BRPI1007915B1

BRPI1007915B1 - Genes de variante axmi-r1 delta-endotoxina, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, e métodos para controlar e matar uma população de peste de coleópteros, 5 e para protegeruma planta de uma peste

Info

Publication number: BRPI1007915B1
Application number: BRPI1007915-7A
Authority: BR
Inventors: Volker Heinrichs
Original assignee: Athenix Corporation
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2019-05-14
Also published as: JP6009165B2; CN102369286B; CA2751409C; US20100197592A1; CA2751409A1; EA201171006A1; EP2393929A1; EP2728007A3; AR075371A1; JP2012516700A; ZA201105749B; MX2011008246A; WO2010091230A1; EP2728007B1; HUE032178T2; US8299217B2; EP2728007A2; BRPI1007915A2; CN102369286A

Abstract

genes de variante axmi-r1 delta-endotoxina, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, e métodos para controlar e matar uma população de peste de coleópteros, e para proteger uma planta de uma peste a presente invenção refere-se a composições e métodos para conferir atividade pesticida à bactéria, plantas, célula de plantas, tecidos e sementes. composições compreendendo uma sequência de codificação para polipeptídeos de pesticida são providas. as sequências de codificação podem ser usadas em construções de dna ou cassetes de expressão para transformação e expressão em plantas e bactéria. as composições também compreendem bactéria, plantas, célula de plantas, tecidos, e sementes transformados. em particular, moléculas de ácido nucleico que codificam sequências de variante cry3 são providas. adicionalmente, sequências de aminoácido correspondentes aos polinucleotídeos são envolvidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para GENES DE VARIANTE AXMI-R1 DELTA-ENDOTOXINA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, COMPOSIÇÃO, E MÉTODOS PARA CONTROLAR E MATAR UMA POPULAÇÃO DE PESTE DE COLEÓPTEROS, E PARA PROTEGER UMA PLANTA DE UMA PESTE.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular. São providos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas e as sequências de ácido nucleico que as codificam são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes à peste.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria de solo de formação de esporo Gram-positiva caracterizada por sua capacidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas a certas ordens e espécies de insetos, mas são inócuas a plantas e outros organismos não alvos. Por esta razão, composições incluindo cepas de Bacillus thuringiensis ou suas proteínas inseticidas podem ser usadas como inseticidas ambientalmente aceitáveis para controlar pestes de inseto agrícolas ou vetores de inseto para uma variedade de doenças de ser humano ou de animal.

Proteínas de cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis têm atividade inseticida potente contra predominantemente larvas Lepidopteran, Dipteran, e Coleopteran. Estas proteínas também têm mostrado atividade contra ordens de peste Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, e Acari, bem como outras ordens de invertebrados tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes, e Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) A árvore da família de Bacillus Thuringiensis. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas foram originalmente classificadas como CryI a CryV baseada principalmente em sua atividade inseticida. As classes maiores foram Lepidoptera-específica (I), Lepidoptera- e Diptera-específica (II), Coleoptera-específica (III), Diptera-específica

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Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. A proteínas ainda mais proximamente relacionadas dentro de cada divisão eram dados nomes tais como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Uma nova nomenclatura foi recentemente descrita para os genes Cry baseados na homologia de sequência de aminoácido preferivelmente do que especificidade de alvo de inseto (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). Na nova classificação, a cada toxina é designado um nome único incorporando um ranque primário (um Número arábico), um ranque secundário (um letra em caixa alta), um ranque terciário (um letra em caixa baixa), e um ranque quaternário (outro Número arábico). Na nova classificação, numerais romanos foram trocados por numerais arábicos no ranque primário. As proteínas menos do que 45% de identidade de sequência têm ranques primários diferentes, e o critério para ranques secundários e terciários são 78% e 95%, respectivamente.

A proteína de cristal não exibe atividade inseticida até que ela tenha sido ingerida e solubilizada no intestino médio do inseto. A protoxina ingerida é hidrolisada por proteases no trato digestivo do inseto a uma molécula tóxica ativa. (Hõfte and]e Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se liga a receptores de borda de escova apical no intestino médio das larvas alvos e insertos na membrana apical criando canais de íons ou poros, resultando na morte das larvas.

Delta-endotoxinas geralmente têm cinco domínios de sequência conservados, e três domínios estruturais conservados (vide, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste de sete alfa espirais, e é envolvido na inserção de membrana e formação de poro. O domínio II consiste de três beta-folhas em uma configuração de chave Greek, e o domínio III consiste de duas betafolhas antiparalelas na formação jelly-roll (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III são envolvidos no reconhecimento e ligação de receptor, e são, portanto, considerados determinantes de especificidade de toxina.

Delta endotoxinas tipo Cry3 foram primeiro identificadas nos anos de 1980. A delta endotoxina Cry3Aa1 (também anteriormente conhecida

3/69 como cryC e crylllA) foi anteriormente isolada de cepas Bacillus thuríngiensis var san diego (Herrnstadt et al. (1987) Gene. 57:37-46), Bacillus thuringiensis tenebríonis (Hofte et al. (1987) Acids nucleics Res. 15: 7183; McPherson et al. (1988) Bio/Technology 6:61-66; Sekar et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7036-7040) e EG2158 (Donovan et al. (1988) Mol Gen Genet. 214(3):365-72).

Cry3Aa é frequentemente observada como um componente maior de um cristal rombóide em certas cepas nativas de Bacillus, e é produzida como uma proteína de 72 kDa que é subsequentemente processada a uma toxina de 66 kDa por processamento proteolítico por esporulação associada a proteases. Esta proteína de 66 kDA foi conhecida por produzir atividade no coleopteran Colorado Potate Beetle.

Devido à devastação que os insetos podem conferir, e ao aperfeiçoamento na produção pelo controle das pestes de inseto, existe uma necessidade contínua de se descobrir novas formas de toxinas pesticidas. RESUMO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para conferir atividade pesticida à bactéria, plantas, célula de plantas, tecidos e sementes são providos. As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores compreendendo aquelas moléculas de ácido nucleico, e células hospedeiras compreendendo os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeo pesticida e anticorpos para aqueles polipeptídeos. As sequências de nucleotídeo podem ser usadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microorganismos e plantas. O nucleotídeo ou sequências de aminoácido podem ser sequências sintéticas que foram designadas para expressão em um organismo incluindo, mas não limitado a, um microorganismo ou uma planta. As composições também compreendem bactéria transformada, plantas, célula de plantas, tecidos, e sementes.

Em particular, moléculas de ácido nucleico isoladas são providas que codificam uma proteína pesticida. Adicionalmente, sequências de ami

4/69 noácido correspondentes à proteína pesticida são envolvidas. Em particular, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma variante CRY3. As sequências de nucleotídeo que são complementares a uma sequência de nucleotídeo da invenção, ou que hibridizam a uma sequência da invenção são também envolvidas.

Métodos são providos para produção dos polipeptídeos da invenção, e para uso daqueles polipeptídeos para controle ou morte de uma peste de lepidopteran, coleopteran, nematódeo, ou dipteran. Métodos e kits para detecção dos ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra são também incluídos.

As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância à peste aumentada. Estes organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para propostas agrícolas. As composições da invenção são também úteis para geração de proteínas alteradas ou aperfeiçoadas que têm atividade pesticida, ou para detecção da presença de proteínas pesticidas ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra a sequência detalhada AXMI-R1 (SEQ ID NO:2). As regiões sublinhadas representam regiões de circuito fechado (L1, L2 e L3). As barras verticais representam os limites entre domínio I (Dl), domínio II (Dll) e domínio III (Dlll). As setas notam algumas das regiões alvos para geração de variantes.

A figura 2 mostra um alinhamento de Axmi164 (SEQ ID NO: 13), Axmi161 (SEQ ID NO:44), Axmi152 (SEQ ID NO:45), Axmi151 (SEQ ID NO:26), Axmi146 (SEQ ID NO:27), Axmi141 (SEQ ID NO:28), Axmi129 (SEQ ID NO:29), Axmi128 (SEQ ID NO:30), Axmi127 (SEQ ID NO:31), Axmi120 (SEQ ID NO:32), Axmi116 (SEQ ID NO:33), Axmi114 (SEQ ID NO:34), Axmi101 (SEQ ID NO:35), Axmi091 (SEQ ID NO:36), Axmi087 (SEQ ID NO:37), Axmi037 (SEQ ID NO:38), Axmi029 (SEQ ID NO:39), Axmi028 (SEQ ID NQ:40), Cry8Bb1 (SEQ ID NO:41), Cry8Bc1 (SEQ ID

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NO:42), Cry7Aa (SEQ ID NO:43), AxmiRI PermutP3c7 (evo21) (SEQ ID NO:13), e Axmi-R1 (SEQ ID NO:2).

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção é direcionada a composições e métodos para regulação de resistência ou tolerância à peste em organismos, particularmente plantas ou células de planta. Por resistência é pretendido que a peste (por exemplo, inseto) seja morta após ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por tolerância é pretendido um dano ou redução no movimento, alimentação, reprodução ou outras funções da peste. Os métodos envolvem transformação dos organismos com uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para preparação de plantas e microorganismos que possuem atividade pesticida. Desse modo, bactéria transformada, plantas, célula de plantas, tecidos de planta e sementes são providos.

Providas, no presente documento, são composições compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam sequência de aminoácido de variante Cry3s em que a variante tem atividade pesticida, particularmente atividade pesticida contra peste coleopterans. Por sequência de aminoácido de variante Cry3 é pretendido uma sequência de Cry3 outra do que uma sequência de aminoácido de Cry3 que ocorre naturalmente em que a sequência de aminoácido tem uma ou mais substituições de aminoácido correspondentes às substituições colocadas na Tabela 16. Para uma lista de sequências Cry3, vide Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, e para atualizações regulares, vide Crickmore et al. (2003) Bacillus thuringiensis toxin nomenclatura, em www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

Em algumas concretizações, a sequência de Cry3 que ocorre naturalmente, ou tipo selvagem, sequência de Cry3 é a Axmi-R1 sequência de nucleotídeo colocada em SEQ ID NO:1, que codifica a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO:2. A sequência AXMI-R1 corresponde à sequência tipo selvagem descrita no GENBANK® Accession No. P0A379.

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Contudo, será compreendido que as substituições descritas na Tabela 16 podem ser feitas em posições correspondentes de qualquer proteína Cry3, tais como qualquer proteína Cry3A, Cry3B, ou Cry3C. As posições correspondentes podem ser determinadas pelo alinhamento da sequência alvo com SEQ ID NO:2. Vide, por exemplo, o alinhamento mostrado na figura 2.

A estrutura de cristal da proteína de cry3Aa foi determinada anteriormente (Li et al, 1991, Nature 353:815-821). Esta estrutura de cristal delineia as várias regiões de circuito fechado, e permite que os locais de processamento proteolítico relativo à estrutura tridimensional da proteína. Esta estrutura sugere que a toxina é disposta em três domínios consistentes com as estruturas de outras sequências de delta-endotoxina (tipicamente referidas como Domínios I, II, e III). Cada domínio da toxina tem regiões de circuito fechado que são definidas baseado na estrutura de cristal. Antes de e desde a publicação desta estrutura de cristal, foram feitas múltiplas tentativas de descobrir regras amplas simples relacionadas à estrutura e função de toxicidade de Bt endotoxinas, e, em particular, as endotoxinas tipo cry3, e o papel de proteólise nesta atividade.

Por exemplo, Van Rie et al., 1997 (Patente dos Estados Unidos 5.659.123) sugere a identificação de aminoácidos que conduzem a toxicidade aperfeiçoada por realização de modificações de Domínio II nas áreas relacionadas como circuitos fechados por identificação das posições negativamente impactando a citotoxicidade, seguido por substituição aleatória de aminoácidos em certas posições sem estes circuitos fechados. Similarmente, inserção aleatória de alanina em resíduos de Circuito Fechado II por Wu e Dean (J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640) reduziu a função da proteína. A mutagênese aleatória de resíduos de Circuito Fechado I por Wu et al (Febs Letters, 2000, 473:227-232) em muitos casos resultou em proteína instável e função reduzida de proteína, e em dois casos foi reportado para produzir proteínas com toxicidade aumentada e propriedades de ligação alteradas. Para a toxina cry3Bb (English et al, Patente dos Estados Unidos 6.023.013 re-publicada como RE39,580), foi reportado que certas substituições naquela toxina conduzem a atividade aperfeiçoada de verme de raiz de milho,

7/69 mas, em muitos casos, estas alterações ocorrem em resíduos diferentes do que aqueles sugeridos por Van Rie, ou estudados por Wu e Dean.

Além disso, modificações nas regiões da toxina de cry3A que são normalmente clivadas por proteases similares a tripsina ou quimiotripsina foram feitas em tentativas de aperfeiçoar atividade de cry3A em coleopteran e notavelmente verme de raiz de milho ocidental. Chen et al (Patente dos Estados Unidos 7.030.295) reportam que inserção do tetrapeptídeo sintético AAPF (SEQ ID NO:20), descrita como um Local de divagem de Catepsin G (ou um local de divagem de quimiotripsina/Catepsina G; Walters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374), em localizações específicas na proteína podem conduzir a atividade aperfeiçoada de cry3A.

