JP6009165B2 - 変異AXMI−R1δ−エンドトキシン遺伝子及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫タンパク質をコードする新規な遺伝子が提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫製剤の調製及びトランスジェニック害虫抵抗性植物の産生に有用である。
Bacillus thuringiensis(Bt)は、ある目及び種の昆虫に特異的に毒性であるが、植物及び他のターゲティングされていない生物に無害な結晶状封入体を産生する能力を特徴とするグラム陽性芽胞形成土壌細菌である。この理由から、Bacillus thuringiensis株又はそれらの殺虫タンパク質を含む組成物は、多様なヒト又は動物疾患についての農業害虫又は媒介昆虫を防除する、環境的に許容されうる殺虫剤として使用することができる。
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に殺虫活性を付与するための組成物及び方法が提供される。組成物には、殺虫及び農薬ポリペプチドについての配列をコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、ならびにそのベクターを含むホスト細胞が含まれる。組成物には、また、殺虫ポリペプチド配列及びそれらのポリペプチドに対する抗体が含まれる。ヌクレオチド配列は、微生物及び植物を含めた生物にトランスフォーメーション及び発現させるための、DNA構築物又は発現カセットに使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、非限定的に微生物又は植物を含めた生物における発現のために設計された合成配列のこともある。組成物は、また、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子を含む。
本発明は、生物における、特に植物又は植物細胞における害虫抵抗性又は寛容性を調節するための組成物及び方法を対象とする。「抵抗性」とは、本発明のポリペプチドを摂取したとき、又はそれと他の接触をしたときに、害虫(例えば昆虫)が死滅することが意図される。「寛容性」とは、害虫の運動、摂食、生殖、又は他の機能の障害又は減退が意図される。その方法は、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列を生物にトランスフォーメーションすることを伴う。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物及び微生物を調製するために有用である。したがって、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。
本発明の一局面は、殺虫タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子又はリコンビナント核酸分子、及び配列相同領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子に関する。本明細書に使用されるような「核酸分子」という用語には、DNA分子(例えばリコンビナントDNA、cDNA又はゲノムDNA)及びRNA分子(例えばmRNA)ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成したDNA又はRNAのアナログが含まれることが意図される。核酸分子は、1本鎖又は2本鎖でありうるが、好ましくは2本鎖DNAである。
殺虫タンパク質もまた、本発明に包含される。「殺虫タンパク質」とは、本明細書に包含される殺虫変異Cry3配列が意図される。そのフラグメント、生物学的活性部分、及び変異体もまた提供され、本発明の方法の実施に使用することができる。「単離されたタンパク質」又は「リコンビナントタンパク質」は、もはやその自然環境中にないタンパク質、例えばインビトロ又はリコンビナントの細菌細胞又は植物ホスト細胞を表すために使用される。
殺虫タンパク質のDNA配列を様々な方法によってさらに変更することができること、及びこれらの変更が本発明の殺虫タンパク質によってコードされるものと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列をもたらしうることが認識されている。このタンパク質は、1個又は複数個のターゲット突然変異領域に最大で約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、又はそれを超えるアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、本明細書に包含される変異Cry3配列1個又は複数個のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、短縮、及び挿入を含む様々な方法で変更することができる。そのような操作の方法は、当技術分野において一般に公知である。例えば、殺虫タンパク質のアミノ酸配列変異体は、DNAにおける突然変異によって調製することができる。これは、また、いくつかの形態の突然変異誘発の一つによって、かつ/又は定方向進化で達成することができる。いくつかの局面では、アミノ酸配列にコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を与えない。そのような変異体は、所望の(又は改善された)殺虫活性を有する。しかし、殺虫タンパク質が殺虫活性を付与する能力を、本発明の組成物にそのような技法を使用することによって改善できることが理解されている。例えば、DNA複製の間に高率の塩基の誤取込みを示すXL-1 Red(Stratagene、La Jolla, CA)などのホスト細胞を用いて殺虫タンパク質を発現させることができる。そのような株で増殖後に、(例えばプラスミドDNAを調製することによって、又はPCRによって増幅し、結果として生じたPCRフラグメントをベクターにクローニングすることによって)DNAを単離し、非突然変異誘発株で殺虫タンパク質突然変異を培養し、そして例えば殺虫活性を試験するためにアッセイを行うことによって、殺虫活性を有する突然変異遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質を混合して摂食アッセイに使用する。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。そのようなアッセイには、植物を1種類又は複数種類の害虫と接触させること、及びその植物が生存し、かつ/又は害虫の死滅を引き起こす能力を決定することが含まれうる。毒性増加を招く突然変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見出される。
