JP3825255B2 - 炎症媒介物質のアンタゴニスト - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬の製造におけるＯＳＭのアンタゴニストの使用、及びこのようなアンタゴニストのスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜の過形成及び単核細胞と多形核白血球（ＰＭＮ）による著しい細胞の浸潤を特徴とする関節性連結（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔｓ）に影響を及ぼす慢性炎症性疾患である。固有の細胞種と浸潤した細胞種との複雑で、よく分かっていない相互作用が、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の慢性的な分泌を引き起こし、関節の軟骨、靭帯、及び肋軟骨下骨の破壊をもたらす（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．４：３４８−５４，１９９２）。ＲＡ関節の病理学を引き起こすと推測されている数多くの炎症促進性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の中で、ＴＮＦαが中心的な役割を果たしていることが示され、抗ＴＮＦα療法が明確な有益性を示している（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＭＪ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ．３４４（８９３０）：１１０５−１０，１９９４）。ＴＮＦαは、ＭＭＰｓの誘導（Ｄａｙｅｒ ＪＭ． ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １６２（６）：２１６３−８，１９８５）、他の炎症促進性サイトカインのアップレギュレーション（Ｈａｗｏｒｔｈ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２１（１０）：２５７５−９，１９９１ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１６３（６）：１４３３−５０，１９８６）、及びＰＭＮの接着の増加及び内皮細胞透過性細胞移動の増加（Ｓｍａｒｔ ＳＪ． Ｃａｓａｌｅ ＴＢ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２６６：Ｌ２３８−４５，１９９４）を含む幾つかの病理的効果を媒介する。現在、ＴＮＦαは、炎症促進性サイトカインカスケードの初発因子と考えられているが、その正の制御に関しては、相対的に殆ど知られていない（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４：３９７−４４０，１９９６）。
【０００３】
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｒｏｓｅ ＴＭ． Ｂｒｕｃｅ ＡＧ． ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８（１９）：８６４１−５，１９９１）は、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、及びカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）（Ｔａｇａ Ｔ． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５：７９７−８１９，１９９７）を含むサイトカインファミリーに属する２８ｋＤａの糖タンパク質である。全てのメンバーは、ヘテロおよびホモダイマー受容体の複合ファミリーの一員として、共通のシグナリング鎖ｇｐ１３０を有する（Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ． ［Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ２７（１）：９６−１０９，１９９７）。ＯＳＭは、ＬＩＦと共通のヘテロダイマー受容体（ＬＩＦｒ：ｇｐ１３０、タイプＩ）を共有し、ＯＳＭｒβ鎖及びｇｐ１３０（タイプＩＩ）を含むそれ自身の固有の受容体も有する（Ｍｏｓｌｅｙ Ｂ． ｅｔ ａｌ．［Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７１（５１）：３２６３５−３２６４３，１９９６）。ＯＳＭは、細胞の増殖と分化に対する効果が以前から知られていた（Ｈｏｒｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ［Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．２（２−３）：１５７−６５，１９９０）。最近、ＯＳＭは、インビボでマウスに対して強力な炎症促進特性を有することも示され（Ｍｏｄｕｒ Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １００：１５８−１６８，１９９７）、ＩＬ−１との強力な協働作用によってエクソビボのモデル系において関節の軟骨の分解を促進することが実証されている（Ｃａｗｓｔｏｎ Ｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２１５（１）：３７７−８５，１９９５）。
【０００４】
ＯＳＭは、内皮細胞に延長したＰ−セレクチン（及びＥ−セレクチン）の増加を誘導し（Ｙａｏ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １８４（１）：８１−９２，１９９６）、ヒト滑液繊維芽細胞中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の活性を刺激し（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． １８０（２）：６５２−９、１９９１）、内皮細胞からのＩＬ−６の強力な誘導物質である（Ｂｒｏｗｎ Ｔｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １４７（７）：２１７５−８０，１９９１ Ｏｃｔ１）。ＯＳＭは、最近、ＲＡの滑液及び滑膜中で計測されたが、ＯＡの滑液及び滑膜では計測されず（Ｈｕｉ Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．５６（３）：１８４−１８７，１９９７）、その産生は、マクロファージに限局していた（１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４０（６）：１０９６−１１０５）及びＣａｗｓｔｏｎら（１９９８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１（１０）：１７６０−１７７１）。現在まで、この分野におけるさらなる実験は、ＩＬ−６サブファミリーのメンバーの類似性に基づく推論的なものである（Ｃａｒｒｏｌｌ Ｇ． ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４７（１９９８）１−７）。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ＯＳＭがマクロファージでＴＮＦα分泌を誘導し得ることを発見した。ＯＳＭは、ＭＭＰ−１と複合体を形成してこれを不活化し、それ故、コラーゲンの放出を減少させると予想される組織メタロプロテアーゼ阻害剤−１（ＴＩＭＰ−１）の産生をアップレギュレートすることを示唆する最近のデータ（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ １９９６， Ａ＆Ｒ ３９（４），５６０−５６６）に反して、ＯＳＭがＴＮＦα分泌を誘導するという本発明者らの発見は、ＯＳＭが実際に軟骨の破壊を媒介する役割を果たしているかもしれないということを示唆していた。この発見に基づいて、本発明者らは、他のＩＬ−６ファミリーのメンバーを阻害することなく中和抗ＯＳＭ抗体の治療的投与だけで、マウスモデルのコラーゲン誘発性関節炎を改善することができることを実証した。その後、ＴＮＦαとＯＳＭの協働作用により、軟骨からのコラーゲンの放出が促進されることが、Ｔ．Ｃａｗｓｔｏｎらによって示された（１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４１（１０）１７６０−１７７１）。
【０００６】
それ故、本発明によれば、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬の製造におけるＯＳＭのアンタゴニストの使用が提供される。とりわけＯＳＭのアンタゴニストの使用は、軟骨からのコラーゲンの放出を阻害又は抑制するための医薬の製造においてなされる。本発明は、さらに、有効量のＯＳＭアンタゴニストをこのような疾患に罹患した患者に投与することを備えた炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防法を提供する。
【０００７】