A divagem de tripsina de cry3A é bem conhecida na técnica, e foi mostrada ocorrer naturalmente na região de aproximadamente R158N159 no peptídeo nativo cry3A (Carroll et al 1989 Biochem J. 261:99-105). Além disso, a quimiotripsina é também conhecida por clivar nesta região na junção His161-Ser162 (Carroll et al 1997 J Invert. Biol. 70: 41-49). Walters et al (2008) mostraram divagem de uma Cry3A modificada (mCry3A, que contém um local de reconhecimento de protease quimiotripsina/catepsina G) por quimiotripsina em sua localização nativa nesta região (a junção His161Ser162). Não existem relatórios de mutagênese da sequência de aminoácido que ocorre naturalmente nesta região de Cry 3A resultando na atividade pesticida aperfeiçoada nas pestes coleopterans.

Desse modo, a invenção proporciona sequências de variante Cry3 tendo atividade pesticida aperfeiçoada relativa à sequência tipo selvagem correspondente. Em várias concretizações, as sequências pesticidas variantes Cry3 têm atividade pesticida aperfeiçoada comparada a atividade pesticida de AXMI-R1. Por atividade aperfeiçoada é pretendido um aumento na mortalidade, redução na alimentação, ou redução no crescimento de uma peste alvo. O aperfeiçoamento na atividade é pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo

8/69 menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, ou maior do que o aumento na atividade relativa à atividade da sequência tipo selvagem, por exemplo, AXMI-R1. Em algumas concretizações, a peste alvo é a peste coleopteran.

Em algumas concretizações, as sequências pesticidas envolvidas aqui compreendem variantes da sequência axmi-R1 colocada em SEQ ID NO:1. Por variantes de axmi-R1 é pretendido um nucleotídeo ou sequência de aminoácido correspondente a AXMI-R1, onde uma ou mais mutações foram introduzidas dentro de certas regiões (isto é, região (ões) de mutação alvo(s)) da sequência AXMI-R1. A menos que de outro modo especificado, as regiões de aminoácido fora da(s) região (ões) de mutação alvo(s) são idênticas à sequência AXMI-R1. As regiões idênticas são ou sequências de aminoácido idênticas, ou uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido idêntica. Será compreendido que sequências de nucleotídeo podem diferir da sequência de nucleotídeo tipo selvagem, ainda codifica a sequência de aminoácido tipo selvagem, devido a degeneração do código genético.

Em outras concretizações, a região de mutação alvo de Cry3 corresponde ao processamento proposto e região de formação de poro descrita em Li et al. (1991, Nature 353:815-821, aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação às descrições estruturais da proteína de cry3Aa). Em várias concretizações, a região de mutação alvo corresponde a posições de aminoácido 480 a 490, e posições 510 a 530 de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência variante de Cry3 contém uma ou mais das mutações descritas na Tabela 16, incluindo qualquer combinação das mutações listadas na Tabela 16, até e incluindo mutação em toda posição descrita na Tabela 16.

Em algumas concretizações, as sequências variantes Cry3 da invenção têm uma ou mais substituições selecionadas das posições de aminoácido correspondentes às posições 158, 482, 483, e 519 de SEQ ID NO:2. Em outra concretização, as sequências variantes Cry3 não têm as seguintes

9/69 substituições: P154H, V155H, R315W, R315D, R315M, R315L, G316K, G316N, G316V, ou G316A. Em ainda outra concretização, a sequência variante de Cry3 da invenção não tem qualquer da combinação de mutações listada na Tabela 2 da Patente dos Estados Unidos 6.023.013.

Em outra concretização, a sequência variante de Cry3 é selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO:6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, e 21-43. Em ainda outra concretização, as sequências variantes Cry3 aqui envolvidas consistem de uma ou mais mutações no processamento e região de formação de poro e uma ou mais mutações da região de ligação de receptor. As variantes envolvidas aqui têm atividade pesticida aperfeiçoada relativa a atividade pesticida da Cry3 tipo selvagem. Em algumas concretizações, a atividade pesticida aperfeiçoada é contra a peste coleopterans, por exemplo, uma peste de verme de raiz.

As sequências de variante Cry3 da invenção podem ser adicionalmente modificadas para introduzir uma ou mais das mutações de Cry3 descritas na técnica. Por exemplo, a sequência de variante AXMI-R1 aqui envolvida pode compreender uma ou mais das substituições listadas na Tabela 16 em adição a uma ou mais das mutações descritas na Patente dos Estados Unidos 5.659.123 e 6.023.013; Wu e Dean (J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640); ou Wu et al (Febs Letters, 2000, 473:227-232), ou qualquer combinação destes. Adicionalmente, a sequência variante AXMI-R1 pode compreender uma inserção de um ou mais locais de divagem de catepsina G conforme discutido supra (por exemplo, em ou perto do local de divagem de quimiotripsina ou tripsina nativas).

Em ainda outra concretização da invenção, as mutações descritas na Tabela 16 podem ser introduzidas nas posições correspondentes de quaisquer sequências de aminoácido tendo homologia para AXMI-R1 para introduzir ou aperfeiçoar toxicidade a uma peste de interesse, particularmente uma peste coleopteran, tal como peste de verme de raiz. Vide, por exemplo, as sequências de aminoácido alinhadas com AXMI-R1 na figura 2, ou as sequências de aminoácido homólogas colocadas em, por exemplo, GENBANK® Accession No. P0A379.1, AAA22336.1, AAA22542.1, AAS79487.1,

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AAU29411.1, AAW82872.1, ΑΑΑ73184.1, CAA51996.1, 1DLC_A, Q45744.1, Q06117.1, AAA74198.1, P17969.1. As sequência de aminoácido homólogas podem ser alinhadas usando-se um dos programas de alinhamento aqui descritos para identificar as posições correspondentes para mutação. Alternativamente, uma estrutura de cristal ou outra representação tridimensional desta da sequência de aminoácido homóloga pode ser superimposta na estrutura de cristal de Cry3A (descrita em Li etal. 1991, Nature 353:815-821) e as posições correspondentes alinhadas. A estrutura de cristal da proteína de Cry3B é descrita na Patente dos Estados Unidos 6.023.013.

As sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos), e para a geração de proteínas pesticidas de interesse por métodos conhecidos na técnica, tais como permuta de domínio ou embaralhamento de DNA. As proteínas encontram uso no controle ou morte de populações de peste lepidopteran, coleopteran, dipteran, e nematódeo e para produção de composições com atividade pesticida.

Por toxina pesticida ou proteína pesticida é pretendido uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pestes, incluindo, mas não limitadas a, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, e Coleoptera, ou a filo Nematoda, ou uma proteína que tem homologia para tal proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas de organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Clostrídium bifermentans e Paenibacillus popilliae. Proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácido deduzidas das sequências de nucleotídeos de comprimento total aqui reveladas, e sequências de aminoácido que são mais curtas do que as sequências de comprimento total, ou devido ao uso de um local de partida à jusante alternado, ou devido a processamento que produz uma proteína mais curta tendo atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa em, ou na peste após ingestão da proteína.

Moléculas de ácido nucleico isoladas e Variantes e Fragmentos dos mesmos

Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico

11/69 isoladas ou recombinantes compreendendo sequência de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas e polipeptídeos ou porções biologicamente ativas destes, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Conforme aqui usado, o termo molécula de ácido nucleico é pretendido incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerado usando-se análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de trançado simples ou de trançado duplo, mas preferivelmente é DNA de trançado duplo.

Uma sequência de ácido nucleico isolada ou recombinante (ou DNA) é aqui usada para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que é não maior em seu ambiente natural, por exemplo, em um bacterial recombinante in vitro ou em uma célula hospedeira de planta. Em algumas concretizações, um ácido nucleico isolado ou recombinante é livre de sequências (preferivelmente proteínas que codificam sequência) que flanqueiam naturalmente as sequências de ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Para proposta da invenção, isolado quando usado para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias concretizações, a delta-endotoxina isolada que codifica molécula de ácido nucleico pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeo que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado. Em várias concretizações, uma proteína delta-endotoxina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também referida aqui como uma proteína de contaminação).

As sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas da

12/69 presente invenção incluem sequências de nucleotídeo que codificam variantes de Cry3, bem como fragmentos e complementos destas. Por complemento é pretendido uma sequência de nucleotídeo que é suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotídeo tal que ela pode hibridizar à dada sequência de nucleotídeo para, desse modo, formar um duplex estável.

As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos destas sequências de nucleotídeo que codificam proteínas pesticidas são também envolvidas pela presente invenção. Por fragmento é pretendido uma porção da sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeo pode codificar porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou prímer de PCR usandose métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína pesticida compreende pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presente em uma sequência de nucleotídeo de comprimento total que codifica uma proteína pesticida aqui revelada, dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos contíguos é pretendido resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes entre si. Os fragmentos das sequências de nucleotídeo da presente invenção codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína pesticida e, consequentemente, retêm atividade pesticida. Por retêm atividade é pretendido que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, ou mais alto da atividade pesticida da proteína pesticida de referência (isto é, as sequências pesticidas de variante Cry3 aqui reveladas). Em uma concretização, a atividade pesticida é atividade coleoptericida. Os métodos para medição de atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;

13/69 e Patente dos Estados Unidos No. 5.743.477, todos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína pesticida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção codificará pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presente em uma proteína pesticida de comprimento total da invenção. Em algumas concretizações, o fragmento é um fragmento de divagem proteolítico. Por exemplo, o fragmento de divagem proteolítico pode ter um truncamento N-terminal de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, ou cerca de 160 aminoácidos relativos a SEQ ID NO:2. Em várias concretizações, o fragmento de divagem proteolítico pode correspondes ao local de divagem de tripsina ou quimiotripsina nativas correspondente a posições de aminoácido 158-159, ou posições 160-161 de SEQ ID NO:2, respectivamente, ou pode corresponder a quaisquer locais de divagem artificialmente inseridos, tal como é o local de divagem de Catepsina G descrito em Walters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374.

Proteínas pesticidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeo suficientemente idêntica às sequências de variante Cry3 aqui envolvidas. Por suficientemente idêntica é pretendido um aminoácido ou sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência comparada a uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de Cry3 nativa ou variante, incluindo uma sequência nativa ou variante Cry3A, Cry3B, ou Cry3C, ou uma sequência selecionada de SEQ ID NO:2, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, e 21-43, ou uma sequência de nucleotídeo que codifica quaisquer destas sequências nativas ou variantes Cry3) usando-se um dos programas de alinhamento aqui descritos usando-se parâmetros padrões. Um versado na técnica reconhecerá que estes

14/69 valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar identidade correspondente de proteínas codificadas pelas duas sequências de nucleotídeo levando-se em conta a degeneração de códon, similaridade de aminoácido, leitura do posicionamento da estrutura, e similares.

Para determinar a porcentagem de identidade das duas sequências de aminoácido ou dos dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para proposta de comparação ótima. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, porcentagem de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições de sobreposição) x 100). Em uma concretização, as duas sequências são de mesmo comprimento. Em outra concretização, a porcentagem de identidade é calculada através da totalidade da sequência de referência (isto é, sequências de variante Cry3 aqui envolvidas). A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando-se técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir folgas. No cálculo da porcentagem de identidade, equiparações tipicamente exatas são contadas.

A determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser efetuada usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas de BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pesquisas de nucleotídeo de BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, classificação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a moléculas de ácido nucleico similares à pesticida da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, classificação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácido homólogas para moléculas de proteína pesticida da invenção. Para obter alinhamentos com folga para proposta de comparação, BLAST com Folga (em BLAST 2.0) pode ser utilizado

15/69 conforme descrito em Altschul et al. (1997) Acids nucleic Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa interada que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Vide Altschul et al. (1997) supra. Quando se utiliza BLAST, BLAST com Folga, e programas PSI-Blast, os parâmetros de falta dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento pode também ser realizado manualmente por inspeção.

Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de ClustalW (Higgins et al. (1994) Acids nucleics Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha na totalidade do aminoácido ou sequência de DNA, e, desse modo, pode proporcionar dados sobre a conservação da sequência da sequência de aminoácido total. O algoritmo de ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido comercialmente disponível, tal como o módulo ALIGNX do Vetor NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após alinhamento de sequências de aminoácido com ClustalW, a porcentagem de identidade de aminoácido pode ser avaliada. Em exemplo não limitativo de um programa de software útil para análise de alinhamentos de ClustalW é GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite avaliação de similaridade e identidade de aminoácido (ou DNA) entre proteínas múltiplas. Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível de Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácido, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de folga de 12, e um a penalidade de folga de 4 podem ser usados.

A menos que de outro modo citado, a Versão GAP 10, que usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será usada para determinar identidade ou similaridade de sequência usando-se

16/69 os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeo usando-se Peso GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e ta matriz de classificação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácido usando-se peso GAP de 8 e peso de comprimento de 2, e o programa de classificação BLOSUM62. Programas equivalentes podem também serem usados. Por programa equivalente é pretendido qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo resíduo de nucleotídeo idêntico equiparado e uma porcentagem de identidade de sequência idêntica quando comparada ao alinhamento correspondente gerado por GAP Version 10.

