



   Es kann ein äusserer Zusatz einer Base, zweckmässig Natrium- oder Kaliumhydroxyd, vorgenommen werden, um eine genaue Steuerung während der Umsetzung aufrechtzuerhalten, z. B. wenn der pH-Wechsel durch ein   pH-Meter    verfolgt wird. Häufig kann ein solcher Zusatz zusammen mit einem Puffer verwendet werden.



   Wenn man unter den oben beschriebenen Bedingungen arbeitet, können Peptide von vorbestimmter Struktur durch aufeinanderfolgende Umsetzungen einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Derivats davon mit dem ausgewählten N-Carboxyanhydrid hergestellt werden, worauf, wenn nötig, die erzielte N-Carboxyverbindung decarboxyliert wird und die Umsetzung ohne Isolierung der erzeugten Produkte so oft im   u°sprüng-    lichen Reaktionsmilieu wiederholt wird, wie notwendig ist, um das   de    gewünschte Kettenlänge aufweisende Peptidprodukt zu erzielen. Es ist ebenfalls zweckmässig, ein N-Carboxyanhydrid eines Peptids mit einem anderen Peptid umzusetzen, um Peptide mit einem hohen Molekulargewicht von genau bekannter Struktur zu erzielen.

 

   Normalerweise ist das Peptid unter sauren und basischen Bedingungen löslich, da es amphoter ist.



  Gelegentlich ist die Struktur des erzeugten Produkts so, dass es unter den Reaktionsbedingungen oder bei einer späteren Einstellung des pH-Werts ausfällt. In einem solchen Fall ist es oft von Vorteil, das Produkt durch Filtrieren zu isolieren und nachfolgende Umsetzungen in einem frischen wässerigen Milieu durchzuführen. Oft fallen ein hohes Verhältnis Aminosäuren mit aromatischen Säuren aufweisende Peptide, wie z. B.  



  Phenylalanin oder Tyrosin, nach der Decarboxylierung aus einer sauren Lösung aus. In gewissen Fällen sind Carbamatsalze von Peptiden im basischen Milieu, in dem sie erzeugt werden, unlöslich und fallen aus. Diese Salze können durch Filtrieren isoliert und in frischer wässeriger Säure decarboxyliert werden, bevor sie mit einem andern Anhydrid umgesetzt werden.



   Wie bereits betont, werden beim erfindungsgemässen Verfahren die gewünschten Produkte in einem ausgezeichneten Einheitsgrad und in hoher Ausbeute bei einer minimalen Anhäufung von   Nebenprodukten    erzeugt.



  Die dabei gebildeten Nebenprodukte unterscheiden sich im allgemeinen in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften genügend, um die nachfolgenden Umsetzungen nicht wesentlich zu stören. Es ist jedoch von Vorteil, die   gewünschten    Zwischenprodukte von Zeit zu Zeit, zum Beispiel nach 10 oder 15 Umsetzungen, zu isolieren. Oft ist die Struktur des hergestellten Peptids eine solche, dass es sich sehr leicht von angesammelten Nebenprodukten isolieren lässt. Zum Beispiel kann ein Arginin oder eine andere basische Aminosäure enthaltendes Peptid leicht gereinigt werden, indem es mit einem kationischen Ionenaustauscherharz, zum Beispiel einem Carbonsäureharz, wie zum Beispiel Amberlit IRC 50, auf dem   Säurezyklus    bei einem pH, bei dem das Peptid und die Nebenprodukte selektiv absorbiert und eluiert werden, zusammengebracht wird.

  Das das Peptid enthaltende Eluat kann als   ReaktionFmilieu    für eine nachfolgende Umsetzung mit einem andern Anhydrid verwendet werden. Ähnliche Verfahren können mit Dicarbonsäure Aminosäure enthaltenden Peptiden befolgt werden.



   Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten End- und Zwischenprodukte können nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren, wie z.B. durch Kristallisation, Aussalzen, zum Beispiel mit Ammoniumsulfat, oder Einstellung des pH-Werts auf den Punkt, wo das Produkt ausfällt, isoliert werden. Möglich ist auch eine chromatographische Trennung unter Verwendung von Silicagel, Ionenaustauscherharzen oder chro   matographischen    Mitteln mit einem molekularen Sieb, wie zum Beispiel vernetzte Dextrane, die in verschiedenen Formen unter der Handelsbezeichnung  Sephadex  von der Firma A. B. Pharacia, in Uppsala (Schweden), erhältlich sind. Ein sehr zweckmässiges Verfahren besteht darin, das Endprodukt mit einem leicht entfernbaren  Griff  herzustellen.

  Zum Beispiel reagiert eine stark basische Gruppe, wie zum Beispiel die basische Gruppe von Alginin, leicht mit einem Ionenaustauscherharz oder einem anderen Reagens, wobei das gewünschte Produkt von den kein Arginin enthaltenden Nebenprodukten getrennt wird. Der  Griff  wird dann entfernt. Ist zum Beispiel das gewünschte Produkt ein Hexapeptid, so ist es zweckmässig, ein Heptapeptid mit Arginin als Carboxy-Endaminosäure herzustellen.



  Das Arginin ist stark basisch, und infolgedessen wird das Heptapeptid ohne weiteres von einem kationischen Ionenaustauscherharz absorbiert, so dass eine Trennung von den Nebenprodukten erfolgt. Das Heptapeptid wird dann eluiert und der Einwirkung des Enzyms Carboxypeptidase-B unterzogen, das das Arginin selektiv entfernt und das gewünschte Hexapeptid zurücklässt.



   Der Arginin- Griff  ist auch bei der   Herctellung    von Polypeptiden von Nutzen, bei der ein Überschuss an N-Carboxyanhydrid im Verlauf der Herstellung verwendet wird. Wurde in einer früheren Stufe der Umsetzung das N-Carboxyanhydrid oder Arginin der Polypeptidkette beigefügt oder ist Arginin die Carboxy End-Aminosäure, so weist das erzielte Arginin, das ein Polypeptidprodukt enthält, physikalische und chemische Eigenschaften auf, die eine leichte Trennung von irgendeinem der unerwünschten Nebenprodukte ermöglicht, insbesondere von denen, die von der Verwendung von überschüssigem Anhydrid bei einer oder mehreren Stufen herrühren. Das Produkt kann wie oben beschrieben isoliert werden, und, wenn erwünscht, kann ein Carboxy-End-Arginin mit Carboxypeptidase-B entfernt werden.



   Ein Verfahren, das zur Isolierung von Produkten besonders nützlich ist, ist ein   chromatographlsches    Verfahren mit Kapillarfluss. Dieses Verfahren ist ähnlich wie Dünnschichtchromatographie im grossen Massstab.



  Man bemüht sich, die Bedingungen der Dünnschichtchromatographie so genau wie möglich zu wiederholen, nur werden grössere Mengen Reagenzien verwendet.



  Man behält dasselbe Verhältnis von aufsaugendem Stoff zu Aminosäure oder Peptid bei.



   Im Verfahren wird eine Säule mit Silicagel, Cellulose oder einem andern zweckmässigen aufsaugenden Stoff gefüllt. Man bringt eine das Peptid enthaltende Lösung mit einem unteren Abschnitt der Säule   in    Berührung und lässt sie sich entwickeln. Es ist beobachtet worden, dass Rr-Zwischenwerte der Komponenten des Reaktionsgemisches im wesentlichen parallel zu durch Dünnschichtchromatographie bestimmte   R-Werte    für dieselben Bestandteile sind. Der geeignete Abschnitt der das gewünschte Produkt enthaltenden Säule, der durch Dünnschichtchromatographie bestimmt wird, wird dann einfach herausgeschnitten und eluiert. In einer Alternative kann die Oberfläche der Säule mit Ninhydrin oder einem anderen Reagens, das eine Farbänderung zur Lokalisierung des Produkts bewirkt, besprüht werden.



  Die Säule wird dann durchgeschnitten, die gefärbte Oberflächenschicht abgekratzt und das Produkt auf dem verbleibenden Teil des Abschnitts eluiert.



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann sowohl bei natürlichen als auch bei synthetischen Aminosäuren und Peptiden sowohl in deren rechts- als auch in deren linksdrehenden Form verwendet werden. Es kann bei Verbindungen, die andere funktionelle Gruppen als die Amino- und Carboxylgruppen der gewünschten Peptidbindung aufweisen, wie z. B. Tyrosin, Arginin, Threonin, Glutaminsäure und dergleichen, verwendet werden. Es lässt sich auch mit Derivaten verwenden, bei denen diese zusätzlichen funktionellen Gruppen durch eine Gruppe gehemmt sind, die sich nach der Peptidbildung leicht entfernen lässt, wie zum Beispiel die N-Carboxyanhydride von Im-Benzylhistidin, Trifluoracetylserin oder Tetrahydropyranyltyrosin. 

  Der Ausdruck  Derivate , wie er hierin verwendet wird, umfasst auch Amide, Euter und andere funktionelle Modifikationen der Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids sowie Homologe und Analoga natürlicher Aminosäuren, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome substituiert sind, zum Beispiel durch eine Niederalkylgruppe, wie zum Beispiel   a-Methylleucin    oder a-Fluorglycin. Diese letzteren Verbindungen sind besonders nützlich bei der Analyse der Beziehungen zwischen der Struktur und der Wirkung bei physiologisch aktiven Proteinen, wie zum Beispiel Hormonen, und bei der Herstellung von Antagonisten für solche aktive Proteine zwecks verschiedener therapeutischer Anwendungen.

  Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch zur Herstellung physiologisch aktiver Derivate  primärer und sekundärer Amine, Thioalkohole und aus Phosphor enthaltenden Säuren erzielter Verbindungen, wie zum Beispiel   Phosphateter,    verwendet werden.



   Infolge ihrer Struktur erfordern gewisse Aminosäuren eine besondere Berücksichtigung im erfindungsge mässen Verfahren.



   Der Imidazol-Stickstoff des N-Carboxyanhydrids von Histidin kann vor der Umsetzung durch die Bil dung eines Im-Benzyl-Derivates geschützt werden, das durch Hydrierung oder durch die Wirkung von Natrium in   Ammoniaktlüssigkeit    aus dem Peptid entfernt werden kann. Die Imidazolgruppe dieser Aminosäure scheint nicht die nachfolgenden Umsetzungen mit Anhydrid zu stören, wenn das Peptid gebildet ist. Die Hydroxylgruppe in Serin- und Threoninanhydriden oder zweckmässig durch Bildung von Trifluoracetyl- oder Trichloracetyl-Derivaten der entsprechenden N-Carb oxyanhydriden wird gehemmt. Diese Gruppen sind be sonders zweckmässig, da sie bei der Bildung des Peptids hydrolytisch entfernt werden können. Hydroxylgruppen können durch die Bildung von   Äthem,    wie z. B.

  Benzyl  äther, Tetrahydroanyläther, oder einem anderen Acetal oder Cetal geschützt werden.



   Es ist ein Merkmal des vorliegenden Verfahrens, dass die Anhydride von Asparagin- und Glutaminsäure in unerwarteter Weise ohne Schutz ihrer Carboxyl Endgruppen verwendet werden können.



   Cystin, das eine Dithioaminosäure mit   symmetri    schen   Aminoearbonsäure-Teilen    auf beiden Seiten der
Disulfid-Bindung ist, kann im vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren auf eine einzigartige Weise zur Bildung von zwei   idenrischen    Peptiden verwendet wer den, die jede Cystein und eine eine einzige   Sulfhydryl-   
Gruppe aufweisende Aminosäure enthalten. Beim vorliegenden Verfahren wird ein symmetrisches Di-N-Carboxyanhydrid von Cystin mit einem Aminosäure- oder Peptidausgangsprodukt oder einem Derivat davon zur Bildung eines symmetrischen Produkts mit mindestens einer Peptidbindung auf beiden Seiten der   Disulfidb:n-    dung umgesetzt.



   Zum Beispiel kann das   Anhydrid    von Cystin zur Bildung von bis(Alanyl)cystin mit Alanin umgesetzt werden. Daraufhin wird das Wachstum der Kette wie oben beschrieben fortgesetzt, zum Beispiel durch stufenweise Umsetzungen mit den Anhydriden von Leucin und Valin zur Bildung von   bis(Leucylvalylalanyl)cystin.   



  Wenn ein die gewünschte molekulare Struktur aufweisendes Polypeptid hergestellt worden ist, wird die Verbindung zum Beispiel mit Schwefelwasserstoff, Thioglykolsäure oder einem gleichwertigen Reduktionsmittel zur Abspaltung der   Disulfidbindung    reduziert, wobei zwei identische Moleküle des gewünschten Polypeptids, die Cystein enthalten, gebildet werden. Im vorgeschlagenen Beispiel wäre das Produkt Leucylvalylal anylcystein.



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist ohne weiteres zur Herstellung einer Reihe von Analoga langkettiger Proteine, wie zum Beispiel Enzyme oder Hormone, bei denen eine Aminosäure in der Mitte der Kette variiert wird, zu verwenden. Soll zum Beispiel die zehnte Aminosäure eines 20 Aminosäuren enthaltenden Polypeptids zur Herstellung von Analoga, bei denen alle andern Aminosäuren in derselben Reihenfolge gehalten werden, variiert werden, so ist es zweckmässig, zuerst eine Reihe von 9 Aminosäuren enthaltenden Peptiden und eine zweite Reihe von 10 Aminosäuren enthaltenden Peptiden herzustellen. Die Glieder der ersten Reihe werden durch Umsetzung mit N-Carboxyaminosäureanhydriden einer Vielfalt von Aminosäuren in verschiedene Dekapeptide umgewandelt.

  Jedes der auf diese Weise erzeugten Dekapeptide kann zur Bildung von 20 Aminosäuren enthaltenden Polypeptiden, bei denen die einzige Variable eine Aminosäure in der Mitte der Kette ist, mit Dekapeptiden gekuppelt werden. Eine solche Kupplung kann nach einem herkömmlichen Kupplungsverfahren, wie zum Beispiel dem Carbobenzoxyverfahren, durchgeführt werden.



   Ein weiterer und sehr wichtiger Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht darin, dass das Verfahren bei im wesentlichen vollständiger Steuerung der Razemisierung durchgeführt werden kann. Die optische Reinheit der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Produkte lässt sich leicht bestimmen, zum Beispiel indem sie der hydrolytischen Wirkung eines spezifischen Enzyms, wie zum Beispiel Leucinaminopeptidase, das nur ein optisches Isomer angreift, ausgesetzt werden.



   Es liegt kein Bericht vor über die Verwendung der Thioanaloga von   N-Carboxyaminosäureanhydriden,    bei denen der   Athersauerstoff    durch Schwefel ersetzt ist, zur gesteuerten schrittweisen Synthese von Hetero   Peptiden.    Diese Analoga sind nicht einmal bei der nicht gesteuerten Synthese von Homopeptiden von wesentlichem Molekulargewicht verwendet worden.



   Es wurde ferner festgestellt, dass diese Thio-Analoga vorteilhaft zur gesteuerten stufenweisen Synthese von Heteropeptiden verwendet werden können. Aus der gleichfalls oben angeführten Formel folgt, dass dies substituierte Thiazolid-2,5-dione, die als N-Thioanhydride von Aminosäuren betrachtet werden können, sind. Der Einfachheit halber werden sie hierin als N-Thiocarboxyaminosäureanhydride und das Herstellungsverfahren als TCA-Verfahren bezeichnet.



   Gemäss dieser Form der vorliegenden Erfindung wird ein   Aminooäure-Ausgangsprodukt    zuerst in ein   N-Thiocarboxyaminosäureanhydrid    umgewandelt. Das Thioanhydrid wird dann mit einer andern Aminosäure oder einem Peptid zur Bildung eines N-Thiocarboxydipeptids oder eines höheren Peptids umgesetzt, das durch die Thiocarboxylierung in die gewünschte Verbindung gesetzt wird. Es ist entdeckt worden, dass es gemäss nachstehend detaillierter angegebenen Verahrensbedingungen möglich ist, diese   Umçetzungen    so zu steuern, dass die gewünschten Produkte bei einer minimalen Bildung störender Nebenprodukte erzeugt werden.



  Wie das NCA-Verfahren wird das erfindungsgemässe TCA-Verfahren in wässerigem Milieu ausgeführt.

 

   Das TCA-Verfahren kann dazu verwendet werden, eine Peptidsynthese einfach und schnell in Wasser in gesteuerter stufenweiser Art mit oder ohne Isolierung von Peptid-Zwischenprodukten zur Bildung von Polypeptiden wie zum Beispiel Oxytocin, Vasopressin, Angiotensin oder Bradykinin, und eiweiss artigen Substanzen, wie zum Beispiel Adrenocorticotropin und Insulin, zu erzielen. Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Synthese höherer Peptide und Proteine, einschliesslich Enzyme und Hormone, die nach bis anhin verwendeten Verfahren nicht hergestellt werden konnten.