アンタゴニストは、ＯＳＭとＯＳＭ受容体ｇｐ１３０又は他のＯＳＭ受容体、ＯＳＭｒβ鎖若しくはＬＩＦｒとの相互作用を阻害し、あるいはこれらのタンパク質のヘテロダイマーの形成を阻害し、このようにＯＳＭの結合とシグナリングを阻害することにより、炎症促進性サイトカイン及び／又はＭＭＰの合成を減少させることによって機能し得る。本発明のアンタゴニストは、それ故、ＯＳＭ若しくは一以上のＯＳＭ受容体の何れかに対するリガンド（ｇｐ１３０、ＯＳＭｒβ、又はＬＩＦｒ）、又はＯＳＭの生物学的活性に影響を与えるようにこれらの相互作用を妨害することができる物質であり得る。以下、本明細書において、ＯＳＭに対するアンタゴニストという語は、ＯＳＭ自身に対するアンタゴニスト又はその受容体の一つに対する受容体の何れかを意味するものと理解し得る。
【０００８】
本発明者らは、慢性関節リウマチの滑膜血管の内皮には、Ｐ−、及びＥ−セレクチンがｇｐ１３０、Ｉ型及びＩＩ型ＯＳＭ受容体のシグナリング要素と共存することも実証した。理論に拘泥するものではないが、このことは、滑膜マクロファージによって産生されたＯＳＭは、ＲＡ血管内皮に、Ｐ及びＥ−セレクチンのアップレギュレーションを介した白血球の補充の促進を引き起こさせるかもしれないということを示している。特異的な抗体又はフコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）（Ｌ−セレクチンのアゴニスト）の何れかによるＬ−セレクチンの連結反応がヒト単核細胞にＯＳＭの分泌させるという知見は、ＴＮＦαとＰ及びＥ−セレクチンを作動させるためのＯＳＭのさらなる局部的供給源を与えることによって、炎症性応答を増幅するという点で極めて重要である。
【０００９】
ＯＳＭとｇｐ１３０との相互作用に重要なアミノ酸残基が同定されている。ＯＳＭの公表されたアミノ酸配列（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９（７），２８４７−５３、ＥＭＢＬデータベースのＤＮＡ配列エントリーＭ２７２８８、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのタンパク質配列エントリーＰ１３７２５）から、これらはＧ１２０、Ｑ１６及びＱ２０であり、Ｎ１２３及びＮ１２４も役割を果たしているかもしれない（配列番号１２及び下記参照）。最初の２５残基は、シグナルペプチドであり、成熟したタンパク質は、配列ＡＡＩＧＳ（配列番号１３）から始まる。配列は、記載のごとく、成熟したタンパク質の最初のアミノ酸から番号が付されている。
【００１０】

それ故、本発明は、さらに、これらの特異的な残基の一以上、及び／又はＯＳＭ上で規定するのに役立ってＯＳＭの生物活性を変化させる結合部位と相互作用することができるアンタゴニスト又は物質を提供する。
【００１１】
本発明によって治療し得る炎症性関節症には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節炎、炎症性変形性関節症、及び／又は反応性関節炎が含まれる。治療し得る炎症性疾患には、とりわけ、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、例えば、Ｈ．ピロリ感染から生じる胃炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び乾癬が含まれる。
【００１２】
ＯＳＭのアンタゴニスト候補には、ＯＳＭと特異的に相互作用する小有機分子、イオン、例えば、基質、できれば天然の基質、細胞膜の成分、受容体又は天然のリガンド、その断片、又はペプチド若しくは他のタンパク質性分子が含まれ、特に好ましいのは、ＯＳＭのＯＳＭ受容体への結合のみならず、修飾されたＯＳＭ分子の結合も阻害するであろう非シグナリング型ＯＳＭ変異体である。このようなアンタゴニストは、タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡの形態であり得、前記アンタゴニストをインビボで発現するために供給され得る。アンタゴニストは、インビボでネイティブのＯＳＭに対して標的化された抗体応答の誘導を介してＯＳＭに対するアンタゴニスト効果をもたらすようにデザインされた、このようなタンパク質又はペプチド分子又はＤＮＡを含むワクチンであり得る。このようなアンタゴニストには、抗体、抗体由来の試薬、又はキメラ分子も含まれ得る。アンタゴニストの定義には、このような上記分子のうちの任意の分子の構造的又は機能的模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）が含まれる。ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーのような核酸分子も想定される。
【００１３】
好ましいアンタゴニストには、小有機分子が含まれる。このような化合物は、任意のクラスの化合物に由来し得るが、上述した機序のうちの一つを介して、ＯＳＭの生物活性に影響を与える能力を基礎として選択され、生理的に許容される、すなわち、無毒性であるか、又は許容可能なレベルの毒性若しくはその他の副作用を示すであろう。有用なアンタゴニストを与え得る一つのクラスの化合物は、Ｎ−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミド）のようなリボヌクレオシドである；（Ｄａｖｏｌｌ ａｎｄ Ｋｅｒｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，２５８９，１９６１）。
【００１４】
他の好ましいアンタゴニストには、抗体若しくはその断片、又は抗体若しくはその断片の結合を模倣するようにデザインされた人工構築物を含む抗体、それらの断片、又は人工的構築物が含まれる。このような構築物は、Ｔｉｂｔｅｃｈ １２、３７２−３７９（１９９４）の中でＤｏｕｇａｌｌらによって論述されている。
【００１５】
抗体の定義には、組換えヒト抗体のような組換え抗体も含まれ、これらも使用し得る。これらの抗体は改変され得る。すなわち、それらは、（ＷＯ８６／０１５３３に記載されているような）ドナー抗体の可変ドメインとヒト抗体の定常ドメインを含む「キメラ」抗体であり得、又は（ＥＰ−Ａ−０２３９４００に開示されているような）抗体の可変ドメインのフレームワークでなくＣＤＲのみが異なる種に由来する「ヒト化」抗体であり得る。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、哺乳類又は霊長類のモノクローナル抗体に由来し得る。改変された抗体の可変ドメインのフレームワーク、及び定常ドメインは、通常ヒトの抗体に由来する。このようなヒト化抗体は、ヒトに投与したときに、齧歯類に由来する抗体のような完全な外来抗体に対してヒトが引き起こす免疫応答に比べて、大きな免疫応答を引き起こさないはずである。
【００１６】
好ましいアンタゴニストには、完全な抗体、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、他の断片、ＣＤＲペプチド及び模倣体が含まれる。これらは、当業者によって取得／調製され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦａｂ断片を取得するためには、（ＩｇＧ分子をそれぞれペプシン又はパパイン切断に供することによる）酵素消化を使用することができる。以下の記載では、「抗体」という語は、上記の可能性を全て含むものと理解しなければならない。
【００１７】
当業者であれば理解できるであろうが、具体的なタンパク質又はペプチドのアンタゴニストが本明細書で記載される場合には、このようなアンタゴニストの誘導体も使用し得る。「誘導体」という語には、前記アンタゴニストに対して一以上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されているが、記載された結合活性をまだ保有している記載されたアンタゴニストの変形物（ｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。好ましくは、これらの誘導体は、明記したアンタゴニストと実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
アミノ酸配列の同一性の程度は、任意の二つの配列間の類似性が最良のセグメントを見出すために、「ｂｅｓｔｆｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、４８２−４８９（１９８１））のようなプログラムを用いて計算することができる。アラインメントは、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ ｐｐ ３５３−３５８に記載されているように、アミノ酸類似性のマトリックスを用いて達成されるスコアを最大にすることに基づく。
【００１９】
