JPH08504172A

JPH08504172A - 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法

Info

Publication number: JPH08504172A
Application number: JP6502307A
Authority: JP
Inventors: ジー．カスプルジク，フィリップ; アール．キング，チャールズ
Original assignee: オンコロジクス，インコーポレイティド
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1992-10-21
Publication date: 1996-05-07
Also published as: AU3773393A; CA2120745A1; EP0655924A4; KR950700075A; KR100269879B1; AU687346B2; EP0655924A1; WO1994000136A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、悪性細胞かgp185^erbB-2を過剰発現しているところのヒト悪性腫瘍を予防及び治療することかできる少なくとも２つのモノクロナール抗体の組み合わせ物に関する。本組み合わせ物のモノクロナール抗体は、erbB-2のgp185発現生成物の異なるエピトープを認識し、それ故、この抗体は、互いに交差反応しない。好ましくは、本組み合わせ物は、erbB-2遺伝子の発現生成物を減少させる。他の態様においては、本組み合わせは、gp185発現生成物のチロシン・リン酸化を本質的に増加させない。

Description

【発明の詳細な説明】抗-erbB-2モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法本出願は、腫瘍を予防し且つ治療することができるモノクロナール抗体の組み合わせ物（combination）に関する。さらに特に、本モノクロナール抗体は、腫瘍を予防し且つ治療することができる単一鎖のモノクロナール抗体である。このerbB-2遺伝子（HER-2又はneuともいう）の増幅及び／又は過剰発現は、er bBのmRNA及び蛋白の過剰発現をもたらし、そして、胸部（1-5）、卵巣（3）、肺（6）及び胃（7）の腺癌（Adenocarcinoma）の20-30％内であることが証明されている。２系統の証拠は、ヒト腫瘍形成（neoplasia）の病因におけるerbB-2の過剰発現を巻き込んでいる、第一に、過剰発現が、胸部（8-11）、卵巣（12）、胃（13）、及び肺癌（14）における不十分な予知（poor prognosis）と結びついており、過剰発現がその癌細胞を変更するということを示している。第二に、er bB-2の人工的過剰発現がNIH/3T3繊維芽細胞（15,16）並びに***の上皮細胞（17 ）内で形質転換された表現型を誘発し、過剰発現が有害な表現型の発展に直接的に寄与することができるということを示唆している。 gp185^erbB-2と上皮成長因子レセプタ（EGFR）との間の広範な相同性により、それらの活性化が類似の機構を通して進行するかもしれないということが広く推定されている。１つのこのような機構は、レセプタのダイマー化／オリゴマー化（dlmerization/oligomerization）であって上記のEGFR内因性チロシン・キナーゼ機構の活性化における重要な段階であると考えられているものを含む（18,19 ）。レセプタ−レセプタ相互作用による妨害は、erbB-2過剰発現による癌の治療に対する可能性のある治療的アプローチとして評価されている。先行の研究は、癌の治療のための可能性のある治療剤としての、erbB-2（20）及び関連上皮成長因子レセプタ（EGFR）蛋白（21）に対して向けられた単一のモノクロナール抗体の使用を評価している。可能性のある治療剤として評価されているerbB-2に対して向けられた単一のモノクロナール抗体の使用は、チロシン・キナーゼ（tyrosine klnase）の活性における増加を原因とする、増加されたgp185^erbB-2の自動リン酸化をもたらしている。単一抗体剤は、可能性のある抗癌治療としての約束を示した（20,27）。発明の要約出願人の発明の１つの目的は、悪性細胞がgp185^erbB-2を過剰発現しているヒトの悪性腫瘍（malignancies）を治癒し又は防止することかできる少なくとも２つのモノクロナール抗体の組み合わせ物に関する。本組み合わせ物は、少なくとも第一抗体及び第二抗体であってそれぞれがerbB-2のgp185細胞外ドメインを認識するものを含んで成る。本組み合わせ物抗体の治療により証明された活性は、同一の全体的な抗体濃度におけるその個々の抗体の合計により予測されるよりも大きな活性を示している。本発明の他の目的は、単一鎖モノクロナール抗体であるモノクロナール抗体の使用を提供する。本単一抗体は、２特異的（bispecific）抗体を作るために使用されることができる。図面の詳細な説明図1A．モノクロナール抗体#21及び#23の特異性。サブ集密（Subconfluent）SK -Br-3単層を、35S-Cysにより代謝的に標識した（比活性（spec.act.）1000Ci/mm ol）。細胞蛋白の全てを、10μgの上記抗体のにより免疫沈降させた。この免疫複合体を、プロテインGアガロース（G enex，Galthersburg，MD）により回収し、そして8-16%のTris-グリシン・ゲル上のSDS-PAGEにより分析した。