   Das erfindungsgemässe TCA-Verfahren zur gesteuerten Synthese von Peptiden und Derivaten davon besteht in der Umsetzung einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Derivats davon, das eine freie Aminogruppe enthält, als Ausgangsstoff mit einem N-Thio  carboxyaminosäureanhydrid oder einem Derivat davon, indem die Reaktionsteilnehmer in einem wässerigen Milieu unter solchen gesteuerten Bedingungen zusammengebracht werden, dass die einzige bei der Umsetzung in merklicher Konzentration und reaktionsfähiger Form vorliegende Aminogruppe die Aminogruppe der Aminosäure, des Peptids oder eines Derivats davon ist, die zur Bildung des gewünschten Produkts reagieren soll, und dass keine andere vorhandene Aminogruppe, einschliesslich derjenigen im erzeugten Peptidprodukt, in einer solchen Konzentration und Form vorliegt.

  Unter den sorgfältig gesteuerten Bedingungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Umsetzung zwischen dem Thioanhydrid und der Aminosäure, dem Peptid oder einem Derivat davon auf jeder Stufe der Synthese mit einer minimalen Bildung von Nebenprodukten, die die nächste Thioanhydridumsetzung oder die Reinigung des gewünschten Produkts stören würden. Unter den gesteuerten Bedingungen wird die   N-Thiocarboxy-Zwi-    schenverbindung vor einer Dethiocarboxylierung bewacht, oder, wenn eine solche Dethiocarboxylierung stattfindet, wird die erzielte Aminogruppe so lange durch Protonierung geschützt, bis das im wesentlichen ganze Ausgangsmaterial mit dem Thioanhydrid umgesetzt ist.



  Das Ergebnis dieser sorgfältigen Steuerung besteht darin, dass die Umsetzung mit der höchsten Geschwindigkeit diejenige ist, die das gewünschte Produkt erzeugt, und dass die Bildung unerwünschter Nebenprodukte, insbesondere solcher, die von einer   Überreaktion    und Polymerisation herrühren, innerhalb von Grenzen gehalten wird, bei denen keine Störung der nachfolgenden Stufen der gesteuerten Synthese erfolgt. Nach der Zersetzung des   N-Thiocarboxy-Zwis chenprodukts    oder von allfällig nicht umgesetztem Thioanhydrid kann das auf diese Weise gebildete Peptidprodukt unter gleichen Reaktionsbedingungen ohne Isolierung von Zwischenprodukten mit einem andern Thioanhydrid weiter umgesetzt werden.

  Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich im ganzen zur Herstellung von Dipeptiden in einer Ausbeute, die normalerweise 95-98 % beträgt und häufig im wesentlichen quantitativ ist, sowie zur Herstellung von Polypeptiden und Proteinen von vorbestimmter Struktur verwenden.



   Es gibt für jede Umsetzung im TCA-Verfahren einen optimalen schützenden pH. Je nach der jeweiligen Umsetzung kann dieser pH 4-10,0 betragen. Bei Umsetzungen, bei denen das Thiocarbamat die Schutzgruppe ist, befindet sich der optimale schützende pH auf der alkalischen Seite und beträgt gewöhnlich 7,5-10. Im Fall von Peptid-Reaktionsteilnehmern kann der schützende pH für eine im wesentlichen vollständige Reaktion wesentlich niedriger als bei Aminosäure-Reaktionsteilnehmern sein. Hat man mit einem Produkt zu tun, bei dem die Aminogruppe durch Protonierung geschützt wird, so liegt der optimale schützende pH auf der sauren Seite und beträgt gewöhnlich etwa 4-6. Wenn die einmal bestimmt ist, soll die Umsetzung unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen der pH so gesteuert wird, dass er möglichst nahe beim optimalen Schutzwert liegt.

  Eine gewisse Abweichung vom optimalen schützenden pH ist annehmbar. Vorzugsweise soll der pH jedoch nicht mehr als 0,2 Einheiten vom   optimale    len Schutzwert abweichen, obwohl Abweichungen von bis zu 0,5 Einheiten toleriert werden können. Der optimale pH kann unter Verwendung der Methoden des NCA-Verfahrens bestimmt werden. Der pH kann unter Verwendung der oben im Zusammenhang mit dem NCA-Verfahren besprochenen Methoden verfolgt und gesteuert werden.



   Ein Vorteil des   TCA-Verfahrens    im Vergleich zum NCA-Verfahren besteht darin, dass die beim ersteren erforderlichen   Steuerungsmethoden    weniger anspruchsvoll sind. Zum Beispiel ist beim NCA-Verfahren die Umsetzung normalerweise in weniger als einer Minute vollständig. Infolge dieser raschen Umsetzung ist es oft schwierig, die im Verlauf der Umsetzung auftretenden   Änderungen    in der Wasserstoffionenkonzentration zu verfolgen und zu steuern. Die   TCA-Umsetzung    hingegen kann in einem Zeitraum von etwa 10 Minuten bis zu etwa 4 Stunden durchgeführt werden, je nach der verwendeten Temperatur und den jeweiligen Reaktionsteilnehmern unter andern Faktoren.



   Das TCA-Verfahren wird unter Bedingungen von inniger Mischung unter Verwendung derselben Methoden wie beim NCA-Verfahren durchgeführt, wobei man dieselben Vorteile erzielt.



   Der beim TCA-Verfahren verwendete Temperaturbereich ist grösser als beim NCA-Verfahren, und er erstreckt sich gewöhnlich von etwa 0 bis etwa   400 C,    obwohl auch Temperaturen, die etwas über oder unter diesem Bereich liegen, ohne eine negative Wirkung verwendet werden können. Es ist oft zweckmässig, die Umsetzung bei Raumtemperatur, d. h. bei etwa 20 bis 300 C, durchzuführen. Die Möglichkeit, bei Raumtemperatur Produkte ohne eine unzweckmässige Anhäufung von Nebenprodukten zu erzielen, ist ein besonderer Vorteil des TCA-Verfahrens.



   Ist einer der Reaktionsteilnehmer eine Aminosäure, so sind die bevorzugten Reaktionsbedingungen   0-250    C während etwa 10-30 min. Ist der Reaktionsteilnehmer Glycin, so wird die bevorzugte Reaktionsdauer um einen Faktor von 10 herabgesetzt, so dass sie etwa 1 bis 10 min beträgt. Peptide haben eine etwas langsamere Reaktion, und die bevorzugten Bedingungen sind etwa 15 min bis 4 h bei einer Temperatur von 0 bis 250 C.



   Es können oft äquimolare Mengen Reaktionsteilnehmer verwendet werden. Wenn das Thioanhydrid durch Hydrolyse teilweise aufgebraucht ist, wird es oft vorgezogen, es in Überschuss zu verwenden, um zu gewährleisten, dass sich der Aminosäure- oder Peptidausgangsstoff vollständig in das gewünschte Produkt umgewandelt hat. Der optimale Überschuss kann durch Versuchsumsetzungen bestimmt werden. Das Ausmass des Überschusses kann innerhalb von weiten Grenzen schwanken, je nach den Faktoren, die bereits im Zusammenhang mit dem NCA-Verfahren oben besprochen worden sind.

 

   Die Dethiocarboxylierung wird unter Verwendung derselben Verfahren und Befolgung derselben Grundsätze wie bei der Decarboxylierung im NCA-Verfahren durchgeführt. Nach der Dethiocarboxylierung kann eine zusätzliche Aminosäure oder ein zusätzliches Derivat der Peptidkette beigefügt werden, indem man das oben beschriebene Verfahren wiederholt.



   Wenn man unter den oben beschriebenen Bedingungen arbeitet, können Polypeptide von vorbestimmter Struktur durch aufeinanderfolgende Umsetzungen einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Derivats davon mit dem ausgewählten N-Thiocarboxyanhydrid hergestellt werden, worauf, wenn nötig, das erzielte N   Thiocarbamat    dethiocarboxyliert wird und die Umsetzung ohne Isolierung der erzeugten Produkte im ursprünglichen Reaktionsmilieu so oft wie nötig wiederholt wird, bis man das die gewünschte Kettenlänge und   Struktur aufweisende Polypeptid-Produkt erhält. Es ist ebenfalls zweckmässig, ein N-Thiocarboxyanhydrid eines Peptids mit einem andern Peptid umzusetzen, um Polypeptide mit einem hohen Molekulargewicht von genau bekannter Struktur zu erzielen.



   Die Isolierungsverfahren beim NCA-Verfahren können die gleichen sein wie die, die man beim vorliegenden TCA-Verfahren verwendet.



   Es ist ein Merkmal des TCA-Verfahrens, dass die Thioanhydride von Asparagin- und Glutaminsäure und von Histidin in unerwarteter Weise verwendet werden können, ohne dass deren zusätzliche funktionelle Gruppen geschützt werden.



   Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten   N-Thiocarboxyaminosäureanhydride    können durch Zyklisierung eines   Alkylthionourethaa-Derivats    oder einer Aminosäure, zum Beispiel durch Behandlung mit einem Phosphortrihalogenid, wie zum Beispiel Phosphortribromid, hergestellt werden. Das Thionourethan kann durch Umsetzung einer Aminosäure mit einem Dialkyloder   Dialkarylxanthat,    vorzugsweise einem Dialkylxanthat, hergestellt werden. Das Verfahren kann   folgender-    massen dargestellt werden:
EMI9.1     

In den obigen Gleichungen ist R ein Aminosäurerest, während   R1    und   R2,    die gleich oder voneinander verschieden sein können, Niederalkyl- oder Aralkylgruppen sind, die zum Beispiel bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweisen.



   Bei diesen Grundverfahren können verschiedene Abweichungen vorgenommen werden, um weitere funktionelle Gruppen an gewissen Aminosäuren zu berücksichtigen. Zum Beispiel kann die Hydroxylgruppe von Tyrosin durch die   Tetrahydropyranyl-Schu tzgruppen      ge    schützt werden. Die aliphatische Hydroxygruppe von Threonin und Serin kann durch Trifluoracetyl- oder Trichloracetal-Gruppen geschützt werden. Die Carbonsäuren, wie zum Beispiel Asparagin- und Glutaminsäure, können als Halbester verwendet werden, wobei die Omega-Carboxylgruppen verestert sind. Die Omegaaminogruppe von Diaminosäuren, wie zum Beispiel Lysin, können durch Alkoxycarbonyl- oder Aralkoxycarbonylgruppen, wie zum Beispiel Methoxycarbonyl oder Benzoxycarbonyl-Gruppen, geschützt werden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch im Zusammenhang mit dem NCA-Verfahren verwendet werden, wie dies in den Beispielen veranschaulicht wird.



   Es wurde ferner festgestellt, dass Hydroxylgruppen von N-Carboxy- oder N-Thiocarboxy-aliphatischen Aminosäuren, d. h. Hydroxylgruppen, die einen alkoholischen eher als einen phenolischen Charakter aufweisen, durch Trihalogenacetyl-Gruppen, bei denen das Halogenatom ein Atomgewicht von weniger als 36 hat, insbesondere Trifluoracetyl- oder Trichloracetylgruppen, blockiert werden können, und dass diese Gruppen bei der Kupplungsumsetzung spontan und gleichzeitig gelöst werden. Die   Trihalogenacetyl-N-carboxyaminosäure-    anhydride und Trihalogenacetyl-N-Thiocarboxyaminosäureanhydride sind neuartige Verbindungen.



   Die Verbindungen werden durch Umsetzung zwischen dem ausgewählten Trihalogenacetylierungsmittel und der zweckmässigen hydroxylierten N-Carboxy- oder N-Thiocarboxyaminosäure erhalten. Es können Trihalogenacetylsäuren, Anhydride und Säurehalogenide, insbesondere das Chlorid oder das Bromid, verwendet werden. Vorzugsweise werden die entsprechenden Anhydride als Trihalogenacetylierungsmittel für Trifluoracetyl-Derivate und das Säurechlorid für Trichloracetylderivate verwendet, da beobachtet worden ist, dass diese Verfahren zur besten Ausbeute führen.



   Bei einer typischen Reaktion, die gemäss dem vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren geführt wird, wird das eine alkoholische Hydroxylgruppe aufweisende Aminosäurecarboxyanhydrid oder Thiocarboxyanhydrid in einem wasserfreien, der Reaktion gegenüber inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, zweckmässig einem   Ätherlösungsmittel,    insbesondere einem Lösungsmittel aus einem zyklischen Äther, wie zum Beispiel Dioxan oder Tetrahydrofuran, aufgenommen, und das Trihalogenacetylierungsmittel beigefügt. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Raumtemperatur, d. h. bei etwa   20-30  C,    durchgeführt, obwohl auch etwas höhere oder niedrigere Temperaturen ohne negative Wirkung verwendet werden können.

  Die Reaktionsdauer kann innerhalb eines weiten Rahmens schwanken, je nach der gewählten Temperatur und der Reaktivität der zu schützenden Hydroxylgruppe und den gewählten Tri   halogenacetylierungçmitteln.    Sie kann zum Beispiel etwa 1-16 h betragen, wobei eine Dauer von einer bis vier h vorgezogen wird, um eine gute Ausbeute innerhalb einer praktisch annehmbaren Reaktionsdauer zu erzielen. Obwohl äquimolare Mengen Reaktionsteilnehmer verwendet werden können, wird normalerweise ein Überschuss, beispielsweise bis zu einem 1 % igen molaren Überschuss an Trihalogenacetylierungsmittel verwendet, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Eine inerte Atmosphäre, gerade zum Beispiel Stickstoff, kann verwendet werden, um die Nebenreaktionen auf ein Minimum zu beschränken, jedoch ist es nicht notwendig.

 

   Das Produkt kann auf irgendeine zweckmässige Weise isoliert werden. Ein besonders nützliches Verfahren besteht darin, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck zu entfernen, wobei man das gewünschte Produkt als Rückstand erhält.



   Die Umsetzung ist besonders nützlich zur Herstellung von Derivaten jener Aminosäuren, die normalerweise im Zusammenhang mit tierischem Gewebe gefunden werden, wie zum Beispiel Serin und Threonin, doch beschränkt sich die Reaktion nicht darauf. Sie lässt sich mit gleicher Leichtigkeit zur Herstellung analoger Derivate    unnatürlicher >     Aminosäuren, wie zum Beispiel a-Hydroxynorvalin, E-Hydroxynorvalin, und andere Säuren, wie zum Beispiel die in diesem Patent angegebenen, verwenden.



   Die hergestellten Produkte können zur Bildung einer grossen Vielfalt von Heteropeptiden gemäss den in den Beispielen veranschaulichten Verfahren verwendet  werden. Wenn erwünscht, können sie auch zur Herstellung von ein hohes Molekulargewicht aufweisenden Homopolymeren, wie zum Beispiel Polyserin und Polythreonin, durch Polymerisation in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base verwendet werden. Solche polymeren Verbindungen werden häufig als Musterverbindungen beim Studium der physikalischen Eigenschaften von protein ähnlichen Strukturen verwendet.



   Im Zusammenhang mit der erfindungsgemässen Herstellung von Peptiden wurde gefunden, dass Hydroxylgruppen hydroxylierter Aminosäuren durch Trialkylsilylgruppen, vorzugsweise Triniederalkylsilylgruppen, wie zum Beispiel der   Trimethylsilylgruppe,    gehemmt werden. Es   warde    festgestellt, dass diese Gruppen bei der   Kupplungsumsetzung    spontan und gleichzeitig gelöst werden können.



   Es hat sich ferner erwiesen, dass Hydroxylgruppen von N-Carboxy- oder   N-Th iocarboxy-aromatischen    Aminosäureanhydriden, d. h.   Hydroxylgnippen,    die eher einen phenolischen als einen alkoholischen Charakter haben, durch eine   Tetrahydropyranylgruppe    gehemmt werden können. Es hat sich auch   gezeigt,    dass diese Gruppe bei der   Decarboxylierungs    oder Dethiocarboxylierungsumsetzung spontan und gleichzeitig gelöst wird.



   Beispiel 1    Valylalanylalanylprolylphenylalanylarglnin   
Ein Gemisch von 420 mg (2 mMol) Argininhydrochlorid in 20 ml   l-molarem    wässerigen Kaliumborat Puffer, der 5 g Eis enthält, bei pH 11 wird auf etwa   0 C    abgekühlt; 386 mg (2,01 mMol) festes N-Carboxyphenylalaninanhydrid wird unter raschem Rühren beigefügt. Das Gemisch wird eine Minute vermischt und der pH bei   0     C mit konzentrierter Schwefelsäure auf etwa 3 eingestellt, während Stickstoff etwa 10 min durchgeperlt wird. Das erzielte Produkt, Phenylalanylarginin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz konzentrierten Kaliumhydroxyds auf 9,5 gebracht und das Gemisch auf   0     C abgekühlt. 5 g Eis und dann 285 mg (2,02 mMol) N-Carboxyprolinanhydrid werden beigefügt, und das Gemisch wird 3 min gerührt. Die Decarboxylierung wird wie oben beschrieben durchgeführt, und das Produkt wird nicht isoliert.