A invenção também envolve moléculas de ácido nucleicos variantes. Variantes das sequências de nucleotídeo que codificam proteína Cry3 variante pesticida incluem aquelas sequências que codificam as proteínas pesticidas variantes aqui reveladas, mas que diferem conservativamente por causa da degeneração do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As sequências de nucleotídeo variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese direcionada de local, mas que ainda codificará as proteínas pesticidas reveladas na presente invenção conforme discutido abaixo. As proteínas variantes envolvidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína de referência (isto é, sequências de variante Cry3 aqui envolvidas), isto é, atividade pesticida. Por reter atividade é pretendido que a variante terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína de referência. Em algumas concretizações, as proteínas pesticidas variantes descritas aqui mostram atividade aperfeiçoada relativa à proteína AXMI-R1 colocada em SEQ ID NO:2. Métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al.

17/69 (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos Estados Unidos No. 5.743.477, todos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

O versado na técnica apreciará adicionalmente que mudanças podem ser introduzidas por mutação das sequências de nucleotídeo da invenção conduzindo, desse modo, a mudanças na sequência de aminoácido das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Desse modo, moléculas de ácido nucleico isoladas variantes podem ser criadas por introdução de uma ou mais substituições, adições ou anulações de nucleotídeo na sequência de nucleotídeo correspondente aqui revelada, tal que uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou anulações são introduzidas nas região (ões) de mutação alvo(s) da proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênese direcionada de local e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeo variantes são também envolvidas pela presente invenção.

Por exemplo, substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais, resíduos de aminoácido não essenciais prognosticados. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de referência de uma proteína pesticida sem alterar substancialmente a atividade biológica, pelo que um resíduo de aminoácido essencial é requerido para atividade biológica. Uma substituição de aminoácido conservativa é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, tréonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias

18/69 laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina).

Delta-endotoxinas geralmente têm cinco domínios de sequência conservados, e três domínios estruturais conservados (vide, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste de sete alfa espirais e é envolvido na inserção de membrana e formação de poro. O domínio II consiste de três beta-folhas em uma configuração de chave Greek, e o domínio III consiste de duas betafolhas antiparalelas em formação jelly-roll (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III são envolvidos no reconhecimento e ligação de receptor, e são, portanto, considerados determinantes de especificidade de toxina.

As substituições de aminoácido podem ser produzidas nas regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não produzem resíduos de aminoácido conservados, ou para resíduos de aminoácido residindo no interior de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para atividade de proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda retêm atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm somente substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências da invenção (por exemplo, resíduos que têm somente substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento de proteínas homólogas). Contudo, um versado na técnica compreendería que variantes funcionais podem ter alterações menores conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

Alternativamente, sequências de nucleotídeo variantes podem ser produzidas por introdução de mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da(s) região (ões) de mutação alvo(s), tais como metagênese de permutação ou saturação, e os mutantes resultantes podem ser classifica

19/69 dos para capacidade de conferir atividade pesticida para identificar mutantes que retêm atividade ou mostram atividade aperfeiçoada. Em seguida à mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente, e a atividade da proteína pode ser determinada usando-se técnicas de ensaio padrões.

Usando-se métodos tais como PCR, hibridização, e similares, sequências pesticidas correspondentes podem ser identificadas, tais sequências tendo identidade substancial às sequências da invenção. Vide, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de nucleotídeo pesticida pode ser usada para classificar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tal cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, 2001, supra. As sondas de hibridização assim denominadas podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser etiquetadas com um grupo detectável tais como ³²P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. As sondas para hibridização podem ser produzidas por etiquetação de oligonucleotídeos sintéticos baseados na sequência de nucleotídeo que codifica proteína pesticida conhecida aqui revelados. Prímeres degenerados designados na base de nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido na sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido codificada podem adicionalmente serem usados. A sonda tipicamente compreende uma região de sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes para pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, ou 200 nucleotídeos conservativos de sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante destes. Métodos para a prepara

20/69 ção de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, 2001, supra aqui incorporados por referência.

Por exemplo, uma sequência de proteína pesticida total aqui revelada, ou uma ou mais porções desta, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente a sequências similares à proteína pesticida correspondente e RNAs mensageiros. Para alcançar hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e são preferivelmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências pesticidas correspondentes de um organismo escolhido por PCR. Esta técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem classificação de hibridização de bibliotecas de DNA revestido (ou placas ou colônias; vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

A hibridização de tais sequências pode ser efetuada sob condições estringentes. Por condições estringentes ou condições de hibridização estringentes é pretendido condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência alvo a um grau detectavelmente maior do que para outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre precedente). Condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Pelo controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, sequências alvos que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma desequiparação nas sequências de modo que graus inferiores de similaridade são detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente menor do

21/69 que 500 nucleotídeos de comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é menos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem também serem alcançadas com a adição de agentes de desestabilização tal como formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1 M, 1% de SDS (sódio dodecil sulfato) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X SSC = 3,0 M NaCI/0,3 M citrato de trisódio) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderadas exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M NaCI, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M NaCI, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração de hibridização é geralmente menos do que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

A especificidade é tipicamente a função de lavagens de póshibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a T_m pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% de forma) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares bases. A T_m é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) em que 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente equiparada. A T_m é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de desequiparação; desse modo, T_m, hibridização, e/ou condições de lavagem

22/69 podem ser ajustadas para hibridizar as sequências da identidade desejada. Por exemplo, se sequências com >90% de identidade são procuradas, a T_mpode ser diminuída 10°C. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (T_m) para a sequência específica e seu complemento a uma resistência iônica definida e pH. Contudo, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (T_m); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (T_m); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (T_m). Usando-se a equação, a hibridização e composições de lavagem, e T_m desejada, aqueles técnicos no assunto compreenderão que variações na estringência de hibridização e/ou condições de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de desequiparação resulta em uma T_m de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta pode ser usada. Uma guia extensiva para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrada em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Acid nucleic Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Vide, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Proteínas Isoladas e Variantes e Fragmentos do mesmos

Proteínas pesticidas são também envolvidas dentro da presente invenção. Por proteína pesticida é pretendido as sequências pesticidas de variante Cry3 aqui envolvidas. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e variantes destes são também providos, e podem ser usados para praticar os métodos da presente invenção. Uma proteína isolada ou uma proteína recombinante é usada para se referir a uma proteína que não é maior em

23/69 seu ambiente natural, por exemplo célula hospedeira de planta in vitro ou recombinante bacterial.

Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptídeo das sequências de variante Cry3 aqui envolvidos, e que exibem atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo que é, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para atividade pesticida. Métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos Estados Unidos No. 5.743.477, todos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Conforme aqui usado, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos da proteína de referência. A invenção envolve outros fragmentos, contudo, tal como qualquer fragmento na proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, ou mais aminoácidos.

Por variantes é pretendido proteínas ou polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2. Variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza para a molécula de ácido nucleico que codifica as sequências de variante Cry3 aqui envolvidas, ou um complemento destas, sob condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácido devido a mutagênese. Proteínas variantes envolvidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína variante Cry3, isto é, retêm atividade pesticida. Em algumas concretizações, as variantes têm atividade aperfeiçoada relativa a proteína de referência (por exemplo, relativa a SEQ ID NO:2, ou relativa a uma proteína específica vari

24/69 ante Cry3). Métodos para medição de atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos Estados Unidos No. 5.743.477, todos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Genes bacteriais, tais como os genes axmi desta invenção, muito frequentemente possuem códons de iniciação de metionina múltiplos em proximidade ao início da estrutura de leitura aberta. Frequentemente, a iniciação de translação em um ou mais destes códons de partida conduzirá a geração de uma proteína funcional. Estes códons de partida podem incluir códons ATG. Contudo, bactéria, tal como Bacillus sp., também reconhece o códon GTG como um códon de partida, e proteínas que iniciam translação nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a translação em sistemas bacteriais pode se iniciar a um códon TTG, embora neste evento o TTG codifica uma metionina. Além disso, não é frequentemente determinado a priorí que estes códons são usados naturalmente na bactéria. Desse modo, é compreendido que o uso de um dos códons de metionina alternados pode também conduzir a geração de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas são envolvidas na presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Será compreendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon de partida alternado para ATG para translação correta.

Os anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para variantes ou fragmentos destes, são também envolvidos. Métodos para produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente dos Estados Unidos No. 4.196.265).

Variantes Alteradas ou Aperfeiçoadas

É reconhecido que sequências de DNA de uma proteína pesticida podem ser adicionalmente alteradas por vários métodos, e que estas alte

25/69 rações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácido diferentes do que codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Esta proteína pode ser alterada em vários modos incluindo substituições de aminoácido, anulações, truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos das sequências de variante Cry3 aqui envolvidas, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155, ou mais substituições de aminoácido, anulações ou inserções em uma ou mais das regiões de mutação alvos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências de aminoácido variantes de uma proteína pesticida podem ser preparadas por mutações no DNA. Isto pode também ser efetuado por uma de várias formas de mutagênese e/ou em evolução direta. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácido não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade pesticida desejada (ou aperfeiçoada). Contudo, é compreendido que a capacidade de uma proteína pesticida conferir atividade pesticida pode ser aperfeiçoada pelo uso de tais técnicas após as composições desta invenção. Por exemplo, pode-se expressar uma proteína pesticida em células hospedeiras que exibem altas taxas de desincorporação base durante replicação de DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após propagação em tais cepas, pode-se isolar o DNA (por exemplo, por preparação de DNA de plasmídeo, ou por amplificação por PCR e clonagem do fragmento de PCR resultante em um vetor), cultura das mutações da proteína pesticida em uma cepa não mutagênica, e identificação dos genes que sofreram mutação com atividade pesticida, por exemplo, ela realização de um ensaio para testar atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Vide, por exemplo,

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Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir contato das plantas com uma ou mais pestes e determinando a capacidade da planta sobreviver e/ou causar a morte das pestes. Exemplos de mutações que resultam em toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carboxi sem afetar substancialmente a atividade. Isto pode incluir inserções, anulações, ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações de PCR que alteram ou prolongam a sequência de codificação de proteína em virtude de inclusão de sequências que codificam aminoácido nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências que codificam proteína totais, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epítope para facilitar ou purificação de proteína, detecção de proteína, ou outros usos experimentais conhecidos na técnica, (3) secreção ou translação alvo de uma proteína a uma organela subcelular, tal como o espaço periplásmico de bactéria Gram-negativa, ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, a última das quais frequentemente resulta na glicosilação da proteína.

Nucleotídeo e sequências de aminoácido variantes da presente invenção também envolvem sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tal como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de proteína pesticida diferentes podem ser usadas para criar uma nova proteína pesticida possuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas de uma população de sequências de polinucleotídeo relacionadas compreendendo regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando-se esta aproximação, motivos

27/69 de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos para obter um novo gene que codifica para uma proteína com uma propriedade de interesse aperfeiçoada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e Patente dos Estados Unidos Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

A permuta ou embaralhamento de domínio é outro mecanismo para geração de proteínas pesticidas alteradas. Os domínios podem ser permutados entre proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade pesticida aperfeiçoada ou espectro alvo. Métodos para geração de proteínas recombinantes e teste das mesmas para atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vetores

Uma sequência pesticida da invenção pode ser provida em um cassete de expressão para expressão e uma planta de interesse. Por cassete de expressão de planta é pretendido uma construção de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína de uma estrutura de leitura aberta em uma célula de planta. Tipicamente estas contêm um promotor e uma sequência de codificação. Frequentemente, tais construções também contêm uma região 3' não transladada. Tais construções podem conter uma sequência de sinal ou sequência condutora para facilitar transporte cotranslacional ou pós-translacional do peptídeo para certas estruturas intracelulares tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático,

28/69 ou aparelho de Golgi.

Por sequência de sinal é pretendido uma sequência que é conhecida ou suspeite de resultar em transporte de peptídeo co-translacional ou pós-translacional através da membrana da célula. Em eucariotes, isto tipicamente envolve secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Toxinas inseticidas de bactéria são frequentemente sintetizadas como protoxinas, que são proteoliticamente ativadas no intestino da peste alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas concretizações da presente invenção, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa, ou pode ser derivada de uma sequência da invenção. Por sequência condutora é pretendido qualquer sequência que quando transladada, resulta em uma sequência de aminoácido suficiente para disparar transporte co-translacional da cadeia de peptídeo a uma organela subcelular. Desse modo, isto inclui sequências condutoras tendo como alvo transporte e/ou glicosilação por passagem no retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndria, e similares.

