Procédé d'obtention de la nystatine La présente invention a pour objet un procédé pour obtenir l'antibiotique nystatine à partir du mycelium pro venant du bouillon de fermentation entier dans lequel elle est produite.
La nystatine est un antibiotique antifongique décrit dans le brevet des U.S.A. No 2797183. On la prépare par culture de Streptontvces noursei dans tin milieu nutritif.
Grâce au procédé selon l'invention, la nystatine peut être obtenue en meilleur rendement et pureté qu'il était possible jusqu'à maintenant avec les processus connus.
Conformément au procédé selon l'invention, on extrait la nystatine du mvcelium avec tin milieu d'extrac tion comprenant de l'eau, un alcanol inférieur et un sel d'addition d'acide d'une amine pour transformer la nys- tatine en un sel. on sépare l'extrait du mycelium et on isole la nystatine de l'extrait. L'eau peut être ajoutée comme telle au milieu d'extraction ou elle peut être apportée par un mycelium mouillé. L'alcanol inférieur est de préférence du méthanol.
Le sel d'addition d'acide petit être formé à partir d'acide oxalique, malonique, suc cinique ou citrique, et de préférence à partir d'un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique et plus spéciale ment l'acide sulfurique ; et d'une amine primaire, telle qu'une alcoylamine inférieure (par exemple la méthyla- mine) ou une hydroxyalcoylamine inférieure (par exem ple l'éthanolamine), une amine secondaire, telle qu'une dialcoylamine inférieure (par exemple la diméthylamine et la diéthvlamine),
une dihydroxyalcoylamine inférieure, et une alcoyl (hvdroxyalcoyl) amine inférieure (par exemple la méthyléthanolamine), et de préférence à partir d'une amine tertiaire, telle qu'une trialcoyla- mine inférieure et, encore mieux, une trihydroxyalcoy- lamine inférieure.
De préférence, le milieu d'extraction ne contient pas d'excès d'acide ou d'amine par rapport à la proportion stoechiométrique, afin que la solution aqueuse alcoolique ait tin pH compris entre 6 et 6,5, de préférence entre fi et 6,2, grâce à quoi la nystatine se dissout sous forme de sel dans la solution aqueuse alcoolique.
Le mycelium, utilisé comme matière de départ dans le procédé selon l'invention, peut être obtenu par filtra tion du bouillon entier d'un milieu de fermentation con tenant de la nystatine, de préférence après avoir ajouté tin auxiliaire de filtration, par exemple du Hyflo . Le filtrat est abandonné et le mycelium mouillé séparé, contenant la nystatine. est traité par le procédé selon l'invention.
Bien que l'addition de l'alcanol, de l'acide et de l'amine au mycelium mouillé puisse se faire dans n'im porte quel ordre, il est préférable que l'acide et l'amine soient ajoutés ensemble sous la forme du sel d'addition d'acide de l'amine préformé, en sorte que le pH du sol vant aqueux-alcanolique ne varie pas beaucoup. com me ce serait le cas si l'acide et l'amine étaient ajoutés séparément. et ce qui pourrait causer une dégradation dela nystatine.
Bien que la quantité d'alcanol ajoutée n'ait pas une importance déterminante, il convient d'en utiliser au moins 2,0 ml par gramme du gâteau de mycelium mouil lé. afin d'extraire pratiquement complètement la nysta- tine du mycelium dans l'alcanol aqueux. Il est même préférable de n'utiliser pas plus de 2,5 ml d'alcanol par gramme de mycelium pour éviter la nécessité d'éli miner de grandes quantités de solvant après l'extraction.
Bien que la quantité d'amine n'ait pas une importance déterminante. la concentration préférée de l'amine est de 0,02 m1 à 0,05 ml d'amine par ml d'alcanol. L'aci de est utilisé de préférence en quantité telle que l'inter valle de pH final désiré, mentionné plus haut, soit res pecté. La quantité d'eau n'est pas importante non plus, cependant, il est préférable que pas plus de 0,25 ml d'eau par ml d'alcanol soient présents pendant l'extrac tion. Lorsque la dissolution de la nystatine est complète, si nécessaire avec l'aide d'une agitation, on sépare le mycelium épuisé par filtration ou par centrifugation et on l'abandonne.