   Das obige Verfahren wird bei pH 10 wiederholt, wobei 235 mg (2,04 mMol) N-Carboxyalaninanhydrid unter Vermischen während 1 min beigefügt werden.



  Das Produkt,   Alanylprolylphenylalanylarglnin,    das man durch Decarboxylierung wie oben beschrieben erhält, wird nicht isoliert.



   Dasselbe Verfahren wird bei pH 10 wiederholt wobei 1 min unter Verwendung von 235 mg (2 mMol) N-Carboxyalaninanhydrid gerührt wird; man erhält Alanylalanylprolylphenylalanylarginin, das nicht isoliert wird.



   Bei Wiederholung des Verfahrens bei pH 10 mit 294 mg (2,05 mMol) N-Carboxyvalinanhydrid erhält man Valylalanylalanylprolylphenylalanylarginin.



   Das pH der 46 ml der erzielten Lösung wird mit wässrigem Natriumhydroxyd auf pH 7,5 gebracht und mit einer Geschwindigkeit von 1,0 ml/min auf eine Säule von 1,5 cm Innendurchmesser, die 30 ml IRC 50-Harz auf dem Säurezyklus enthält, gegeben. Die Säule wird mit 200 ml Wasser bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von 2 ml/min gewaschen und mit 75 ml 0,25 n Schwefelsäure und dann 75 ml 1,0 n Schwefelsäure eluiert. Das Eluat, das Peptid enthaltendes Arginin enthält, wird bei einer   Geschwindigkeit    von 1 ml/ min in 25 ml Anteilen gesammelt.



   Muster aller Funktionen werden für eine Kreis   papierstreifenchromatographie    im System sekundäres   Butanol/Wasser/Essigsäure    im Verhältnis von   6 : 3 :1    getüpfelt. Bei einer Lösungsmittelfront bei etwa 6 cm weisen die Eluatfraktionen 3, 4, 5 und 6 starke Ninhydrin positive Bänder bei einem   Rl-Wert    von 0,39, was das gewünschte Hexapeptid anzeigt. (Die Rf Werte des Produkts und der Reaktionsteilnehmer sind vorgängig durch Dünnschichtchromatographie bestimmt worden.) Diese   Fraktiorlen    werden kombiniert und im Vakuum konzentriert und der pH mit wässeriger Natriumhydroxydlösung auf 7,5 gebracht und   gefriergb    trocknet. Der gefriergetrocknete Feststoff wird 4 mal mit je 10 ml Methanol extrahiert und das Methanol im Vakuum entfernt.

  Der Rückstand wird in 6 ml Wasser gelöst und der pH mit wässeriger Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt. Das Produkt wird durch Zusatz von 25 ml Methanol und dann 55 ml   Athanol    gefällt. Die Suspension wird über Nacht abgekühlt und filtriert, wobei man das gewünschte Produkt erhält, wie dies durch Spinco-Aminosäureanalyse nach der Hydrolyse bestimmt wird.



   Nachstehend bringen wir eine Liste von   Amine    säuren, die beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung einer weiten Vielfalt von Polypeptiden sowohl in der Säureform als auch als N-Carboxyanhydride verwendet werden. Jeder dieser Aminosäuren wird eine Abkürzung zugeteilt, und in der nachstehenden Liste werden die nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Produkte mit diesen Abkürzungen bezeichnet.



  In der zweiten Liste ist das als GLY-ALA-LEU-ILEU   VAGPHE    bezeichnete Produkt Glycylalanylleucylisoleucylvalylphenylalanin. Es wird wie jedes der verwendeten Produkte nach dem oben veranschaulichten Verfahren hergestellt. Die optimalen Bedingungen, was die Konzentration der Reagenzien, den pH, die Temperatur und die Dauer betrifft, werden durch Versuchsreaktionen bestimmt, bei denen kleine Mengen Reagenzien umgesetzt werden, bevor man die volle Reaktion durchführt. Die Umsetzungen werden bei pH-Werten von 4-11 im allgemeinen unter Verwendung eines   hub er    schusses an Anhydrid bei einer Temperatur von -5 bis   +50 C    in einer Mischpumpe durchgeführt. Die Temperatur wird durch innere oder äussere Kühlung oder beides beibehalten.

 

   Die Anhydride folgender Säuren werden als Trifluoracetyl-Derivate verwendet:
Serin
Thereonin  ss-Hydroxyleucin    :,-Hydroxynorvalin   
Die Anhydride folgender Säuren werden als   S-    Benzyl-Derivate verwendet:
Cystein  ss-Thiolnorvalin
Pencillamin
Das N-Carboxyanhydrid von Tyrosin wird in Form seines   Tetrahydrofuranderivats    verwendet.



   Die Omega-Aminogruppe von Lysin und   Ornithin    werden durch eine Carbobenzyloxygruppe gesperrt, die  aus dem Endprodukt aus Hydrieren entfernt wird. Andere Sperrgruppen werden auch am Schluss der Umsetzung entfernt.



   1. Glycin - GLY
2. Alanin - ALA
3. Leucin - LEU
4. Isoleucin - ILEU
5. Valin - VAL
6. Phenylalanin - PHE
7. Tyrosin - TYR
8. Tryptophan - TRY
9. Arginin - AGN
10. Lysin-LYS
11. Histidin - HIS
12. Serin -   SER   
13. Threonin - THR
14. Prolin - PRO
15. Cystein - CYS
16. Cystin -   CYST   
17. Methionin - MET
18. Asparaginsäure - ASP
19. Glutaminsäure - GLU
20. Asparagin - ASN
21.   Glutamin -    GLN
22. a-Aminoadipinsäure - a,AD
23. a-Aminopimelinsäure - a,PI
24.   a-Aminosuberinsäure -    a,SU
25. a-Aminosebacinsäure - u,SE
26.   ii-Methylasparaginsäure    - ssM,ASP
27.   ss;Methylglutaminsäure    -   ssM,GLU   
28.   ss,,l3-Dimethylasparaginsäure    -   ,6M,ssM,ASP   
29.

  Ornithin - ORN
30.   a-Aminoisobutensäure-    a,IBU
31. a-Aminodiäthylessigsäure - ADA
32. a-Aminodiisopropylessigsäure -   a,ADIA   
33. a-Aminoäthylisopropylessigsäure - a,AEIA
34. ss-Hydroxynorvalin -   ssOH,NVAL   
35. Penicillamin - PENM
36.   e-Thiolnorvalin -      ,d,Th,VAL   
37. a-Aminophenylessigsäure -   a,ASPA   
38. O-Chlorphenylalanin -   O-C1 > PHE   
39. Furfurylalanin - FALA
40. Thienylalanin - THALA
41.   a-Naphthylalanin -    a,NALA
42. 3-Thionaphthenylalanin - TNALA
43. 3-Cumaronylalanin - COU,ALA
44. N-Methylglycin - NM,GLY
45. N-Methylalanin - NM,ALA
46. N-Methylleucin - NM,LEU
47.

  N-Methyltyrosin - NM,TYR
Befolgt man das obige Verfahren, so erhält man folgende Hexapeptide:    GLY-ALA-ILEU-VAL-PHE-TYR;   
TRY-AGN-LYS-HIS-SER-THR;    PRO-CYST-MET-ASP-GLU-ASN;
GLN-a,aAD-a,PI-a,SU-a,SE-ssM,ASP;
M,GLU-ssM,ASP-ORN-a-IBU-ADA-a,ADIA; a-AEIA-flOH, NVAL-PENM-/3Th,
VALa,APA-O-Cl-PHE;
FALA-THALA-u,NALA-TNALA-
COU,ALA-NM,GLY;
MN,ALA-NM,LEULNM,TYR-OLY-ALA-LEU:    di-LEU-VAL(CYS- bis ALA);    SER-GLU-FALA-NM,ALA-A SN-GLN;    und    THR-MET-ORN-SER-a,PI-AS > P .   



   Beispiel 2
Asp artylglycylglycylleucin
Ein Gemisch von 2 Millimol Leucin in 20 ml wässerigem   Kaliumborat-Puffer    bei pH 10 wird auf   -50    C abgekühlt; 2,05 Millimol festes N-Carboxyglycinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Reaktion wird 40 sec fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0     C auf 5 eingestellt, während ein Stickstoffstrom etwa 10 min durch das Gemisch durchgeleitet wird.



   Das Verfahren wird bei pH 10 ohne Isolierung der erzeugten Glycylleucin-Zwischenverbindung unter Verwendung von 2,02 Millimol N-Carboxyglycianhydrid wiederholt, wobei man Glycylglycylleucin erhält, das nicht isoliert wird.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz von konzentrierter Kaliumhydroxyd auf 8,5 eingestellt, und 2,1 Millimol N-Carboxyasparaginsäureanhydrid werden bei   0 C    unter raschem Rühren beigefügt. Nach 30 min wird der pH des Gemisches auf 4 gebracht, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird.



  Es bildet sich das gewünschte Tetrapeptid, das durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat isoliert wird.



   Ersetzt man das N-Carboxyasparaginsäureanhydrid durch das zweckmässige Anhydrid und wiederholt man das obige Verfahren, so werden folgende Verbindungen hergestellt:    Glutamylglycylglycylleucin   
Glutaminylglycylglycylleucin
Asparaginylglycylglycylleucin
Beispiel 3
Tyrosylleucylphenylalanin
Ein Gemisch von 3 Millimol Phenylalanin in 30 ml 5 g Eis enthaltendem wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10,5 wird auf 30 C abgekühlt; 3,2   Millunol    festes N-Carboxyleucinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Reaktion wird 30 sec fortgesetzt und das pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0     C auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch durchgeleitet wird. Das erzielte Produkt, Leucylphenylalanin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz konzentrierten Kaliumhydroxyds auf 10,0 eingestellt, und 3,4 Millimol Tetrahydropyranyltyrosin-N-Carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa   0     C gehalten wird. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und die Decarboxylierung durchgeführt, indem der pH mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt wird. Man lässt das Gemisch Raumtemperatur erreichen, bei der es 1 h gehalten wird, um die Schutzgruppe zu entfernen. Das gewünschte Produkt wird auf einer Silicagel-Säule chromatographisch isoliert.



   Bei Wiederholung des obigen Verfahrens unter Verwendung von   =2ithoxyäthyltyrosin-N-Carboxyanhydrid    erhält man dieselbe Verbindung.



   Beispiel 4
Valylleucylalanylcystein
Ein Gemisch von 2 Millimol Cystin in 30 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10 wird bei etwa    100 C    gehalten, während 4,1 Millimol N-Carboxyala   ninhydrid    unter raschem Rühren beigefügt werden. Die   Reaktion wird 2 min fortgesetzt und der pH mit verdünnter Salzsäure bei 20 C auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch durchgeleitet wird. Das erzielte Produkt, Cystyl-bis-alanin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird auf 10,2 eingestellt.



  Das Gemisch wird auf   0  C    abgekühlt; 4,2 Millimol N-Carboxyleucinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Reaktion wird 1 min fortgesetzt und die Decarboxylierung durchgeführt, indem der pH auf 3,5 eingestellt wird, während ein   SLicks,toffstrom    durch das Gemisch geleitet wird. Die Dileucyl (cystylbis-alanin)-Zwischenverbindung wird nicht isoliert, sondern bei pH 5 mit 4,3 Millimol N-Carboxyvalinanhydrid bei   0     C unter raschem Rühren behandelt und bei pH 3 mit Schwefelsäure decarboxyliert, wodurch man Divalylleucyl(cystyl-bis-alanin) erhält, das aus dem Reaktionsgemisch ausgesalzen wird.



   Das Produkt wird mit Schwefelwasserstoff zu Valylleucylalanylcystein reduziert.



   Beispiel 5    Lysylgiycylglycylleucinacetat       Glycylgiycylleucin    wird nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt und das diese Verbindung enthaltende Reaktionsgemisch 40 sec bei   0  C    mit 2,5 Millimol festem   Omega-Carbobenzoxy-N-carboxylysin-    anhydrid unter raschem Rühren behandelt. Die Decarboxylierung wird mit Schwefelsäure in Gegenwart von Stickstoff bei pH 4 durchgeführt. Das Produkt, N   Carbobenzoxylysylglycylglycylleucin,    wird aus dem Gemisch ausgesalzen, und durch Filtrieren zurückgewonnen.



   Die Carbobenoxygruppe wird durch Hydrierung bei atmosphärischem Druck und Raumtemperatur mit einem gleichen Gewicht   10%    Palladium auf Kohle in Essigsäurelösung entfernt und das Produkt isoliert, indem das Lösungsmittel nach Abfiltrieren des Katalysators vakuumentfernt wird.



   Beispiel 6
Glycylphenylalanylleucin
In ein Gemisch von 4,0 Millimol Leucin   in    20 ml Wasser werden bei   0  C    3,1 Millimol N-Carboxyphenylalanylanhydrid gegeben, während das pH durch zeitweiligen Zusatz von Bariumhydroxyd-Pulver bei 10,5 gehalten wird. Die Umsetzung ist in einer Minute zu Ende. Der pH wird durch Zusatz von   10%    Schwefelsäure auf 3,5 gebracht. Der sich bildende Bariumsulfatniederschlag wird durch Filtrieren entfernt und das Phenylalanylleucin enthaltende Filtrat mit 3,2 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid bei   -3  C    behandelt, während der pH unter Verwendung von Bariumhydroxyd bei 10,5 gehalten wird. Die Decarboxylierung wird durch Einstellen des pH-Werts auf 3,5 mit konzentrierter Schwefelsäure durchgeführt und das gewünschte
Produkt durch Gefriertrocknen isoliert.



   Man erhält das gleiche Produkt, wenn die Um setzung so durchgeführt wird, dass verdünntes wässeriges
Natriumhydroxy anstelle von festem Bariumhydroxyd beigefügt wird. Selbstverständlich bildet sich kein Bari umsulfat, so dass die Filtrierungsstufe weggelassen wer den kann. Das Produkt wird zurückgewonnen, indem das Reaktionsgemisch zuerst über eine Kohlenstoff
Säule geführt wird. Das Peptid wird adsorbiert und dann mit einem Gemisch von Essigsäure und Wasser eluiert. Es wird durch Gefriertrocknen aus dem Eluat zurückgewonnen.



   Beispiel 7
N-Methylleucyclglycyclglycylglycylglycylisoleucin
Ein Gemisch von 4 Millimol   Glycylglycylglycylgly-    cylisoleucin in 30 ml wässerigem Klaiumborat-Puffer von pH 9,5 wird auf etwa   0     C abgekühlt; 4,3 Millimol   N-Methylleucin-N-carboxyanhydrid    werden unter raschem Rühren beigefügt. Das Gemisch wird 30 sec rasch gerührt und das pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,1 eingestellt, um eine Decarboxylierung in Gegenwart von Stickstoff zu bewirken. Das gewünschte Produkt wird isoliert, indem die Lösung über ein Carbonsäureharz geführt und dann mit Ammoniumhydroxydlösung eluiert wird.



   Beispiel 8    Leucylvalylalanylalanylprolylphenylalanylarginin   
Beispiel 1 wird wiederholt und die aus der   Valylalanylalanylprolylphenylalanylarginin    enthaltenden chromatographischen Säule erzielten Fraktionen 3, 4, 5 und 6 kombiniert und zu einem Volumen von 20 ml konzentriert. Das erzielte Gemisch wird auf   0     C abgekühlt und 1,5 Millimol N-Carboxyleucinanhydrid bei gefügt, wobei der pH durch automatisches Titrieren mit verdünntem Kaliumhydroxyd bei 10,5 gehalten wird.



  Die Umsetzung ist in 90 min zu Ende, und die Decarboxylierung wird wie üblich mit konzentrierter Schwefelsäure durchgeführt. Das Heptapeptid-Produkt wird isoliert.



   Man erhält das gleiche Produkt, wenn das   Valylalanylprolylphenylalanylarginin    isoliert, gereinigt, eine Minute bei   0  C    mit 1,5   Millimol      NCarboxy-    leucinanhydrid in Kaliumborat-Puffer bei pH   10',5    umgesetzt und dann durch Einstellen des pH-Werts auf 3,3 mittels konzentrierter Schwefelsäure decarboxyliert wird. Es wird unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 chromatographisch isoliert.