Por vetor de transformação de planta é pretendido uma molécula de DNA que é necessária para transformação eficiente de uma célula de planta. Tal molécula pode consistir de um ou mais cessetes de expressão de planta, e pode ser organizada em mais do que uma molécula de DNA de vetor. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de planta que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções de requisito de cis- e trans-ação para transformação de células de planta (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Planta Science 5:446-451). Vetor se refere a uma construção de ácido nucleico designada para transferência entre células hospedeiras diferentes. Vetor de expressão se refere a um vetor que tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências de DNA heterólogas ou fragmentos em uma célula estranha. O cassete incluirá sequências regulatórias 5' e 3' operavelmente ligadas a uma sequência da invenção. Por operavelmente ligadas é pretendido uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e intermedia transcrição da sequência de DNA cor

29/69 respondente à segunda sequência. Geralmente, operavelmente ligadas significa que as sequências de ácido nucleico sendo ligadas são contíguas e, onde necessário, unem duas regiões de codificação de proteína, contíguas e na mesma estrutura de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional (is) pode(m) ser provido(s) em cassetes de expressão múltiuplos.

Promotor refere-se a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar transcrição de uma sequência de codificação à jusante. O promotor junto com outras sequências regulatórias transcricionais e translacionais de ácido nucleico (também denominadas sequências de controle) são necessárias para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

Tal cassete de expressão é provido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência pesticida a estar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias.

O cassete de expressão incluirá na direção 5-3' de transcrição, uma região de iniciação transcricional e translacional (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção, e um região de terminação translacional e transcricional (isto é, região de terminação) funcional nas plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, ao hospedeiro da planta e/ou à sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Onde o promotor é nativo ou homólogo ao hospedeiro da planta, é pretendido que o promotor seja encontrado na planta nativa em que o promotor é introduzido. Onde o promotor é estranho ou heterólogo à sequência de DNA da invenção, é pretendido que o promotor não seja o promotor nativo ou que ocorre naturalmente para a sequência de DNA operavelmente ligada da invenção.

A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a sequência de DNA operavelmente ligada de interesse, pode ser nativa com o hospedeiro da planta, ou pode ser

30/69 derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de DNA de interesse do hospedeiro da planta, ou qualquer combinação destes). Regiões de terminação convenientes são disponíveis a partir do Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Vide também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Ce//64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:12611272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Acids nucleics Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Acid nucleic Res. 15:96279639.

Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizados para expressão aumentada na célula hospedeira transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados usando-se códons preferidos de célula hospedeira para expressão aperfeiçoada, ou podem ser sintetizados usando-se códons a uma frequência de uso de códon preferida de hospedeiro. Geralmente, o teor de GC do gene será aumentado. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Planta Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro. Métodos são disponíveis na técnica para genes preferidos de sintetização de plantas. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Acids nucleics Res. 17:477-498, aqui incorporados por referência.

Em uma concretização, a proteína pesticida é alvejada ao cloroplasto para expressão. Dessa maneira, onde a proteína pesticida não é diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão adicionalmente conterá um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar a proteína pesticida aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; DellaCioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

O gene pesticida a ser alvejado para o cloroplasto pode ser oti

31/69 mizado para expressão no cloroplasto para contar as diferenças no uso do códon entre o núcleo da planta e esta organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando-se códons preferidos de cloroplasto. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Transformação da Planta

Os métodos da invenção envolvem introdução de uma construção de nucleotídeo em uma planta. Por introdução é pretendido apresentar à planta a construção de nucleotídeo de tal maneira que a construção ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que um método particular para introdução de uma construção de nucleotídeo a uma planta seja usado, somente que a construção de nucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introdução de construções de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, métodos de transformação adequados, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

Por planta é pretendido plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, célula de plantas, propagules, embriões e progenia das mesmas. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura de suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de foema, pólen).

Plantas transgênicas ou plantas transformadas ou plantas ou células ou tecidos estavelmente transformados se referem a plantas que foram incorporadas ou integradas sequências exógenas de ácido nucleico ou fragmentos de DNA na célula de planta. Estas sequências de ácido nucleico incluem aquelas que são exógenas, ou não apresentam na célula de planta não transformada, bem como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula de planta não transformada. Heteróloga geralmente se refere a sequências de ácido nucleico que não são endógenas à célula ou parte do genoma nativo em que elas estão presentes, e foram adicionadas à

32/69 célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou similares.

As plantas transgênicas da invenção expressam uma ou mais das sequências de variante Cry3 aqui reveladas. Em várias concretizações, a planta transgênica adicionalmente compreende um ou mais genes adicionais para resistência à inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controle de peste coleopterans (por exemplo, Cry1, tais como membros das famílias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, e Cry1F; Cry2, tal como membros da família Cry2A; Cry9, tal como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, e Cry9F; Cry34/35; VIPs, tal como VIP3; ou qualquer das sequências modificadas de Cry3A ou Cry3B conhecidas na técnica como tendo toxicidade contra peste coleopterans. Será compreendido pelo versado na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que concede um traço agronômico de interesse.

A transformação de células de plantas pode ser efetuada por uma de várias técnicas conhecidas na técnica. O gene pesticida da invenção pode ser modificado para obter ou intensificar a expressão nas células de planta. Tipicamente, uma construção que expressa tal proteína conteria um promotor para acionar transcrição do gene, bem como uma região 3' não transladada para permitir terminação de transcrição e polialdenilação. A organização de tais construções é bem conhecida na técnica. Em alguns exemplos, pode ser útil projetar o gene tal que o peptídeo resultante é secretado, ou, de outro modo, alvejado dentro da célula de planta. Por exemplo, o gene pode ser projetado para conter um peptídeo de sinal para facilitar transferência do peptídeo ao retículo endoplasmático. Pode também ser preferível projetar o cassete de expressão da planta para conter um intron, tal que processamento de mRNA do intron é requerido para expressão.

Tipicamente, este cassete de expressão de planta será inserido em um vetor de transformação de planta. Este vetor de transformação de planta pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar transformação de planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que são compre

33/69 endidos de mais do que um segmento de DNA contínuo. Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como vetores binários. Os vetores binários, bem como vetores com plasmídeos auxiliadores são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e complexidade de segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente é muito grande, e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários tipicamente contêm um vetor de plasmídeo que contém sequências de cis-ação requeridas para transferência de T-DNA (tal como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é projetado para ser capaz de expressão em uma célula de planta, e um gene de interesse (um gene projetado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para qual geração de plantas transgênicas é desejado). Também presentes neste vetor de plasmídeo são sequências requeridas para replicação bacterial. As sequências de cis-ação são dispostas em um modo para permitir transferência eficiente em células de plantas e expressão nestas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente um Segundo vetor de plasmídeo contém os fatores de trans-ação que mediam a transferência de T-DNA de Agrobacterium a células de plantas. Este plasmídeo frequentemente contém as funções de virulência (genes Vir) que permitem infecção de células de plantas por Agrobacterium, e transferência de DNA por divagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por vir, conforme é compreendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usadas para transformação de planta. O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para transformação das plantas por outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

Em geral, métodos de transformação de planta envolvem transferência de DNA heterólogo em células de plantas alvos (por exemplo, embriões imaturos ou maturos, culturas de suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguido por aplicação de um nível de limite máximo de

34/69 seleção apropriado (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas de um grupo de massa de célula não transformada. Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em rebentos após colocação no meio de regeneração suplementado com um nível de limite máximo de seleção de agente. Os rebentos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperação do rebento enraizado ou plantinha. A plantinha transgênica então cresce em uma planta matura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Joumal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para geração de plantas transgênicas são encontrados em Ayres e Park (1994) Criticai Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Desde que o material transformado contém muitas células; ambas células transformadas e não transformadas estão presentes em qualquer peça de calo alvo submetido ou tecido ou grupo de células. A capacidade de matar células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de planta transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limitação a recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem sucedida de plantas transgênicas.

Protocolos de transformação, bem como protocolos para introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocot ou dicot, alvejadas para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitados a, microinjeção, eletroporação, transferência de gene direta, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células de planta (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células de planta com DNA estranho heterólogo aderido às partículas, aceleração de partícula de balística, transformação de feixe de

35/69 aerosol (Pedido Publicado dos Estados Unidos No. 20010026941; Patente dos Estados Unidos No. 4.945.050; Publicação Internacional No. WO 91/00915; Pedido Publicado dos Estados Unidos No. 2002015066), transformação de Lec1, e vários outros métodos mediados por não partícula diretos para transferir DNA.

Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método ocorre na distribuição de canhão de partícula de DNA contendo um marcador selecionável e alvejamento do DNA ao genoma de plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, transformação de plastídeo pode ser acompanhada por transativação de um transgene nato de plastídeo omisso por expressão preferida de tecido de uma polimerase RNA nuclear-codificada e direcionada de plastídeo. Tal sistema foi reportado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.

Em seguida à integração de DNA estranho heterólogo em células de planta, aplica-se então um nível de limite máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células putativamente transformadas que sobrevivem deste tratamento de seleção por transferência regularmente a um meio fresco. Por passagem continua e desafio com seleção apropriada, identifica-se e prolifera-se as células que são transformadas com o vetor de plasmídeo. Métodos moleculares e bioquímicos podem então serem usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com modos convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então serem crescidas, e ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que expressão da característica fenotípica desejada seja

36/69 estavelmente mantida e herdada e, em seguida, sementes coletadas para assegurar expressão da característica fenotípica desejada foram alcançadas. Dessa maneira, a presente invenção proporciona semente transformada (também referida como semente transgênica) tendo uma construção de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporada em seu genoma.

Avaliação de Transformação da Planta

Seguindo à introdução de DNA estranho heterólogo em células de planta, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos tal como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.

A análise de PCR é um método rápido para classificar células transformadas, tecido ou rebentos para a presença de gene incorporado no estágio anterior antes do transplante no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR é efetuado usando-se prímeres de oligonucleotídeo específicos ao gene de interesse ou antecedente de vetor Agrobacteríum, etc.

A transformação da planta pode ser confirmada por análise de mancha de Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma nitrocelulose ou membrana de nylon. A membrana ou mancha é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA alvo radio etiquetado ³²P para confirmar a integração de gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Na análise de mancha de Northern, RNA é isolado de tecidos específicos de transformante, fracionado em um gel de formaldeído agarose, e manchado em um filtro de nylon de acordo com procedimentos padrões que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é então testada por hibridização do filtro a uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida,

37/69 por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

A mancha de Western, ensaios bioquímicos e similares podem ser efetuados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra) usando-se anticorpos que se ligam a um ou mais epítopes presentes na proteína pesticida.

Atividade pesticida em Plantas

Em outro aspecto da invenção, pode-se gerar plantas transgênicas expressando uma proteína pesticida que tem atividade pesticida. Os métodos acima descritos por meio de exemplo podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas, mas a maneira em que as células de planta transgênicas são geradas não é crítica a esta invenção. Os métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como transformação mediada por Agrobacteríum, transformação biolística, e métodos mediados por não partícula podem ser usados na discreção do experimentador. As plantas expressando uma proteína pesticida podem ser isoladas por métodos comuns descritos na técnica, por exemplo, por transformação de calo, seleção de calo transformado, e regeneração de plantas férteis de tal calo transgênico. Em tal processo, pode-se usar qualquer gene como um marcador selecionável considerando-se que sua expressão nas células de planta confere capacidade de identificar ou selecionar para células transformadas.

Um número de marcadores foram desenvolvidos para uso com células de planta, tal como resistência a cloranfenicol, o aminoglicosídeo G418, higromicin, ou similares. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo de cloroplasto podem também serem usados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, os genes que proporcionam resistência a plantas herbicidas tais como glifosato, bromoxinil, ou imidazolinona podem encontrar uso particular. Tais genes foram reportados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene nitralase de resistência a bromoxinil); e Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (AHAS imidazolinona resistance gene). Adicionalmente, os genes aqui revelados são úteis como marcadores para avaliar transformação de bacterial ou células de

38/69 planta. Os métodos para detecção da presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), semente, célula de planta, propagule, embrião ou progenia do mesmo são bem conhecidos na técnica. Em uma concretização, a presença do transgene é detectada por teste para atividade pesticida.

As plantas férteis expressando uma proteína pesticida podem ser testadas para atividade pesticida, e as plantas mostrando atividade ótima selecionada para geração adicional. Os métodos são disponíveis na técnica para ensaiar atividade de peste. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Vide, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

A presente invenção pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitadas a, monocots e dicots. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não são limitados a, milho (milho amarelo), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, e óleo de semente de colza, Brassica sp., alfalfa, centeio, painço, açafroa, amendoins, batata doce, cassava, café, côco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, aveias, vegetais, ornamentais, e coníferas.

Vegetais incluem, mas não são limitados a, tomates, alfaces, feijões verdes, feijões lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo, e melão almiscarado. Ornamentais incluem, mas não são limitadas a, azaléia, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravo, poinsétia, e crisântemo. Preferivelmente, as plantas da presente invenção são plantas de colheita (por exemplo, milho amarelo, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, óleo de semente de colza., etc.). Uso no Controle Pesticida

Métodos gerais para emprego de cepas compreendendo uma sequência de nucleotídeo da presente invenção, ou uma variante desta, em controle pesticida ou no projeto de outros organismos como agentes pestici

39/69 das são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.039.523 e EP 0480762A2.

