Procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé. La présente invention se rapporte à un procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé à partir d'un bouillon de culture contenant la pénicilline à l'état relativement impur.
On retire la pénicilline du bouillon de fer mentation en soumettant ce dernier, après l'avoir acidifié, à un certain nombre d'extrac tions et à. d'autres traitements de purifica tion, comme il est bien connu dans la pra tique, le dernier stade consistant à sécher à basse température une solution aqueuse du sel potassique de pénicilline, obtenue par ad jonction à l'extrait organique d'un composé alcalin du potassium en solution aqueuse, pour obtenir le sel potassique de pénicilline sous forme amorphe, coloré et d'une pureté relative, la pureté et la coloration dépendant du degré de purification atteint.
Le sel po tassique de pénicilline amorphe ainsi obtenu est moins pur et plus fortement coloré qu'il n'est désirable.
De nombreuses méthodes de cristallisation des sels de pénicilline ont été décrites. Ces méthodes consistent. à dissoudre un sel solide de pénicilline dans un solvant organique, puis à refroidir la solution jusqu'à ce que la cristallisation se produise. Les procédés de cristallisation des sels de pénicilline utilisés jusqu'ici se caractérisent par le fait que la dissolution du sel solide de pénicilline dans un solvant se fait. approximativement à la température ordinaire et que la cristallisa- tion à partir de la solution résultante se fait toujours à une température inférieure à la température de préparation de la solution, par exemple en laissant la solution pendant une nuit. dans un réfrigérateur.
On a trouvé maintenant que l'emploi de températures élevées pour la cristallisation du sel potassique de pénicilline augmente no tablement le rendement en sel cristallisé et, en outre, réduit le temps nécessaire à la cris tallisation.
Le procédé selon l'invention, pour la, pré paration du sel potassique de pénicilline cris tallisé, est caractérisé en ce qu'on extrait à. l'aide d'un solvant organique la, pénicilline libre contenue dans un bouillon de culture acidifié, en ce qu'on transforme la pénicil line libre en le sel potassique de pénicilline par adjonction d'un composé alcalin du po tassium, en ce qu'on recueille le sel potas sique de pénicilline impur sous forme solide et amorphe, en ce qu'on mélange ensuite, sous agitation, ce sel amorphe avec au moins un solvant organique, à. une température ne dépassant. pas R5 C.
en ce qu'on maintient le mélange à une température comprise entre 40 et 85 C, tout en poursuivant l'agitation pen dant la cristallisation du sel potassique de pé nicilline, et en ce qu'on sépare ledit sel cris tallisé formé.
Le solvant organique peut. être un alcool aliphatique monovalent ayant de 3 à 6 atomes de carbone, ou des mélanges d'un tel alcool avec un ou plusieurs esters carboxyliques aliphatiques. Le rapport des poids de sel po tassique solide amorphe et de solvant orga nique utilisés peut être compris entre 0,5:10 et 6:10; la température de mélange peut être comprise entre 20 et 80 C, le mélange pou vant être amené ensuite à, une température comprise de préférence entre 40 et 80 C, cette nouvelle température étant de préfé rence égale ou supérieure à la température précédente.
Parmi les solvants organiques qui peuvent être utilisés, on peut citer le pro panol normal et l'iso-propanol, le butanol normal, l'alcool amylique, l'hexanol normal et les mélanges butanol normal -acétated'éthyle, et butanol normal-acétate d'amyle.
Il est. préférable que le solvant utilisé soit pratiquement anhydre, la présence d'eau pen dant la cristallisation réduisant. le rendement en sel potassique de pénicilline cristallisé.
Le sel potassique amorphe de pénicilline peut. être recueilli par dessiccation à basse température ou par pulvérisation de sa solu tion aqueuse. Quand l'activité de ce sel est inférieure à 600 unités/mg, la cristallisation peut être inhibée par les impuretés présente et il est préférable que le sel ait une acti- v ité d'au moins 800 unités/mg.
Le rapport du sel potassique amorphe de pénicilline au solvant organique utilisé est compris de préférence entre 5 et 60 g de sol pour 100 millilitres de solvant. Un obtient le rendement maximum en général avec une proportion d'environ 40 g de sel pour 100 millilitres de solvant. Quand on utilise une plus forte proportion de sel potassique amorphe par rapport au solvant, par exemple clé 4:10 et 6:10 en poids, il est préférable de diluer le mélange avec un solvant or-a- nique approprié frais pour que le rapport soit. inférieur à -1:
10, avant de séparer le sel cristallisé de la liqueur mère, pour éviter des difficultés lors de la filtration. Quand un rapport supérieur à. 6:10 est -utilisé, le mé lange tend à devenir trop visqueux pour per mettre un brassage efficace, et il est liéces- saine de diluer le mélange avec un solvant organique.