   Beispiel 9    Leucylalanylgiycylprolylphenylalanylarginin   
Ins gesamt 3,48 g Arginin werden in 200 ml 1molarem Kaliumborat-Puffer aufgenommen. Der pH wird mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt und das Gemisch mit Stickstoff gereinigt, um das Kohlendioxyd zu entfernen. Der pH wird dann mit verdünntem wässerigem Kaliumhydroxyd auf 11 eingestellt und das Gemisch auf   0 C    abgekühlt. 3,84 g festes N-Carboxyphenylalanylanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. (2 Tropfen Caprylalkohol werden in das Ge misch gegeben, um eine Schaumbildung während der Umsetzung zu verhindern.) Nach 1 min beträgt der pH des Reaktionsgemisches 10,9. 

  Die   N-Carboxyphenyl       alanylarginin-Zwischenverbindung    wird decarboxyliert, indem das pH mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt wird; man erhält Phenylalanylarginin, das nicht isoliert wird.



   Die nachstehende Tabelle fasst die Reaktionsbedin gungen zusammen, unter denen die folgenden Umsetzungen zur Bildung des Produkts durchgeführt wurden.



  Die verschiedenen Aminosäuren und Peptide werden durch dieselben Abkürzungen wie in Beispiel 1 bezeichnet.  



   NCA Anfangs-pH Temp. Dauer End-pH -CO   pH2    Produkt PRO 2,82 g 9,5   00 C    1 8,9 3 PRO-PHE-AGN GLY 2,2 g 11   00 C    1 10,4 3 GLY-PRO-PHE-AGN ALA 2,30 g 10   00 C    1 9,6 3   ALA-GLY-PRO-PHE-AGN    LEU 3,14 g 10   00 C    1 9,8 7 LEU-ALA-GLY-PRO-PHE-AGN
Der optimale pH wird für jeden Fall durch Probeumsetzungen bestimmt.



   Der pH des Endgemisches wird auf 7 eingestellt und das Gemisch filtriert, so dass man eine klare Lösung erhält, aus der das gewünschte Produkt isoliert wird. Bei dieser letzten Stufe erfolgt die Decarboxylierung bei pH 7 durch Stehen.



   Insgesamt 335 ml der auf diese Weise erzielten klaren Lösung werden mit Wasser bis zu einem Volumen von 1340 ml verdünnt. Der pH der erzielten Lösung beträgt 7,3. Die Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min auf eine Säule von 3,3 cm Innendurchmesser, die 400 ml IRC 50-Harz auf dem   Säurezzrklus    enthält, gegeben. Die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 20-25 ml/min mit 2800 ml Wasser gewaschen. Das Harz wird dann mit 0,5 n Schwefelfelsäure bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/min eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 250 ml gesammelt.



   Die Fraktionen 3, 4 und 5 und die Fraktionen 6 und 7 werden kombiniert, so dass man zwei Gemische erhält. Jedes Gemisch wird mit Natriumhydroxydlösung auf pH 7,5 gebracht und gefriergetrocknet. Jeder gefriergetrocknete Feststoff wird 4 mal mit je 100 ml Äthanol extrahiert, und das Methanol im Vakuum entfernt. Die Rückstände werden in Wasser gelöst und wiederum gefriergetrocknet. Die kombinierten Rückstände werden in 50 ml Wasser gelöst; der pH wird mit Schwefelsäure auf 3,4 eingestellt und das Sulfatsalz des Hexapeptids mit einem Liter   Athanol    gefällt.



   Eine Probe des Produkts wird hydrolysiert und das Hydrolysegemisch analysiert. Nachstehend die Ergebnisse:   
Säureverhältnis
Aminosäure Mikrogramm/mg gefunden berechnet gefunden berechnet   
ARG 1,13 0,98 1
PHE 0,99 1,01 1    Säureverhältnis
Aminosäure Mikrogramm/mg Säureverhältnis gefunden gefunden berechnet   
PRO 1,19 0,95 1
GLY 1,03 1,10 1
ALA 1,09 0,92 1
LEU 1,06 1,05 1
Beispiel 10    Leucylalanylglycylprolylphenylalanylarginin   
Man wiederholt das Verfahren des vorigen Beispiels auf einer etwas grösseren Skala, um N-Carboxyprolylphenylalanylarginin herzustellen, das bei pH 3 decarboxyliert wird. Etwa 900 ml der erzielten Lösung werden mit Schwefelsäure auf pH 7 gebracht und mit Wasser zu 10 Liter verdünnt.

  Die Lösung wird über eine 3-Liter-Säule von IRC 50 auf den Säurezyklus geleitet und mit 17,5 Liter Wasser gewaschen. Die Säule wird mit 7 Liter 0,5 n Schwefelsäure eluiert und in eine Fraktion von 4 Litern und eine solche von 3 Litern geteilt. Die 4-Liter-Fraktion wird mit wässerigem Natriumhydroxyd auf pH 7 gebracht und gefriergetrocknet und der Rückstand mit 15 Liter wasserfreiem Methanol extrahiert. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand in Wasser gelöst. Das Tripeptid wird als Sulfatsalz gefällt, indem der pH mit Salzsäure auf 5 eingestellt, ein gleiches Volumen Methanol und ein doppeltes Volumen   Athanol    beigefügt und schliesslich abgekühlt wird.



   Dieses Beispiel veranschaulicht die Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, wenn infolge der Leichtigkeit der Isolierung eine Tripeptid-Zwischenverbindung im Verlauf der Herstellung eines höheren Peptids isoliert wird.



   Die nachstehende Tabelle zeigt das Verfahren, nach dem 1,808 g Prolylphenylalanylargininsulfat in das gewünschte Hexapeptid umgewandelt wird.



  NCA Gewicht Anfangs-pH Temp. Dauer End-pH -CO   pH2    Produkt GLY 399 mg 10   00 C    1 9,6 3   GLY-PRO-PHRARG    ALA 460 mg 10   00 C    1 9,5 3   ALA-GLYPROPHE-ARG    LEU 634 mg 10   00 C    1 9,6 3 LEU-ALA-GLY-PRO-PHE-ARG
Das Endprodukt wird chromatographisch isoliert.



   Beispiel 11    Glycylprolylphenylalanylarginin   
Insgesamt 4,21 g Argininhydrochlorid werden in 200 ml Kaliumborat-Puffer aufgenommen; der pH wird auf 3,0 herabgesetzt, während Stickstoff durch das Gemisch geleitet wird, um Kohlendioxyd auszutreiben, und dann durch Zusatz von wässerigem Kaliumhydroxyd auf 11,0 eingestellt. Das Gemisch wird 1 min in einer Mischpumpe rasch gerührt. Der End-pH beträgt 10,7 und wird mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt, um eine Decarboxylierung zu bewirken.



   Der pH wird dann durch Zusatz von Kaliumhydroxyd auf 10 erhöht und das Verfahren mit 2,82 g N-Carboxyprolinanhydrid wiederholt. Der End-pH beträgt 9,85 und wird zur Decarboxylierung auf 3,0 herabgesetzt.  



   Das Verfahren wird mit 2,22 g N-Carboxyglycinanhydrid bei einem Anfangs-pH von 9,5 wiederholt. Der End-pH beträgt 9,1 und wird mit Schwefelsäure auf 7 herabgesetzt. Das Gemisch wird etwa 16 h stehengelassen, um die Decarboxylierung zu bewirken.



   Das Reaktionsgemisch wird bis zu insgesamt 10 1    10fach    verdünnt und 18 h über eine 800 ml Säule von IRC 50 geleitet. Die Säule wird mit 4 1 Wasser bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/min gewaschen und mit 0,35 n Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wird in 300 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, bei denen der   Ninhydrin-Test    positiv ausfällt, werden gefriergetrocknet; die Feststoffe werden kombiniert und mit Methanol extrahiert, bis die Extrakte auf die Ninhydrin-Probe negativ reagieren. Die Extrakte, bei denen die Ninhydrin-Probe positiv ausfällt, werden kombiniert und im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird bei pH 4,5 in einer minimalen Menge verdünnter Schwefelsäure aufgenommen und durch Zusatz von 5 Volumen Methanol und dann 10 Volumen Äthanol gefällt.

  Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, in Wasser gelöst und mit denselben Mengen Methanol und Äthanol wieder gefällt. Das gefällte Produkt, Glycylprolylphenylalanylarginin, wird isoliert und mit Methanol und Äther gewaschen.



   Beispiel 12
Cysteinylglycylglycylglycin
Insgesamt 19 Millimol Glycin werden in 200 ml Kaliumborat-Puffer bei pH 11 aufgenommen und auf   00 C    abgekühlt; 19 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid werden beigefügt.



   Das Gemisch wird 1 min rasch gerührt und der pH zur Decarboxylierung auf 3 eingestellt. Der pH wird dann mit Kaliumhydroxyd auf 11 erhöht und das Verfahren mit 19,5 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid wiederholt.



   In die Glycylglycylglycin enthaltende Lösung werden bei pH 11 22 Millimol S-Benzyl-N-carboxycysteinanhydrid und 50 g Eis gegeben, und das Gemisch wird 1 min gerührt. Der End-pH beträgt 10,2. Er wird mit Schwefelsäure auf 5,5 erhöht und das Gemisch über eine 100 ml Kohlenstoff-Säule geleitet. Die Säule wird mit 200 ml Wasser und dann mit 800 ml 5   S    iger Essigsäure gewaschen. Die Eluierung erfolgt in   5 S iger    Essigsäure in   50 S igem    Aceton. Das Eluat wird im Vakuum verdampft, wobei man das gewünschte Produkt als Rückstand erhält. Es wird aus einem Gemisch von Aceton unter Wasser umkristallisiert.



   Beispiel 13
Alanylalanylalanylalanylglycin
In eine Lösung von 80 Millimol Glycin in 4 1 Natriumborat-Puffer werden bei pH 10 und   0 C    80
Millimol   N-Carboxyalaninanhydrid    unter raschem Rüh ren gegeben. Nach 2 min wird der pH auf 3 herabgesetzt, um die Decarboxylierung zu bewirken, wäh rend 1 Stickstoffatom durch das Gemisch geleitet wird.



   Der pH wird mit 50 % igem wässerigem   Natrilimhy-    droxy auf 10 erhöht und die obige Umsetzung wieder holt. Das Verfahren wird dann zweimal wiederholt.



   Nach der letzten Decarboxylierung bei pH 3 bildet sich ein Niederschlag, der durch Lösen in wässerigem
Natriumhydroxyd bei pH 11 und Herabsetzung des    pH-Werts auf 5,5 kristallisiert wird. Die Verbindung wird durch Elementaranalyse und eine Spinco-Amino-    säure-Hydrolyse bestimmt.



   Beispiel 14
Synthese von Schaf-a-Adrenocorticotropin
Die Struktur von Schaf-a-Adrenocorticotropin wird nachstehend gezeigt:
ACTH
EMI14.1     


<tb> SER <SEP> TRY
<tb> TYR <SEP> GLY
<tb>   5ER    <SEP> LYS
<tb> MET <SEP> A <SEP> PRO
<tb> GLU <SEP> A <SEP> VAL <SEP> B
<tb> HIS <SEP> GLY
<tb> PHE <SEP> LYS
<tb> ARG <SEP>    ¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP>     <SEP> LYS
<tb>  <SEP> ARG
<tb>  <SEP> ARG
<tb> PRO <SEP> GLU
<tb> VAL <SEP> ALA
<tb> LYS <SEP>    SER    <SEP> 
<tb> VAL <SEP> C <SEP> GLN <SEP> D
<tb> TYR <SEP> ALA
<tb> PRO <SEP> PHE
<tb> ALA <SEP> PRO
<tb> GLY <SEP> LEU
<tb> GLU <SEP> GLU
<tb> ASP <SEP> PHE
<tb>   ASP <SEP> ¯    <SEP> 
<tb> 
Es wird gemäss den Verfahren der vorigen Beispiele unter Verwendung der in den nachstehenden Tabellen 1, 2, 3 und 4 angegebenen Reaktionsbedingungen hergestellt. 

  Diese Tabellen zeigen die Herstellung der verschiedenen oben angeführten Segmente. Bei der ersten Stufe der Synthese wird der Tetrahydropyranyl äther von   N-Carboxytyrosinarfhydrid    unter den in Stufe 1 der Tabelle 1 angegebenen Bedingungen mit Serin gekuppelt. Die Stufenreihe wird wie in den Tabellen angegeben fortgesetzt.



   Tabelle 1
Herstellung von Peptid A   
Reaktions- verwendetes verwendeter Kupplungs-pH Dauer Decarboxylierungs Stufe bedingungen NCA Überschuss in % KUplungs-pH in min pH   
1 I   TYR *    5 10,0 2 3
2 I   SER*    25 10,2 2 3
3 I MET 10 9,8 3 3  
Fortsetzung Tabelle 1
Reaktions- verwendetes verwendeter   K    l   H    Dauer Decarboxylierungsbedingungen NCA Überschuss in %    Kupplungs-pH in min pH   
4 I   HtS*    10 9,8 3 4
5 I PHE 10 10,6 1 3
6 I ARG 30 10,2 2 3
Das Produkt, in welchem das Histidin wie im Imidazolbenzylderivat ist, wird unter Verwendung von IRC 50-Harz isoliert.



   Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Bedingungen zur Umwandlung von Peptid A in Peptid A B.



   Tabelle 2
Herstellung von Peptid AB aus Peptid A    Reaktions- verwendetes verwendeter Kupplungs-pH Dauer Decarboxylierungs bedingung-en NCA Überschuss in % in min pH   
1 III TRY 30 10,2 2 5
2 III GLY 5 10,1 2 5
3 III LYS* 7 9,9 2 5
4 III PRO 10 10,0 2 5
5 III VAL 10 10,3 3 3
6 III GLY 10 10,4 3 3
7 III LYS* 15 10,4 1 3
8 III LYS* 15 10,4 1 3
9 III ARG 20 9,8 1 3
10 III ARG 25 10,0 1 3
Peptid A B wird gemäss den in Beispiel 3 angegebenen Verfahren in Peptid A B C umgewandelt.



   Die End-Aminogruppe im in den Tabellen 2 und 3 angeführten Lysin wird durch eine Carbobenzoxygruppe geschützt. Die Hydroxylgruppe beim in Tabelle 3 aufgeführten Tyrosin wird wie das Tetrahydropyranyl Derivat geschützt. Die Hydroxylgruppe von Serin in Tabelle 4 wird wie die Trifluoracetylgruppe geschützt.



  Beide Schutzgruppen werden im Verlauf der Kupplungsumsetzungen entfernt.



   Tabelle 3
Herstellung von Peptid ABC aus Peptid AB   
Reaktions- verwendetes verwendeter Kupplungs-pH Dauer Decarboxylierungs bedingungen NCA Überschuss in % Kupplungs-pH in min pH   
1 I PRO 5 9,8 2 5
2 I VAL 7 9,8 2 5
3 I LYS* 10 10,2 3 5
4 I VAL 5 10,2 2 3
5 I TYR* 10 10,2 2 3
6 I PRO 20 10,4 1 4
7 I ALA 10 10,2 1 3
8 I GLY 10 10,2 1 3
9 I GLU 15 10,4 1 3
10 I ASP 15 10,4 1 3
11 I ASP 20 10,6 1 3
Dieses Peptid wird dann gemäss den in Tabelle 4 angegebenen Verfahren in das Produkt ABCD umgewandelt.  



   Tabelle 4
Herstellung von Peptid   ABCD    aus Peptid ABC
Reaktions- verwendetes verwendeter Kupplungs-pH Dauer Decarboxylierungs Stufe bedingungen NCA Überschuss in % in min pH
1 I GLU 5 10,2 2 5
2 I ALA 5 10,4 2 5
3 I SER* 7 10,4 1 3
4 I GLN 8 10,2 1 5
5 I ALA 8 9,8 1 5
6 I PHE 10 10,0 1 5
7 I PRO 10 10,2 1 5
8 I LEU 10 10,6 3 5
9 I GLU 15 10,2 1 3
10 I PHE 20 10,4 1 3
Das Produkt wird unter Verwendung von IRC 50 Harz isoliert.



   Die Carbobenzoxy- und Benzylgruppen werden durch Reduktion mit Natrium in Ammoniakflüssigkeit entfernt.



   Beispiel 15    Valylalanylglycylprolylphenylalanyl-(C14) arginin   
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines mit Radioisotopen versetzten Peptids.