このゲルを、増感スクリーンにより-70℃において一夜フィルムに露出させた。図1B．胃細胞系N87におけるgp185^erbB-2過剰発現並びに高い及び低いgp185^erb ^B-2 過剰発現体（overexpressers）と比較したN87マウス異種移植片からの腫瘍。細胞又は腫瘍を、サンプル・バッファーであって0.125M Tris-HCl、4%SDS、0.00 2%ブロモフェノール・ブルー、及び15%グリセロールを含むものの中で溶菌させた。その蛋白濃度を測定した後に、5%β-メルカプトエタノールを添加した。サンプル（10μgの全蛋白）を、３分間沸騰させ、8-16%Tris-グリシン・ゲル上のS DS-PAGEにより分画し、そしてニトロセルロースに移した。gp185^erbB-2の検出を、その蛋白のc-末端部分に対するモノクロナール抗体により行った。図1C．N87（胃）、SK-Br-3（胸部）、及ひSK-OV-3（卵巣）細胞系及びヒト胎盤（placenta）内のerbB-2遺伝子のサザン・ブロット分析。DNAを、細胞系及びヒト胎盤組織からグアニジン・チオシアネート（guanidine thiocyanate）及びセシウム・グラジエント遠心分離を使用して抽出した。DNA（15μg）を、制限酵素HindIIIにより解裂させ、１%アガロース・ゲル上の電気泳動により分離し、ニトロセルロースに転移させ、そして放射性erbB-2 cDNAプローブにより先に記載されているように（26）プローブした。このcDNAプローブは、完全なerbB-2蛋白コード領域に一致する。図２．単層MTT増殖検定におけるヒトN87胃腫瘍細胞の増殖に対するAb#21及びA b#23の効果。10,000細胞/wellの単一細胞懸濁液を、インシュリン（Insulin）（５μg/ml）、ヒト・トランスフェリン（tra nsferrin）（10μg/ml）、17-β-エストラジオール（estradiol）（10nM）、亜セレン化ナトリウム（sodium selenite）（５nM）、及び10mM Hepesを補われたR PMI-1640から成る化学的に定められた培地内に入れた。所定の濃度においてPBS 、Ab#21、Ab#23又はAb#21とAb#23との組み合わせを、次に添加した。このプレートを、５%CO₂加湿雰囲気中で37℃において培養した。７日後、50μlの3-（4,5- ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド（ 0.1mg）を添加し、そして37℃において４時間インキュベートに供した。この培地の90%を、次に取り除き、そしてその結晶を、0.175ml DMSO中で可溶化した。吸光度を、Molecular Devices Vmax kinetic microplate reader内で540nmにおいて測定した。結果は、標準偏差を伴った８つのwellの平均である。使用した条件の下で、その細胞数は、MTT減少に正比例している。図3A．BNXマウスにおけるN87腫瘍異種移植片の増殖に対する、Ab#21（）、A b#23（）、Ab#21とAb#23（）との組み合わせによる治療、又はPBSの効果。腫瘍細胞（５ｘ10⁶／マウス）を、BNX（ベージュ（beige）、ヌード（nude）、x id）マウスのわき腹（flanks）中に皮下注射した。１日目に開始された治療は、４つの試験群（群当たり３マウス）から成り、それぞれに、３週間にわたり、それぞれの１週間に２回ずつ、PBS（）、200μg精製Ab#21（0）、200μg精製Ab# 23（0）、又は100μg精製Ab#21と100μg精製Ab#23（）との混合物を、腹膜中に注射した。腫瘍の増殖を、平均相対腫瘍容量、s.e.m.±15%として報告する。この実験の２回の繰り返しは、同じ結果を与えた。図3B．小腫瘍の形成後の治療の効果。細胞を、上記と同じ治療手順を使用して注射した。但し、その治療を、１日目の代わりに細胞注射後４日目に開始したという事実を除く。動物の世話を、制度化合物されたガイドラインに従って行った。図4A．erbB-2蛋白回転率（turnover）に対する抗体結合の効果。サブ集密N87 細胞単層を、20μCiの³⁵S-システインにより１時間パルス標識し、そして次にAb #21単独、Ab#23単独、又はAb#21とAb#23との1:1の組み合わせ（10μg/ml）の存在中で24時間、５mM Cysによりチェース（chased）した。全細胞蛋白を、Sephar oseに結合したgp185^erbB-2のC-末端に対して向けられたモノクロナール抗体を使用して図１中に記載したように免疫沈降させ、そしてSDS-PAGEにより分析した。このゲルを、増感スクリーンにより-70℃において一夜フィルムに露出させた。図4B．抗体組み合わせ物とのインキュベーション後のgp185^erbB-2-2のチロシン・リン酸化（tyrosine phosphorylation）の測定。細胞を、図4A中のようにプレートした。１時間後、細胞を、図IB中のように処理した。この蛋白を、ニトロセルロース紙上にエレクトロブロットし、そして抗-ホスホチロシンIgG（ポリクロナール、Upstate Biotechnology，Inc.）と共にインキュベートし、そしてECL ウェスタン・ブロッティング検出装置（Amersham）を使用して免疫検出した。このフィルムを、室温において５分間露出させた。図５．単層MTT増殖検定におけるヒトCalu-3肺腺癌（adenocarcinoma）腫瘍細胞の増殖に対するAb#21及びAb#23の効果。