As cepas de Bacillus contendo uma sequência de nucleotídeo da presente invenção, ou uma variante desta, ou os microorganismos que foram geneticamente alterados para conter um gene pesticida e proteína podem ser usados para proteção de colheitas agrícolas e produtos de pestes. Em um aspecto da invenção, isto é, células não lisadas de um organismo de produção de toxina (pesticida) são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente de peste(s) alvo(s).

Alternativamente, o pesticida é produzido por introdução de um gene pesticida em um hospedeiro celular. A expressão do gene pesticida resulta diretamente ou indiretamente na produção intracelular e manutenção do pesticida. Em um aspecto desta invenção, estas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente de peste(s) alvo(s). O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Estes pesticidas naturalmente encapsulados podem então serem formulados de acordo com técnicas convencionais para aplicação ao hospedeiro ambiental a uma peste alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Vide, por exemplo, EPA 0192319, e as referências aqui citadas. Alternativamente, pode-se formular as células expressando um gene desta invenção tal como para permitir aplicação do material resultante como um pesticida.

Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições, e podem ser aplicados à área de colheita ou planta a serem tratadas, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Estes compostos podem ser fertilizadores, matadores de erva daninha, crioprotetores, surfactantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros, e/ou formulações transportadoras de liberação no tempo ou biodegradável que permitem dosagem de longo prazo de uma área alvo, seguindo uma aplicação simples da formulação. Eles podem também serem herbicidas seletivas, inseticidas químicos, virucidas, microbici

40/69 das, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacteriocidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de várias destas preparações, se desejado, junto com transportadores agriculturalmente aceitáveis adicionais, surfactantes ou adjuvantes de promoção de aplicação costumeiramente empregados na técnica de formulação. Transportadores adequados e adjuvantes podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias ordinariamente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes de umedecimento, grudadores, ligantes ou fertilizantes. Do mesmo modo as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou formadas em armadilhas de peste para permitir alimentação ou ingestão por uma peste alvo da formulação pesticida.

Métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacteriais da presente invenção incluem aplicação de folha, revestimento de semente e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação depende da intensidade de infestação pela peste correspondente.

A composição pode ser formulada como um pó, serragem, pélete, grânulo, spray, emulsão, coloide, solução, ou similares, e pode ser preparada por tais meios convencionais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1 % a cerca de 99% por peso.

Pestes lepidopteran, dipteran, ou coleopterans podem ser matadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da invenção, ou podem ser profilaticamente aplicadas a uma área ambiental para prevenir infestação por uma peste susceptível. Preferivelmente a peste ingere, ou é contactada com, uma quantidade pesticidamente efetiva do polipeptídeo. Por quantidade pesticidamente efetiva é pretendido uma quantidade

41/69 do pesticida que é capaz de determinar a morte a pelo menos uma peste, ou reduzir marcadamente o crescimento da peste, alimentação, ou desenvolvimento fisiológico normal. Esta quantidade variará dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pestes alvos específicas a serem controladas, o ambiente específico, localização, planta, colheita, ou local agrícola a serem tratados, as condições ambientais, e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo pesticidamente efetiva. As formulações podem também variar com relação a condições climáticas, considerações ambientais, e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação de peste.

As composições pesticidas descritas podem ser produzidas por formulação ou da célula bacterial, cristal e/ou suspensão de esporo, ou componente de proteína isolado com o transportador agriculturalmente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio apropriado tal como transportador liofilizado, secado por congelamento, dissecado ou em um transportador aquoso, meio ou diluente adequado, tal como salina ou outro tampão. As composições formuladas pode estar na forma de uma serragem ou material granular, ou uma suspensão no solo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões óleo/água, ou como um pó umedecível, ou em combinação com qualquer outro material transportador adequado para aplicação agricultural. Transportadores agriculturais adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo transportador agriculturalmente aceitável cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, grudadores, ligantes, etc. que são ordinariamente usados em tecnologia de formulação de pesticida; estes são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto em formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura homogeneamente, mistura e/ou moagem da composição pesticida com adjuvantes adequados usando-se técnicas de formulação convencionais. Formulações adequadas e métodos de aplicação são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 6.468.523, aqui incorporada por referência.

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Peste inclui, mas não é limitada a, insetos, fungos, bactéria, nematódeos, ácaros, carrapatos, e similares. As pestes de inseto incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Tríchoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, e Diptera.

A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquanto a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae, e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae.

A ordem Diptera inclui as Subordens Nematocera, Brachycera, e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, e Cecidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, e Dolichopodidae. A subordem Cyclorrhapha inclui as Divisões Aschiza e Aschiza. A divisão Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae, e Conopidae. A divisão Aschiza

43/69 inclui as seções Acalyptratae e Calyptratae. A seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, e Sarcophagidae.

A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyrídae, Hesperíidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, e Tineidae.

As pestes de inseto da invenção para as maiores colheitas incluem: Milho amarelo: Ostrinia nubilalis, ciclóstomo de milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Helicoverpa zea, earworm de milho; Spodoptera frugiperda, lagarta do cereal; Diatraea grandiosella, ciclóstomo de milho southwestern; Elasmopalpus lignosellus, ciclóstomo de pé de milho menor; Diatraea saccharalis, ciclóstomo de cana-de-açúcar Diabrotica virgifera, verme de raiz de milho eestern; Diabrotica longicornis barberi, verme de raiz de milho; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme de raiz de milho do sul; Melanotus spp., larvas de elaterídeo; Cyclocephala borealis, besouro do norte (larva de inseto branca); Cyclocephala immaculata, larva de elaterídeo do sul (larva de inseto branca); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, besouro de pulga de milho; Sphenophorus maidis, milho amarelo billbug; Rhopalosiphum maidis, pulgão de folha de milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão de raiz de milho; Blissus leucopterus, percevejo chinch; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, larva de inseto de semente de milho; Agromyza parvicornis, minerador de folha de mancha de milho; Anaphothrips obscrurus, tripses de grama; Solenopsis milesta, thief ant; Tetranychus urticae, ácaro de aranha; Sorqo: Chilo partellus, ciclóstomo de sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta; Helicoverpa zea, lagarta de milho; Elasmopalpus lignosellus, ciclóstomo de pé de milho menor; Feltia subterrânea, lagarta granulada; Phyllophaga crinita, larva de inseto branca; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., larva de elaterídeos; Oulema melanopus, besouro de folha de cereal; Chaetocnema pulicaria, besouro de pulga de milho; Spheno

44/69 phorus maidis, milho amarelo billbug; Rhopalosiphum maidis; pulgão de folha de milho; Sipha fiava, pulgão de cana-de-açúcar amarela; Blissus leucopterus, percevejo chinch Contarínia sorghicola, maruin de sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro de aranha de carmina; Tetranychus urticae, ácaro de aranha de duas pernas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta dos cereais; Spodoptera frugiperda, lagarta dos cereais; Elasmopalpus lignosellus, ciclóstomo de talo de milho menor; Agrotis orthogonia, western lagarta; Elasmopalpus lignosellus, ciclóstomo de talo de milho menor; Oulema melanopus, besouro de folha de cereal; Hypera punctata, broca de folha de trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme de raiz de milho ocidental; pulgão de trigo russo; Schizaphis graminum, percevejo verde; Macrosiphum avenae, pulgão de grão inglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório, Mayetiola destructor, mosca Hessian; Sitodiplosis mosellana, maruin do trigo; Meromyza americana, maggot de haste de trigo; Hylemya coarctata, mosca de bulbo de trigo; Frankliniella fusca, tripses de tabaco; Cephus cinctus, vespão de talo de trigo; Aceria tulipae, ácaro de trigo; Girassol: Suleima helianthana, traça de muda de girassol; Homoeosoma electellum, traça de girassol; zygogramma exclamationis, besouro de girassol Bothyrus gibbosus, besouro de cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, maruin de semente de girassol; Algodão: Heliothis virescens, verme de muda de algodão; Helicoverpa zea, lagarta que ataca o algodão; Spodoptera exigua, lagarta de cereais de abelha; Pectinophora gossypiella, lagarta rosa; Anthonomus grandis, broca; Aphis gossypii, pulgão de algodão; Pseudatomoscelis seriatus, pulga de algodão Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, percevejo de planta; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripse da cebola; Franklinkiella fusca, tripse de tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro de aranha de carmina; Tetranychus urticae, ácaro de aranha; Arroz: Diatraea saccharalis, ciclóstomo de cana-de-açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta de careais; Helicoverpa zea, verme de milho; Colaspis brunnea, colaspis de uva; Lissorhoptrus oryzophilus, broca de arroz de água; Sitophilus oryzae,

45/69 broca de arroz; Nephotettix nigropictus, cigarra de arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo de chinch; Acrosternum hilare, percevejo verde Soja: Pseudoplusia includens, mede-palmos de soja; Anticarsia gemmatalis, feijãoveludo caterpillar; Plathypena scabra, verme de trevo verde; Ostrinia nubilalis, ciclóstomo de milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Spodoptera exigua, lagarta de cereais de abelha; Heliothis virescens, verme de percevejo de algodão; Helicoverpa zea, lagarta de algodão; Epilachna varivestis, besouro Mexipode seran; Myzus persicae, pulgão de pêssego verde; Empoasca fabae, cigarra de batata; Acrosternum hilare, percevejo verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, larva de inseto de semente de milho; Sericothrips variabilis, tripses de soja; Thrips tabaci, tripses de cebola; Tetranychus turkestani, ácaro de aranha de morango; Tetranychus urticae, ácaro de aranha; Cevada: Ostrinia nubilalis, ciclóstomo de milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Schizaphis graminum, percevejo verde; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo chinch; Acrosternum hilare, percevejo verde; Euschistus servus, percevejo marrom; Delia platura, larva de inseto de semente de milho; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Petrobia latens, ácaro de trigo marrom; Óleo de Semente de Colza: Brevicoryne brassicae, pulgão de repolho; Phyllotreta cruciferae, besouro Flea; Mamestra configurata, lagarta de cereais Bertha; Plutella xylostella, traça negra; Delia ssp., Root maggots.

Nematódeos incluem nematódeos parasíticos tais como rootknot, cyst, e nematódeos de lesão, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos cyst, incluindo, mas não limitados a, Heterodera glycines (soja cyst nematódeo); Heterodera schachtii (beet cyst nematódeo); Heterodera avenae (cereal cyst nematódeo); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (batata cyst nematódeos). Os nematódeos de lesão incluem Pratylenchus spp.

As plantas podem também serem tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicida, inseticidas, ou fungicidas. Composições químicas exemplares incluem: Herbicidas de Frutas/Veqetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Si46/69 mazina, Trifluralin, Fluazifop, Glufosinato, Halossulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Sethoxidim, Butafenacil, Halossulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutos/Veqetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarila, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrin, Deltametrin, Diazinon, Malation, Abamectin, Ciflu5 trin/beta-ciflutrin, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrin, Acequinocila, Bifenazato,

Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidin, Spirodiclofen, Gamma-cihalotrin, Spiromesifen, Spinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Spinoteram, Triflumuron, Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflume10 tofen, Cianopirafen, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Spinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, Emamectin-benzoato, Indoxacarb, Foztiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifen, Fenbutatin-oxid, Hextiazox, Metomil, 4[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-on; Fungicidas de Frutos/Veqetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato15 metil, Azoxistrobin, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Kresoxim-metil,

Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobin, Ethaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobin, Fenhexamid, Oxpoconazol fumarato, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamide, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Ciflufenamid, Boscalid; Herbicidas de Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenoxies, Clorsulfuron, Clodinafop, Diclofop, 20 Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluroxipir, Metsulfuron, Triassulfuron, Flucarbazona, lodossulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesossulfuron, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidossulfuron, Tifensulfuron, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfossulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralkoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas de Cereais: Carbendazim, Clorothalonil, Azoxistro25 bin, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Kresoxim-metil,

Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Simeconazol, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Dimoxistrobin, Protioconazol, Fluoxastrobin; Insetoicidas de Cereais: Dimetoato, Lambda-cihaltrin, Deltametrin, alfa-Cipermetrin, β-ciflutrin, Bifentrin, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Di30 netofurano, Clorfirifos, Metamidofos, Oxidemethon-metil, Pirimicarb, Methiocarb; Herbicidas de milho amarelo: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamid, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S

47/69 )Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Thiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Inseticidas de milho amarelo: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrin, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cihalotrin, Teflutrin, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidin, Spiromesifen, Flubendiamida, Triflumiiron, Rinaxipir, Deltametrin, Tiodicarb, β-Ciflutrin, Cipermetrin, Bifentrin, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrin, Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Avermectin, Methiocarb, Spirodiclofen, Spirotetramat; Fungicidas de milho amarelo: Fenitropan, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobin; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cihalofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Thiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrothion, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezin, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, Clotianidin, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrin, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-Benzoato, Cipermetrin, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furano-2(5H)-on, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de Arroz: Tiofanato-metil, Azoxistrobin, Carpropamid, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobin, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrin, Trifluralin, Carfentrazona]e, Cletodim, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalin, Piritiobac-sódio, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrin, Deltametrin, Malation, Monocrotofos, Abamectin, Acetamiprid, Emamectin Benzoato, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrin, Spinosad, Tiodicarb, Gamma-Cihalotrin, Spiromesifen, Piridalil, Flonicamid, Flubendiamida,

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Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrin, Spirotetramat, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, gamma Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano2(5H)-on, Tiodicarb, Avermectin, Flonicamid, Piridalil, Spiromesifen, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfan; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-Etil, Cloransulam-Metil, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzin, Pendimetalin, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de Soja: Lambda-cihalotrin, Methomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-Benzoato, Fipronil, Etiprol, Deltametrin, β-Ciflutrin, gama e lambda Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furano-2(5H)-on, Spirotetramat, Spinodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrin; Fungicidas de Soja: Azoxistrobin, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba: Cloridazon, Desmedipham, Etofumesato, Fenmedifam, Triallato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Inseticidas de Beterraba: Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Deltametrin, β-Ciflutrin, gama/lambda Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-on, Teflutrin, Rinaxipir, Cijiaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralin Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Clethodim, Tepraloxidim; Fungicida de Canola: Azoxistrobin, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolin; Inseticidas de Canola: Carbofurano, Organofosfatos, Piretróides, Tiacloprid, Deltametrin, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofurano, β-Ciflutrin, gama e lambda Cihalotrin, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-on.