   Ein Gemisch wird aus 0,392 mg einheitlich indiziertem   Cl4-Arginin    (0,5 Millicurie) in 5,0 ml 0,01 n Salzsäure und 421 mg nicht indiziertem Arginin in 20 ml 1 M Kaliumborat-Puffer bei pH 10,5 hergestellt. Es wird eine Probe von 0,2 ml entnommen. In das Gemisch werden 401 mg (5   C    iger molarer Überschuss) des N-Carboxyanhydrids von Phenylalanin in einem einzigen Los bei einer Temperatur von   0-2     C unter raschem Rühren gegeben; das Rühren wird eine Minute fortgesetzt, während der pH durch Zusatz von 5 n Kaliumhydroxyd bei 10,5-10,4 gehalten wird. Am Ende dieser Reaktionsperiode wird ein Tropfen Caprylalkohol als Antischaummittel beigefügt. Der pH wird dann durch Zusatz konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 herabgesetzt und Stickstoff 10 min durch das Gemisch geleitet.

  Der pH wird mit konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht und eine 0,1 ml Probe Prolyl-(C14)arginin enthaltendes Reaktionsgemisch entnommen.



   In das erzielte Gemisch werden bei einer Temperatur von   0-2     C 300,5 mg (6,5 % iger molarer Überschuss) des N-Carboxyanhydrids von Prolin unter raschem Rühren gegeben. Die Umsetzung wird eine Minute fortgesetzt, während der pH mit 5 n Kaliumhydroxyd bei 10,2-10,1 gehalten wird. Die Decarboxylierung wird auf die oben beschriebene Weise bei pH 3,0 durchgeführt. Der pH wird dann mit konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht und eine Gly   cylprolylphenylalanyl-(Ct4)arginin    enthaltende 0,1   ml    Probe zur Analyse entnommen.



   Das Tetrapeptid wird durch Zusatz von 248 mg   (8Siger    molarer Überschuss) des N-Carboxyanhydrids von Anilin zum Reaktionsgemisch bei   0-2  C    unter raschem Rühren in das N-Carboxy-Peptid von Alanyl   glycylprolylphenylalanyl-(Ct4)arginin    umgewandelt. Die Reaktion wird eine Minute fortgesetzt, während der pH mit 5 n Kaliumhydroxyd bei 10,2-10,0 gehalten wird und das N-Carboxypeptid bei pH 3 wie oben beschrieben decarboxyliert. Der pH wird mit wässerigem konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht und eine die gewünschte Form enthaltende 0,1   ml    Probe zwecks Analyse entnommen.



   In das Reaktionsgemisch werden 340 ml N-Carb   oxyvalinanhydnd    bei   0-2  C    unter raschem Rühren gegeben. Die Umsetzung wird 2 min fortgesetzt, während der pH mit 5 n Kaliumhydroxyd bei 10,3 bis 10,0 gehalten wird. Der pH wird dann mit konzentrierter Schwefelsäure auf 6,5 herabgesetzt und eine das gewünschte radioaktive Hexapeptid enthaltende 0,2 ml Probe zur Analyse entnommen.



   Jede der oben gesammelten Proben wird unter Verwendung eines   Butanol-Essigsäure-Wasser-Systems    im Verhältnis von 4:1: 5 auf Papier chromatographiert.



  Die Chromatogramme werden mit einem Radioaktivitätsstreifenabtaster abgetastet. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass jede der gewünschten Umsetzungen bei einer mehr als   85%gen    Ausbeute vor sich geht, wobei man ein Produkt erhält, das im wesentlichen frei von Nebenreaktionen ist.



   Das Reaktionsgemisch wird gefriergetrocknet und der Rückstand dreimal mit je 150 ml Methanol extrahiert. Die kombinierten Extrakte werden im Vakuum bei 400 C zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird in 2 ml Wasser aufgenomnen und   l/4    der Lösung zu einem Liter verdünnt. Diese verdünnte Lösung wird auf einer Säule von 2,2 cm Durchmesser und 55 cm Höhe, die 200 ml Carbonsäureionenaustauscher (CG-50, erhältlich bei Rohm  & Haas, Philadelphia) enthält, am Wasserstoffzyklus chromatographiert. Der Säule wird die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min zugeführt; sie wird dann gewaschen, wobei 2 Liter Wasser gesammelt werden. Die Säule wird mit 0,01 n Schwefelsäure eluiert. 

  Der ausfliessende Strom wird unter Verwendung einer Anthracensäule, die anfänglich mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ml/ min beliefert wird, auf das   Ct4-Isotop    hin untersucht.



  Die Zuleitungsgeschwindigkeit wird in einem Zeitraum von 20 min allmählich auf 0,6 ml/min erhöht und die Geschwindigkeit bis zum Schluss des Versuchs konstant gehalten. Das Eluierte wird in 24 ml Anteilen   ge    sammelt und das gewünschte Produkt durch Einstellen des pH-Werts auf 9,5 mit   50 40    Natriumhydroxyd und Gefriertrocknung aus den Anteilen 25-72 erzielt. Der   Rückstand wird mit Methanol extrahiert und der Extrakt bei 400 C im Vakuum zur Trockne konzentriert.



  Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst und der pH mit konzentrierter Salzsäure auf 3,5 gebracht. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält, das aus einem Gemisch von Wasser und Äthanol umkristallisiert wird.



   Beispiel 16
Insgesamt 3 Millimol Phenylalaninamid werden in 30   ml      Kaliumborat-Puffer    bei pH 10,2 aufgenommen.



  Die Lösung wird auf   00 C    abgekühlt, und 3 Millimol N-Carboxyasparaginsäureanhydrid werden unter raschem Rühren in einer Mischpumpe beigefügt. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 4 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird.



   Nach 4 min bei pH 4 wird die Wasserstoffionenkonzentration durch Zusatz von konzentriertem Kali   umhydroxyd    auf pH 10,2 gebracht. Das Gemisch wird wiederum auf   0 C    abgekühlt, und 3,45 Millimol N Carboxymethioninanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Nach 3 min wird der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 4   eingestellt    und ein Stickstoffstrom 15 min durch das Gemisch geleitet.



   Der Niederschlag,. der sich bei der Decarboxylierung bildet, wird durch Einstellen des pH-Werts auf 10,2 mit konzentriertem Kaliumhydroxyd gelöst. Die Lösung wird auf 10 C abgekühlt, und 4,6 Millimol N-Carboxytryptophananhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Der pH wird durch wiederholten Zusatz von wässerigem Kaliumhydroxyd bei 10,2 gehaltern. Das Gemisch wird durch Filtrieren geklärt und der pH des Filtrats durch Zusatz konzentrierter Salzsäure auf 2,0 eingestellt.



   Die Feststoffe werden durch Filtrieren entfernt. Die Lösung (etwa 50 ml) wird auf einer 1000 g  Sephadex G-25 -Säule (Feinkorn-7,5 cm, Durchmesser-100 cm Länge) chromatographiert. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser entwickelt, während 100 ml Anteile gesammelt werden. Die Anteile 39 und 40 enthalten das nicht umgesetzte   Tripeptidmethionylaspartylphenyl-    alanylamid. Andere kleiner Fraktionen unbestimmter Struktur werden aus den Anteilen 41-59 gesammelt.



  Das gewünschte Produkt wird aus den kombinierten Anteilen 60-64 erzielt, indem der ursprüngliche pH
7,4 mit konzentrierter Salzsäure auf 2 herabgesetzt wird und dann gefriergetrocknet wird. Die Identität und die optische Reinheit des Produkts werden durch eine Spinco-Analyse und enzymatische Hydrolyse mit
Leucinaminopeptidase, einem für L-Aminosäuren spezifischen Enzym, bestimmt. Aus der Spinco-Analyse geht hervor, dass die erwarteten Aminosäuren in dem erwarteten Verhältnis vorliegen. Das enzymatische Hy drolysegemisch wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Ninhydrin als Probereagens analysiert. Auf dem Chromatogramm sieht man Flecken, die jeder der Ausgangsaminosäuren entsprechen; es hat keine Flecken, die den Zwischenverbindungen entspre chen, und auch keine, die dem Produkt entsprechen.



   Diese beiden letzten Faktoren sind von grosser Wichtigkeit. Hätte irgendwelche optische Inversion im Laufe der Umsetzung stattgefunden, so hätte man Produkte oder Zwischenverbindungen oder beides auf dem Chro matogramm gefunden. Der Grund dafür ist darin zu sehen, dass die enzymatische Hydrolyse infolge der optischen Spezifität des Enzyms bei der invertierten Aminosäure haltmachen würde.



   Beispiel 17
Verwendung vermischbarer und unvermischbarer
Lösungsmittel
Ein Apparat wird aus Glasröhren hergestellt. Er besteht aus einem waagrechten Abschnitt mit einem ausgeweiteten blasähnlichen Teil in der Mitte. Ein zu einem Kochbecher in einem Gemisch von Eis und Salz führender Abschnitt der Glasröhren hängt vom ausgeweiteten Teil ab und steht damit in Verbindung. An beiden Enden des waagrechten Abschnitts sind nach oben ragende Abschnitte, die dazu   auvgerüstet    sind, subkutane Spritzen zu halten. Die Spritzen enthalten vor    gängig abgekühlte Lösungen der Reaktionsteilnehmer in mischbaren oder unvermischbaren Lösungsmitteln. Die    Spritzen werden gleichzeitig betätigt, so dass die Lösungen den ausgeweiteten Teil zur im wesentlichen selben Zeit erreichen.

  Infolge ihrer Geschwindigkeit bewirken die Lösungen eine Wirbelströmung in der Reaktionszone, so dass die Reaktionsteilnehmer innig vermischt werden. Die Umsetzung findet statt, und das N-Carboxypeptid fliesst durch die sich nach unten erstreckende Röhre in den Becher. Nach etwa 2 min wird die Decarboxylierung im Becher durchgeführt, in dem konzentrierte Salzsäure unter   raschem    Rühren beigefügt wird, während Stickstoff durch das Gemisch geleitet wird.



   Bei einem solchen Versuch werden 85 mg (0,44 Millimol) N-Carboxyphenylalaninanhydrid in 2 ml Dioxan und 18 ml vorgängig auf etwa 30 C abgekühltes Wasser in die eine Spritze und 42 mg (0,40 Millimol) Serin in 20 ml Kaliumborat in die andere gegeben. Man bringt die Lösungen in der Reaktionszone zusammen und lässt sie in den Becher fliessen. Nach 90 sec wird das Produkt im Becher bei pH 3 mit konzentrierter Salzsäure unter raschem Rühren decarboxyliert, während ein ununterbrochener   StickstoffFtrom    15 min durch das Gemisch geleitet wird. Das Gemisch wird dann gefriergetrocknet und der Rückstand mit Methanol extrahiert. Die Methanollösung wird auf einer Silicagel Säule chromatographiert und die Säule mit einem Gemisch von N-Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 4:1: 5 entwickelt.

  Die ersten Fraktionen enthalten Phenylalanin, die mittleren das gewünschte Produkt und die letzten nicht umgesetztes Serin.



   In einem ähnlichen Versuch wird das Dioxan durch Äthylacetat ersetzt. Nach der Decarboxylierung wird die Äthylacetatschicht isoliert und das Produkt wie beim vorliegenden Verfahren aus der Wasserschicht zurück gewonnen.

 

   Beispiel 18
Arginylprolylprolylglycylphenylalanylserylprolyl phenylalanylarginin
Serylprolylphenylalanylarginin
15,75 g (75 Millimol) Arginin   HC1    werden in 2,62 1 pH 10 Natriumborat-Puffer gelöst, der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und Stickstoff 10 min eingeleitet. Der pH wird mit   50S    Natriumhydroxyd auf 10,2 erhöht und die Lötung auf   0  C    abgekühlt. 400 g Eis und dann 82,5 Millimol in 200 ml Aceton gelöstes N-Carboxyphenylalaninanhydrid werden beigefügt. Nach kräftigem Rühren während 1 min wird die Lösung bis zu pH 3 angesäuert und Stickstoff 10 min eingeleitet.

  Der pH wird dann  auf 9,5 erhöht, und 15,9 g (112,5 Millimol) N-Carboxyprolinanhydrid in   150    ml Aceton und dann 400 g Eis, um die Temperatur bei   0     C zu behalten, werden beigefügt. Die Lösung wird 1 min kräftig gerührt und wie oben decarboxyliert. Das Produkt wird nicht isoliert. Das Verfahren wird bei pH 9,3 unter Beigabe von 34 g (150 Millimol)   O-Trifluoracetyl-N-carboxy    serinanhydrid in 150 ml Aceton wiederholt. Nach Vermischen während 1 min wird der pH auf 7 eingestellt und das Gemisch gefriergetrocknet. Die gesamten Feststoffe werden dreimal mit Methanol extrahiert und die   Methanolcxtrakte    von Silicagel adsorbiert und zur Trockne konzentriert. Das Silicagel wird dann einer in Isopropanol hergestellten Silicagel-Säule beigefügt.

  Die Säule wird mit einem Gemisch von 80 Teilen Methanol,
18 Teilen Wasser und 2 Teilen Ammoniak entwickelt.



  Das gewünschte Tetrapeptid wird aus den Fraktionen
18-21 isoliert und die Struktur durch eine Spinco Analyse bestätigt.



      Phenylalanylserylprolylphenylalanylarginin   
1,8 g (3,56 Milimol) Serylprolylphenylalanylarginin werden in 125 ml Natriumborat-Puffer bei pH 9,5 gelöst und auf   00 C    abgekühlt und 70 g Eis beigefügt, um die Temperatur beizubehalten. 755 mg (3,92 Millimol) N-Carboxyphenylalaninanhydrid werden in Aceton gelöst und unter kräftigem Rühren in die gepufferte Lösung gegeben. Der pH wird auf 7 eingestellt und das ganze Reaktionsgemisch auf eine 40 ml Kohlenstoffsäule gegeben. Die Säule wird mit 500 ml Wasser gewaschen und dann mit Ammoniumhydroxyd eluiert, bis die Fraktionen sich bei der Ninhydrinprobe reaktiv verhalten. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden gefriergetrocknet. Der feste Rückstand wird auf einer Silicagel-Säule chromatographiert.



  Die Säule wird mit 6 Teilen sekundärem Butanol, 3 Teilen Wasser und 1 Teil Essigsäure entwickelt. Die Fraktionen 6-9 enthalten das gewünschte Tetrapeptid.



  Die Struktur wird durch eine Spinco-Analyse bestätigt.



     Prolylprolylgiycin   
1,5 g (20 Millimol) Glycin werden in 250 ml Natriumborat-Puffer bei pH 10 gelöst und auf   0     C abgekühlt. Es werden 50 g Eis und dann 2,82 g (20 Millimol) N-Carboxyprolinanhydrid in 20 ml Aceton beigefügt. Das Reaktionsgemisch wird 1 min kräftig gerührt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt. Stickstoff wird 10 min eingeleitet und der pH durch Zusatz von 50 % Natriumhydroxyd auf 10 eingestellt. Die Lösung wird auf   0  C    abgekühlt, und 50 g Eis und 3,1 g (22 Millimol) N-Carboxyprolinanhydrid in 25 ml Aceton werden beigefügt. Nach Vermischen während 1 min wird der pH auf 7 herabgesetzt und das Gemisch gefriergetrocknet.

  Das Produkt wird durch dreimaliges Extrahieren mit 25 ml Methanol entsalzt und die   Methanolextrakte    an IRC 50-Harz adsorbiert und mit einem Gemisch von Essigsäure und Wasser entwickelt. Das Produkt wird aus einem   Ge    misch von Wasser und Aceton kristallisiert. 2,5 g (9,3 Millimol) des isolierten Prolylprolylglycins werden in 2,5 n Natriumhydroxyd gelöst, so dass der pH der Lösung 10 beträgt, und auf   0-50 C    abgekühlt. 1,75 g (10,4 Millimol) Carbobenzoxychlorid werden unter kräftigem Rühren tropfenweise beigefügt. Die Temperatur wird bei   0     C und der pH durch Zusatz von 2,5 n Natriumhydroxyd bei 10 gehalten. Wenn der pH konstant ist, wird das Reaktionsgemisch weitere 30 min gerührt.

  Es wird zweimal mit je 10 ml Äther extrahiert, um das überschüssige Säurechlorid zu entfernen, und dann mit 2,5 n Salzsäure angesäuert (Lackmuspapier).



  Es scheidet sich ein Ö1 ab, das aus Chloroform kristallisiert wird.



   2,85 g (7 Millimol) Carbobenzoxyprolylprolylglycin werden in 15 ml Dioxan gelöst und 800 mg (7 Millimol) Hydroxysuccinimid der   Lösung    beigefügt. 1,4 g (7 Millimol) N,N-Dicyclohexylcarbodiimid werden beigefügt, und das Reaktionsgemisch wird über Nacht abgekühlt.



  Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit Dioxan gewaschen. Das Filtrat wird zu einem Ö1 konzentriert, das aus einem Gemisch von Äthylacetat und   Petroiäther    kristallisiert wird.