好ましくは、配列の同一性の程度は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％である。少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性が最も好ましい。しかしながら、様々なアミノ酸は、多くの場合、タンパク質のある特性を実質的に変化させずに、又はこれに悪影響を与えずに、類似の特性を有する他のアミノ酸に置換され得るので、必ずしも高度の配列同一性は必要でないことが、当業者であれば理解できるであろう。これらは、時々、「保存された」アミノ酸変化と称される。このため、アミノ酸グリシン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンは、多くの場合、相互に置換することができ、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香属側鎖を有するアミノ酸）；リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びにシステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）を含む。このように、「誘導体」という語には、配列に対して一以上のこのような「保存的」変化を含むアミノ酸配列の変形物も含まれ得る。
【００２０】
本発明には、記載された結合活性をなお保有した本発明のアンタゴニストの断片又はそれらの誘導体も含まれる。好ましい断片は、少なくとも１０アミノ酸長であるが、それよりも長いものであり得る（例えば、５０アミノ酸長まで、又は１００アミノ酸長まで）。
【００２１】
本発明に使用するのに好ましいＯＳＭのさらなるアンタゴニストは、オリゴヌクレオチドリガンドである。指数的濃縮による系統的リガンド開発（ＳＥＬＥＸ；ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｔｉｃｈｍｅｎｔ）は、標的タンパク質又は他の分子に対する所望の活性について一本鎖オリゴヌクレオチドの莫大なライブラリーをスクリーニングするプロトコールである（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ １９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｍｅｔｈｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２ ７５−８６；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９５ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６４，７６３−７９７；Ｕｐｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，２８１−２８８）。このスクリーニングの産物は、標的タンパク質に対して所望の活性、通常は高いアフィニティー結合を有するアプタマーと呼ばれる単一のオリゴヌクレオチド配列である。ＳＥＬＥＸ操作は、通常、約１０^１４〜１０^１５個のランダムオリゴヌクレオチド配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡライブラリーを用いて開始される。完全にランダム化されたオリゴヌクレオチドライブラリーでは、各分子は、その分子のヌクレオチド配列に完全に依存するであろう固有の四次構造を示すであろう。このため、標的タンパク質に対してスクリーニングすれば、そのタンパク質に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性は、オリゴヌクレオチドの形状と前記標的タンパク質上のエピトープとの間の適合性によって決定されるであろう。莫大な多様性を有するライブラリーから開始する結果、通常、全体的な構造の相同性を有する他のタンパク質に比して標的タンパク質に対する選択性を有し、標的タンパク質に対するサブｎＭ親和性を持ったアプタマーを同定することができるであろう（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ １９９０上記、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９１上記；Ｇｏｌｄら、１９９５上記；Ｕｐｈｏｆら、１９９６上記）。ＳＥＬＥＸ法を用いて、１００を超えるタンパク質及びドーパミン（Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，９７２６−９７３４）、サブスタンスＰ（Ｎｉｅｕｗｌａｎｄｔ ｅｔ ａｌ，１９９５ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，５６５１−５６５９）、ヒト好中球エラスターゼ（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｉｏｌ．７，８７７−８８０）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４４１３−１４４２４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２，６８３−６９５）、トロンビン（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５６４−６６）、及びＬ−セレクチン（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３，５８８３−５８８７）を含む小分子に対してＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーが作成されてきた。
【００２２】
多数のアプタマーが、生物活性、多くの場合、インビトロとインビボの両者での受容体拮抗作用又は酵素阻害を有することが実証されている。例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）に対して高い親和性と阻害活性を有するＲＮＡアプタマーは、混合ＳＥＬＥＸ（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７上記）によって作成された。インビボでの安定性を増加させるためのＳＥＬＥＸ後修飾の後に、肺炎症のラットモデルでアプタマーをテストした（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７上記）。第二の例では、ヒトＬ−セレクチンに対し、該タンパク質に対してｎＭの親和性を有する４９ヌクレオチド長のＤＮＡアプタマーが作成された（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６上記）。該アプタマーは、Ｅ−セレクチンに比べて６００倍、Ｐ−セレクチンと比べて１０，０００倍のＬ−セレクチンに対する選択性を示す。該アプタマーのＰＥＧ調合物を静脈内投与することによって、放射能ラベルされたヒトＰＢＭＣのリンパ節への輸送が用量依存的に阻害されたが、他の臓器への輸送は阻害されなかった（Ｈｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９８，２６８８−２６９２）。第三の例では、脈管形成におけるＶＥＧＦの役割を調べるために、高親和性のＲＮＡアプタマーが、ヒトＶＥＧＦに対して作成された（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１０４５０−１０４５６；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｒｕｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３，２０５５６−２０５６７；Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９，５７３−５８２）。ＶＥＧＦアプタマーのリポソーム調合物は、ＶＥＧＥによって誘導されるインビトロでの内皮細胞の増殖とインビボでの血管透過性の増加及び脈管形成を阻害した（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８上記）。それ故、本発明に使用するためのＯＳＭのオリゴヌクレオチドリガンド又はＯＳＭ受容体（ＯＳＭＲ、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０）が提供される。
【００２３】
本発明に使用する上記アプタマーを作成するためには、ＯＳＭ又は受容体をまず、スクリーニング用のプレートに結合させなければならない。続いて、ＦｉｔｚｗａｔｅｒとＰｏｌｉｓｋｙに従って（Ｍｅｔｈｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７，２７５−３０１）、ヒトＯＳＭに対するＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーを作成するために、選別と増幅のラウンド（すなわち、ＳＥＬＥＸ操作）の繰り返しを行うことができる。ＲＮＡが最も大きな構造的多様性を与え、それ故、高親和性分子を作成する可能性を与えるので、これらのアプタマーは、典型的には修飾されたＲＮＡアプタマーである。高親和性アプタマーの作成に続いて、アプタマーの安定性を増加させるために、アプタマー（典型的には、アプタマーは、１００マー以下である）を固相合成により適したコア配列に末端切断することにより、合成コストを下げるために、及びインビボで使用するための調合物を開発するために多数のポストＳＥＬＥＸ至適化プロトコールを実施し得る。
【００２４】