本発明の殺虫配列は、関心が持たれる植物に発現させるための発現カセットの中に提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞におけるオープンリーディングフレームからタンパク質の発現をもたらすことができるDNA構築物が意図される。典型的には、これらはプロモーター及びコード配列を有する。多くの場合に、そのような構築物は、3’非翻訳領域も有する。そのような構築物は、クロロプラスト(又は他の色素体)、小胞体、又はゴルジ装置などのある種の細胞内構造へのペプチドの共翻訳又は翻訳後輸送を促進する「シグナル配列」又は「リーダー配列」を有することがある。
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを伴う。「導入する」とは、ヌクレオチド構築物が植物の細胞内部に到達するようにその構築物を植物に提示することが意図される。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法が使用されることを必要とせず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも1個の細胞内部に到達することだけを必要とする。非限定的に安定トランスフォーメーション法、一過性トランスフォーメーション法、及びウイルス介在法を含めた、植物にヌクレオチド構築物を導入するための方法は、当技術分野において公知である。
植物細胞に異種外来DNAを導入後、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質及び代謝物の分析などの様々な方法によって、植物ゲノムにおける異種遺伝子のトランスフォーメーション又は組み込みを確認する。
本発明の別の局面では、殺虫活性を有する殺虫タンパク質を発現しているトランスジェニック植物を作出することができる。一例としてトランスジェニック植物を作出するために上記方法を利用することができるが、トランスジェニック植物細胞が作出される方式は、本発明に重要ではない。Agrobacterium介在性トランスフォーメーション、バイオリスティックトランスフォーメーション、及び非パーティクル介在法などの、当技術分野において公知又は記載の方法を実験者の自由裁量で使用することができる。殺虫タンパク質を発現している植物は、当技術分野で記載されている通常法によって、例えばカルスのトランスフォーメーション、トランスフォーメーションされたカルスの選択、及びそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生によって、単離することができる。そのようなプロセスでは、植物細胞におけるその遺伝子の発現がトランスフォーメーションされた細胞を同定又は選択する能力を付与する限り、選択マーカーとして任意の遺伝子を使用することができる。
殺虫剤防除に、又は殺虫因子として他の生物を操作することに、本発明のヌクレオチド配列又はその変異体を含む株を採用する一般法は、当技術分野において公知である。例えば米国特許第5,039,523号及びEP0480762A2を採用されたい。
コムギ:Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム(army worm);Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ;Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Agrotis orthogonia、ウエスタンカットワーム(western cutworm);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Oulema melanopus、シリアルリーフビートル;Hypera punctata、クローバーリーフウィービル(clover leaf weevil);Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム;ラッシャンウィートアフィド(Russian wheat aphid);Schizaphis graminum、グリーンバグ(greenbug);Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインアフィド(English grain aphid);Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー(differential grasshopper);Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー;Mayetiola destructor、ヘシアンフライ(Hessian fly);Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ(wheat midge);Meromyza americana、ウィートステムマゴット(wheat stem maggot);Hylemya coarctata、ウィートバルブフライ(wheat bulb fly);Frankliniella fusca、タバコスリップス(tobacco thrips);Cephus cinctus、ウィートステムソーフライ(wheat stem sawfly);Aceria tulipae、ウィートカールマイト(wheat curl mite);ヒマワリ:Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス(sunflower bud moth);Homoeosoma electellum、サンフラワーモス(sunflower moth);zygogramma exclamationis、サンフラワービートル(sunflower beetle);Bothyrus gibbosus、キャロットビートル(carrot beetle);Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ(sunflower seed midge);ワタ:Heliothis virescens、コットンバッドワーム(cotton budworm);Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(cotton