   Eine Lösung wird aus 652 mg (1 Millimol) Pentapeptid und 168 mg (2 Millimol) Natriumbicarbonat in 2 ml Wasser hergestellt. 50 mg (1 Millimol) des N Hydroxysuccinimidesters von Carbobenzoxyprolylprolylglycin, in 3 ml Äthanol gelöst, werden beigefügt. Das   Reaktionsgemiscli    wird über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach Ansäuern bis zu pH 2 mit Salzsäure wird das Äthanol im Vakuum entfernt, und es fällt ein Ö1 aus. Dieses Öl wird aus der wässerigen Schicht isoliert, in Äthylacetat gelöst, mit Wasser   ge    waschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert; man erhält 565 mg Carbobenzoxyoctapeptid.



   485 mg (0,462 Millimol) Carbobenzoxyoctapeptid werden in 10 ml Eisessig gelöst und 500 mg eines aus 10 % Palladium auf Holzkohle bestehenden Katalysators beigefügt. Die Verbindung wird 2 h bei einem Druck von 2,8   kg,/cm2    hydriert. Der Katalysator wird entfernt und die Lösung zu einem Ö1 konzentriert.



  Dünnschichtchromatographie zeigt, dass das Produkt immer noch das geschützte Peptid ist. Das Ö1 wird in 30 ml Eisessig gelöst und 500 mg eines aus   10%    Palladium auf Holzkohle bestehenden Katalysators werden wieder beigefügt. Das Reaktionsgemisch wird dann über Nacht bei einem Druck von 2,8 kg/cm2 hydriert.



  Der Katalysator wird entfernt und das Reaktionsgemisch zur Trockne konzentriert; man erhält 167 mg ungeschütztes    Prolylprolylglycylphenylalanylserylprolylphenyl-    alanylarginin.



   48 mg Octapeptid werden in 1,8 ml pH-10-Puffer gelöst, und der pH wird bei   03 C    auf 9,5 eingestellt.



  In diese Lösung wird 0,3 ml   N-Carboxyargininanhy-    drid in Dimethylformamid gegeben. Die beigefügte Menge NCA ist ein   100%iger    Überschuss. Nach Vermischen während 1 min wird der pH auf 6,3 gebracht und das Reaktionsgemisch getrocknet. Der   gefrierge    trocknete Feststoff wird durch Extraktion mit Methanol entsalzt und auf eine Säule aus Amberlite IRC-50-Harz gegeben und das gewünschte Nonapeptid mit   25-50 %    Essigsäure in Wasser eluiert. Nach Gefriertrocknen der Fraktionen 13-19 werden 17,9 mg Bradykinin isoliert und in 7 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird ausge   schlendert,    um gewisse unlösliche Substanzen zu entfernen, und bei Raumtemperatur zu einem kleinen Volumen konzentriert. 

  Ein amorpher Feststoff wird ausgeschleudert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Eine Sinco-Essigsäure-Analyse bestätigt die   Bradykinin-Struktur.   



   Beispiel 19    Phenylalanylglycylleucylvalylglycin   
Ein trockenes Gemisch von 2,02 Millimol N-Carboxyanhydrid von Phenylalanin und 2 Millimol Glycylleucylvalylglycin wird auf einmal in   20    ml eines rasch gerührten wässerigen Kaliumborat-Puffers bei pH  9 und   0  C    gegeben. Das Gemisch wird 45 sec gerührt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0     C auf 4 eingestellt, während ein Stickstoffstrom etwa
10 min durch das Gemisch geleitet wird.



   Das Produkt wird durch Gefriertrocknen und Extraktion des Rückstandes mit Methanol zurückgewonnen. Die Methanollösung wird mit einem   4:1: 5    Gemisch von n-Butanol, Essigsäure und Wasser entwickelt.



   Beispiel 20
Tyrosylleucyl-(D)-phenylalanin
Ein Gemisch von 3 Millimol D-Phenylalanin in 30 ml 5 g Eis enthaltendem Kaliumborat-Puffer bei pH 10,5 wird auf   30 C    abgekühlt; 3,2 Millimol festes n-Carboxyleucinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Umsetzung wird 30 sec fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0     C auf 3   eingestellt,    während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Produkt, Leucylphenylalanin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,0 eingestellt; 3,4
Millimol Tetrahydropyranyltyrosin-N-Carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa   0     C gehalten wird. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und die Decarboxylierung bewirkt, indem der pH mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt wird. Man lässt das Gemisch bis zu Raumtemperatur erwärmen und hält es 1 h bei dieser Temperatur, um die Schutzgruppe zu entfernen. Das gewünschte Produkt wird chromatographisch auf einer Sillicagel Säule isoliert.



   Beispiel 21    ss(3 ,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanylphenylalanyl-    glycylleucylvalylglycin
2,02 Millimol des Produkts aus Beispiel 21 werden in 30 ml Kaliumborat-Puffer bei pH 10 aufgenommen. Die Lösung wird auf   0  C    abgekühlt, und 3 Millimol Ditetrahydropyranyläther von N-Carboxy-ss   (2,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin    (DOPA) werden unter raschem Rühren in einer Mischpumpe beigefügt. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 4 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird.



  Stickstoff wird weitere 20 min durchgeleitet. Man lässt das Gemisch sich dann bis zu Raumtemperatur erwärmen und hält es eine Stunde bei dieser Temperatur.



  Das Produkt wird chromatographisch isoliert.



   Beispiel 22    Isoleucylvalylgiycylepinephrin   
Ein Gemisch von 3 Millimol Epinephrin in 30 ml 5 g Eis enthaltendem wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10 wird auf   0     C abgekühlt; 3,01 Millimol N Carboxyglycinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Umsetzung wird 40 sec fortgesetzt und der pH mit Schwefelsäure bei 20 C auf 4 herabgesetzt, während Stickstoff 20 min durch das Gemisch geleitet wird. Das Produkt, Glycylepinephrin, wird nicht isoliert.



   Die nachstehende Tabelle zeigt das Verfahren, nach welchem das   Glycylepinephrin    in das Endprodukt umgewandelt wird.



  NCA Millimol pH Temp. Dauer   -CO2-pH    VAL 3,1 10   20 C    1 min 3 ILEU 3,4 10,5 0 C 45 sec 4
Das Produkt wird chromatographisch isoliert.



   Beispiel 23    Glykylleucylvalyl-a-naphthylamin   
Ein Gemisch von 2,0 Millimol a-Naphthylamin wird in 30 ml Essigsäure-Natriumacetat-Puffer bei pH 4,6 auf 50 C abgekühlt; 2,03 Millimol N-Carboxyvalylanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Das sich bildende Carbamat von Valyl-a-naphthylamin decarboxyliert spontan. Das Gemisch wird 20 min mit Stickstoff gereinigt. Der pH wird dann durch Zusatz von wässerigem Natriumhydroxyd auf 10 eingestellt, und 2,3 Millimol N-Carboxyleucinanhydrid werden bei einer Temperatur von 20 C unter raschem Rühren beigefügt.



  Der pH wird mit Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt, um die Decarboxylierung zu bewirken, und das Gemisch 15 min Stickstoff gereinigt. Am Ende dieser Zeit wird der pH mit Natriumhydroxy auf 9,5 erhöht und 2,9 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid bei   30 C    unter raschem Rühren beigefügt. Der pH wird dann mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt und das Gemisch 20 min mit Stickstoff gereinigt. Das Produkt wird auf einer Silicagel-Säule chromatographisch isoliert.



   Beispiel 24    Phenylalanylglycylgiycylleucin   
In ein Gemisch von 2 Millimol Leucin in 20 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10 und   250 C    werden 2,05 Millimol festes N-Thiocarboxyglycinanhydrid unter raschem Rühren gegeben. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 5 eingestellt, um die Dethiocarboxylierung zu bewirken, während ein Stickstoffstrom etwa 10 min durch das Gemisch geleitet wird, um Glycylleucin zu erzeugen, welches nicht isoliert wird.



   Das Verfahren wird bei pH 10 während einer Reaktionsdauer von 10 min unter Verwendung von 2,02 Millimol N-Thiocarboxyglycinanhydrid wiederholt, um Glycylglycylleucin zu erzeugen, das nicht isoliert wird.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 9,5 eingestellt, und 2,1 Millimol   N-Thiocarboxyphenylalaninanhydrid    werden bei   250 C    unter raschem Rühren beigefügt. Nach 30 min wird der pH auf 4 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das gewünschte Tetrapeptid bildet sich und wird durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat isoliert.



   Ersetzt man das N-Thiocarboxyphenylalaninanhydrid durch das geeignete Anhydrid und wiederholt man das obige Verfahren, so werden folgende Verbindungen hergestellt:
Valylglykylglykylleucin    Isoleuoylglykylglykylleucin   
Alanylglykylglykylleucin
Beispiel 25
Tyrosylleucylphenylalanin
In ein Gemisch von 3 Millimol Phenylalanin in 30 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10 werden 3,2 Millimol festes N-Thiocarboxyleucinanhydrid unter raschem Rühren gegeben. Die Temperatur wird auf 400 C  erhöht und 10 min dort gehalten. Die Lösung wird dann abgekühlt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0  C    auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Produkt, Leucylphenylalanin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Beigabe von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,0 eingestellt, und 3,4 Millimol Tetrahydropyranyltyrosin-N-thiocarboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei ungefähr 250 C gehalten wird. Die Umsetzung wird 20 min fortgesetzt und die Dethiocarboxylierung bewirkt, indem der pH mit Schwe felsäure auf 3 gebracht wird. Das Gemisch wird eine Stunde stehengelassen, um die Schutzgruppe zu entfernen. Das gewünschte Produkt wird auf einer Silicagel Säule chromatographisch isoliert.



   Die gleiche Verbindung wird hergestellt, indem man das obige Verfahren unter Verwendung von Athoxy   äthyltyrosin-N-carboxyanhydrid    wiederholt.



   Beispiel 26
Valylleucylalanylcystein
Ein Gemisch von 2 Millimol Cystin in 30 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 10 wird bei etwa   10     C gehalten, während 4,1 Millimol N-Thiocarboxyalaninanhydrid unter raschem Rühren beigefügt werden.



  Die Umsetzung wird 15 min fortgesetzt und der pH mit verdünnter Salzsäure bei   20 C    auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das erzielte Produkt, Bis(alanyl)cystin, wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird auf 10,2 eingestellt.



  Das Gemisch wird auf   0     C abgekühlt, und 4,2 Millimol N-Thiocarboxyleucinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Die Umsetzung wird 1 h fortgesetzt und die Dethiocarboxylierung bewirkt, indem der pH auf 3,5 herabgesetzt wird, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Bis(leucylalanyl)cystin-Zwischenprodukt wird nicht isoliert, sondern mit 4,3 Millimol N-Thiocarboxyvalinanhydrid bei 250 C unter raschem Rühren behandelt und mit Schwefelsäure bei pH 3 dethiocarboxyliert, wobei man Bis(Valylleucylaianyl)cystin erhält, das aus dem Reaktionsgemisch ausgesalzt wird.



   Das Produkt wird mit Schwefelwasserstoff zu Valylleucylalanylcystein reduziert.



   Beispiel 27    Lysylglykylglykylleucinacetat   
Glykylglykylleucin wird gemäss dem Verfahren von Beispiel 25 hergestellt und das diese Verbindung enthaltende Reaktionsgemisch 2 h unter raschem Rühren bei   0     C mit 2,5 Millimol festem epsilon-Carbobenzoxy N-thiocarboxylysinanhydrid behandelt. Die Dethiocarb   oxJrlierung    wird mit Schwefelsäure in Gegenwart von Stickstoff bei pH 4 bewirkt. Das Produkt, E-Carbobenzoxylysylglykylglykylleucin, wird aus dem Gemisch ausgesalzt und durch Filtrieren zurückgewonnen.



   Die Carbobenzoxygruppe wird durch Hydrieren entfernt und das Produkt isoliert, indem der Raneynickel Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt wird.



   Beispiel 28    Glykylphenylalanylleucin.   



   Eine Lösung von 40 Millimol Leucin in   400    ml 0,45 M Borsäure-Puffer wird in einer Mischpumpe unter Stickstoff bei 20 C mit   50X    Natriumhydroxyd auf pH 10,5 eingestellt. In die gerührte Lösung werden 35 Millimol N-Carboxyphenylalaninanhydrid rasch gegeben, während der pH durch Zusatz von   50%    Natriumhydroxyd bei 10,5 gehalten wird. Das Gemisch wird filtriert und das farblose Filtrat mit   50S;    Schwefelsäure bis zu pH 5,4 angesäuert, während Stickstoff durch die Lösung geleitet wird. Das Produkt, Phenylalanylleucin, fällt aus und wird durch   Filtrieren    zurückgewonnen.



   Ein Gemisch von 2 Millimol Phenylalanylleucin in 10 Millimol 0,45 M Borsäure-Puffer wird durch Zusatz von 50 % Natriumhydroxyd unter Stickstoff bei 40 C auf pH 9,5 gebracht. In das gerührte Gemisch werden 2,1 Millimol N-Thiocarboxyglycinanhydrid gegeben, während der pH durch Beigabe von   50%    Natriumhydrid bei 9,5 gehalten wird. Nach 10-minutigem Rühren bei etwa 40 C wird das Gemisch filtriert und der pH mit 50 % Schwefelsäure auf 5,5 eingestellt, während Stickstoff durch das Gemisch geleitet wird. Das gewünschte Produkt,   Glycylphenylalanylleucin,    wird durch Filtrieren zurückgewonnen.



   Beispiel 29
Glykylprolylphenylalanylarginin
Insgesamt 2,0 Millimol Argininhydrochlorid werden in 200 Mol Kaliumborat-Puffer aufgenommen; der pH wird auf 3,0 herabgesetzt, während Stickstoff durch das Gemisch geleitet wird, um   Kohlendioxyd    zu vertreiben, und dann durch Zusatz von wässerigem Kaliumhydroxyd auf 10,5 erhöht. Das Gemisch wird auf   0     C abgekühlt, und 25 g Eis und dann 3,82 g N-Thiocarboxyphenylalaninanhydrid werden beigefügt. Das Gemisch wird 2 h in einer Mischpumpe rasch gerührt.



  Der pH wird mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt, um die Dethiocarboxylierung zu bewirken.



   Der pH wird durch Beigabe von Kaliumhydroxyd auf 10 erhöht und das Verfahren mit 2,02 Millimol N-Thiocarboxyprolinanhydrid während einer Reaktionsdauer von 30 min bei 250 C wiederholt. Der pH wird mit Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt, um die Dethiocarboxylierung zu bewirken.



   Das Verfahren wird bei 200 C, einem anfänglichen pH von 9,5 und einer Reaktionsdauer von 15 min mit 2,02 Millimol N-Thiocarboxyglycinanhydrid wiederholt.



  Der pH wird mit Schwefelsäure auf 7 herabgesetzt und das Gemisch etwa 16 h stehengelassen, um die Dethiocarboxylierung zu bewirken.



   Das Reaktionsgemisch wird bis zu einem Volumen von 10 1   10flach    verdünnt und 18 h über eine Säule von 800 ml IRC-50 geleitet. Die Säule wird mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 ml/min mit 4 1 Wasser gewaschen und mit 0,35 n Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 300 ml gesammelt. Die Fraktionen, bei denen die Ninhydrinprobe positiv ausfällt, werden gefriergetrocknet und die Feststoffe   kom-    biniert und mit Methanol extrahiert,   bis    die Ninhydrinprobe bei den Extrakten negativ ausfällt. Die Extrakte mit der positiven Ninhydrinprobe werden   kom-    biniert und im Vakuum zur Trockne verdampft. 

  Der Rückstand wird in einer minimalen Menge verdünnter Schwefelsäure bei pH 4,5 aufgenommen und ein Niederschlag durch Zusatz von 5 Volumen Methanol und dann 10 Volumen Äthanol gebildet. Der Niederschlag wird durch Filtrieren zurückgewonnen, in Wasser gelöst und mit denselben Mengen Methanol und   Äthanol      wiedergefällt.    Das gefällte Produkt, Glykylprolylphenyl  alanylarginin, wird isoliert und mit Methanol und Äther gewaschen.



   Beispiel 30
Bradykinin
Die nachstehende Tabelle veranschaulicht das Verfahren, nach dem Nonapeptid    Arginylprolylprolylglykylphenylalanylseryl-    prolylphenylalanylarginin gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt wird. Die Tabelle gibt die Stufenreihe an, in welcher N - Carboxyanhydride oder   N - Thiocarboxyanhydride    nacheinander beigefügt werden, um das gewünschte Produkt zu erzeugen. Die Anfangsumsetzung erfolgt zwischen einem Millimol Arginin und einem Millimol N-Carboxyphenylalaninanhydrid in 10 ml wässerigem Milieu, das mit Borsäure auf pH 10,5 gepuffert wird.