Pour que toute la nystatine soit séparée du mycelium, on peut laver ce dernier avec un supplé ment d'alcanol.
Pour isoler la nystatine, on peut concentrer le filtrat (éventuellement avec les liqueurs de lavage réunies), après quoi on ajoute de l'eau et une cétone miscible à l'eau, par exemple de l'acétone. On chauffe le mélange à une température de 45-55 C, de préférence de 50-52 C, puis on le refroidit, ce qui fait cristalliser de la nystatine sensiblement pure, et on isole cette dernière.
Dans les exemples qui suivent, toutes les températures sont données en degrés centigrades. Exemple <I>!</I> <I>a)</I> Séparation du rrrt-celiurrt Au bouillon entier, contenant de la nystatine, résult- tant de la fermentation de Strepiorrtyces noursei dans un milieu nutritif aqueux contenant de la farine de soja et de la mélasse,
on ajoute 4 % en poids!volume de Hyflo . On filtre le mélange et on recueille le myce- lium.
<I>b)</I> Exiraction <I>de la</I> nystatine du rrtycelittr?t On suspend le mycelium provenant de l'opération (a) dans environ 10 volumes de méthanol, on ajuste au pH 3 avec de l'acide sulfurique, on agite pendant 7 minutes, on neutralise avec de la triétylamine et on filtre.
On concentre le filtrat jusqu'à environ 1J20 de son volume initial. on dilue la suspension résultante avec un volume égal d'acétone aqueuse à 40 % et on laisse cristalliser à 45 On recueille le précipité sur une centrifugeuse à bol massif, on le remet en suspension dans de l'acétone aqueuse à 40 % et on laisse cristalliser à 45 . On recueille le précipité sur une centrifugeuse à bol massif, on le re met en suspension dans de l'acétone aqueuse à 40%, on recentrifuge, on resuspend dans de l'acétone, on re- centrifuge et on sèche.
La nystatine obtenue a une acti vité d'environ 4000 unités mg. elle est plus thermostable que la nystatine isolée par les procédés antérieurs et a une teneur en cendres inférieure à 1 %. <I>Exemple 2</I> On prépare une solution méthanolique en ajoutant 2 en volume de triéthylamine à du méthanol, puis en ajoutant de l'acide sulfurique aqueux à 40 % de manière à abaisser le pH à 6.
Ceci fait, on ajoute le mycelium provenant de l'opération (a) de l'exemple 1 à la solution de sulfate de triéthylamine dans le méthanol, de manière que la concentration finale du méthanol soit d'environ <B>90%.</B> Ensuite, on agite énergiquement le mélange pen dant une demi-heure. on ajiste le pH à 6,8 avec de la triéthvlamine et on filtre. On lave le résidu avec du méthanol aqueux à<B>90% (10%</B> du volume du liquide d'extraction) puis on abandonne ce résidu.
On mélange le filtrat et le méthanol de lavage et en concentre le tout jusqu'à environ 1/20 de leur volume oriL,inal. Ceci élimine essentiellement tout le méthanol. On ajoute au concentré deux volumes d'acétone aqueuse à 60 %. On ajuste le mélange au pH 6,5 par addition de triéthylamine ou d'acide sulfurique, suivant les besoins, on chauffe à 50-52 C pendant une heure, on refroidit jusqu'à la température ordinaire en l'espace d'une heu re à une heure et demie, puis on laisse reposer à la tem pérature ordinaire pendant 5 à 6 heures.