10,000細胞/wellの単一細胞懸濁液を、インシュリン（５μg/ml）、ヒト・トランスフェリン（10μg/ml）、17-β-エストラジオール（10nM）、亜セレン化ナトリウム（５nM）、及び10mM Hepesを補われたRPMI-1640から成る化学的に定められた培地内に入れた。所定の濃度においてPBS、Ab#21、Ab#23又はAb#21とAb#23との組み合わせを、次に添加した。このプレートを、５%CO₂加湿雰囲気中で37℃において培養した。７日後、50μlの3 -（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）- 2,5-ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド（0.1mg）を添加し、そして37℃ において４時間インキュベートに供した。この培地の90%を、次に取り除き、そしてその結晶を、0.175ml DMSO中で可溶化した。吸光度を、Molecular Devices Vmax kinetic microplate reader内で54Onmにおいて測定した。結果は、標準偏差を伴った８つのwellの平均である。使用した条件の下で、その細胞数は、MTT 減少に正比例している。図６．単層MTT増殖検定におけるヒトCalu-3肺腺癌腫瘍細胞の増殖に対するAb# 23及びAb#94の効果。10,000細胞/wellの単一細胞懸濁液を、インシュリン（５μ g/ml）、ヒト・トランスフェリン（10μg/ml）、17-β-エストラジオール（10nM ）、亜セレン化ナトリウム（５nM）、及び10mM Hepesを補われたRPMI-1640から成る化学的に定められた培地内に入れた。所定の濃度においてPBS、Ab#23、Ab#9 4又はAb#21とAb#23との組み合わせを、次に添加した。このプレートを、５%CO₂ 加湿雰囲気中で37℃において培養した。７日後、50μlの3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド（0.1mg）を添加し、そして37℃において４時間インキュベートに供した。この培地の90%を、次に取り除き、そしてその結晶を、0.175ml DMSO中で可溶化した。吸光度を、Mo lecular Devices Vmax kinetic microplate reader内で540nmにおいて測定した。結果は、標準偏差を伴った８つのwellの平均である。使用した条件の下で、その細胞数は、MTT減少に正比例している。図７．*一本鎖の抗-erbB2抗体、Ab#23のためのcDNA配列。図８．*一本鎖の抗-erbB2抗体、Ab#21（e22）のためのcDNA配列。発明の詳細な説明本発明の１つの目的は、ヒトの悪性腫瘍を防止し又は治療することができる少なくとも２つのモノクロナール抗体の組み合わせ物であって、その悪性細胞がgp 185^erbB-2を過剰発現しており、そしてその少なくとも２つの異なる抗体のそれぞれがerbB-2のgp185発現生成物の異なるエピトープを認識しており、それ故に、その抗体が互いに交差反応しないような組み合わせ物である。本発明の態様は、その組み合わせ物が、第二に対する第一の得られる比がそのerbB-2遺伝子の発現生成物を減少させることに効果があるように好ましくは組み合わされている第一抗体及び第二抗体を含んで成ることを提供する。erbB-2遺伝子の発現生成物の測定のための便利な方法を、図4A中に見つけることができる。このerbB-2遺伝子生成物の発現における減少は、その細胞内のerbB-2蛋白の半減期を減少させる組み合わせ物の結果である。本発明の他の態様においては、この抗体の組み合わせ物は、gp185発現生成物のチロシンのリン酸化を本質的に増加させない特徴的な特性をもっている。 erbB-2遺伝子の発現生成物を減少させるために必要な活性をもつ第二抗体に対する第一抗体の比の例は、約1:2から約2:1までの比を含んで成る。好ましくは、このような比は、1:1である。しかしながら、本発明は、本明細書中に討議する抗体比に限定されることを意図していない。他の比が効果的であり、そして例として使用した1:1の比よりも高い活性を生じさせることができるという事実は、本発明の範囲内にあるように本発明者により認識され、そして知られている。本組み合わせの活性を、以下のように、図1A-C、２及び3A、B中に例示する。図1A-Cは、N87細胞がerbB-2遺伝子増幅の結果としてgp185 erbB-2蛋白を過剰発現しているとこと証明している。図２は、Ab#21とAb#23との組み合わせ物がインビトロにおいてN87細胞の増殖を抑制することを示している。同様の結果が、ヒトCalu-3肺腺癌の増殖に対して、Ab#23とAb#94との組み合わせ物並びにAb#23とAb#21との組み合わせ物を使用して証明されている（図５及び図６を参照のこと）。図3A及びBは、Ab#21とAb #23との組み合わせ物が免疫不全マウスにおいて腫瘍としてのN87細胞の増殖を抑制し、そして逆転させるところの活性について示している。これらの結果は、本明細書の抗体組み合わせ物の一般的な性質についてを示している。本発明において使用するerbB2遺伝子コード生成物に対する抗体を、キメラ抗体として設計することができる。キメラ抗体は、非ヒト（例えば、ネズミ）起源の可変領域（抗原結合領域）及びヒト起源の定常領域をもっている。