  Dieser pH wird durch Zusatz von   5 S igem    wässerigem Natriumhydroxyd während der Reaktionsdauer beibehalten. Die   Prolylphenylalanylarginin-Zwischenverbin-    dung wird nach der End-Decarboxylierung bei pH 3 isoliert, indem das Gemisch zuerst gefriergetrocknet und der Rückstand dann in Methanol aufgenommen wird.



  Die Methanollösung wird auf einer Silicagel-Säule chromatographiert und das gewünschte Tripeptid mit 20 % igem wässerigem Methanol, das genügend Essigsäure enthält, damit der pH bei 5 liegt, eluiert. Dieses Tripeptid wird durch aufeinanderfolgende Umsetzungen ohne Isolierung der Zwischenverbindungen in das gewünschte Nonapeptid umgewandelt. In der ersten Umsetzung wird 1 Millimol Tripeptid in 5 Millimol Wasser 30 min bei pH 9,0 und 40 C mit einer äquivalenten Menge N-Thiocarboxyserinanhydrid umgesetzt. Die Bedingungen bei der zweiten Umsetzung werden in der Tabelle angegeben, wobei der pH unter Verwendung von festem Bariumhydroxyd gesteuert wird. Die Dethiocarboxylierung wird am Schluss jeder Umsetzung mit konzentrierter Schwefelsäure bewirkt. Der Bariumsulfat   Niederçchlag    wird durch Filtrieren entfernt, bevor man zur nächsten Umsetzung übergeht.

  Das Endprodukt dieser Reihe von Umsetzungen ist eine lösliche Sulfatlösung von Bradykinin, die in die freie Säure umgewandelt und auf IRC-50, einem Sulfosäure-Ionenaustauscherharz, durch stufenweises Eluieren mit wässeriger Essigsäure chromatographisch isoliert wird.



   Tabelle I
Stufe Reagens Substrat Kong. pH Temp. Dauer
1 Phe NCA Arg.   1 mM/10 ml    10,5   00 C    1 min
2 Pro NCA Phe-arg. 1 mM/10 ml 10,0   00 C    1 min
3 Ser TCA   *    mM/5 ml 9,0   40 C    30 min
4 Phe TCA *   1 mM/5 ml    9,5   250 C    1 h
5 Gly TCA *   1 mM/5 ml    9,0   40 C    10 min
6 Pro TCA * 1   mM/5    ml 9,0 250 C 30 min
7 Pro TCA * 1   mM/5    ml 9,0 250 C 30 min
8 Arg TCA   *      1 mM/5 ml    9,5   250 C    1 h   t    Das Substrat ist das oben hergestellte Peptid
Beispiel 31    Glykylleucylphenylalanyl-(C14)    

   arginin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines mit Radioisotopen versetzten Peptids.



   Ein Gemisch wird aus 0,392 mg einheitlich versetztem   C14    Arginin (0,5 Millicurie) in 5,0 ml 0,01 n Salzsäure und 421 mg nicht versetztem Arginin in 20 ml 1 M Kaliumborat-Puffer bei pH 10,5 hergestellt. Eine Probe von 0,2 ml wird entnommen. In das Gemisch wird bei einer Temperatur von   25-300 C    ein 5 %iger molarer Überschuss an N-Thiocarboxyanhydrid von Phenylalanin unter raschem Rühren auf einmal gegeben und das Rühren 15 min fortgesetzt, während der pH durch Beigabe von 5 n Kaliumhydroxyd bei 10-10,5 gehalten wird. Am Ende der Reaktionszeit wird ein Tropfen Caprylalkohol als Antischaummittel beigefügt.



  Der pH wird dann durch Zusatz konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 herabgesetzt   urid    Stickstoff 10 min durch das Gemisch geleitet. Der pH wird mit konzentriertem Kaliumhydroxyd auf   102    erhöht und eine 0,1 ml-Probe des   Phenylalanyl-(C14)arginin    enthaltenden Reaktionsgemisches entnommen.



   In das erzielte Gemisch wird bei einer Temperatur von   25-300    C ein 6,5   %    iger molarer Überschuss an N Thiocarboxyanhydrid von Leucin unter raschem Rühren gegeben. Die Umsetzung wird 20 min fortgesetzt, während der pH mit 5 n Kaliumhydroxyd bei 9 bis 9,5 gehalten wird. Die Dethiocarboxylierung wird auf die oben beschriebene Weise bei pH 3,0 durchgeführt.



  Der pH wird dann mit konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht und eine   Leucylphenylalanyl-(Ct4)argi-    nin enthaltende Probe von 0,1 ml zur Analyse entnommen.



   Das Tripeptid wird durch Zugabe eines 8 % igen molaren Überschusses an N-Thiocarboxyanhydrid von Glycin zum Reaktionsgemisch bei 150 C unter raschem Rühren in das N-Thiocarboxypeptid von Glykylleukylphenylalanyl-(C14)arginin umgewandelt. Die Umsetzung wird 30 min fortgesetzt, während der pH mit 5 n Kaliumhydroxyd bei 9,8-10 gehalten wird und das N Thiocarboxypeptid wie oben beschrieben bei pH 3 decarboxyliert. Der pH wird mit wässerigem konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht und eine die gewünschte Verbindung enthaltende Probe von 0,1 ml zur Analyse entnommen.



   Jede der oben gesammelten Proben wird unter Verwendung eines aus Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 4:1: 5 gebildeten Gemisches auf Papier chromatographiert. Die Chromatogramme werden mit einem Radioaktivitätsstreifen abtaster abgetastet. Die Ergebnisse zeigen, dass jede der gewünschten Umsetzungen     zu    einer Ausbeute von über 85   %    und einem Produkt, das im wesentlichen frei von Nebenreaktionen ist, führt.



   Das Reaktionsgemisch wird gefriergetrocknet und der Rückstand dreimal mit je 150 ml Methanol extrahiert. Die kombinierten Extrakte werden bei   40     C im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird in 2 ml Wasser aufgenommen und   114    der Lösung bis zu 1 Liter verdünnt. Diese   verdünnte    Lösung   wird    auf einer Säule von 2,2 cm Durchmesser und 55 cm Höhe, die 200   ml    Carbonsäureionenaustauscher (CG-50, erhältlich bei Rohm  & Haas, Philadelphia) enthält, am Wasserstoffzyklus chromatographiert. Die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min mit der Lösung gespiesen und   dann    gewaschen, so dass man 2   1    Wasser erhält. Die Säule wird mit   (),01    n Schwefelsäure eluiert.

  Der   ausfiiessende    Strom wird unter Verwendung einer Anthracen-Säule, die anfänglich mit einer Geschwindigkeit von 0,2   milmin    gespiesen wird, auf das   Cl4-Isotop    hin untersucht. Die Zuflussgeschwin   digkeit    wird   iii    einem Zeitraum von 20 min allmählich auf 0,6   mllmin    erhöht und die Geschwindigkeit bis zum Schluss des Versuchs konstant gehalten. Das Eluierte wird in Anteilen von 24 ml gesammelt und das gewünschte Produkt erzielt, indem die Anteile mit dem erwarteten   Is otopengeh alt    für Tetrapeptid durch Einstellen des pH-Werts auf 9,5 mit   50 % igem    wässerigem Natriumhydroxyd und Gefriertrocknung kombiniert werden.

  Der Rückstand wird mit Methanol extrahiert und der Extrakt bei   40     C im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst und der pH mit konzentrierter Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält, das aus einem Gemisch von Wasser und Äthanol umkristallisiert wird.



   Beispiel 32
Histidylalanylleucylglykylisoleucin
In ein Gemisch von 4 Millimol   Alanylleucylgtykyl-    isoleucin in 30 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer bei pH 9,5 werden 4,3 Millimol   N-Tliiocarboxyhistidinan-    hydridhydrobromid unter raschem Rühren gegeben, während die Temperatur bei   15     C gehalten wird. Das Gemisch wird 20 min bei dieser Temperatur gehalten   und    die Temperatur dann auf etwa   3     C gesenkt. Der pH wird auf   3,1    herabgesetzt. um die   Dethiocarboxy    lierung zu bewirken. Das Gemisch wird mit Stickstoff gereinigt. Der pH wird auf 7 erhöht und das gewünschte Produkt auf Silicagel chromatographisch isoliert.



   Beispiel 33    Glykylhistidylglykylphenylal anylleucin   
Eine Lösung von 40 Millimol Leucin in 400 ml 0.45 M Borsäure-Puffer wird in einer Mischpumpe unter Stickstoff bei   2     C mit Natriumhydroxyd auf pH 10,5 gebracht. In die gerührte Lösung werden 35 Millimol N-Carboxyphenylalaninanhydrid rasch gegeben, während der pH durch Zusatz von   50%    Natriumhydroxyd bei 10,5 gehalten wird. Das Gemisch wird filtriert und das farblose Filtrat mit   50%    Schwefelsäure bis zu pH 5,4 angesäuert, während Stickstoff durch die Lösung geleitet wird. Das Produkt, Phenylalanylleucin, fällt als und wird durch Filtrieren gesammelt.



   Beispiel 34    Threonylphenyl alanin   
Eine Lösung von 145 mg Phenylalanin in 10 ml Wasser und 10 ml 0,9 M Borsäure wird in einer Mischpumpe mit 50   Sigem    wässerigem Natriumhydroxyd auf pH 10,5 gebracht, und 326 mg   O-Trimethylthreonin-    N-carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren in einem Zeitraum von etwa 3 min unter Stickstoff in Anteilen beigefügt. Das Gemisch wird bei etwa   50 C    und der pH durch die tropfenweise Beigabe von insgesamt   075    ml 2,5 n wässerigem Natriumhydroxyd während der Reaktionsdauer konstant gehalten. Der pH wird dann durch Zusatz von Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt. Man lässt die Temperatur sich bis zu etwa   30     C erhöhen und hält das Gemisch 5 min bei dieser Temperatur, um die Decarboxylierung zu bewirken.



   Eine kleine Probe des Reaktionsgemisches wird in 0,1 molarem Natriumtetraborat bei pH 9,5 und 600 Volt 3 h einer Papier-Elektrophorese unterzogen und das Threonylphenylalanin durch den Vergleich seiner Beweglichkeit mit derjenigen einer authentischen Probe des Produkts unter gleichen Bedingungen identifiziert.



   Der Rest des Reaktionsgemisches wird mit 2,5 n wässeriger Salzsäure auf pH 6,5 gebracht und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird mit Methanol extrahiert und filtriert und das Filtrat zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne verdampft und der Rückstand mit Methanol verrieben. Die Methanollösung wird auf entaktivierter Holzkohle chromatographiert und zuerst mit Wasser (19 2 ml Fraktionen) und   dann    mit einem Gemisch von 47,5 ml Aceton, 47,5 ml Wasser und 5 ml 5   %    iger Essigsäure chromatographiert. Das Produkt wird erzielt, indem die je etwa 2 ml enthaltenden Fraktionen 20-26 kombiniert und gefriergetrocknet werden.



   Beispiel 35    Seryl-phenylalanin   
Eine Lösung von 330 mg Phenylalanin, 10 ml Wasser und 10 ml 0,9 molarer Borsäure wird in einer Mischpumpe mit   50 % igem    wässerigem Natriumhydroxyd auf pH 10,5 gebracht; 406,6 mg Trimethyl   silylserin-N-carboxyanhydrid    werden unter Stickstoff in Anteilen in einem Zeitraum von 3 min unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei   30 C    gehalten wird. Der pH wird durch die tropfenweise Beigabe von insgesamt 0,85 ml 2,5 n wässerigem Natriumhydroxyd konstant gehalten. Eine Probe wird in einem 10:   1 :    3 Gemisch von Butanol, Essigsäure und Wasser gelöst und einer Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unterzogen.

  Das Produkt wird dadurch bestimmt, dass seine Beweglichkeit im System mit derjenigen einer authentischen Probe verglichen wird.

 

   Beispiel 36
Threonylmethionyl-O-benzylserylisoleucylthreonin
Ein Gemisch von 10 ml Wasser und 10 ml 0,9 molarer Borsäure in einer Mischpumpe wird mit   50% igem    wässerigem Natriumhydroxyd auf pH 10 gebracht und 1,081 g   Methionyl-O-henzylserylisoleucyl    threonin beigefügt. Der pH wird dann mit zusätzlichem wässerigem Natriumhydroxyd auf 10,3 erhöht, und 478 mg Trimethylsilylthreonin-N-carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren in einem Zeitraum von etwa 2 min in Anteilen beigefügt, während die Temperatur bei etwa   3     C gehalten wird. Während der Beigabe wird insgesamt 1 ml 2,5 n wässeriges Natriumhydroxyd beigefügt, um den pH konstant zu halten.

  Das Gemisch wird mit Wasser bis zum   sachen    seines Volumens verdünnt und dann filtriert, das Filtrat gewaschen  und der pH des Filtrats mitsamt dem zum Waschen verwendeten Wasser mit   50%iger    wässeriger Schwefelsäure auf 6,7 eingestellt. Es fällt ein amorpher Feststoff aus, der durch Papier-Elektrophorese auf 0,1 molarem   Natriumtetrabora    bei pH 9,5 und 600 Volt während 6,5 h als das gewünschte Produkt identifiziert wird.



   Beispiel 37    Glykyltyrosylleucylphenylalann   
Ein Gemisch von 3 Millimol Phenylalanin und 30 ml wässerigem Kaliumborat-Puffer von pH 10,5 wird auf 30 C abgekühlt, und 3,2 Millimol festes Leucin-N-carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt.



  Die Umsetzung wird 30 sec fortgesetzt und der pH mit konzentrierter Schwefelsäure bei   0     C auf 3 herabgesetzt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Produkt wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Beigabe von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,0 erhöht, und 3,4 Millimol Triäthylsilyltyrosin- N -carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa   0 C    gehalten wird. Die Umsetzung wird 1 min fortgesetzt und der pH mit Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt, um die Decarboxylierung zu bewirken. Das Produkt wird nicht isoliert.



   Der pH des Gemisches wird durch Zusatz von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,2 erhöht, und 3,6 Millimol Glycin-N-carboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa 30 C und der pH durch die tropfenweise Beigabe von 2,5 n Natriumhydroxyd bei 10,0-10,2 gehalten wird. Die Umsetzung wird etwa 2 min fortgesetzt und die Decarboxylierung bewirkt, indem man den pH mit Schwefelsäure auf 3,2 herabsetzt und das Gemisch sich bis zu Raumtemperatur erwärmen lässt. Das Ge   misoh    wird etwa 1 h stehengelassen und durch Filtrieren geklärt. Das gewünschte Produkt wird isoliert, indem das Reaktionsgemisch zuerst über eine Kohlensäule geleitet wird. Das Peptid wird adsorbiert und dann mit einem Gemisch von   5 %    Essigsäure mit Wasser eluiert.



  Es wird durch Gefriertrocknung aus dem Eluat zurückgewonnen.



   Beispiel 38    Tyrosylprolylphenylalanylarginin   
Insgesamt 15,75 g Argininhydrochlorid werden in 2,62 1 Natriumtetraborat-Pufferlösung von pH 10 gelöst. Der pH wird mittels konzentrierter Schwefelsäure auf 3 gebracht und Stickstoff 10 min lang eingeleitet.



  Der pH wird mit 50 % igem wässerigem Natriumhydroxyd auf 10,2 erhöht und die Lösung auf   0     C abgekühlt. In das Gemisch werden 400 g Eis und dann 82,5 Millimol in 200 ml Aceton gelöstes Phenylalanin N-carboxyanhydrid gegeben. Das Gemisch wird 1 min bei dieser Temperatur kräftig gerührt und mit konzentrierter Schwefelsäure bis zu pH 3 angesäuert, während Stickstoff 10 min eingeleitet wird. Der pH wird mit   50,Oigem    Natriumhydroxyd auf 9,5 herabgesetzt und 400 g Eis und dann 112,5 Millimol Prolin-Ncarboxyanhydrid in 150 ml Aceton beigefügt. Die Lösung wird 1 min bei   0     C kräftig gerührt und wie oben decarboxyliert. Das Verfahren wird unter Beigabe von 15,0 Millimol Tetrahydropyranyltyrosin- N -carboxyanhydrid in 150 ml Aceton bei pH 9,3 wiederholt.

  Nach Vermischen während 1 min wird der pH auf 7 herabgesetzt und das Gemisch gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in Methanol aufgenommen und das Produkt aus Lösung auf Silicagel absorbiert. Das Silicagel mit dem absorbierten Produkt wird dann auf eine vorgängig in Isopropanol hergestellte Silicagel-Säule gegeben. Die Säule wird mit einem   80:18 : 2-Gemisch    von Methanol, Wasser und Ammoniak entwickelt und das gewünschte von der Tetrahydropyranylgruppe freie Tetrapeptid isoliert.