これらの操作の初めに、アプタマーは、活性に必要なコア配列まで分子の長さを減らすために末端切断され得る。多くの場合２０〜４０ヌクレオチド長の間の短いコア配列は、合成するのが安価且つ早く、増加した生体利用性を有し得る。コア配列の組成物に関する情報は、配列の相同性の比較から取得し得る。
【００２５】
しかしながら、末端切断実験では、活性が生じるのに必要とされる最少の配列まで、連続的により短いアプタマーを合成するのが普通である。これには、通常、固定された配列を除去することが含まれるが、固定された配列中のヌクレオチドがアプタマーの親和性に寄与する例が多数存在する（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９９６上記；Ｒｕｃｋｍａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２０５５６−２０５６７．Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５上記）。それ故、本発明は、選択されたアプタマーの末端切断されたバージョン又は伸長されたバージョンであるアプタマー又は選択されたアプタマーの配列と７０％を超える相同性を示すアプタマーを提供し得る。
【００２６】
末端切断に続いて、リボヌクレアーゼ切断に対する保護によって、アプタマーの安定性を向上させるために、多数の塩基の修飾実験を行い得る。インビトロ転写に使用されるＴ７ポリメラーゼはこの修飾を耐えられないと思われるので、ＳＥＬＥＸの間には、２’修飾されたプリン塩基を含有させることはできない。このため、ＳＥＬＥＸ後にアプタマーの安定性を増加させるためには、アプタマー中のプリン塩基と２’修飾されたプリンとを置換するのが普通である。この修飾は、通常、２’−０−メチルプリンの使用によって行われるが、２’−アミノプリン、又は２’−フルオロプリンを含む他の修飾されたプリンを使用してもよい（Ｒｕｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８上記；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５上記）。ＳＥＬＥＸ後の該修飾は、親和性の喪失ももたらし得るので、連続的な態様でこれを行わなければならない（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５上記）。
【００２７】
末端切断と安定化に続いて、化学的固体規模（ｓｏｌｉｄ ｓｃａｌｅ）の合成によって合成され得る短い完全に修飾されたアプタマーを極めて大量に作成することができる。アプタマーの５’末端には、アプタマーの使用を容易にするために、又はインビボ供給用にアプタマーを調合するために、多くの分子を付加することができる。これには、イメージングを助けるための被封入部分（ｃａｇｅｄ ｍｏｉｅｔｙ）（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ Ｄ．Ｊ．（１９９６）Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０，２０２−８）、分子の検出を助けるためのフルオレセイン（Ｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７０，４５４０−５）、リポソームへの挿入を助けるための脂肪基（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８上記）、又は小分子薬物又はペプチドへの抱合（Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ（１９９７ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，３０１８−３０２６）が含まれる。一般的には、アプタマーの５’末端への分子の付加は、親和性又は特異性の喪失をもたらさない。
【００２８】
インビボでの半減期を向上させるために、アプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加、又はリポソームへの取りこみによって修飾されてきた。何れの場合でも、このような修飾は、インビボでの半減期の顕著な増加を引き起こし得る（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９８上記）。
【００２９】
リポソームとの調合に加えて、インビボでの血清安定性を増加させるために、アプタマーは、２０ＫのＰＥＧと４０ＫのＰＥＧの両者と調合されてきた。ヒトＬ−セレクチンに対してＤＮＡアプタマーが作成されてきた。インビボ安定性を増加させるために、Ｎ末端のアミン部分を介して２０ＫのＰＥＧエステルがアプタマーに連結された。ＰＥＧ抱合アプタマーは、インビボでＳＣＩＤマウス中のＬ−セレクチン依存性リンパ球の輸送を阻害することが実証された（Ｈｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６上記）。それ故、本発明に使用するための、アプタマーと担体分子、例えばＰＥＧとのコンジュゲートが提供される。この態様では、アプタマーと担体は、例えば、Ｎ末端アミン部分を介して連結されるであろう。加えて、アプタマーと輸送分子、例えばリポソームを含む本発明に使用するための調合物又は組成物が提供される。この態様では、アプタマーと担体の間には結合はなくてもよく、アプタマーは、単に、担体全体に封入され、分散され、又は分配され得る。
【００３０】
本研究で単離されたアプタマーは、血清、組織、又は他のエクソビボ試料中のヒトＯＳＭの存在を検出するための診断用分子として使用するために、又はインビボでの全身イメージング研究でのヒトＯＳＭの検出のためにも修飾され得る（Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ（１９９７） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，８０９−８１６．：Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，１９９６上記）。ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（Ｄａｖｉｓ ＫＡ．Ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，７０２−６．；Ｃｈａｒｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７上記）、ＥＬＯＮＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｓｓａｙｓ）アッセイ（Ｄｒｏｌｅｔ ＤＷ，ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４，１０２１−１０２５）、及び他の診断用途のような利用のための蛍光検出を補助するために、フルオレセイン又は他の蛍光性検出基を、アプタマー分子の５’末端に付加することができる。ＭＡＧ３（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ Ａ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９８６：２７，１１１−６）のようなテクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ９９ｍ）キレーティングペプチドケージの出現は、標的タンパク質の存在をインビボでイメージングするために、広範な分子（Ｋｕｂｏ Ａ．ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｋａｋｕ Ｉｇａｋｕ ３５，９０９−２８）と巨大分子（Ｔａｉｌｌｅｆｅｒ Ｒ． ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２２，４５３−６４）の使用を著しく促進した（巨大分子（Ｐａｌｌｅｌａ Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０，３５２−６０））。イメージは、γカメラの補助により可視化され、マウスからヒトまでの様々な種で達成されてきた。Ｔｃ９９ｍキレーターの最近の修飾によって、穏やかの条件下で、より効率的且つ安定な分子の標識化が可能となった（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ Ｄ．Ｊ．１９９８ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３９，５６−６４）。一本鎖オリゴヌクレオチドを放射能ラベルする方法が既に開発されており、このような未修飾の被標識オリゴヌクレオチドのインビボでの挙動が、予備的に調べられている（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ、１９９６上記）。
【００３１】
もちろん、本発明に使用するための全てのペプチド、タンパク質、又は核酸をベースとするアンタゴニストは、精製された形態、すなわち、その天然の状態で、またはその製造の結果の何れかにおいて、このような分子に付随する物質がないことが好ましく、とりわけ、純度は、７０％を超えることが好ましく、８０％又は９０％の純度を超えることがより好ましいことが理解されるであろう。