bollworm);Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ(beet armyworm);Pectinophora gossypiella、ワタアカミムシ(pink bollworm);Anthonomus grandis、ワタミハナゾウムシ(boll weevil);Aphis gossypii、ワタアブラムシ(cotton aphid);Pseudatomoscelis seriatus、コーンフリーホッパー(cotton fleahopper);Trialeurodes abutilonea、バンデドウイングドホワイトフライ(bandedwinged whitefly);Lygus lineolaris、サビイロカスミカメムシ(tarnished plant bug);Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー;Thrips tabaci、ネギアザミウマ(onion thrips);Franklinkiella fusca、タバコスリップス;Tetranychus cinnabarinus、カーマインスパイダーマイト;Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト;
イネ:Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー(sugarcane borer);Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ;Colaspis brunnea、グレープコラプシス(grape colaspis);Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ(rice water weevil);Sitophilus oryzae、ココクゾウムシ(rice weevil);Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ(rice leafhopper);Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ;Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ(green stink bug);ダイズ:Pseudoplusia includens、ソイビーンルーパ(soybean looper);Anticarsia gemmatalis、ベルベットビーンキャタピラー(velvetbean caterpillar);Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム(green cloverworm);Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー(European corn borer);Agrotis ipsilon、タマナヤガ;Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ;Heliothis virescens、コットンバッドワーム;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ;Epilachna varivestis、インゲンテントウ(Mexican bean beetle);Myzus persicae、モモアカアブラムシ(green peach aphid);Empoasca fabae、ジャガイモヒメヨコバイ(potato leafhopper);Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ;Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー;Hylemya platura、シードコーンマゴット;Sericothrips variabilis、ソイビーンスリップス(soybean thrips);Thrips tabaci、ネギアザミウマ;Tetranychus turkestani、ストロベリースパイダーマイト(strawberry spider mite);Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト;オオムギ:Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー;Agrotis ipsilon、タマナヤガ;Schizaphis graminum、グリーンバグ;Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ;Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ;Euschistus servus、ブラウンスティンクバグ(brown stink bug);Delia platura、タネバエ;Mayetiola destructor、ヘシアンフライ;Petrobia latens、ブラウンウィートマイト(brown wheat mite);アブラナ:Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ(cabbage aphid);Phyllotreta cruciferae、フリービートル(Flea beetle);Mamestra configurata、バーサアーミーワーム(Bertha armyworm);Plutella xylostella、コナガ(Diamond-back moth);Delia ssp.、ルートマゴット(Root maggot)が含まれる。