   Folgende Verbindungen werden in ähnlicher Weise unter Verwendung des Tetrahydropyranyl-Derivates des geeigneten N-Carboxy- oder N-Thiocarboxyaminosäureanhydrids hergestellt. In jedem Fall wird das Produkt frei von der Tetrahydropyranyl-Schutzgruppe isoliert. Bei den N-Thiocarboxy-Verbindungen beträgt der Kupplungs-pH 8,8 anstatt 9,3 und die Reaktionsdauer 40 min.



     
3,5 -Dibromtyrosylprolylphenylalanylarginin
2,5-Dijodtyrosyl-prolylphenylalanylarginin   
Beispiel 39
Glutaminylalanin
Insgesamt 1,0 g N-Carboxyglutaminanhydrid wird in 25 ml Natriumborat-Puffer von pH 10 aufgenommen und das Gemisch auf etwa   0     C abgekühlt. 0,5 g Alanin wird unter raschem Rühren beigefügt. Nach 2minutigem Rühren wird der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 gebracht und Wasserstoff durch dos Gemisch durchgeperlt, um zum Entfernen von Kohlendioxyd beizutragen. Der pH wird mit wässerigem Natriumhydroxyd auf 5,7 erhöht und das Produkt unter Verwendung eines   Schwefelsäureionenaustauscherharzes    (Dowex 50-X2; erhältlich bei Dow Chemical Company, Midland, Michigan) am Wasserstoffzyklus chromatographisch isoliert. Das Produkt wird mit Ammoniumhydroxyd eluiert.



   Beim chromatographischen Verfahren wird das Re   aktionçgemisch    über eine Säule von 800 ml Harz geleitet. Die Säule wird mit Ammoniumhydroxyd von pH 11,0 bei einer Geschwindigkeit von 60   ml /min    eluiert; es werden Anteile von 500 ml gesammelt. Das gewünschte Produkt wird erzielt, indem der 17. und 18. Anteil kombiniert und gefriergetrocknet werden.



   Das Verfahren wird zur Herstellung von Glutaminylleucin wiederholt, indem das Alanin durch eine äquivalente Menge Leucin ersetzt wird. In diesem Fall wird das gewünschte Produkt zurückgewonnen, indem der 15. und 16. Anteil kombiniert und gefriergetrocknet werden.

 

   Asparaginylphenylalanin wird in ähnlicher Weise unter Verwendung äquivalenter Mengen N-Carboxyasparagin und Phenylalanin hergestellt.



   Beispiel 40    Glykylglutaminylglykylphenylalanylleucin   
In einem Gemisch von 4,0 Millimol Leucin in 20 ml Wasser bei   0  C    werden 3,1 Mol N-Carboxyphenylalaninanhydrid gegeben, während der pH durch zeitweilige Beigabe von Bariumhydroxydpulver bei 10,5 gehalten wird. Die Umsetzung ist in 1 min zu Ende.



  Der pH wird durch Zusatz von   10 %    Schwefelsäure auf 3,5 ermässigt. Das Bariumsulfat, das ausfällt, wird durch Filtrieren entfernt und das Phenylalanylleucin enthaltende Filtrat mit 3,2 Millimol N-Carboxyglycinan  hydrid bei   -3 C    behandelt, wobei unter Verwendung von Bariumhydroxyd der pH bei 10,5 gehalten wird.



  Die Decarboxylierung wird bewirkt, indem der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 herabgesetzt wird.



  Das ausfallende Bariumsulfat wird durch Filtrieren entfernt. Der pH des Filtrats wird mit 40 % Natriumhydroxyd auf 10 erhöht, und 4 Millimol N-Carboxy   asparaginanhydn.d    unter raschem Rühren bei   0     C beigefügt. Nach 2 min wird der pH durch Beigabe konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 herabgesetzt und Stickstoff 3 min durch das Gemisch durchgeperlt. Der pH wird mit   40%    Natriumhydroxyd auf 10 erhöht und das Gemisch auf 20 C abgekühlt. 4,0 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Nach 1 min wird der pH durch Beigabe von Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt und Stickstoff 5 min durch das Gemisch geleitet. Der pH wird mit Natriumhydroxyd auf 7 erhöht und das Gemisch gefriergetrocknet.

  Der feste Rückstand wird dreimal mit Methanol extrahiert und der kombinierte   Methanolextrakt    zur Trockne verdampft. Das gewünschte Produkt wird als Rückstand erzielt und ehromatographisch gereinigt.



   Das Gemisch wird dann eine Stunde gerührt und filtriert, um das gefällte Silberchlorid zu entfernen, und das Filtrat gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in 30 ml Äthylacetat aufgenommen und durch Zugabe von 70 ml Hexan gefällt. Das Gemisch wird bei etwa 100 C über Nacht stehengelassen und das gewünschte Produkt durch Filtrieren zurückgewonnen. Folgende Verbindungen werden unter Verwendung der gemäss dem Verfahren von Beispiel 65 erzeugten Chelate in gleicher Weise hergestellt:   
Tyrosin-N-ca rboxyanhydrid;
3 ,5-Dijodtyrosin-N-carboxyanhydrid;   
3 ,5-Dibromtyrosin-N-carb oxyanhydrid;    Hydroxyprolin-N-carboxyanhydrid;     ss-Hydroxyleucin-N-carboxyanhydrid;    a-Hydroxynorvalin-N-carboxyanhydrid;    y-Hydroxynorvalin-N-carboxyanhydrid.



   Beispiel 41    N-Chlorquecksilber-IT-histidin-N-carboxyanhydrid   
Insgesamt 15,52 g L-Histidin werden in eine wässerige Lösung von 25,0 g eines 2:3 Gemisches von Kaliumbicarbonat und Kaliumcarbonat in 1 Liter Wasser gegeben. Diesem Gemisch werden unter raschem Rühren 54,30 g Quecksilber-II-chlorid unter leichtem Erhitzen beigegeben. Man lässt die Temperatur auf etwa 650 C steigen und rührt weiter, während sich das Reaktionsgemisch bis zu Raumtemperatur abkühlt. Das Produkt,   N-Chlorquecksilb er-Il-histidin,    fällt aus und wird durch Filtrieren gesammelt.



   Insgesamt 29,44 g des auf diese Weise hergestellten Produkts werden etwa 90 min in 100 ml trockenem Aceton zur Bildung einer feinen Suspension gerührt.



  Weitere 100 ml Aceton werden beigefügt, und das Reaktionsgemisch wird in Eis gekühlt, während überschüssiges Phosgen etwa 40 min durchgeleitet wird.



  Das Eis wird entfernt, und 2 ml Quecksilber werden in das Gemisch gegeben. Der sich bildende Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat bei niedrigem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen und das gewünschte Produkt als Rückstand zurückzulassen. Das Produkt wird gereinigt, indem der Rückstand in   100    ml Methyläthylketon   aufge-    nommen wird, aus dem es beim Abkühlen ausfällt.



  Der Niederschlag wird gesammelt und mit einer geringen Menge zusätzlichem kaltem Methyläthylketon und dann mit Benzol gewaschen. Man erhält zusätzliches Produkt, indem man der   Methyl äthylketon-Mutterlauge    Benzol sorgfältig beifügt.



   Die nachstehend aufgeführten Verbindungen werden auf die gleiche Weise hergestellt. In jedem Fall wird der Aminosäure-Ausgangsstoff in ein Quecksilber-II-halogenidsalz umgewandelt, indem 0,1 Mol des Amino   säure-Ausgangsstoffs    mit 0.2 Mol Quecksilber-II-chlorid oder   Quecksilber-II-bromid    in einem wässerigen Milieu bei pH 8,9 gemäss dem oben beschriebenen Verfahren umgesetzt wird. Das Quecksilber-II-halogenidsalz wird isoliert und in Aceton oder Methyläthylketon in das Anhydrid umgewandelt. Die beiden ersten Verbindungen werden bei   0     C und die letzten 5 bei 100 C hergestellt.



   N-Chlorquecksilber-II-arginin-N-carboxyanhydrid    N-Chlorquecksilber-II-lysin-Nearboxyanhydrid
N-Chlorquecksilber-II-ornithin-N-carboxyanhydrid
N-Bromquecksilber-II-arginin-N-carboxyanhydrid
N-Bromqueckilber-II4ysin-N-carboxyarhydn.d   
N-Bromquecksilber-II-ornithin-N-carboxyanhydrid    N-Bromquecksilber-II-histidin-N-carboxyanhydrid-   
Beispiel   42       Histidylalanin   
Insgesamt 90 mg Alanin werden in 25 ml 0,2 molarem EDTA-Puffer bei pH 10 gelöst und 1,292 g
N-Chlorquecksilber-II-histidin-N-carboxyanhydrid unter raschem Rühren bei   0     C schnell beigefügt. Nach 5 min wird der pH des Gemisches durch Zugabe konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 herabgesetzt.

  Schwe   felwasserstoff    wird durch das Gemisch geleitet, um das Quecksilber zu fällen, und der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird mit Stickstoff von Schwefelwasserstoff und andern Gasen befreit und bis zu einem Volumen von 50 ml verdünnt. Der pH wird durch Zusatz von verdünntem Natriumhydroxyd auf etwa 8 eingestellt. Die Lösung wird entsalzt, indem sie über eine Kohlensäule geleitet wird. Das gewünschte Produkt wird   chromatographich    isoliert, indem es über eine Silicagel-Säule geführt und mit einem 1: 9 Gemisch von Ammoniak und Methanol eluiert wird.



   Beispiel 43    Lysylalanylleuoylglykylisoleucin   
Insgesamt 368 mg Alanylleucylglykylisoleucin werden in 100 ml EDTA-Puffer enthaltendes Wasser bei pH 8 aufgenommen und 1,68 g   N-Chlorquecksilber-II-    lysin-N-carboxyanhydrid bei 30 C unter raschem Rühren beigefügt. Nach 30 sec wird der pH des Gemisches durch Zugabe konzentrierter Schwefelsäure auf 2 herabgesetzt. Schwefelwasserstoff wird durch das Gemisch geleitet, um das Quecksilber als Sulfid zu fällen, das durch Filtrieren entfernt wird. Stickstoff wird durch das Filtrat geleitet, um es von verbleibendem Schwefelwasserstoff und Kohlendioxyd zu befreien. Das Filtrat wird dann bis zu 150 ml verdünnt und der pH durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd auf 8,5 eingestellt. 

  Die Lösung wird entsalzt, indem sie über eine Kohlensäule geleitet wird, und das gewünschte Produkt aus einer Silicagel-Säule chromatographisch isoliert.  



   Beispiel 44    Glykylarginylglykylphenylalanylleucin   
In ein Gemisch von 4,0 Millimol Leucin in 20 ml Wasser bei   0  C    werden 3,1 Mol N-Carboxyphenylalaninanhydrid gegeben, während der pH durch zeitweilige Beigabe von Bariumhydroxydpulver bei 10,5 gehalten wird. Die Umsetzung ist in einer Minute zu Ende. Der pH wird durch Zugabe von   10%    Schwefelsäure auf 3,5 eingestellt. Das ausfallende Bariumsulfat wird durch Filtrieren entfernt und das Phenylalanyl    leucin enthaltende Filtrat bei -30C mit 3,2 Millimol    N-Carboxyglycinanhydrid behandelt, während der pH unter Verwendung von Bariumhydroxyd bei 10,5 gehalten wird. Die Carboxylierung wird bewirkt, indem der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,5 herabgesetzt wird, und das ausfallende Bariumsulfat durch Filtrieren entfernt.

  Der pH des Filtrats wird mit einem EDTA-Puffer auf 9,5 erhöht und 1,15 g N-Bromqueck   silber-II-arginin-N-carboxyanhydrid    bei   50 C    unter raschem Rühren beigefügt. Nach 2 min wird der pH durch Beigabe konzentrierter Schwefelsäure auf 2 herabgesetzt. Schwefelwasserstoff wird durch das Gemisch geleitet, um das Quecksilber als Sulfid zu fällen, das durch Filtrieren entfernt wird. Das Filtrat wird mit Stickstoff gereinigt und der pH mit   40 %    Kaliumhydroxyd auf 10 eingestellt. Das Gemisch wird auf   0     C abgekühlt, und 3,5 Millimol N-Carboxyglycinanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt. Nach 1 min wird der pH durch Zusatz von Schwefelsäure auf 3 herabgesetzt und Stickstoff 5 min durch das Gemisch geleitet. Der pH wird auf 7 erhöht und das Gemisch gefriergetrocknet.

  Der feste Rückstand wird dreimal mit Methanol extrahiert und die Methanolextrakte an Silicagel adsorbiert und zur Trockne verdampft. Das Silicagel wird dann einer in Isopropanol hergestellten Silicagel-Säule beigefügt. Die Säule wird mit einem Gemisch von Äthanol, Wasser und Ammoniak in einem Verhältnis von   80:18      : 2    entwickelt, um das gewünschte Produkt zu isolieren.



   Beispiel 45
Arginyl-Prolylphenylalanin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von N-Carboxyargininanhydrid-hydrochlorid zur Herstellung des Tripeptids Arginylprolylphenylalanin.



   Insgesamt 1,68 Millimol Prolylphenylalanin werden in 70 ml 60 g Eis enthaltendem Kaliumborat-Puffer bei pH 9,5 gelöst, und 4 Millimol in 15 ml Dimethylformamid gelöstes N- Carboxyargininanhydridhydrochlorid werden beigefügt. Das Gemisch wird 30 sec bei etwa   30 C    gerührt und der pH zur Decarboxylierung der N-Carbamat-Zwischenverbindung durch Beigabe von Schwefelsäure auf 5,6 herabgesetzt. Das Gemisch wird über eine 25 mm Kohlensäule gegossen und die Kohlensäule mit 300 ml Wasser gewaschen.



  Sie wird dann mit   50 % igem    wässerigem Aceton, das   5%    Essigsäure enthält, eluiert. Das Aceton-Essigsäure Gemisch wird unter vermindertem Druck verdampft, wobei ein Rückstand zurückbleibt, der in eine minimale Menge eines 9:1 Gemisches von Methanol und Ammoniak aufgenommen wird. Diese Lösung wird an eine Silicagel-Säule adsorbiert, die mit demselben Lösungsmittel eluiert und in 15 ml Fraktionen gesammelt wird.

 

  Das gewünschte Produkt wird erzielt, indem man die Fraktionen 5-9 kombiniert und das Lösungsmittel bei niedrigem Druck verdampft.



   Beispiel 46
Histidylphenylalanin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von   N-Carboxyhistidinanhydrid-hydrobromid    zur Herstellung eines Dipeptids.



   In insgesamt 1 Millimol Phenylalanin in 10 ml eines Kaliumborat-Puffers bei pH 9,5 wird 1 Millimol   N-Carboxyhistidinanhydrid-hydrochlorid    gegeben, und das Gemisch etwa 1 min bei   0     C gerührt. Die Carbamat-Zwischenverbindung wird durch die Beigabe von genügend Schwefelsäure, um den pH auf 3 einzustellen, decarboxyliert, während Stickstoff durch das Gemisch geleitet wird; das gewünschte Produkt wird chromatographisch isoliert. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einem N-Carboxyaminos äureanhydrid (A) oder einem N-Thiocarboxy-aminosäureanhydrid (B) der Formeln: EMI25.1 worin R ein Aminosäureester ist, in einem wässerigen Medium unter derartigen pH- und Temperaturbedingungen sowie bei solcher Rührgeschwindigkeit umsetzt, dass nur die gewünschte Aminogruppe der Aminosäure bzw.

   des Peptids in brauchbarer Konzentration zur Reaktion gelangt und alle anderen gegebenenfalls vorhandenen Aminogruppen vergleichbarer Basizität blockiert sind und die Umsetzung mit der höchsten Geschwindigkeit jene ist, die zum gewünschten Peptid führt und das erhaltene Zwischenprodukt decarboxyliert.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das pH bei 10,0-10,5 gehalten wird und das Reaktionsgemisch genügend stark gerührt wird, um eine Wirbelströmung hervorzurufen.

   2. Verfahren gemäss Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reaktionsmittel das N-Carboxyasparaginanhydrid, N-Carboxyglutamins äureanhydrid, N-Thiocarboxyasparaginanhydrid, N-Thiocarboxyglutamins äureanhydrid oder N-Thiocarboxyhistidinanhydrid verwendet.

   3. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man in Gegenwart eines das pH steuernden Puffers arbeitet.

   4. Verfahren gemäss Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffer einen Boratpuffer verwendet.

   5. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das pH durch Zusatz eines alkalischen Reagens im Verlauf der Umsetzung gesteuert wird.

   6. Verfahren gemäss Patentanspruch und Unteransprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Temperatur von - 5 C bis + 5 gearbeitet wird.