On recueille le produit cristallin par filtration, on le resuspend dans 5 ml d'acétone aqueuse à 40 % par gram me de produit mouillée, puis dans 10 ml d'acétone par gramme de produit mouillé, et on le sèche sous vide de la manière usuelle. On obtient de la nystatine cristal line en rendement de 75-90 % (rapporté à l'activité ini tialement présente dans le mycelium), titrant environ 4500 unités par milligramme et stable à 100e pendant environ 48 heures.
Exemple <I>3</I> On prépare une solution méthanolique en ajoutant 4 % en volume de triéthanolamine à du méthanol, puis en ajoutant de l'acide sulfurique aqueux à 40 % pour abaisser le pH à environ 6. Ensuite, on ajoute le myce- lium provenant de l'opération (a) de l'exemple 1 à la solution de sulfate de triéthanolamine dans du méthanol, de manière que la concentration finale du méthanol soit d'environ 80 % en volume. Ceci fait, on agite le mélange énergiquement pendant une demi-heure et on le filtre. On lave le résidu avec du méthanol aqueux à 85 % (20 % du volume du méthanol utilisé pour l'extraction). puis on l'abandonne.
On mélange le filtrat et la liqueur de lavage et on concentre le tout jusqu'à un dixième de leur volume initial. On ajoute au concentré 3 volumes d'acétone aqueuse à 60 %, on ajuste le pH à 6,5 (avec de l'acide sulfurique ou de la triéthanolamine suivant les besoins). on chauffe le mélange à 50-52 pendant une heure, on le refroidit jusqu'à la température ordinaire en un laps de temps d'une heure à une heure et demie et on l'agite à la température ordinaire pendant 5 à 6 heures. On recueille le produit cristallin par filtration, on le resuspend dans 6 ml d'acétone aqueuse à 40 % par gramme de produit mouillé, puis dans 10 m1 d'acétone par gramme de pro duit mouillé, et on le sèche sous vide de la manière usuel le.
On obtient de la nystatine cristalline en rendement de 90-100 % (rapporté à l'activité initialement présente dans le mycelium), titrant environ 5000 unités par milligramme et stable à 100a pendant au moins 48 heures.
Exemple <I>4</I> On prépare la solution méthanolique en ajoutant 2,5 % en volume de triéthylamine à du méthanol, puis en ajoutant de l'acide citrique solide pour abaisser le pH à 6. On ajoute le mycelium riche provenant de l'opéra tion (a) de l'exemple 1 à la solution de citrate de triéthy- lamine dans du méthanol de manière que la concentra tion finale du méthanol soit d'environ 90 %. On agite énergiquement le mélange pendant 1 ? heure, puis on ajuste le pH à 6,8 avec de la méthylamine et on filtre.
On lave le résidu avec du méthanol aqueux à 90 % (10 IIc du volume du liquide d'extraction) et on l'abandonne On concentre le filtrat et la. liqueur de lavage jus qu'à 1!20 du volume initial pour chasser le méthanol. On ajoute au concentré 2 volumes d'acétone aqueuse à 60 %. on ajuste le pH à 6,5 avec de la triéthylamine ou de l'acide citrique suivant les besoins, on chauffe à 50-52e C pendant une heure, on refroidit jusqu'à la température ordinaire en un laps de temps de 1 heure à 1 1/.= heure. puis on laisse reposer à la température ordinaire pendant 5 à 6 heures.
On recueille le produit cristallin par filtration, on le resuspend dans de l'acétone aqueuse à 40% en quantité de 5 ml par gramme de produit mouillé, on filtre, on suspend le produit séparé dans l'acétone en quantité de 10 ml par gramme de produit mouillé, on filtre et on sè che le produit sous vide de la manière usuelle.
Le rendement en produit s'élève à 70-85 % (rapporté à l'activité initialement présente dans le mycelium). Les titrages biologiques du produit sont dans l'intervalle de 3800-4500 /mg et le produit présente une bonne sta bilité à 100- C.
L'effet d'autres combinaisons de sels d'amines et d'acides organiques sur la solubilisation de la nystatine dans le méthanol est similaire à celui décrit dans l'exem ple 4.