穀物用除草剤:イソプロツロン、ブロモキシニル、イオキシニル、フェノキシ類(Phenoxies)、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルロキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ヨードスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリナフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロン、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトール(Pyrasulfotole)、ピロックススラム、フルフェナセット、トラルコキシジム、ピロキサスルホン;穀物用殺真菌剤:カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシムメチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン(Fluoxastrobin);穀物用殺虫剤:ジメトエート、λ−シハルトリン(cyhalthrin)、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン(Dinetofuran)、クロルピリホス(Clorphyriphos)、メタミドホス、オキシデメトン(Oxidemethon)メチル、ピリミカーブ、メチオカルブ;トウモロコシ用除草剤:アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、(S−)ジメテナミド、グルフォシネート、グリフォセート、イソキサフルトール、(S−)メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン(Thiencarbazone)、フルフェナセット、ピロキサスルホン;トウモロコシ殺虫剤:カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス(Terbufos)、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン(Triflumoron)、テフルトリン、テブピリンホス、エチプロール、Cyazypyr、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト;トウモロコシ用殺真菌剤:フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン;
イネ用除草剤:ブタクロールプロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマズスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、プリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン;イネ用殺虫剤:ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロクス、イサゾホス、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオルエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ;イネ用殺真菌剤:チオファネートメチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル(Tiadinil);ワタ用除草剤:ジウロン、フルオメツロン、MSMA、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリフォセート、ノルフルラゾン、ペンディメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルフォシネート、フルミオキサジン、チジアズロン;ワタ用殺虫剤:アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、γシハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオルエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール、プロフェノホス(Profenophos)、トリアゾホス(Thriazophos)、エンドスルファン;ワタ用殺真菌剤:エトリジアゾール(Etridiazole)、メタラキシル、キントゼン;
ダイズ用除草剤:アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S−)メトラクロル、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルフォシネート;ダイズ用殺虫剤:λ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ(Thiocarb)、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ及びλシハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオルエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン(Spinodiclofen)、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン;ダイズ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール;テンサイ用除草剤:クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ;テンサイ用殺虫剤:イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ/λシハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオルエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、テフルトリン、リナキシピル、Cyaxypyr、フィプロニル、カルボフラン;カノーラ用除草剤:クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルフォシネート、グリフォセート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム;カノーラ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン;カノーラ用殺虫剤:カルボフラン、有機リン酸エステル、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、γ−及びλ−シハロトリン、τ−フルバレリエート(Fluvaleriate)、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオルエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オンが含まれる。