それらが優先的にヒトのものであるので、キメラ抗体は、ヒトにおいて、より少ない免疫原性であり、このことは、ヒトへの外来蛋白の投与に関連した問題を克服するのを助けることができる。さらに、本発明の抗体を、遺伝子組換え又は抗体の生産のためのKohler-Milst einのハイブリドーマ法を通して作ることができる。抗体それ自体の断片、同族体又は誘導体をその完全な抗体の代わりに本発明において使用することができるということも認識されている。本発明の他の目的は、一本鎖抗体として設計されたerbB-2遺伝子コード生成物に対する抗体を提供する。一本鎖抗体は、ここで、その抗体の軽可変領域と重可変領域とが互いに結合し一本鎖抗体を形成しているものである。これらの抗体の組み合わせ物が、先に討議したような混合物として組み合わされた抗体を並びに２特異的抗体を作るために組み合わされた抗体を含むということを本明細書中で考慮する。２特異的抗体は、普通には、２つの一本鎖抗体であってそのそれぞれが異なる抗原結合部位を認識するものから成る人工的に作られた抗体である。以下のもの：胸部、卵巣、肺及び胃の腺癌が、本発明を使用して治療又は予防することができるヒトの悪性腫瘍のいくつかの例である。出願人の発明の他の態様は、先に記載したようなヒト悪性腫瘍を予防しそして根絶する（eradicating）ための方法を提供する。この方法は、有効量の抗-erbB -2抗体組み合わせ物を患者に投与し、その腫瘍部位において抗体組み合わせ物の効果的な濃度；例えば、少なくとも１μg/mlの濃度を達成することを含む。好ましくは、腫瘍部位における濃度は、約10μg/mlを超えない。一般的には、腫瘍部位におけるこの組み合わせ物の所望の濃度を達成するために、この組み合わせ物を、約0.1mg/kgから約10mg/kg体重までの投与量において投与する。出願人の発明の他の態様は、本抗体組み合わせ物が受動的な腫瘍の治療において使用されることを提供し、ここで、この抗体組み合わせ物の有効投与量が、ヒト悪性腫瘍過剰発現gp185^erbB-2を患った患者に医薬として許容される担体と共に又はその中で投与される。担体（vehicles）の例は、非毒性バッファー、生理学的な生理食塩水等である。また、出願人の発明は、この抗体組み合わせ物の抗体の中の少なくとも１つがイムノトキシン（immunotoxin）の成分として使用されることを提供する。イムノトキシン治療のために、上記組み合わせ物の中の少なくとも１つの抗体を、抗癌医薬又は細胞毒素（cytotoxin）に結合させ、イムノトキシンを作ることができる。様々の医薬又は細胞毒素剤を、化学的又は遺伝子操作にいよりこの組み合わせ物に結合させることができる。いくつかの有用な治療剤の例は放射性化合物（例えば、ホウ素及びレニウムのアイソトープ）；DNAと結合する剤、例えは、アルキル化剤又は様々な抗体（例えは、ダウノマイシン（daunomysin）、アドリアマイシン（adriamycin）、クロラムブシル（chlorambucil），抗-代謝産物（例えば、メトトレキサート（methotrexate））；及び蛋白合成の阻害剤（例えば、ジフテリア毒素（diphteria toxin）及び毒性植物蛋白）を含む。本組み合わせ物内の抗体の中の少なくとも１つがイムノトキシンに結合しているところの組み合わせ物の使用は、上記の治療効果を増加させるであろう。本明細書中に記載する抗体の組み合わせ物の有効量の患者への投与を、治療されているヒト悪性腫瘍の緩解（regression）又は根絶をもたらすのに十分な時間にわたり慢性的な静脈内投与を介して、達成することができる。また、本組み合わせ物の投与は、その腫瘍部位に本組み合わせ物を直接注射又は直接配達することによりその患者内で達成されることができる。このような投与は、その腫瘍の根絶又は減少をもたらすのに十分な継続時間及び濃度を有するであろう。本発明の範囲は、理論的な根拠のいずれにも限定されることを意図されていないが、以下の理論は、それによりgp185^erbB-2を過剰発現しているヒト悪性腫瘍細胞からのダウン・レギュレート及び保護が上記の２つの抗体の組み合わせにより達成されるところの機構を説明することができる。仮定されている１つの機構は、本２つの抗体組み合わせ物がgp185^erbB-2を活性化コンホメーションになるように強要し、これにより作用薬のリガンド（agon ist ligand）をまねることにより、作用する。本２つの抗体組み合わせ物がそのリガンドをまねる場合には、この組み合わせ物を使用するその後の治療が、増加されたgp185^erbB-2自動リン酸化（autophosphorylation）をもたらすはずである。抗-ホスホチロシン・イムノブロット（anti-Phosphotyrosine immu noblots）を、この仮説をテストするために使用した。図4B中に示すように、N87細胞からのgp185^erbB-2のチロシンのリン酸化における増加は、その抗体組み合わせ物の添加の１又は２時間後には又は治療の24時間目までには、全く観察されなかった。このことは、本抗体組み合わせ物がgp185^erbB-2の自動リン酸化を増加させず、そしてそれ故、そのチロシン・キナーゼの活性を阻害するために作用しないということを示唆している。この結果は、抗-レセプタ抗体の組み合わせ物が単一抗体と異なったそしてより能力のある抗-腫瘍活性を導くことを証明している。さらに特に、結果は、本組み合わせ抗体の治療が、gp185^erbBを過剰発現するヒト悪性腫瘍の治療への有用なアプローチであることを示している。このアプローチは、胃癌、すなわち、最近の全身的な化学療法に対して殆ど反応しない病気の治療において特に重要であることができる。