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Métodos para Aumento de Produção de Planta

Os métodos para aumentar a produção de planta são providos. Os métodos compreendem introduzir em uma planta ou célula de planta um polinucleotídeo compreendendo uma sequência pesticida aqui revalada. Conforme definido acima, a produção da planta se refere a qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por biomassa é pretendido qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer aperfeiçoamento na produção do produto de planta medido. O aumento na produção da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento na biomassa da folha da planta pode aumentar a produção de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa da folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos industriais ou farmacêuticos derivados de planta. Um aumento na produção pode compreender qualquer aumento estatisticamente significante incluindo, mas não limitados a, pelo menos 1% de aumento, pelo menos 3% de aumento, pelo menos 5% de aumento, pelo menos 10% de aumento, pelo menos 20% de aumento, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100% ou um aumento maior na produção comparado a uma planta não expressando a sequência pesticida.

Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Construção de Expressão pAX 5510 é um vetor de expressão, baseado no sistema de vetor pRSF1b1 (Invitrogen) que contém a estrutura de leitura aberta SEQ ID NO:1 (Designada aqui como axmi-R1, que codifica a sequência descrita em GENBANK® Accession No. POA379) à jusante do T7 promotor, tal que indução de transcrição do T7 promotor (por exemplo, em cepas BL21: DE3) resulta no acúmulo da proteína cry-R1 (SEQ ID NO:2, que corresponde à sequência descrita em GENBANK® Accession No. POA379), com um etiqueta N-terminal His, em células de E. coli.

Exemplo 2: Bioensaios de verme de raiz de milho ocidental (WCRW) e ver

50/69 me de raiz de milho do sul (SCRW)

Ovos de verme de raiz de milho ocidental e do sul (Diabrotica virgifera e Diabrotica undecimpunctata, respectivamente) (Crop Characteristics, MN) foram lavados e incubados a 25 °C até perto de eclosão. Dieta artificial fundida foi preparada conforme anteriormente descrito (US Patent No. 7.351.881, aqui incorporada por referência), colocada em alíquotas de 1 ml e permitida resfriar em placas de cultura de tecido de 24 cavidades (Corning 3527) por 1 hora. Uma vez solidificada, 40 pl de amostra foi colocada em cada cavidade e permitida difundir na dieta. Após a amostra ser absorvida, 7,5 pl de ovo: 0,15% de pasta fluida de agar (aproximadamente 25 ovos de verme de raiz por cavidade) foram distribuídos no lado de cada cavidade e permitida secar. Uma vez secas, as placas foram vedadas com uma membrana permeável à gás BREATHE-EASY® (Research Products International) e colocadas em uma câmara de crescimento escura (25 °C, 90% de umidade relativa (RH)).

Após 24 horas, cada placa tem sua membrana e em seguida os ovos não eclodidos removidos, re-vedados com membranas permeável à gás e retornada para a câmara de crescimento escura (25 °C, 90% RH) por quatro dias adicionais. Após um total de cinco dias, os insetos nas cavidades da amostra foram comparados aos controles na placa e avaliados para interrupção e mortalidade (Vide Tabela 1 para o sistema de classificação). Tabela 1: Sistema de Classificação usado em Bioensaios de WCRW e SCRW

Classificação	Definição
0	Nenhuma Atividade
1	Interrupção não uniforme leve
2	Interrupção não uniforme
3	Interrupção uniforme
4	Interrupção uniforme com mortalidade (expressa como uma porcentagem)
5	Interrupção uniforme com 100% de mortalidade

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Exemplo 3: Estratégia de Mutagênese e criação de primeira biblioteca mutagenizada

A primeira biblioteca de mutação de ponto de geração (PM Biblioteca 1, PM1) tem como alvo 4 regiões de SEQ ID NO:2, compreendendo vinte e oito (28) posições. Usando-se pAX5510 como um gabarito, várias posições individuais foram randomizadas usando-se o kit de mutagênese direcionada de local QUIKCHANGE®, e as sequências de DNA de uma grande número de variantes foram determinadas. Pela análise das sequências de DNA, variantes desejadas foram reunidas, enquanto clones indesejados (tais como clones tipo selvagens, mutantes duplicatas e mutantes de alteração de estrutura) foram eliminados. Duzentas e noventa e quatro (294) variantes únicas foram identificadas de PM Bibliotecal para teste adicional.

Classificação Primária. As variantes de bibliotecas reunidas, bem como pAX5510, foram transformadas nas células BL21*DE3 e colocadas em LB+ Kanamycin (100 pg/ml). Colônias frescas foram captadas em 8,5 ml de meio líquido de LB + Kanamycin (100 ug/ml) e foram crescidas em 24 blocos de cavidade profundos a 37°C e 250 rpm até um OD600 nm de 0,3-0,4 ser alcançado. IPTG foi adicionado a uma concentração final de 0,5 mM e as culturas foram incubadas por um adicional de 18 horas a 20°C. O OD600 nm foi determinado e as células foram coletadas por centrifugação (10 minutos a 4500 rpm, 4 graus C). Os péletes de célula foram resuspensos em 50 mM de Carbonato de sódio pH 10,5, 1 mM de DTT a uma densidade de 10 OD600/ml. As células foram rompidas por batimento de gota e extratos solúveis foram obtidos após centrifugação a 4000 rpm por 15 minutos a 4°C.

Os extratos foram ensaiados para atividade contra WCRW e SCRW a 4 réplicas por variante cada. Após 5 dias, as classificações da toxicidade do verme de raiz foram determinadas por classificação média das classificações de 4 réplicas. Variantes (436 total) foram classificadas nesta classificação primária, proporcionando uma cobertura de 1,5x da biblioteca.

Re-ensaios e escala. Quarenta e três variantes de contagem >3 na classificação primária foram re-ensaiadas usando-se as mesmas condi

52/69 ções experimentais como a classificação primária. As contagens obtidas da classificação primária e re-ensaio, incluindo contagens de isolados repetidos devido a sobre-amostragem, foram classificadas, e 20 variantes foram priorizadas para escalas mais extensivas.

Para escalas, 5 colônias frescamente transformadas foram captadas em 135 ml de LB+Kanamycin (100 pg/ml) e crescidas em frascos osciladores de 1 litro a 37°C e 250 rpm até que um OD600 nm de 0,3-0,4 foi alcançado. O IPTG foi adicionado a uma concentração final de 0,5 mM e as culturas foram incubadas por um adicional de 18 horas a 20°C. O OD600 nm foi determinado e as células foram coletadas por centrifugação (10 minutos a 5000 rpm, 4 graus C). Os péletes de célula foram resuspensos em 50 mM de Carbonato de sódio pH 10,5, 1 mM de DTT a uma densidade de 10 OD600/ml. As células foram rompidas por batimento de gota e extratos solúveis foram obtidos após centrifugação a 4000 rpm por 15 minutos a 4^o C. As variantes AXMI-R1 naqueles extratos foram quantificadas em SDS-PAGE manchado com Coomassie por comparação de diluições em série de extrato a um BSA padrão de concentração conhecida. As concentrações das variantes AXMI-R1 estudadas foram fechadas, variando de 0,13-0,22 pg/ul.

Para o ensaio, diluições em série de extratos contendo variante AXMI-R1 foram preparadas em um extrato de controle de BL21*DE3 transformado com pRSFIb. AS diluições variam de 40 a 1,25 pl de extrato contendo variantes AXMI-R1. Desse modo, a concentração de variantes AXMIR1 foi titulada, enquanto a quantidade de proteínas BL21#DE3 foi mantida constante. Quarenta réplicas por variante e diluição foram ensaiadas em WCRW. A contagem média para cada diluição foi determinada, bem como o EC50.

As variantes AXMI-R1 foram ranqueadas de acordo com a contagem de bioensaio médio (n=40) a 40 μΙ de extrato (Tabela 2). Para comparação, 6 réplicas biológicas de AXMI-R1 tipo selvagem (peso) foram preparadas, e os dados e desvios padrões são providos.

Variantes D4F11, H9, G5, H4, D5D8, e D4A2 mostraram uma atividade significantemente aperfeiçoada contra WCRW. A sequência de nu

53/69 cleotídeo que codifica D5D8 é colocada em SEQ ID NO:5, e a sequência de aminoácido é colocada em SEQ ID NO:6.

Tabela 2: Variantes com Atividade Aperfeiçoada em WCRW.

Posição do Aminoácido relativa a SEQ ID NO:2	Proteína Variante ID	Mudança de Aminoácido
154	D4F11	P154A
160	H9	P160I
160	G5	P160A
160	H4	P160F
316	D5D8	G316T
316	D4A2	G316Q

Desse modo, enquanto não ligado por qualquer teoria particular ou mecanismo, atividade de WCRW aperfeiçoada pode estar iigaaa a mutações em três posições de AXMI-R1 (Tabela 2). As posições 154 e 160 de AXMI-R1 estão no processamento proposto e região de formação de poro, enquanto a posição 316 está na região de ligação de receptor proposta (Li et al, 1991, Nature 353:815-821).

Exemplo 4: Variantes de combinação:

Variantes foram geradas, as quais combinam mutações favoráveis na posição 316 com mutações favoráveis nas posições 154 e 160 para identificar combinações de mutações proporcionando aperfeiçoamentos cumulativos de processamento e reconhecimento de receptor. A Tabela 3 lista os resultados de tal teste; os dados de bioensaio indicam que os mutantes de combinação P160I; G316T (H9 + D5D8) e P160F; G316T (H4 + D5D8) proporcionam aperfeiçoamentos cumulativos na atividade. A sequência de nucleotídeo que codifica H9 + D5D8 é colocada em SEQ ID NO:7, e a sequência de aminoácido é colocada em SEQ ID NO:8. A sequência de aminoácido para H4+D5D8 é colocada em SEQ ID NO:26.

54/69

Tabela 3a: Atividade de Variantes Combinadas no SCRW

Contagem
	0	1	2	3	4	5	MÉDIA	DESVIO PADRÃO
AXMI-R1	2	12	6	0	0	0	1,2	0,62
H4	0	0	12	8	0	0	2,4	0,5
H9	0	0	16	4	0	0	2,2	0,41
G5	0	0	13	7	0	0	2,35	0,49
D4F11	0	0	18	2	0	0	2,1	0,31
D5D8	0	0	13	7	0	0	2,35	0,49
D4A2	0	0	16	4	0	0	2,2	0,41
H9+D5D8	0	0	2	15	3	0	3,05	0,51
H4+D5D8	0	0	3	17	0	0	2,85	0,37
G5+D5D8	0	0	14	6	0	0	2,3	0,47
D4F11 + D5D8	0	0	18	2	0	0	2,1	0,31
H9+ D4A2	0	1	10	9	0	0	2,4	0,6
H4+ D4A2	0	0	17	3	0	0	2,15	0,37
G5+ D4A2	0	0	8	12	0	0	2,6	0,5
D4F11+ D4A2	0	0	18	2	0	0	2,1	0,31
Vetor	20	0	0	0	0	0	0	0

Tabela 3b: Atividade de Variantes Combinadas em WCRW

Contagem
	0	1	2	3	4	5	MÉDIA	DESVIO PADRÃO
AXMI-R1	0	3	37	0	0	0	1,93	0,27
H4	0	0	33	7	0	0	2,18	0,38
H9	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
G5	0	0	35	5	0	0	2,13	0,33
D4F11	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
D5D8	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
D4A2	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
H9+D5D8	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
H4+D5D8	0	0	39	1	0	0	2,03	0,16
G5+D5D8	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00

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Contagem
	0	1	2	3	4	5	MÉDIA	DESVIO PADRÃO
D4F11 + D5D8	0	0	34	0	0	0	1,85	0,36
H9+ D4A2	0	0	40	0	0	0	2,00	0,00
H4+ D4A2	0	32	7	0	0	0	1,18	0,39
G5+ D4A2	0	16	24	0	0	0	1,60	0,50
D4F11+ D4A2	0	18	21	0	0	0	1,54	0,51
Vetor	20	0	0	0	0	0	0,0	0,00

Exemplo 5: Biblioteca mutante de ponto 2: resíduos que flanqueiam a posição 316

Dada a atividade pesticida aperfeiçoada gerada na PM Biblioteca 1 (PM1) de mutações no resíduo 316, uma segunda biblioteca de mutayau uu \ι ινι uiuiiuicua

317, e 318 relativas a SEQ ID NO:2. Esta biblioteca tem uma diversidade calculada de 61 variantes. Noventa e duas (92) variantes foram ensaiadas, e cinco variantes (R315F, R315M, R315W, Y317E, Y317N) que flanqueiam a posição 316 mostraram algum aperfeiçoamento na classificação primária. Variantes R315M e R315W foram escaladas e ensaiadas em concentrações de proteína na faixa de 125-250 pg/ml. Os dados indicam que alterações na posição 315 podem gerar atividade aperfeiçoada contra CRW.