植物の収量を増加させる方法が提供される。その方法は、本明細書に開示された殺虫配列を含むポリヌクレオチドを植物又は植物細胞に導入することを含む。本明細書に定義されるように、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの質及び/又は量を表す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物が意図される。バイオマス産生の増加は、測定された植物産物の収量における任意の改善である。植物の収量増加は、いくつもの商業的な用途がある。例えば、植物葉バイオマスを増加させることで、ヒト又は動物が消費するための葉物野菜の収量を増加させることができる。追加的に、葉バイオマスの増加は、植物由来医薬品又は工業製品の生産を増加させるために用いることができる。収量の増加は、殺虫配列を発現していない植物に比べて、非限定的に収率の少なくとも1%の増加、少なくとも3%の増加、少なくとも5%の増加、少なくとも10%の増加、少なくとも20%の増加、少なくとも30%の増加、少なくとも50%の増加、少なくとも70%の増加、少なくとも100%の増加又はそれよりも大きな増加を含めた任意の統計的に有意な増加を含みうる。
実施例1. 発現構築物
pAX5510は、pRSF1b1ベクターシステム(Invitrogen)ベースの発現ベクターである。このベクターは、E. coli細胞におけるT7プロモーター(例えば、BL21:DE3株における)の転写誘導が、N末端にHisタグを有するcry−R1タンパク質(配列番号2、GENBANK(登録商標)アクセッション番号POA379に記載された配列に対応)の蓄積を招くように、T7プロモーター下流にオープンリーディングフレーム 配列番号1(本明細書においてaxmi−R1と呼ばれ、GENBANK(登録商標)アクセッション番号POA379に記載された配列をコードする)を有する。
ウエスタンコーンルートワーム及びサザンコーンルートワームの卵(それぞれDiabrotica virgifera及びDiabrotica undecimpunctata)(Crop Characteristics, MN)を洗浄し、孵化近くまで25℃でインキュベーションした。以前に記載されたように、溶かした人工飼料を調製し(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,351,881号)、24ウェル組織培養プレート(Corning 3527)中に1ml分量ずつ入れ、1時間放冷した。いったん固化したならば、40μlの試料を各ウェルに入れ、試料に拡散させた。試料が吸収された後で、7.5μlの卵:0.15%の寒天スラリー(ウェル1個あたりルートワームの卵約25個)を各ウェルの端に加え、乾燥させた。いったん乾燥したならば、プレートをBREATHE-EASY(登録商標)気体透過性メンブラン(Research Products International)で密封し、暗グロースチャンバー(25℃、90%の相対湿度(RH))の中に置いた。
第一世代の点突然変異ライブラリー(PMライブラリー1、PM1)は、28個の位置を含む配列番号2の4領域をターゲティングした。テンプレートとしてpAX5510を使用して、いくつかの個別の位置をQUIKCHANGE(登録商標)部位特異的突然変異誘発キットを使用して無作為化し、多数の変異体のDNA配列を決定した。DNA配列の分析によって、所望の変異をプールし、一方で望まれないクローン(野生クローン、重複する突然変異体及びフレームシフト突然変異体など)を除去した。294種類の独特な変異体をPMライブラリー1から同定し、さらなる試験に供した。
316位の有利な突然変異を154及び160位の有利な突然変異と組み合わせた変異体を生成させ、プロセシング及びレセプター認識に累積的な改善を提供する突然変異の組み合わせを同定した。表3は、そのような試験の結果を一覧したものであり;バイオアッセイのデータは、組み合わせ突然変異体P160I;G316T(H9+D5D8)及びP160F;G316T(H4+D5D8)が活性に累積的な改善を提供することを示している。H9+D5D8をコードするヌクレオチド配列を配列番号7に示し、アミノ酸配列を配列番号8に示す。H4+D5D8についてのアミノ酸配列を配列番号26に示す。
残基316における突然変異からPMライブラリー1(PM1)において改善された殺虫活性が生成したと仮定して、配列番号2に関する313、314、315、317、及び318位について第二の点突然変異ライブラリー(PMライブラリー2、PM2)を生成させた。このライブラリーは、計算上61種の変異体という多様性を有する。92種の変異体をアッセイし、316位に隣接する5種の変異体(R315F、R315M、R315W、Y317E、Y317N)は、一次選別で幾分改善を示した。変異体R315M及びR315Wをスケールアップし、125〜250μg/mlの範囲のタンパク質濃度でアッセイした。データは、315位の変更がCRWに対して改善された活性を生成できることを示している。
154、155、158及び160位をターゲティングする並べ替え突然変異誘発ライブラリーを生成させた。このライブラリー(ライブラリーP1;P1)を、当技術分野で公知のオリゴ特異的突然変異誘発法を用いて生成させ、768種の変異体という理論的複雑性を有するライブラリーが生じた。ライブラリーに組み入れられた多様性は、以下の通りである:
本明細書記載のスケールアップ実験のために、所望の活性を示すP1由来のいくつかの変異体を選択した。結果として生じたタンパク質を、125〜250μg/mlの範囲のタンパク質濃度で試験した。いくつかの変異体は、これらのアッセイにおいてWCRW及びSCRWを死滅させる能力を示したが、対照タンパク質AXMI−R1wtは、これらのアッセイにおいてWCRWにもSCRWにも致死性を示さなかった。
3c7(P154A、V155K、P160V)と、ライブラリーPM1からの変異体D5D8(G316T)とを組み合わせた変異体を生成させ、CRW活性について試験したが、この変異体は、125〜250μg/mlの範囲のタンパク質濃度でWCRW及びSCRWに対して致死性を示した。3c7+D5D8変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号9に、アミノ酸配列を配列番号10に示す。
第二世代の点突然変異ライブラリー(PM2)を生成させ、482及び483位における変更を315及び316位における変更と組み合わせた。このライブラリーは、756個の変異体を有する。1100個を超えるクローンを釣り上げ、活性について試験した。変異体「1g8」(G316E、Q482L、G483K)及び「2b11」(G316A、Q482L、G483K)は、AXMI−R1に比べてルートワーム害虫に対して改善された活性を示すことが見出された。変異体1g8は、大部分の場合で3c7よりも優れた活性を示した。1g8変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号14に、アミノ酸配列を配列番号15に示す。