本発明を、さらに、本発明の範囲を限定することを意図されていない以下の例により説明する。例１抗体の調製ヒトerbB-2蛋白の源として、我々は、その表面上にヒトerbB-2蛋白を発現するように操作されたNIH/3T3細胞（N/erbB-2）を使用した。これらの細胞の膜調製物を、２mM Hepes pH7.4中の高張性溶解、5,000x gにおける遠心分離による核の除去、そして100,000x gにおける遠心分離による膜の単離により調製した。マウスを、200μ l中のアジュバントの50:50混合物中の100μgのN/erbB-2膜調製物により免疫化した。アジュバントは、最初の注射のためのFreund's完全、その後のFreund's不完全アジュバントであった。マウスに、４週間にわたり４回の腹膜内注射をした。最後のブーストの１週間後に、血清を得て、そして抗-erbB-2免疫応答を、代謝的に標識された細胞からのgp185 erbB-2蛋白の免疫沈降分析により、存在について決定した。免疫マウスを、次に選択し、そして100μgのN/erbB-2膜調製物によりブーストし、そして標準的な方法に従ってAg8.653ミエローマ細胞との融合を行った。ハイブリッド・クローンの選択は、再び標準的な方法に従って、ヒポキサンチン（hypoxanthine）、アミノプテリン（aminopterin）、及びチミン（thy mine）（HAT）含有培地に対する耐性により行った。抗-erbB-2モノクロナール抗体を分泌するハイブリドーマの同定を、96well皿に付着した抗原N/erbB-2膜蛋白を使用したELISAにより行った。ELISA反応を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-マウス抗体及び標準的な方法を使用して発色させた。抗-erbB-2抗体を分泌するハイブリドーマの集落を、単一細胞クローニング及び先に記載したようなELISAによる陽性サブクローンの同定の２ラウンドに供した。上記の手順を、Ab#21;Ab#23;及びAb#94として名付けた３つのモノクロナール抗体を作るために使用する。 gp185^erbB-2の細胞外ドメインに対して向けられたモノクロナール抗体を、ELI SA検定においてN/erbB-2細胞膜に対する特異的反応についてテストした。増殖検定においてスクリーニングした後にAb#21及びAb#23と名付けられたこれらの中の２つは、最も高い生物活性を示し、そして本研究において使用した。抗体を、大量に腹水液から単離し、そしてGammabind Ultraカラム（genex，Gaithersburg， MD）によるHPLCにより精製した。標準的なSDS-PAGEゲル電気泳動を、coomassieブルー染色を使用して非還元条件下で走らせ、130kdの単一バンドが〉98%精製調製物を示すことを観察した（データを示さず）。両方の抗体は、図1A中に示すように、SK-Br-3細胞（gp185^erbB-2蛋白を過剰発現する胸部細胞系）（22）からのMW185,000の単一の³⁵S-標識蛋白を、特異的に免疫沈降させた。このgp185^erbB-2蛋白を過剰発現しない細胞（例えば、MDA-MB- 468、データを示さず）においては、免疫沈降は全く検出されなかった。これらの細胞の細胞増殖に対する効果を、胃細胞系、すなわちN87であってSK- Br-3と釣り合ったレベルにおいてgp185^erbB-2を過剰発現するものに対して研究した。このN87細胞系の免疫ブロット及びN87からのヌード・マウス腫瘍異種移植片の免疫ブロットを、胸部細胞系SK-Br-3（高レベルのgp185^erbB-2過剰発現）及びMDA-MB-231（低レベルのgp185^erbB-2過剰発現）と比較して図1B中に示す。図1 C中に示すようなN87内のerbB-2遺伝子増幅のレベルは、SK-Br-3及びSK-OV-3細胞系（22）を特徴付けるそのwell中にあるレベルをしのぐ。例２インビトロにおける腫瘍増殖に対する抗体の効果これらの抗体の増殖に対する効果を、半自動比色MIT検定を使用してインビトロにおいて最初に研究した。10,000細胞/wellの単一細胞懸濁液を、インシュリン、ヒト・トランスフェリン、17-エストラジオール、亜セレン化ナトリウム及びHepesを補われたRPMI-1640から成る化学的に定められた培地内にプレーティングした。PBS、Ab#21、Ab#23又はAb#21とAb#23との組み合わせを、次に添加した。この細胞を、５%CO₂加湿雰囲気中で37℃において培養した。７日後、50μlの3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド（MTT試薬）を添加し、そして37℃において４時間インキュベートに供した。この培地の90%を、次に取り除き、そしてその結晶を、DMSO中で可溶化した。吸光度を、molecular devices Vmax kinetic microplat e reader内で540nmにおいて測定した。N87細胞の増殖に対する抗体の効果の投与量応答分析を、図２中に示す。別個に投与された抗体Ab#21又はAb#23は、10μg/ ml（６μM）の濃度まで、細胞の単層増殖に対して全く効果をもっていなかった。しかしながら、Ab#21とAb#23との1:1の組み合わせ物の投与は、１μg/mlと同じ程低い投与量において細胞の増殖に顕著に影響を及ぼした。また、両方の抗体から調製したFabe断片は、単独で又は組み合わせにおいて細胞の増殖に対して全く効果をもっていなかった（データを示さず）。