Les cristaux de sel potassique de pénicil line peuvent être séparés du solvant orga nique sans refroidissement, par toute méthode appropriée telle qu'une filtration ordinaire ou au vide, ou une centrifugation, bien que la. séparation des cristaux puisse se faire aussi après refroidissement. La masse cris talline séparée peut être débarrassée de la liqueur mère par lavage au moyen de petites quantités du solvant organique utilisé primi tivement. On peut effectuer un autre lava e en utilisant. de petites quantités d'un solvant inerte à bas point d'ébullition, par exemple l'acétate d'éthyle ou de l'éther de pétrole, et éliminer l'excès de solvant du sel potassique de pénicilline en chauffant doucement. dans une étuve à vide.
Le sel cristallisé obtenu peut être facile ment recristallisé pour donner, avec un haut rendement, un sel potassique de pénicilline cristallisé pur et blanc, bien que cette recris- tallisation ne soit pas indispensable si on effectue le procédé dans les meilleures eondi- tions. Cette recristallisation peut se faire le plus avantageusement. en dissolvant le sel po tassique cristallisé dans une solution aqueuse de butanol normal et en ajoutant à la solu tion du butanol normal sec,
de préférence par deux fois ou plus et à 0 C environ, pour amener le butaliol normal à une concentra- tion de 05 à 011% en volume approximative- ment, la cristallisation du sel potassique Oie pénicilline se produisant alors.
La reeristalli- sation peut se faire aussi par dissolution dans une solution aqueuse d'acétone et addi tion subséquente d'acétone sèche jusqu'à, ee que la. concentration en acétone atteigne 110 % en volume, ou s'approche clé cette valeur.
II faut noter que les solvants ort,-aliiqiics utilisés dans le présent procédé ne sont p < 5. strietenient parlant, des solvants du sel potas- sique de pénicilline, mais il est probable que le sel cristallisé est pratiquement insoluble dans lesdits solvants organiques tandis due le sel amorphe est soluble. C'est ainsi que si l'on brasse le sel potassique amorphe de pénicil line avec un de ces solvants organiques, il semble passer en solution, et le sel cristallisé est précipité de cette solution.
Dans certains cas, on obtient, une solution complète du sel amorphe de laquelle précipite le sel cristal lisé, tandis que dans d'autres cas, il n'v a pas de limite nette entre la dissolution da Sel amorphe et la précipitation du sel cristallisé, les deus processus s'effectuant apparcin- ment en même temps.
Quand le sel amorphe est brassé dans le solvant organique à une température inférieure à 40 C, on obtient ordinairement une solution complète et, en élevant la température à une valeur comprise entre -10 et 85 C, la cristallisation se produit. Si, par ailleurs, on brasse le sel amorphe dans le solvant à une température supérieure à 40 C, et si on continue le brassage à cette température, la dissolution du sel amorphe et la précipitation du sel cristallisé se produi sent, ensemble. Il n'est pas possible cependant.
de donner une règle générale pour tous les cas et il est. bien connu que le comportement de la matière première à base de pénicilline varie d'une charge à l'antre, selon la nature des impuretés présentes. Il faut noter cepen dant qu'il n'p a. aucune différence significa tive dans le rendement obtenu selon que le sel potassique de pénicilline amorphe a donné une solution complète ou non. Il est essentiel de continuer le brassage pendant les stades de dissolution et de cristallisation.
En général, la vitesse de cristallisation augmente avec la température, et on a observé qu'il est avantageux de brasser le mélange du sel po tassique de pénicilline et du solvant orga nique pendant un temps minimum de 30 mi nutes.
Les exemples suivants se réfèrent à des mises cri rnuvre du procédé selon L'invention.. L'activité de la pénicilline est, donnée en uni tés internationales, et les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire. Les expressions parties en poids et par ties en volume utilisées dans les exemples ont entre elles la même relation que les termes kilogramme et litre . Exemple <I>1:</I> On prépare le sel potassique de pénicilline amorphe, à. partir d'un bouillon 'de culture contenant la pénicilline, selon la technique habituelle.
On ajoute lentement et en bras sant 10 parties en poids de ce sel potassique de pénicilline amorphe brunâtre, séché à basse température et d'une pureté de 69 %, à. 50 parties en volume de butanol normal sec, à. 60 C. La cristallisation du sel potassique de pénicilline est complète après une courte période à cette température. On filtre le mé lange à chaud et on lave les cristaux de sel potassique de pénicilline séparés avec de pe tites quantités d'acétone sèche.
On obtient, avec un rendement. de 88 %, des cristaux de sel potassique de pénicilline d'une pureté de 98,30/(,.
<I>Exemple</I> N: On ajoute lentement et en brassant 5 par ties en poids d'un sel potassique amorphe, obtenu comme dans l'exemple 1, d'une pureté de 90 %, à. 100 parties en volume de butanol normal sec, à 50 C. Après addition du sel, on continue à brasser le mélange pendant 1 heure à cette température, et après ce temps la cristallisation du sel potassique est complète.