AXMI−R1の481〜486位(本明細書において「ループ3」と呼ぶ)に対応する位置における変異体のライブラリー(ライブラリーP3)を生成させた。殺虫活性への各残基の寄与を評価するために個別のクローンを試験した。残基482及び483における変異体がコーンルートワームに対して改善された活性を示したので、これらの残基は活性に寄与することが見出された(表12)。
プロセシング領域についての第二世代の置換ライブラリーをAXMI−R1(1g8)(配列番号15)にクローニングすることによって、レセプター結合領域に突然変異を有する変異体AXMI−R1(1g8)に関連してプロセシング領域における多様性を選別することを可能にした。そのライブラリーの多様性は573である。変異体(n=813)をスクリーニングし、163個のクローンを再アッセイし、40個の変異体をスケールアップした。AXMI−R1(EVO23)(配列番号17)は、そのライブラリーの中で最高の活性を有した。AXMI−R1(EVO23)をコードするヌクレオチド配列を配列番号16に示す。WCRWに対するEVO23の活性を表13に示す。
axmi−R1のモデル化は、ドメイン2とドメイン3との界面に寄与する三つの領域を同定した。これらの領域は、配列番号2の331〜335位、368〜373位、及び518〜524位に対応する。これらの領域をターゲティングする変異体ライブラリーを生成させた。518〜524位に対応するライブラリーの多様性は8であった(表14)。12個の変異体をスクリーニングし、L61E11を再アッセイ及びスケールアップした。
プロセシング、レセプター結合及び活性を改善するために、有利な突然変異を有するAXMI−R1配列セグメントを他の相同Cryタンパク質に挿入することができよう。例えば、プロセシング領域にわたる、進化したAXMI−R1変異体からの配列セグメントを使用して、axmi008、axmi028、及び他のCryタンパク質における相同領域を交換することができよう。Cryタンパク質の3Dフォールディングは保存されているので、雑種タンパク質のプロセシング及び効力の改善を達成することができる。これらのAXMI−R1変異体配列のさらなる突然変異誘発により、ホストタンパク質に関連したAXMI−R1変異体配列を適合及び改善することを助けることができる。
殺虫タンパク質を産生する能力について本発明のヌクレオチド配列を試験することができる。殺虫タンパク質が害虫に対して殺虫剤として作用する能力は、多くの場合にいくつかの方法で評価される。当技術分野において周知の一方法は、摂食アッセイを行うことである。そのような摂食アッセイでは、被験化合物又は対照試料のいずれかを含有する試料に害虫を曝露する。多くの場合に、これは被験物質又はそのような物質を適切に希釈したものを、害虫が摂取する人工飼料などの物質の上に置くことによって行われる。被験物質は、液体、固体、又はスラリーから構成されることがある。被験物質を、表面上に置き、次に乾燥させることができる。又は、被験物質を溶けた人工飼料と混合し、次にアッセイチャンバーに分注することができる。アッセイチャンバーは、例えば、カップ、ディッシュ、又はマイクロタイタープレートのウェルのことがある。
本発明のコード領域を、植物において発現させるために適切なプロモーター及びターミネーター配列と接続する。そのような配列は当技術分野において周知であり、それらには、単子葉植物における発現用のイネアクチンプロモーター又はトウモロコシユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現用のArabidopsis UBQ3プロモーター又はCaMV 35Sプロモーター、及びnos又はPinIIターミネーターが含まれる。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を産生及び確認するための技法もまた、当技術分野において周知である。
トウモロコシ穂を最良には受粉の8〜12日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが0.8〜1.5mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。DN62A5S培地(3.98g/L N6塩類;1mL/L(1000×原液使用)N6ビタミン類;800mg/L L−アスパラギン;100mg/Lミオイノシトール;1.4 g/L L−プロリン;100mg/Lカザミノ酸;50g/Lスクロース;1mL/L(1mg/mL原液使用)2,4−D)などの適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔く。しかしながら、DN62A5S以外の培地及び塩類は、当技術分野において適切かつ公知である。胚を25℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。
穂を最良には受粉の8〜12日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが0.8〜1.5mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔き、25℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。胚を、Tiプラスミド介在性伝達のために適切なベクターを有するAgrobacterium株と約5〜10分間接触させ、次に共培養培地上に約3日間(25℃の暗条件)蒔く。共培養後に、外植片を回復期培地に約5日間(25℃の暗条件)移植する。利用する特定の選択の性質及び特徴に依存して、外植片を選択培地中で最大8週間インキュベーションする。選択期間の後に、結果として生じたカルスを成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移植する。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野で公知のような再生過程を開始させる。
Claims (36)
- 変異Cry3アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むリコンビナント核酸分子であって、