免疫ブロット分析により少し過剰発現を示すか又は全く示さない３つの他の胃細胞系による類似の実験において、最も高い投与量においてさえ増殖抑制は、その抗体の組み合わせ物又はその抗体単独によっては、全く観察されなかった。例３予防的な組み合わせ物抗体による治療組み合わせ物抗体治療の効果を、N87腫瘍異種移植片の増殖に対してテストした。５百万のN87細胞の１つの接種物をヌード・マウス中に皮下注射したことは、短い潜伏期（latency）をもつ速く増殖する腫瘍を作り出した。この注射部位における腫瘍の増殖は、容易に定量化されたあ。図3A中に示すように、このN87 細胞は、３週間にわたり１週間に２回、Ab#21とAb#23との組み合わせ物を含む注射当たり全体として200μgの抗体により処理された動物内で腫瘍を作らなかった。全く反対に、それらは、単一抗体又はPBSにより処理された動物内で潜在的に腫瘍形成性であり、そしてその腫瘍は、測定期間にわたり腫瘍容量内で１cm³を超えるまで成長した。インビトロにおける実験とは反対に、それぞれのモノクロナール抗体単独は、腫瘍増殖の速度を部分的に制限するための限定された活性をもっことができる。しかしなから、この組み合わせ物により示された活性は、その組み合わせ物から予想される累積効果をはるかに超えた。 Ab#21とAb#23とによる組み合わせ物治療が確立された腫瘍を根絶することができるかどうかを決定するために、抗体治療に先立って測定可能なサイズまで腫瘍を増殖させるところの実験を行った。結果を、図3B中に説明する。その腫瘍の出発サイズが同一容量（100mm³）付近であるようにバラバラにされた動物群において、その動物にAb#21又はAb#23の単一抗体処理（200μg/注射、２注射/週、３週、６匹マウス）を与えるときまで腫瘍を成長させた。反対に、Ab#21とAb#23との２つの抗体の組み合わせ物処理を与えられた動物においては、示された結果は、６匹の動物の平均であって、11日後に腫瘍が完全に緩解されていた（200μgの全抗体の４回の処理）。これは、抗-erbB-2モノクロナール抗体の組み合わせ物により誘導体された腫瘍異種移植片緩解の最初に報告された観察である。先行の研究は、２つの抗-neu抗体が、突然変異により活性化されたneu癌遺伝子（oncogen e）により形質転換されたネズミ細胞による腫瘍の増殖を、抑制することができるということを示していた（23）。このネズミneu癌遺伝子の活性化を、そのneu 遺伝子の構造及び機能における質的な妨害により証明されるような点突然変異（ point mutation）により行うのに対して、ヒトerbB-2癌遺伝子は、erbB-2の過剰発現、すなわち、腫瘍形成をもたらす明らかに正常な蛋白の量的な妨害により活性化される。腫瘍増殖にための機構がネズミ（murine）とヒトとの間でかなり異なっているので、関連遺伝子の中和の類似の機構が有効であろう。また、この効果は、抗- トランスフェリン・モノクロナール抗体を使用して白血病腫瘍細胞の抑制と共に見られる（24）。例４抗体組み合わせ物の抗増殖効果 Ab#21及びAb#23の抗増殖効果についての分子的な基礎を調査するために、我々は、抗体の存在又は非存在中でgp185^erbB-2回転率の速度を測定した。N87細胞を、³⁵S-Cysによりパルス-標識し、そして次に様々な時間にわたり単一抗体又はAb #21/Ab#23組み合わせ物の存在中でチェースした。24時間のチェースの結果を、図4A中に示す。この抗体gp185^erbB-2組み合わせ物は、gp185^erbB-2の速い分解を引き起こし、一方、この個々の抗体処理は、効果を全くもたないか又は少しもっていた。このように、Ab#21/Ab#23処理の抗増殖性効果を、gp185^erbB-2の回転率（turnover）を増加させるそれらの能力により説明できるかもしれない。例５ Calu-3細胞の増殖に効果を及ぼす組み合わせ物抗体治療抗-erbB-2抗体Ab#21及びAb#23の組み合わせ物の効果がN87胃癌細胞系に対する効果に限定されないということを証明するために、我々は、ヒト肺腺癌細胞系Ca lu-3について調査した。この細胞は、免疫ブロット検定により決定されるように gp185 erbB-2蛋白を過剰発現する（データを示さず）。先に記載したものと非常に類似した実験において、Ab#21とAb#23との組み合わせ物は、MTT検定において測定したように細胞増殖の劇的な阻害を示している（図５）。この実験においては、10,000細胞/wellの単一細胞懸濁液を、インシュリン、ヒト・トランスフェリン、17-エストラジオール、亜セレン化ナトリウム及びHepesバッファーを補われたRPMI-1640から成る化学的に定められた培地内にプレーティングした。P BS、Ab#21、Ab#23又はAb#21とAb#23との組み合わせを、次に添加した。この細胞を、５%CO₂加湿雰囲気中で37℃において培養した。７日後、MTT試薬を添加し、そして37℃において４時間インキュベートに供した。この培地の90%を、次に取り除き、そしてその結晶を、DMSO中で可溶化した。吸光度を、Molecular Device s Vmax kinetic microplate reader内で540nmにおいて測定した。抗体処理の効果の投与量応答分析を、図５中に示す。この結果は、組み合わせ物抗体の治療が N87細胞又は胃癌細胞に対して効果において限定されていないということを示している。また、組み合わせ物抗体の治療が肺の腺癌の治療において効果をもつことができることを示している。