Tabela 4a: Atividade de Variantes em WCRW

Frequência de Contagem (0-5)
	WCRW
Contagem	pAX5510 (AXMI-R1)	L3F1 (R315M)	L3G2 (R315W)	pRSFIb (controle)
0	0	0	0	20
1	0	0	0	0
2	32	30	31	0
3	8	9	9	0
4	0	0	0	0
5	0	0	0	0
MÉDIA	2,20	2,23	2,23	0

56/69

Frequência de Contagem (0-5)
WCRW
Contagem	pAX5510	L3F1	L3G2	pRSFIb
(AXMI-R1)	(R315M)	(R315W)	(controle)
Desvio Padrão	0,41	0,43	0,42	0

Tabela 4b: Atividade de Variantes em SCRW

Frequência de Contagem (0-5)
	WCRW
Contagem	pAX5510 (AXMI-R1)	L3F1 (R315M)	L3G2 (R315W)	pRSFIb (controle)
0	0	0	0	17
1	0	0	0	0
2	14	2	0	3
3	6	15	16	0
4	0	3	4	0
5	0	0	0	0
MÉDIA	2,30	3,05	3,20	0,30

Exemplo 6: Biblioteca Permutacional 1

Uma biblioteca de mutagênese permutacional foi gerada tendo como alvo posições 154, 155, 158 e 160. Esta biblioteca (Biblioteca P1; P1) 5 foi gerada usando-se métodos de mutagênese oligo-direcionada conforme conhecidos na técnica, resultando em uma biblioteca com uma complexidade teórica de 768 variantes. A diversidade incorporada na biblioteca é conforme segue:

Tabela 5: Posições alteradas na Biblioteca 2

Posição relativa a SEQ ID NO:2	Aminoácidos Observados em Variantes	Mudanças de aminoácido na Biblioteca (P1)
154	Ρ,Α,Ε	P,A,E,D,H,Q
155	V,E,K	V,E,K,M
158	R.V	R,V,G,L
160	PAF.I	P,A,F,I, L.S.T.V

Quinhentos e setenta e três (573) clones foram analisados em

57/69 um formato de 24 cavidades (4 reps cada), e 155 clones foram identificados para teste adicional. Setenta e três clones foram re-testados, e, por último, oito clones foram testados após escala (conforme descrito aqui).

Exemplo 7: Mortalidade de variantes em WCRW e SCRW

Várias variantes de P1 mostrando atividade desejada foram selecionadas para experimentos de escala conforme aqui descrito. A proteína resultante foi testada a concentrações de proteína na faixa de 125-250 pg/ml. Várias variantes mostraram a capacidade de matar WCRW e SCRW nestes ensaios, pelo que proteína de controle AXMI-R1 wt não mostrou mortalidade em ou WCRW ou SCRW nestes ensaios.

Em um primeiro conjunto de experimentos, ovos de CRW foram depositados nas cavidades, amostras foram adicionadas, e, após 5 dias, dano a CRW e % de mortalidade de CRW (se aplicável) foram contados (Tabela 6). As contagens médias e mortalidade média foram baseadas nas 40 réplicas para WCRW e 20 réplicas para SCRW. Os dados mostraram que variantes PermutP3c6 e PermutP3c7 dão 8-9% de mortalidade contra WCRW e 60-80% de mortalidade contra SCRW, enquanto o AXMI-R1wt não mostrou mortalidade (Tabela 7). A sequência de nucleotídeo que codifica a 3c7 variante é colocada em SEQ ID NO: 12, e a sequência de aminoácido é colocada em SEQ ID NO: 13.

A análise das proteínas por SDS-PAGE mostra que os níveis de expressão de AXMI-R1wt, 3c6, e 3c7 são indistinguíveis e provavelmente idênticas.

Tabela 6: Atividade de Variantes em Verme de raiz de milho

	Contagem: Verme de raiz de milho ocidental	Contagem: Verme de raiz de milho do sul
	Contagem média (n=40)	Desvio Padrão	Contagem média (n=20)	Desvio Padrão
Controle de Vetor	0,00	0,00	0,25	0,44
AXMI-R1	2,50	0,51	2,65	0,49
3c6	3,03	0,62	4,70	0,57

58/69

	Contagem: Verme de raiz de milho ocidental	Contagem: Verme de raiz de milho do sul
	Contagem média (n=40)	Desvio Padrão	Contagem média (n=20)	Desvio Padrão
3c7	3,03	0,62	4,10	0,85

Tabela 7: Mortalidade de Variantes em Verme de raiz de milho

	Mortalidade: Verme de raiz de milho ocidental	Mortalidade: Verme de raiz de milho do sul
	Porcentagem de Mortalidade (n=40)	Desvio Padrão	Porcentagem de Mortalidade (n=20)	Desvio Padrão
Controle de Vetor	0,00	0,00	0,00	0,00
AXMI-R1	0,00	0,00	0,00	0,00
3c6	8,75	18,72	86,50	29,07
3c7	7,75	17,02	59,00	38,78

Em um experimento subsequente, ovos de CRW foram depositados em cavidades, amostra foi adicionada, e após 1 dia ovos não eclodidos foram removidos. Este método dá uma população mais sincronizada de eclosão precoce de larvas de CRW que encontram a amostra dentro de 1-2 dias de aplicação de amostra. Sob estas condições, variante 3c7 alcançou 44% de mortalidade contra WCRW e 86% de mortalidade contra SCRW (Tabela 8).

Tabela 8: Mortalidade de Variante PermutP3c7 em ensaio de Verme de raiz 10 de milho modificado

	Mortalidade: Verme de raiz de milho ocidental	Mortalidade: Verme de raiz de milho do sul
	Porcentagem de mortalidade (n=40)	Desvio Padrão	Porcentagem de Mortalidade (n=20)	Desvio Padrão
Controle de Vetor	0,00	0,00	0,00	0,00
3c7	44,00	26,44	86,50	13,09

Uma terceira variante, 3a11 (V155K; R158G; P160T), também

59/69 induziu mortalidade contra WCRW comparada aos controles AXMI-R1. Neste experimento, ovos de CRW foram depositados em cavidades, amostra foi adicionada, e após 1 dia ovos não eclodidos foram removidos. A mortalidade de 36% foi observada em verme de raízes exposta a 3a11 neste ensaio (Tabela 9).

Tabela 9: Atividade de Variantes 3a11 em Verme de raiz de milho

	Verme de raiz de milho ocidental
	Contagem média (n=40)	Desvio Padrão
Controle do Vetor	0,05	0,22
AXMI-R1	2,45	0,71
3a11	3,8	0,69

Tabela 10: Resumo de mudanças de Aminoácido de certas variantes

Proteína ID	Mudanças de Aminoácido relativas a SEQ ID NO:2
3c7	P154A; V155K; P160V
3c6	P154Q; V155E; P160L
3a11	V155K; R158G; P160T

Exemplo 8: Variantes Combinatoriais.

Uma variante que combinou 3c7 (P154A, V155K, P160V) e a variante D5D8 (G316T) de Biblioteca PM1 foi gerada e testada para atividade de CRW, e mostrou mortalidade contra WCRW e SCRW em concentrações de proteína na faixa de 125-250 pg/ml. A sequência de nucleotídeo que codifica o 3c7 + D5D8 variante é colocada em SEQ ID NO:9, e a sequência de aminoácido é colocada em SEQ ID NO: 10.

Exemplo 9: Biblioteca PM2

Uma segunda biblioteca de mutação de ponto de geração (PM2) foi gerada para combinar alterações em posições 482 e 483 com alterações nas posições 315 e 316. Esta biblioteca contém 756 variantes. Mais do que 1.100 clones foram captados e testados para atividade. Variantes ‘1g8’ (G316E, Q482L, G483K) e ‘2b1T (G316A, Q482L, G483K) foram encontradas para mostrar atividade aperfeiçoada em uma peste de verme de raiz comparada a AXMI-R1. Variante 1g8 mostrou em muitos casos atividade

60/69 superior comparada a 3c7. A sequência de nucleotídeo que codifica a 1g8 variante é colocada em SEQ ID NO: 14, e a sequência de aminoácido é colocada em SEQ ID NO:15.

Tabela 11: Porcentagem de cavidades com 50% ou mais de mortalidade

	WCRW	SCRW
AXMI-R1 (pAX5510)	0	0
3c7	56	13
1g8	100	50
Controle de Vetor	6	0

Exemplo 10: Biblioteca P3

Uma biblioteca (Biblioteca P3) de variantes nas posições correspondentes a posições 481 a 486 de AXMI-R1 (designadas aqui como ‘Loop 3’1 foi aerada. Clones individuais foram testados nara avaliar a contribuição de cada resíduo para atividade pesticida. Resíduos 482 e 483 foram verifi10 cados contribuírem para atividade, visto que variantes nestes resíduos demonstraram atividade aperfeiçoada no verme de raiz de milho (Tabela 12).

Tabela 12: Variantes Aperfeiçoadas de Resíduos 482 e 483

Mudança AA relativa a SEQ ID NO:2		WCRW (contagem)	SCRW (contagem)
Nenhuma	Teste 1	1	0
	Teste 2	2	0
	Teste 3	2	2
Q482I	Teste 1	4	2
	Teste 2	3	2
G483K	Teste 1	4	3
	Teste 2	4	4
G483S	Teste 1	3	1
	Teste 2	4	3
G438Q	Teste 1	2	3
	Teste 2	4	3

Exemplo 11: Variantes de Combinação

Clones foram gerados que combinaram as alterações observa

61/69 das em variantes 1g8 e 2b11 com aquela em 3c7. Os clones resultantes AXMI-R1 (3c7+1g8) e AXMI-R1 (3c7+2b11) foram testados e verificados reter atividade em verme de raiz de milho. Notavelmente, AXMI-R1 (3c7+1g8) pareceu exibir mortalidade mais alta no verme de raiz de milho do que 3c7 sozinho. AXMI-R1 (3c7+2b11) também pareceu em alguns testes exibir atividade maior do 3c7 sozinho.

Exemplo 12: Geração de AXMI-R1(EVO23)

Uma segunda biblioteca permutacional de geração para a região de processamento foi clonada em AXMI-R1(1g8) (SEQ ID NO: 15), permitindo, desse modo, uma classificação de diversidade na região de processamento no contexto de variante AXMI-R1(1g8), que contém mutações na região de ligação de receptor. A diversidade daquela biblioteca é 573. Variantes (n=813) foram classificadas, 163 clones foram re-ensaiados, e 40 variantes foram escaladas. AXMI-R1(EVO23) (SEQ ID NO: 17) tem a atividade mais alta daquela biblioteca. A sequência de nucleotídeo que codifica AXMIR1(EVO23) é colocada em SEQ ID NO: 16. A atividade de EVO23 em WCRW é mostrada na Tabela 13.

Tabela 13: Atividade de EVO23 em Verme de raiz de milho ocidental

	Mortalidade média de WCRW (%)	Desvio padrão
AXMI-R1	1,67	3,79
Evo23	23,44	6,15
pRSFIb	0,20	0,78

Exemplo 13: Geração de variantes de interface de domínio ll/lll

A modelagem de axmi-R1 identificou 3 regiões que contribuem à interface entre domínio 2 e domínio 3. Estas regiões correspondem a posições 331-335, posições 368-373, e posições 518-524 de SEQ ID NO:2. Bibliotecas variantes que têm como alvo estas regiões foram geradas. A diversidade da biblioteca correspondente às posições 518-524 foi oito (Tabela 14). Doze variantes foram classificadas, e L61E11 foi re-ensaiado e escalado.

62/69

Tabela 14: Biblioteca de variante de interface de domínio ll/lll

Posição	518	519	520	521	522	523	524
Wt	Y	K	L	Q	S	G	A
Diversidade		S		K


Códons	Tat	Aag	Tta	caa	tct	ggt	gct
		Agt		aaa


permut dna	Tat	Ark	Tta	maa	tct	ggt	gct
permut prot	Y	KSRN	L	QK	S	G	A

A atividade da variante L61E11 contra WCRW é mostrada na d c i αυσια i u.