【００３２】
本発明のアンタゴニストは、単独で、又はステロイド（プレドニゾン等）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、若しくはプリン類縁体（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン等）、若しくは抗リンパ球抗体のような免疫抑制剤と、あるいは、より好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害物質、例えば抗ＣＤ４抗体（好ましくは、遮断若しくは非除去（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体）、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２３抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、例えば抗ＴＮＦ抗体若しくはＴＮＦ阻害剤、例えば可溶性ＴＮＦ受容体、若しくはＮＳＡＩＤのような物質若しくは他のサイトカイン阻害剤のような耐性誘導、抗自己免疫、又は抗炎症性物質と組合せて使用し得る。
【００３３】
本発明のアンタゴニストの適切な用量は、治療すべき疾病又は疾患、投与経路、治療すべき個体の年齢及び体重、及びアンタゴニストの性質のような要素に応じて変わるであろう。特定の用量に拘泥するものではないが、例えば、非経口投与の場合、一日当り０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の抗体（又は他の大分子）（通常、上記の薬学的組成物の一部として存在する）が、典型的な成体を治療するのに適切であり得ると思われる。より適切には、用量は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜２ｍｇ／ｋｇであり得る。適切には、単位用量は１〜４００ｍｇであるだろう。小有機分子の適切な用量は同様であり、オリゴヌクレオチドリガンドの適切な用量は、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｋｇであるだろう。
【００３４】
本発明は、さらに、薬学的に許容される担体又は賦形剤、及び活性成分として、本発明のアンタゴニスト、及び必要に応じて上述した他の治療剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明のアンタゴニスト、及びその薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、又は静脈内投与に特に有用であるが、アンタゴニストの性質によっては、口腔、吸入、鼻内、局所又は関節内のような他のルートがより適切かもしれない。
【００３５】
経口投与用の組成物は、一般に、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解されたアンタゴニスト又はそのカクテルの溶液を含むであろう。様々な水性担体、例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、一般的には、粒状物が存在しない。これらの組成物は、従来の良く知られた滅菌手法によって滅菌し得る。前記組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のような生理的条件に近似するのに必要とされる薬学的に許容される補助的物質を含有し得る。これらの調合物中の抗体又は他のアンタゴニストの濃度は、例えば、約０．５重量％未満から、通常の約１重量％又は少なくとも１重量％、１５又は２０重量％まで、大きく変わることができ、選択した投与様式に従って、主として、液体の容積、粘度等に基づいて選択されるであろう。
【００３６】
このように、筋肉内投与用の典型的な薬学的組成物は、１ｍＬの滅菌した緩衝化された水、及び５０ｍｇのアンタゴニストを含有するように作成され得る。静脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び１５０ｍｇの抗体、又は本発明の他のアンタゴニストを含有するように作成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知、又は明白であると思われ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）に、より詳細に記載されている。核酸アンタゴニスト用の適切な調合物は、上述されている。
【００３７】
抗体のような本発明のタンパク質アンタゴニストは、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に、適切な担体中で再生される。この手法は、従来の免疫グロブリンによって有効であることが示されている。任意の適切な凍結乾燥及び再生手法を利用することができる。当業者であれば、凍結乾燥及び再生が、様々な程度の抗体活性の喪失をもたらし得ること（例えば、従来の免疫グロブリンを用いると、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体に比べて、より大きな活性の喪失を有する傾向がある）、及び使用レベルは補償のために調節しなければならないかもしれないことを理解できるであろう。
【００３８】
単一の又は複数回の組成物の投与は、治療に当たる医師によって選択されている用量レベルとパターンで実施することができる。どのような場合でも、薬学的調合物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の抗体間又は他のアンタゴニストを与えなければならない。
【００３９】
本発明の範囲には、ＯＳＭに結合するある物質が、炎症性疾患の治療に有用であり得るかどうかを決定するためのアッセイが含まれる。本発明には、それ故、試験物質とＯＳＭを混合する工程、及び前記物質がＯＳＭとＯＳＭ受容体との相互作用を妨害することができるかどうか、又はマーカー分子の識別的遺伝子発現を通じてＯＳＭの生物活性に影響を与えるかどうかを決定する工程とを備えたＯＳＭのアンタゴニストを同定するためのアッセイも含まれる。
【００４０】
上記本発明に使用するアンタゴニストを選別するためには、まずＯＳＭ、担体上に存在する、若しくは結合部位が規定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）態様の上記ＯＳＭの中心的結合残基（‘ＯＳＭ結合部分’）、又はＯＳＭ授与体を得なければならない。ヒトＯＳＭをコードするｃＤＮＡは、ＥＭＢＬ配列に基づいて（受付番号Ｍ２７２８８）合成的に作成され、適切な発現用ビークル中にクローニングし、大腸菌のような適切な宿主を形質転換するために使用され得る。続いて、培地からヒトＯＳＭタンパク質を精製し、スクリーニングのためにプレートに結合される。
【００４１】
ＯＳＭ、ＯＳＭ結合部分、及び／又はＯＳＭ受容体は、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、及び天然産物の混合物中で、小分子基質およびリガンドの結合を評価するために使用され得る。それ故、本発明はＯＳＭのアンタゴニストを同定するためのアッセイであって、ＯＳＭと試験物質を接触させる工程と、結合を測定する工程とを備えたアッセイを提供する。これらの基質及びリガンドは天然の基質であり得、リガンドは構造的又は機能的模倣体であり得る。このような分子は、ＯＳＭのアンタゴニストの定義の中に含まれる。スクリーニング法は、高情報量（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）を含み得る。例えば、アンタゴニストをスクリーニングするには、ＯＳＭ受容体を発現している細胞から、合成反応混合物、膜のような細胞コンパートメント、細胞のエンベロープ、又は細胞壁、又は任意のそれらの調製物を調製し得る。続いて、候補分子の非存在下又存在下で、該調製物を標識されたＯＳＭとインキュベートする。候補分子がＯＳＭ受容体に結合する能力は、標識されたＯＳＭの結合の減少に反映される。無償で、すなわちＯＳＭの機能的効果を誘導せずに結合する分子が、よいアンタゴニストである可能性が最も高い。このアッセイでは、反対に、未標識のＯＳＭと共に標識したＯＳＭ受容体を使用してもよい。ＯＳＭアンタゴニストを同定するために、ＥＬＩＳＡフォーマットを用いたさらなるスクリーニングを使用してもよく、そこでは、候補分子が、ｇｐ１３０−Ｆｃ融合タンパク質のようなＯＳＭ受容体コンジュゲートのプレートに固定化されたＯＳＭへの結合を阻害する能力が測定され、該アッセイにおいては、結合したｇｐ１３０−Ｆｃは、酵素標識した抗Ｆｃ抗体と比色法アッセイによって検出される。
【００４２】
アンタゴニスト候補の機能的効果は、例えば、候補分子と細胞又は適切な細胞調製物を相互作用させた後にレポーター系の活性を決定すること、及びその効果をＯＳＭ又はＯＳＭに対して同じ効果を示す分子の効果と比較することによって測定し得る。この点で有用であり得るレポーター系には、産物に転換された比色標識基質、ＯＳＭ受容体の機能的活性の変化に応答するレポーター遺伝子、及び本分野で公知の結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
ここで、添付の図面のみを参照しながら例によって、本発明を記載する。