例６細胞増殖の抑制における抗体の他の組み合わせ物の効果 Ab#21及びAb#23が増殖阻害を引き起こすためのそれらの組み合わせの能力においてユニークであるかどうかを決定するために、我々は、インビトロにおけるCa lu-3細胞の増殖に対してAb#94とAb#23との組み合わせ物について調査した。細胞増殖のMTT検定を、例５中に記載したように行った。図６中に示すように、この抗体組み合わせ物は、細胞増殖を抑制し、そして個々の抗体は、抑制しない。このことは、より深い増殖抑制を作り出すために抗体を組み合わせるための能力が特定の抗体の組み合わせに限定されていないということを示している。抗体#21;Ab#23;及びAb#94は、American Type Culture Collection，12301 Par klawn Drive，Rockville，Md．20852，USAに寄託されている。Ab#21は、に寄託され、そしてATCC# を与えられた。Ab#23は、に寄託され、そしてATCC# を与えられた。Ab#94は、に寄託され、そしてATCC# を与えられた。本発明を、それらの特定の態様と一緒に記載したけれども、変更、修正及び変化が先の記載を考慮すれば当業者には明らかであろうとうことは明白である。したがって、本発明は、以下の請求の範囲の最も広い範囲及び核心の中のその後のすべての上記のような変更、修正及び変化を包含することを意図されている。例７ mAb e23からの一本鎖（Fv）の調製ポリA RNAを、オリゴdTアフィニティー・クロマトグラフィー（In vitrogen）を使用してハイブリドーマ細胞から抽出した。cDNAを、ランダム・プライマー（ N₆）（Boerhinger Mannheim）を使用して調製した。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のクローンを、PCR及びプライマーを使用して単離した：軽鎖、5'CAC GTC G AC ATT CAG CTG ACC CAC TCT CCA及びGAT GGA TCC AGT TGG TGC AGC ATC 3'；重鎖5' C GGA ATT TCA GGT TCT GCA GIA GTC WGG 3'及び5' AGC GGA TCC AGG GGC CAG TGG ATA GAC 3'［G、A、C、Tは、標準的なヌクレオチドを表し；Iは、イノシンを表し、Wは、A又はTを表している。］。PCR反応の生成物を、PUC18中にクローン化した。SC（Fv）中への結合は、個々の軽鎖及び重鎖cDNAクローン及び４オリゴヌクレオチドを与えるPCRにより行われた。 5' -cgagatgagtccagctgacccagtctc 5'-gaagatttaccagaaccagaggtagaaccttttatttccagcttgga 5'-ctggttctggtaaatcttctgaaggtaaaggtgtgcagctgcaggag 5'-cgagtgcaagcttaggagacggtgaccgt この軽鎖及び重鎖コード領域を、記載したようなオリゴヌクレオチドを重複させることにより特殊化された合成リンカーGSTSGSGKSSEGKGにより結合した。無傷の scFvコード領域に、ラムダＰ_Lプロモーターの方向の下でフレーム内に大腸菌（E .coli） OMPAリーダー配列を挿入した。蛋白の誘導及びバクテリア溶菌及び再折り畳み（refolding）は、先に記載されたものと同じであった（28）。scFvをCM クロマトグラフィーから単一ピークとして精製し、そしてSDSゲル電気泳動により〉70％であると判断した。例８ mAb e21からのscFvの調製ポリA RNAを、オリゴdTアフィニティー・クロマトグラフィー（In vitrogen）を使用してハイブリドーマ細胞から抽出した。cDNAを、ランダム・プライマー（ N₆）（Boerhinger Mannheim）を使用して調製した。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のクローンを、PCR及びプライマーを使用して単離した：軽鎖、5' CAC GTC GAC ATT CAG CTG ACC CAC TCT CCA及びGAT GGA TCC AGT TGG TGC AGC ATC 3'；重鎖5' C GGA ATT TCA GGT TCT GCA GIA GTC WGG 3'及び5' AGC GGA TCC AGG GG C CAG TGG ATA GAC 3'［G、A、C、Tは標準的なヌクレオチドを表し；Iは、イノシンを表し、Wは、A又はTを表している。］。PCR反応の生成物を、PUC18中にクローン化した。scFv中への結合は、個々の軽鎖及び重鎖cDNAクローン及び４オリゴヌクレオチドを与えるPCRにより行われた。 5'-cgagatgagtccagctgacccagtctc 5'-gaagatttaccagaaccagaggtagaaccttttatttccagcttgga 5'-ctggttctggtaaatcttctgaaggtaaaggtgtgcagctgcaggag 5'-cgagtgcaagcttaggagacggtgaccgt この軽鎖及び重鎖コード領域を、記載したようなオリゴヌクレオチドを重複させることにより特殊化された合成リンカーGSTSGSGKSSEGKGにより結合した。無傷の scFvコード領域に、ラムダP_Lプロモーターの方向の下でフレーム内に大腸菌（E. coli） OMPAリーダー配列を挿入した。蛋白の誘導及びバクテリア溶菌及び再折り畳みは、先に記載されたものと同じであった（28）。