Tabela 15: Atividade de L61E11 em Verme de raiz de milho ocidental

	Mortalidade média de WCRW (%)	Desvio Padrão
AXMI-R1	13	14,2
L61e11	18	14,5
pRSFIb	0	0

A presente invenção demonstra que alteração dos resíduos aqui descritos resulta em variantes com atividade aperfeiçoada em pestes. Um resumo dos resíduos que foram alterados na presente invenção é provido na

Tabela 16.

Tabela 16: Resumo de Posições Alteradas em Variantes Aperfeiçoadas

SEQ ID NO:	Identificador	Resumo de mutações	154	155	158	160	315	316	482	483	519
2	wt	wt	P	V	R	P	R	G	Q	G	K
21	D4F11	P154A	A
22	H9	P160I				I
23	G5	P160A				A
24	H4	P160F				F
6	D5D8	G316T						T

63/69

SEQ ID NO:	Identificador	Resumo de mutações	154	155	158	160	315	316	482	483	519
25	D4A2	G316Q						Q
8	H9+D5D8	P160I; G316T				I		T
26	H4+D5D8	P160F; G316T				F		T
27	H9+D4A2	P160I; G316Q				I		Q
28	G5+D4A2	P160A; G316Q				A		Q
29	R315M	R315M					M
30	R315W	R315W					W
31	3c6	P154Q; V155E; P160L	Q	E		L
13	3c7	P154A; \/-i V 1 Wl X, P160V	A	K		V
32	3a11	V155K; R158G; P160T		K	G		T
15	1g8	G316E; Q482L; G483K						E	L	K
33	2b11	G316A; Q482L; G483K						A	L	K
34	Q482I	Q482I							I
35	G483K	G483K								K
36	G483S	G483S								s
37	G483Q	G483Q								Q
38	3c7+1g8	P154A; V155K; P160V; G316E; Q482L; G483K	A	K	V			E	L	K
39	3c7+2b11	P154A; V155K; P160V; G316A; Q482L; G483K	A	K	V			A	L	K

64/69

SEQ ID NO:	Identificador	Resumo de mutações	154	155	158	160	315	316	482	483	519
17	Evo23	P154H; P160L; G316E; Q482L; G483K	H			L		E	L	K
19	L61E11	K519N									N
10	3C7+D5D8 (Evo20)	P154A; V155K; P160V; G316T	A	K		V		T
40	G5+D5D8	P160A; G316T				A		T
41	D4F11+D5D8	P154A; G316T	A					T
42	H4+D4A2	P160F; G316Q				F		Q
43	D4F11+D4A2	P154A; G316Q	A					n

Exemplo 14: Uso de sequências AXMI-R1 evoluídas em outras proteínas

Cry:

Segmentos de sequência AXMI-R1 contendo mutações favoráveis podem ser inseridos em outras proteínas homólogas Cry para aperfei5 çoar processamento, ligação e atividade de receptor. Por exemplo, um segmento de sequência de uma variante AXMI-R1 evoluída cobrindo a região de processamento pode ser usado para substituir a região homóloga em axmi008, axmi028, e outras proteínas Cry. Desde que o dobramento 3D de proteínas Cry é conservado, o processamento aperfeiçoado e potência da 10 proteína híbrida podem ser alcançados. A mutagênese adicional destas sequências variantes AXMI-R1 pode ajudar a adaptar e aperfeiçoar as sequências variantes AXMI-R1 no contexto das proteínas hospedeiras.

Exemplo 15: Ensaios adicionais para Atividade pesticida

As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser testadas 15 para sua capacidade de produzir proteínas pesticidas. A capacidade de uma proteína pesticida agir como um pesticida após uma peste é frequentemente avaliada em um número de modos. Um modo bem conhecido na técnica é realizar um ensaio de alimentação. Em tal ensaio de alimentação, expõe-se

65/69 a peste a uma amostra contendo ou compostos a serem testados ou amostras de controle. Frequentemente isto é realizado por colocação do material a ser testado, ou uma diluição adequada de tal material, em um material que a peste ingerirá, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto de um líquido, sólido, ou pasta fluida. O material a ser testado pode ser colocado na superfície e então permitido secar. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial fundida, então dispensado na câmara de ensaio. A câmara de ensaio pode ser, por exemplo, um copo, um prato, ou uma cavidade de uma placa de micro titulação.

Ensaios para sugar pestes (por exemplo, pulgões) podem incluir separação do material de teste a partir do inseto por uma partição, idealmente uma porção que pode ser perfurada pelas partes da boca de sucção do suga mento do inseto, para permitir ingestão do material de teste. Frequentemente o material de teste é misturado com um estimulante de alimentação, tal como sucrose, para promover ingestão do composto de teste.

Outros tipos de ensaios podem incluir microinjeção do material de este na boca, ou intestino da peste, bem como desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido pelo teste da capacidade da peste alimentar após a planta transgênica. O teste da planta pode envolver isolamento das partes de planta normalmente consumidas, por exemplo, gaiolas pequenas fixadas a uma folha, ou isolamento de plantas inteiras em gaiolas contendo insetos.

Outros métodos e aproximações para ensaiar pestes são conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson e Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, ensaios são comumente descritos em journals Arthropod Management Tests and Journal of Economic Entomology ou por discussão com membros da Sociedade Entomológica da América (ESA). Exemplo 16: Vetoração de Genes para Expressão de Planta

As regiões de codificação da invenção são conectadas com promotor apropriado e sequências terminadoras para expressão em plantas. Tais sequências são bem conhecidas na técnica e podem incluir o promotor

66/69 de arroz actin ou promotor de milho amarelo ubiquitin para expressão em monocots, o promotor Arabidopsis UBQ3 ou promotor CaMV 35S para expressão em dicots, e os terminadores nos ou Pinll. As técnicas para produção e confirmação de promotor - gene - construções de terminador também são bem conhecidos na técnica.

Em um aspecto da invenção, sequências de DNA sintéticas são designadas e geradas. Estas sequências sintéticas têm sequência de nucleotídeo alterada relativa à sequência de origem, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência de origem.

Em outro aspecto da invenção, versões modificadas dos genes sintéticos são designadas tal que o peptídeo resultante é alvejado a uma organela de planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. As sequências de peptídeo conhecidas para resultar em alvejamento de proteínas de fusão em organelas de planta são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região N-terminal do gene ácido fosfatase a partir do White Lupin Lupinus albus (GENBANK® ID Gl: 14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecida na técnica para resultar em retículo endoplasmático alvejando proteínas heterólogas. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção de retículo endoplasmático compreendendo o peptídeo N-terminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (isto é, o motivo KDEL, SEQ ID NO:11) no C-terminal, a proteína de fusão será alvejada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão carece de uma sequência alvejando retículo endoplasmático no Cterminal, a proteína será alvejada para o retículo endoplasmático, mas, por último, será sequestrado no apoplasto.

Desse modo, este gene codifica uma proteína que contém os aminoácidos trinta e um N-terminal do gene ácido fosfatase a partir do White Lupin Lupinus albus (GENBANK® ID GM4276838, Miller et al., 2001, supra) fundido ao N-terminal da sequência de aminoácido da invenção, bem como a sequências KDEL no C-terminal. Desse modo, a proteína resultante é prognosticada para ser alvejada o retículo endoplasmático da planta após expressão em uma célula de planta.

67/69

Os cassetes de expressão de planta descritos acima são combinados com um marcador selecionável de planta apropriado para auxiliar na seleção de células transformadas e tecidos, e ligados nos vetores de transformação de planta. Estes podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores de plasmídeo simples para transformação de aerosol ou biolística.

Exemplo 17: Transformação de Células de Milho amarelo com os genes de proteína pesticida aqui descritos

Espigas de milho amarelo são melhor coletadas 8-12 dias após polinização. Os embriões são isolados a partir das espigas, e aqueles embriões 0,8-1,5 mm de tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são colocados em escutelo de lado para cima em um meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/L N6 Sais; 1 ml_/L (de 1000x Estoque) de N6 Vitaminas; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sucrose; 1 ml_/L (de 1 mg/mL de Estoque) 2,4-D). Contudo, meio e sais outros do que DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. Contudo, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite.

Os explantes resultantes são transferidos para malhas quadradas (30-40 por placa), transferidos no meio osmótico por cerca de 30-45 minutos, em seguida transferidos para uma placa de feixe (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO/0138514 e Patente dos Estados Unidos No. 5.240.842).

As construções de DNA designadas para os genes da invenção em células de planta são aceleradas em tecido de planta usando-se um acelerador de feixe de aerosol, usando-se condições essencialmente conforme descritas na Publicação PCT No. WO/0138514. Após o feixe, os embriões são incubados por cerca de 30 min em meio osmótico, e colocados no meio de incubação durante a noite a 25°C no escuro. Para evitar dano aos explantes com feixe, eles são incubados por pelo menos 24 horas antes da transferência ao meio de recuperação. Os embriões são então difundidos no meio

68/69 de período de recuperação, por cerca de 5 dias, 25°C no escuro, em seguida transferidos para um meio de seleção. Os explantes são incubados no meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante 5 é transferido para o meio de maturação de embrião, até que a formação de embriões somáticos maturos é observada. Os embriões somáticos maturos resultantes são então colocados sob luz baixa, e o processo de regeneração é iniciado por métodos conhecidos na técnica. Os rebentos resultantes são permitidos enraizar no meio de enraizamento, e as plantas são transferidas 10 para potes de sementeiras e propagadas como plantas transgênicas.

Materiais

Meio DN62A5S

Componentes	Por Litro	Fonte
Chu's N6 Basal Mistura de Sal (Prod. No. C 416)	3,98 g/L	Phytotechnology Labs
Chu’s N6 Solução de Vitamina (Prod. No. C 149)	1 mL/L (de 1000x Estoque)	Phytotechnology Labs
L-Asparagina	800 mg/L	Phytotechnology Labs
Mio-inositol	100 mg/L	Sigma
L-Prolina	1,4 g/L	Phytotechnology Labs
Casaminoácidos	100 mg/L	Fisher Scientific
Sucrose	50 g/L	Phytotechnology Labs
2,4-D (Prod. No. D-7299)	1 mL/L (de 1 mg/mL de Estoque)	Sigma

O pH da solução é ajustado a pH 5,8 com 1N KOH/1N KCI, Gelrite (Sigma) é adicionado a uma concentração até 3g/L, e o meio é autocla15 vado. Após resfriamento a 50°C, 2 ml/L de 5 mg/ml de solução de estoque de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) é adicionado

Exemplo 18: Transformação de genes da invenção em Células de planta por transformação mediadas por Agrobacterium

Espigas são melhores coletadas 8-12 dias após polinização. Os

69/69 embriões são isolados a partir das espigas, e aqueles embriões 0,8-1,5 mm de tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são colocados em escutelo de lado para cima em um meio de incubação adequado, e incubados durante a noite a 25°C no escuro. Contudo, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são contatados com uma cepa Agrobacterium contendo os vetores apropriados para transferência mediada por Ti plasmídeo por cerca de 5-10 min, e então colocados em meio de co-cultivação por cerca de 3 dias (25°C no escuro). Após co-cultivação, os explantes são transferidos para recuperação de meio de período por cerca de cindo dias (a 25°C no escuro). Os explantes são incubados no meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até que a formação de embriões somáticos maturos é observada. Os embriões somáticos maturos resultantes são então colocados sob luz baixa, e o processo de regeneração é iniciado conforme conhecidos na técnica.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de técnica anterior a qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência à mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicados para serem incorporados por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por modo de ilustração e exemplo para proposta de clareza de compreensão, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido de variante Cry3, em que a referida variante compreende SEQ ID NO: 16.

2/2

2. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeo é uma sequência sintética que foi designada para expressão em uma planta.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeo é operacionalmente ligada a um promotor capaz de direcionar expressão da referida sequência de nucleotídeo em uma célula de planta.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5 com uma quantidade pesticidamente efetiva do polipeptídeo, como definido na reivindicação 8.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

6. Célula hospedeira microbiana, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Polipeptídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 17.

8 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende 1% a 99% por peso do referido polipeptídeo.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 7.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é selecionada dentre o grupo consistindo em um pó, serragem, pélete, grânulo, pulverização, emulsão, coloide e solução.

10 finido na reivindicação 8.

10. Composição de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que é preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células de Bacillus thuringiensis.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações

Petição 870190009008, de 28/01/2019, pág. 4/10

12. Método para controlar uma população de peste de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida população

13. Método para matar uma peste de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida peste, ou alimentar a referida peste, com uma quantidade pesticidamente efetiva do polipeptídeo, como de-

14. Método para produção de um polipeptídeo com atividade pesticida para uma peste de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreendendo a cultura da célula hospedeira compreendendo o vetor, como definido na reivindicação 4 ou 5, sob condições em que a molécula de ácido nu-

15 cleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

15. Método para proteger uma planta de uma peste, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma planta ou célula da mesma uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido de variante Cry3, em que a referida variante compreende SEQ ID NO: 16.