【００４４】
例１：エクソビボでの滑膜組織培養中のＯＳＭの検出
実験１：
滅菌した皮下針を用いて、慢性関節リウマチ、変形性関節症、又はバニオンを有すると診断された患者から得た切除したばかりの滑膜組織を機械的に切開し、約１ｍｍ^３の断片を得た。１０％の熱で不活化したＡＢ^＋雄の血清（Ｎｏｒｔｈ Ｌｏｎｄｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｔａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ）、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、１％ ピルビン酸ナトリウム、１％ 非必須アミノ酸（全てシグマから購入）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｌｃｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）（完全ヒト培地；ＣＨＭ）を添加した９６穴の組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上の扁平な底部の２００μＬウェルの中にこれらを置き、３７℃でインキュベートした。
【００４５】
第０、２、５、及び９日目に、１００μＬ／ウェルの培養上清試料を採集し、２０℃で凍結した後、ＥＬＩＳＡによるＯＳＭの試験を行った（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。データが図１に示されている。分泌されたＯＳＭは、ＲＡ由来の滑膜試料中に検出されたが、変形性関節症又は非関節症の対照患者由来の滑膜から得た試料中には検出されなかった。ＲＡ組織培養中のＯＳＭレベルは、インキュベーションの５日目付近で最大であり、およそ１４００ｐｇ／ｍＬの濃度に達し、９日目でも、なお８００ｐｇ／ｍＬを超えていた。
【００４６】
実験２：
滑膜組織をＰＢＳ中で洗浄し、脂肪組織を除去した。組織を小さな（１−４ｍｍ）断片に切断するために滅菌した鋏を使用した。この組織は、使用前にＰＢＳ中で洗浄した。該組織を秤量し、２４又は４８穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、１００ｍｇ／ｍＬで直接プレートした。３７℃及び５％ＣＯ_２下において、１０％の加熱により不活化したＡＢ＋ヒト血清（シグマ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４８０Ｕ／ｍＬナイスタチン（シグマ）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ）が補充された、濾過滅菌したダルベッコの修正イーグル培地（シグマ）１．５ｍＬ中で該組織を培養した。３日目に、上清を取り出し、対を成す抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＥＬＩＳＡ中でＯＳＭを試験した。
【００４７】
ＲＡ又は炎症性ＯＡを有する患者の膝の生検から得た滑膜組織培養物は、自発的にＯＳＭを分泌する。３日間のインキュベーション期間後に、ＲＡ培養物からの培養上清中のＯＳＭの平均レベルは２４６ｐｇ／ｍＬであり（レンジ３０〜９８２、ｎ＝１２）、ＯＡ培養物からのＯＳＭの平均レベルは４７３ｐｇ／ｍＬ（レンジ４４〜２００１、ｎ＝１４）であった。ＯＳＭは、炎症によって分泌されたが、静止状態の滑膜組織によっては分泌されなかった（図２）。
【００４８】
例２ａ：ＴＨＰ−１細胞の分化
ヒトの前単球系ＴＨＰ−１細胞（ＥＣＡＣＣ）を一週間に二回、１０％の加熱により不活化したＦＣＳ、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、１％ 非必須アミノ酸（全てＳｉｇｍａから購入）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（完全培地；ＣＭ）を補充したＲＰＭＩ中で経代した後、洗浄した細胞に１μｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。予め加温したＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、ＣＭ中に再懸濁し、９６穴の扁平な底部のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、１．５×１０^５細胞／ｍＬで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、培地を交換し、さらに２４時間インキュベートした。使用前に、細胞を１回ＰＢＳ中で洗浄した。
【００４９】
例２ｂ：ＩＦＮγ刺激された血液単球の調製
ＰＢＳでヒトのバフィコート（Ｎｏｒｔｈ Ｌｏｎｄｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ）を１：３に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ ＵＫ）上に重層し、室温で３０分間６００×ｇで遠心した。採集したＰＢＭＣをＰＢＳ中で３回洗浄し、計数し、５×１０^６細胞／ｍＬになるように、８０ｍＬのＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＣＳ中に再懸濁した。２０ｍＬを４つの１７５ｃｍ^２の各フラスコ中に置き、３７℃で一晩インキュベートし、単球を接着せしめた。非接着性細胞を捨てて、４℃で１５分間、氷冷したベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）と共にインキュベートした後、接着性細胞を掻き取った。ＰＢＳ中で細胞を二度洗浄し、６．９×１０^５／ｍＬになるように、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％の熱で不活化したヒト血清（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、９６穴の扁平な底部のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェル中に２５０μＬの細胞懸濁物を置いた。プレートの半分に、１００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮγを添加し（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、残りの半分は対照として残しておいた。プレートは、アッセイ前に３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。
【００５０】
例２ｃ：ＴＮＦα放出の刺激：
凍結乾燥した、組換えヒトオンコスタチンＭ（ｒｈＯＳＭ）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、滅菌したＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、使用するまで−２０℃で分取試料を保存した。上述のように調製した、マクロファージ、単球、又はＴｈｐ−１細胞のそれぞれにつき３つずつのウェルに、ｒｈＯＳＭ、大腸菌由来のＬＰＳ、又はＣＭを添加し、上述のように調製し、３７℃、５％ＣＯ_２で７時間インキュベートした。上清を採取して、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦαタンパク質をテストするまで−２０℃で凍結した。ＴＮＦα ｍＲＮＡを同時アッセイするようにデザインされたアッセイでは、細胞を上記のように４時間インキュベートし、ＰＢＳ中で一度洗浄し、ＲＮＡ抽出緩衝液中で細胞溶解させた（ＲＮＡｚｏｌｅ）。
【００５１】
ＲＮＡは、以下のように検出した。製造者の指示にしたがって、全ＲＮＡを調製し、ＤＥＰＣ処理した水の中において、−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲの場合、オリゴｄＴプライミング（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、約１μｇのＲＮＡを逆転写し、以下のＴＮＦα用プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ａｍｐｌｉｍｅｒｓ）：フォワード−ＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡ（配列番号１）リバース−ＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣ（配列番号２）を用いて、得られたｃＤＮＡを３０サイクルのＰＣＲに供した。増幅産物（４４４ｂｐ）は、アガロースゲル（２％）電気泳動によって分離され、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【００５２】
例２ｄ：ＯＳＭは単球系のヒト細胞にＴＮＦαの産生を誘導する