scFvをCMクロマトグラフィーから単一ピークとして精製し、そしてSDSゲル電気泳動により〉70%であると判断した。文献１． C.R．King，M.H．Kraus，S.A．Aaronson，Science 229，974 （1985）．２． D.J．Slamon，et al.，science 235，177（1987）．３． D.J．Slamon，et al.，Science 244，707（1989）．４． J．Yokota，et al.，Lancet 1，765（1986）．５． C.R．King，et al.，Cancer Res．49，4185（1989）．６． P.M．Schneider，et al.，Cancer Res．49，4968（1989）．７． J．Park，et al.，Cancer Res．49，6605（1989）．８． C．Wright，et al.，Cancex-Res．49：2087（1989）．９． A.K．Tandon，et al.，J．Clin．Oncol．7，1120（1989）． 10． S．Paik，et al，J．Clin．Oncol. 8, 103（1990）． 11． A．Borg，et al.，Cancer Res．50，4332（1990）． 12． A．Berchuck，et al.，Cancer Res．50，4087（1990）． 13． Y．Yonemura，et al.，Cancer Res．51，1034（1991）． 14． J.A．Kern，et al.，Cancer Res．50，5184（1990）． 15． P.P．Di Fiore，et al.，Science 237，178（1986）． 16． R.M．Hudziak，J．Schlessinger，A．Ullrich，Pro．Natl． Acad．Sci．U.S.A．84，7159（1987）． 17． Pierce，et al.，oncogence，in press． 18． Y．Yarden，A．Ullrich，Biochem．27，3114（19.88）． 19． J．Schlessinger，Biochem．27，3119（1988）． 20． R.M．Hudziak，et al.，Mol．Cell．Biol．9，1165 （1989）． 21． C.R．Divgl，et al.，JNCL 83，97（1991）． 22． M．H．Kraus，N．C．Popescu，S．C．Amsbaugh，C．R．King， EMBO J．6，605（1987）． 23． J.A．Drebin，V.C．Link，M.I．Greene，Ocogene 2，273 （1988）． 24． S．White，et al.，Cancer Res．50，6295（1990）． 25． R．Kumar，H.M．Shepard，J．Mendelsohn，Mol．Cell． Biol．11，979（1991）． 26． C.R．King，et al.，Cancer Res．49，4185（1989）． 27． M.C．Hancock，et al.，Cancer Res．51，4575-4580（1991）． 28． M.W．Pantaliano，et al.，Biochemistry 30，117-125 （1991）．

Claims

【特許請求の範囲】１．悪性細胞がerbB-2を過剰発現しているところのヒト悪性腫瘍を治療又は予防するための抗体組み合わせ物であって：それぞれがerbB-2のgp185発現生成物の異なるエピトープを認識している少なくとも２つの異なるモノクロナール抗体、を含んで成るような抗体組み合わせ物。２．組み合わせ物が：第一及び第二の異なるモノクロナール抗体を含んで成り、そしてerbB-2遺伝子の発現生成物を減少させるような、請求項１に記載の抗体組み合わせ物。３．組み合わせ物がgp185発現生成物のチロシン・リン酸化を本質的に増加させない、請求項２に記載の抗体組み合わせ物。４．抗体組み合わせ物における抗体の中の少なくとも１つがイムノトキシン（im munotoxin）分子に結合している、請求項２に記載の抗体組み合わせ物。５．悪性細胞がerbB-2を過剰発現しているところのヒト悪性腫瘍を患った患者を治療する方法であって：そのヒト悪性腫瘍を患っている患者に、erbB-2のgp185発現生成物の異なるエピトープを認識する少なくとも２つの異なるモノクロナール抗体の組み合わせ物の有効量を、投与することを含んで成るような方法。６．組み合わせ物が：第一及び第二の異なるモノクロナール抗体を含んで成り、そしてerbB-2遺伝子の発現生成物を減少させるような、請求項５に記載の方法。７．組み合わせ物がgp185発現生成物のチロシン・リン酸化を本質的に増加させない、請求項６に記載の方法。８．有効量が腫瘍部位において少なくとも１μg/mlの濃度を提供する、請求項６に記載の方法。９．有効量が腫瘍部位において10μg/ml以下の濃度を提供する、請求項８に記載の方法。１０．有効量か約0.1mg/kgから約10mg/患者体重kgの投与量である、請求項６に記載の方法。１１．組み合わせ物の抗体の中の少なくとも１つがイムノトキシン分子に結合している、請求項６に記載の方法。１２．悪性細胞がerbB-2を過剰発現しているところのヒト悪性腫瘍を予防し又は治療することができる組成物であって：（a）erbB-2のgp185発現生成物の異なるエピトープを認識する少なくとも２つの異なるモノクロナール抗体の組み合わせ物の有効量；及び、（b）医薬として許容される担体、を含んで成る組成物。