Les cristaux sont séparés par fil tration et lavés avec de petites quantités de butanol normal sec purs d'acétone, et séchés ensuite. On obtient, avec un rendement de 92 %, un sel potassique de pénicilline très légèrement coloré et d'une pureté de 98 /o.
Le sel potassique de pénicilline cristallisé est recristallisé par dissolution, à raison d'une partie en poids pour ? parties en volume, dans une solution aqueuse de butanol normal contenant. 12 % d'eau en volume, et par addi- tion à cette solution de butanol normal sec, lentement. et en agitant, jusqu'à.
une coucen- tra.t.ion finale de butanol normal dans le mé- lange de 97 % en. volume. On sépare par fil- tration le sel potassique de pénicilline blanc et pur obtenu.
On répète exactement le même procédé, sauf que dans un premier cas on utilise ?0 parties en poids, et dans un second cas 40 parties en poids (le sel amorphe pour 100 parties en volume de butanol normal sec.
On obtient dans le premier cas, avec un ren- dement de 95 %, un sel potassique de p6nieil- Iine très faiblement coloré et d'une pureté de 99 0/0, et dans le second cas, avec un rende ment de 96 0/0, un sel potassique de pénicil line d'une pureté de 100 0/0.
Exelii.ple <I>3:</I> On ajoute lentement et en brassant 60 par ties en poids d'un sel potassique de p6nieil- line âmorphe, obtenu comme dans l'exemple 1, d'une pureté de 90 1/o, .à, 100 parties en vo lume de butanol normal sec, à 50 C.
On con tinue à brasser le mélange à cette tempéra- ture pendant une heure, après quoi la eris- tallisation est complète, et on ajoute encore \_'00 parties en volume de butanol normal sec pour réduire la viscosité du mélange. Ce der- nier est. ensuite filtré, et les cristaux de sel potassique de pénicilline séparés sont lavés avec de petites quantités clé butanol noriî:al sec, puis d'acétate d'éthyle ou d'acétone.
On obtient, avec un rendement de 95 %, un sel potassique de pénicilline cristallisé, de cou leur pale et d'une pureté de 99 0/0.
Le tel cristallisé, est recristallisé par dissolution dune partie en poids dans ? parties en vo- 1-Lime d'une solution aqueuse de butanol nor- mal contenant 1? /o d'eau en volume, et par addition lente, avec brassage,
clé butanol ilor- inal sec jusqu'à une concentration dans le niélan#e de 99 % en volume. On sépare par filtration le sel potassique de pénicilline eri-#- talli.sé, pur et blanc.
Exemple -: ()n ajoute lentement et en brassant -0 parties en poids d'un sel potassique de péni- ^illine amorphe, obtenu comme dans l'exem ple 1, et. d'une pureté de 90 0/0, à 100 parties en. volume de butanol normal sec, à 80 C. On continue à brasser le mélange à. cette tenipé- rature pendant une heure, et la cristallisation est, complète après cette période.
On sépare par filtration le sel potassique cristallisé, et on le lave avec de petites quantités du butanol normal sec, puis d'acétate d'éthyle. On ob- tient, avec un rendement de 93 %, le sel po- tassique de pénicilline d'une pureté de 100 I#!o. ï:xemple <I>5:
</I> On ajoute lentement et en brassant 40 par ties en poids d'un sel potassique de pénicil line amorphe, obtenu selon la technique usuelle et d'une pureté clé 90 %, à. 100 paf - ties en volume de butanol normal sec, à 35 C.
Après addition du sel, on porte la teni- péra.ture du mélange à. 50 C et l'on maintient cette température pendant 1 heure, en bras sant. On sépare par filtration le sel cristal lisé, on le lave avec de petites quantités du butanol normal sec et on le sèche. On obtient, avec un rendement de 97 %, le sel potassique de pénicilline d'une pureté de 100 0/0.
Exemple <I>6:</I> On effectue quatre opérations en utilisant. respectivement comme solvant l'alcool lique normal, l'hexanol normal, un mélan e clé volumes égaux de butanol normal et d'acétate d'éthyle, et un mélange clé volumes égaux. de butanol normal et d'acétate d'am-#-le. Dans chaque cas, on ajoute lentement. et en brassant \?0 parties en poids d'un sel.
pota- sique de pénicilline amorphe, obtenu selon la technique usuelle et d'une pureté de 90 0/0, à 7.00 parties en volume du solvant organique sec correspondant, à 50 C. On continue à brasser le mélange à cette température pen dant une heure, après quoi la cristallisation du sel potassique est- complète. Le sel cristal lisé est séparé par filtration, lavé avec (le pe tites quantités du solvant organique eniplové et séché.
Les rendements et la pureté du Pro duit obtenu sont donnés dans le tableau sui vant.: Solvant organique employé Alcool amylique normal IIexaliol normal Mélange en volumes égaux de butanol normal et d'acétate d'éthy le Mélange en volumes égaux de butanol normal et d'acétate d'aniyle