ＰＭＡを用いてヒト前単球系Ｔｈｐ−１を分化するように誘導し、完全に洗浄し、上述のように組換えヒトＯＳＭと共にインキュベートした。８時間の時点で、培養の上清を除去し、製造者の指示に従って、特異的なＥＬＩＳＡ（ＴＮＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＴＮＦαの産生をアッセイした。ＯＳＭは、用量に依存したＴＮＦαの放出を誘導し、１ｎｇ／ｍＬ以上のＯＳＭで測定可能、２００−５００ｎｇ／ｍＬで最大であり、多くの場合、２５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαを超える分泌レベルに達した。代表的な実験が、図２に示されている。上記のＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＴＮＦαのメッセンジャーの発現は、刺激されない対照細胞に比して、１００ｎｇ／ｍＬのＯＳＭと４時間インキュベートしたＴＨＰ−１細胞の中で非常に増加した（図３）。
【００５３】
重要なことは、ＯＳＭを予め煮沸するとＴＮＦαの分泌が完全に消失したので、ＴＮＦαの誘導は、混在するエンドトキシンに由来するものではなかったということである（データは示していない）。また、特異工程を用いた免疫沈降によるＯＳＭの除去は、活性を消失せしめた（データは示されていない）。これらの知見は、インターフェロンγで予め活性化したヒト血中単球、７日間の培養で分化したヒト血中マクロファージを含むように拡張された。両細胞種ともに、ＯＳＭと共に８時間にわたって同時インキュベートすると、ＥＬＩＳＡによる測定によれば、ＴＮＦαを分泌した。単球による平均ＴＮＦα分泌は、１４４７ｐｇ／ｍＬであり（レンジ１３７−４７０９ｐｇ／ｍＬ；ｎ＝４ドナー）、及びマクロファージでは５４２ｐｇ／ｍＬであった（レンジ６２−１４２８ｐｇ／ｍＬ；ｎ＝３ドナー）
例３ａ：軟骨分解アッセイ
屠殺後にウシの尾中隔軟骨を一晩４℃に保った。２ｍｍのスライスから直径２ｍｍの円板を切除し、ＨＢＳＳで２回洗浄した。２ｍＭ グルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（軟骨分解溶媒、ＣＤＭ）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する６００μＬの容量のＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）の中で、２４穴のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェル当たり３つの円板を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。６００μＬのＣＤＭのみ、２、１０、又は５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＴＮＦαのみ、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＯＳＭのみ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、又はＴＮＦα＋ＯＳＭの何れかの中で、４つずつのウェルの中において軟骨を培養し、３７℃、５％ＣＯ_２で７日間インキュベートした。上清を採取し、第１日と同一の試験試薬を含有する新鮮な培地と置換した。該実験は、さらに７日間継続され、１４日目に全ての培地が除去され、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５ｍＭ システイン塩酸塩を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．５の中で、４．５ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ）を用いて残りの軟骨を消化し、６５℃で１６時間インキュベートして、軟骨断片の残存するヒドロキシプロリン含量を決定した。１４日目までに培地中に放出されたＯＨ−プロリンの累積的レベルを測定し、以下に示されているように、総放出の百分率として表した。
【００５４】
例３ｂ：ヒドロキシプロリンアッセイ
Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ｉ ａｎｄ ｌｏｘｌｅｙ Ｒ．（１９６３） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５ １９６１−１９６５の方法のマイクロタイタープレート修飾法を用いて、ヒドロキシプロリンの放出を（コラーゲンの分解の測定として）アッセイした。酢酸クエン酸緩衝液（水１Ｌ当たり５７ｇ酢酸ナトリウム、３７．５ｇのｔｒｉ−クエン酸ナトリウム、５．５ｇのクエン酸、３８５ｍＬのプロパン−２−オール）で、クロラミンＴ（７％ｗ／ｖ）を１：４に希釈した。ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＡＢ；３０ｍＬの６０％過塩素酸）中２０ｇ）をプロパン−２−オールで１：３に希釈した。試料を６Ｍ ＨＣＬの中で１０５℃で２０時間加水分解し、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ．を用いて、真空下で、ＮａＯＨを用いて乾燥させることによって、加水分解物を中和した。残留物を水に溶かし、クロラミンーＴ試薬と共に、４０μＬの試料又は標準（ヒドロキシプロリン；５−３０μｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートに添加した後、ＤＡＢ試薬（１５０μＬ）を４分後に添加した。該プレートを６５℃まで３５分間加熱し、冷却し、５６０ｎｍの吸光度を決定した。
【００５５】
例３ｃ：ＯＳＭはＴＮＦαと協働してエクスビボで軟骨外植片からのＭＭＰ１とコラーゲンの放出を増加させる
上述のように、ＯＳＭ若しくはＴＮＦαのみ（ともにＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）、又はこれらの組合せの存在下又は不存在下において、ウシの鼻軟骨を４つずつのウェルの中で１４日間培養した。
【００５６】
第７日目に培養上清の総コラーゲナーゼ活性を、第１４日目に放出されたコラーゲンをアッセイした。図５のデータは、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ／ｍＬで使用されたＯＳＭ又はＴＮＦα単独では、何れも顕著なＭＭＰ１の分泌を誘導しなかったことを実証している。しかしながら、これらの濃度で使用されたＯＳＭとＴＮＦαの組合せは、測定可能なＭＭ１の放出を誘導した。これらの知見は、ＯＳＭとＴＮＦαとの顕著な協働作用を伴って、軟骨からのコラーゲンの放出を増加させた。図４は、１０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ単独では、コラーゲンの放出を誘導しなかったのに対して、使用した最高濃度のＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍＬ）だけは、小さいが、実証可能な効果（１０％未満）を有していたことを示している。しかしながら、５０又は１０ｎｇ／ｍＬの何れかのＴＮＦαと１０ｎｇ／ｍＬの組合せは、それぞれ、８０％及び３０％を超えるコラーゲンの放出をもたらした。
【００５７】
例４ａ：Ｌ−セレクチンを介したＰＢＭＣの刺激
上述のようにヒトのバフィコートから単核細胞を単離した。５×１０^５細胞を０．５ｍＬの容量で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で、６０〜８０ｋＤの分子量のフコイダン（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体、ＬＡＭ１−３、及びＴＱ１、又はアイソタイプが合致した対照ＩｇＧ抗体（全てＣｏｕｌｔｅｒから入手）と共に２４時間インキュベートした。製造者の指示に従って、特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて上清のＯＳＭをアッセイした。
【００５８】
例４ｂ：Ｌ−セレクチンの連結はＯＳＭの分泌を誘導する
抗ヒトＬ−セレクチン抗体、（ＴＱ１又はＬＡＭ−１の何れか）、又はアイソタイプを合致させた対照抗体、及びＥＬＩＳＡによってＯＳＭをアッセイした培養上清と共に健康なドナーからの単核細胞を２４時間インキュベートした。図６のデータは、両抗Ｌ−セレクチン抗体を用いた用量依存的なＯＳＭの誘導を示している。対照抗体は、最少の効果を有していた。続いて、Ｌ−セレクチンアゴニストであるフコイダンが単核細胞培養からＯＳＭを誘導する能力を調べた。図７は、フコイダンがＯＳＭ分泌の強力な刺激物質であり、ＲＡ及びＯＡの滑膜生検培養物で見られたのと同様のレベルを誘導することを示している（例１、実験２、図２）。
【００５９】
例５ａ：免疫組織化学