該変異体が、配列番号2の316位のアミノ酸に対応する位置がグルタミン酸残基で、配列番号2の482位のアミノ酸に対応する位置がロイシンで、配列番号2の483位のアミノ酸に対応する位置がリジンである、改変された配列番号2の配列を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナント核酸分子。 - 前記リコンビナント核酸分子が、配列番号15、17又は38の配列との配列同一性が少なくとも95%あるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のリコンビナント核酸分子。
- 前記リコンビナント核酸分子が、Coleoptera害虫に対する殺虫活性を有する、請求項1又は2記載のリコンビナント核酸分子。
- 前記リコンビナント核酸分子が、ルートワーム害虫に対する殺虫活性を有する、請求項1〜3のいずれか記載のリコンビナン
ト核酸分子。 - 前記ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項4に記載のリコンビナント核酸分子。
- ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計された合成配列である、請求項1〜5のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
- ヌクレオチド配列が、植物細胞における該ヌクレオチド配列の発現を指令可能なプロモーターに作動可能に連結している、請求項1〜6のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
- 請求項1〜7のいずれか記載の核酸分子を含むベクター。
- 異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項8記載のベクター。
- 請求項8又は9記載のベクターを含むホスト細胞。
- 細菌ホスト細胞である、請求項10記載のホスト細胞。
- 植物ホスト細胞である、請求項10記載のホスト細胞。
- 請求項12記載のホスト細胞を含むトランスジェニック植物。
- トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナから成る群より選択される、請求項13記載のトランスジェニック植物。
- 請求項1〜7のいずれか記載の核酸分子を含む種子。
- 変異Cry3アミノ酸配列を含むリコンビナントポリペプチドであって、該変異体が、配列番号2の316位のアミノ酸に対応する位置がグルタミン酸残基で、配列番号2の482位のアミノ酸に対応する位置がロイシンで、配列番号2の483位のアミノ酸に対応する位置がリジンである、改変された配列番号2の配列を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナントポリペプチド。
- 前記リコンビナントポリペプチドが、配列番号15、17又は38の配列との配列同一性が少なくとも95%あるアミノ酸配列を含む、請求項16記載のリコンビナントポリペプチド。
- 前記リコンビナントポリペプチドが、Coleoptera害虫に対する殺虫活性を有する、請求項16又は17記載のリコンビナントポリペプチド。
- 前記リコンビナントポリペプチド、ルートワーム害虫に対する殺虫活性を有する、請求項18記載のリコンビナントポリペプチド。
- 前記ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項19に記載のリコンビナントポリペプチド。
- 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項16〜20のいずれか記載のポリペプチド。
- 請求項16記載のポリペプチドを含む組成物。
- 粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、及び溶液から成る群より選択される、請求項22記載の組成物。
- Bacillus thuringiensis細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮によって調製される、請求項22又は23記載の組成物。
- 約1重量%〜約99重量%のポリペプチドを含む、請求項22〜24のいずれか記載の組成物。
- Coleoptera害虫集団を請求項16記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させることを含む、該集団を防除する方法。
- Coleoptera害虫を請求項16記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させること、又は該害虫に殺虫有効量の該ポリペプチドを摂食させることを含む、該害虫を死滅させる方法。
- 請求項8記載のベクターを含むホスト細胞を培養することを含む、Coleoptera害虫に対して殺虫活性を有するポリペプチドを産生させる方法。
- 変異Cry3アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むDNA構築物がゲノムに安定的に組み入れられた植物であって、該変異体が、配列番号2の316位のアミノ酸に対応する位置がグルタミン酸残基で、配列番号2の482位のアミノ酸に対応する位置がロイシンで、配列番号2の483位のアミノ酸に対応する位置がリジンである、改変された配列番号2の配列を含み、かつ殺虫活性を有する、植物。
- 前記植物が、配列番号15、17又は38の配列との配列同一性が少なくとも
95%あるアミノ酸配列を含む、請求項29記載の植物。 - 前記植物が、Coleoptera害虫に対する殺虫活性を有する、請求項29又は30記載の植物。
- 前記植物が、ルートワーム害虫に対する殺虫活性を有する、請求項31記載の植物。
- 前記ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項32記載の植物。
- 植物が、植物細胞である、請求項29〜33のいずれか記載の植物。
- 変異Cry3アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を植物又はその細胞において発現させることを含む、植物を害虫から保護する方法であって、該変異体が、配列番号2の316位のアミノ酸に対応する位置がグルタミン酸残基で、配列番号2の482位のアミノ酸に対応する位置がロイシンで、配列番号2の483位のアミノ酸に対応する位置がリジンである、改変された配列番号2の配列を含み、かつ殺虫活性を有する、方法。
- 前記変異体が、配列番号15、17又は38の配列との配列同一性が少なくとも
95%あるアミノ酸配列を含む、請求項35記載の方法。
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