ＣＯ_２で冷却して液体ヘキサン中で新鮮なヒト組織試料を凍結して、使用まで液体Ｎ_２の蒸気相中に保存した。３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）（Ｍａｄｄｏｘ Ｐ． ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ． ４０；１２５６−１２６０，１９８７）をコートしたガラススライド上に、７ｍｍのクリオスタット切片を切断し、２％パラホルムアルデヒド中、４℃で１０分間固定した。０．０５％Ｈ_２Ｏ_２中で、内在性のペルオキシダーゼ活性を２０分間ブロックした。未抱合の一次モノクローナル抗体は、以下の入手源：ＣＤ６２Ｐ、ＣＬＢ、オランダ；ＣＤ６２Ｅ及びｇｐ１３０ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＫから得た。一次抗体は、４５分間、室温で、至適希釈で適用した。試験抗体と等しいタンパク質濃度で使用したネガティブコントロールの切片を抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）と共にインキュベートした。一次抗体を標識するために、ビオチン化された二次抗体に続いて、ペルオキシダーゼラベルされたＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｌｉｔｅ）を用いた。ＤＡＢ（３，３’ジアミノベンジジン）基質（ＳＩＧＭＡ）を用いてペルオキシダーゼを展開した。
【００６０】
例５ｂ：ＲＡの滑膜におけるセレクチンとＯＳＭ受容体の共分布
炎症性ＲＡの滑膜組織の凍結切片は、上記ｇｐ１３０、並びにＰ及びＥセレクチンに対する特異抗体を用いて染色した。図８の顕微鏡写真は、ＲＡの血管内皮がｇｐ１３０に対して強い陽性で染まることを実証している。
【００６１】
Ｐ−及びＥ−セレクチンの発現についてＲＡの滑膜を染色することによって、血管内皮細胞に限局したｇｐ１３０と同一の染色パターンが明らかとなった（それぞれ、図８及び図９）。図９では、血管周囲の単核細胞がＥ−セレクチンの染色に付随して浸潤していることに注目されたい。対照一次抗体を用いた連続切片の染色は、血管内皮細胞上では、ネガティブであった（図９）
例６ａ：コラーゲン誘導性関節炎の抗ＯＳＭ抗体処置
コラーゲン誘導性関節炎は、以前記載したように（Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒｋ Ｃ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９８：４４２−７ １９９４ ａｎｄ Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒｋ Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：７８１−５，１９９５）ネイティブのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を用いた免疫化によって、雄のＤＢＡ／１マウス（８−１２週齢）で誘導した。ＣＩＩ免疫化の１６日後から、関節の赤さと膨張の徴候について、マウスを毎日モニターした。臨床徴候が最初に現れてから、１週間に３回マウスを調べ、各肢毎に、以下の視覚的スコア：０＝正常、０．５＝２以上の指に関節炎、１＝指を含まない肢の僅かな膨張と紅斑、１．５＝１と同じだが指を含む、２＝指を含まないより顕著な肢の紅斑を伴う膨張、２．５＝２と同じだが指を含む、３＝動作障害を伴う著しい膨張、３．５＝３と同じだが指を含む、を用いて疾病の重症度に段階を付けた。肢の厚さは、コンパスを用いて測定した（Ｐｒｏｃｔｅｓｔ２Ｔ，Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｌａｎｇｅｎｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ）。
【００６２】
臨床的に疾病が発症してから、１００ｍｇのヤギ抗マウスＯＳＭ抗体を腹腔内投与することによって、ＣＩＩ免疫されたＤＢＡ／１マウスを処置した（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ−４９５−ＮＡ）。上記のように、疾病の進行を評価した。発症から１４日後に、頚椎脱臼によってマウスを屠殺し、組織学的な検査のために肢を採集した。
【００６３】
例６ｂ：関節炎マウスの関節の組織学的な評価
脚の皮を剥ぎ、膝と肢を切除した。４日間（膝）又は１日間（肢）、１０％の緩衝化されたホルマリンの中で関節を固定し、２５％の蟻酸の中で３日間脱灰し、脱水し、パラフィン蝋の中に埋め込んだ。関節の矢状切片（５−７ｍｍ）から蝋を除去し、（上記Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒｋ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載されているように）サフラニンＯ、ファーストグリーン／鉄ヘモキシリン対比染色で染色した。０（浸潤なし）から３（著しい浸潤と滑膜の過形成）まで、滑膜炎をブラインドで段階付けした。軟骨のプロテオグリカンの枯渇の指標となるサフラニンＯ染色強度の消失程度は、０（完全に染色された軟骨）から３（軟骨の完全な枯渇及び消失）までのスケールでスコアを付けた。
【００６４】
例６ｃ：コラーゲン関節炎マウスの関節組織中のＯＳＭ ｍＲＮＡの検出
関節炎マウスと未処置対照動物を屠殺し、両肢と両足を切除し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃で保存した。ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）メカニカルホモゲナイザーを用いて、ＲＮＡｚｏｌｅ中で各脚を砕くことによって、ＲＮＡを調製した。粒状物は沈降させ、続いて、上清を１／１０容量のクロロホルムと混合し、ＲＮＡを含有する水相を分離するために回転させた。ＲＮＡｍａｔｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ＲＮＡを沈降させて混在しているプロテオグリカンを除去した。７５％エタノール中で洗浄した後、ＤＥＰＣ−水の中に全ＲＮＡを溶かし、Ｐｈａｒｍａｃｉａのｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡキット及びオリゴｄＴプライミングを用いて、逆転写した。マウスＯＳＭ配列（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ． ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １５ １０５５−１０６３，１９９６）：ＧＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡ（配列番号３）、ＣＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣ（配列番号４）に由来する以下のプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃｕｓｔｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。３０サイクルのＰＣＲの後、アガロースゲル電気泳動を用いて反応産物（３７９ｂｐ）を検出した。上述のように、関節炎マウスの肢のＯＳＭ ｍＲＮＡを検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。図１０は、段階的に増加する臨床的疾病スコアを有する動物から得た関節では、ＯＳＭ特異的ＰＣＲ産物のレベルは増加していたことを示している。これに対して、対照動物では、ＯＳＭメッセージは、殆ど又は全く検出されなかった。
【００６５】
例６ｄ：ＯＳＭの中和はコラーゲン誘導性関節炎を改善する
中和が関節炎の臨床徴候を改善し得るという仮説を直接試験するために、６匹のマウスからなる群に最初に臨床的な関節炎が現れてから１日及び３日後に、ＯＳＭに対する中和ポリクローナル抗体１００μｇを２回腹腔内投与した。平行して、抗ＯＳＭの代わりに非免疫ヤギＩｇＧを用いて、６匹の関節炎マウスからなる第二の群を同様に処置した。関節炎の臨床的重症度にスコアを付け、第二の抗体を投与した後１１日のフォローアップ期間にわたって各肢の膨張を測定した。対照ヤギＩｇＧで処置したマウスでは、肢の膨張の増加を伴って、進行性の関節炎が発生した。
【００６６】
全く対照的に、抗ＯＳＭ抗体で処置したマウスは、臨床スコアと肢の膨張からみて有意に重症でない関節炎を生じた（図１１）。また、関節炎の肢の数は、対照ＩｇＧ処置動物に比べて、抗ＯＳＭ処置動物で有意に減少しており、この治療用プロトコールが、既に確立した疾病を有する動物をさらなる疾病の進行から保護するのに有効であったことを実証している。（データは示していない）。グループ当たり７匹のマウスを用いて、同様に、この実験を繰り返し、ほぼ合致するデータを得た（データは示していない）。
【００６７】
抗ＯＳＭ抗体による処置から生じた臨床的重症度の減少は、疾病の発症から１４日後に、関節炎の肢を死後組織学的に調べることによって確認された。１４日目における対照ＩｇＧ又は抗ＯＳＭ抗体で処置したコラーゲン関節炎マウスの関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データが、図１２〜１５に示されている。対照ＩｇＧ処置マウスは、ＰＭＮと単核細胞による著しい関節の浸潤を示した（図１２）。これは、広範な好中球の浸潤を特徴とする関節の軟骨の表面破壊を伴っていた（図１３）。対照的に、図１４と１５は、最小限の関節炎を有する抗ＯＳＭ処置した動物の代表的な関節を示しており、細胞の浸潤レベルが顕著に減少し、損傷されていない関節の軟骨が存在することを実証している。さらに、軟骨と滑膜の組織病理学的な外見について、ブラインドで関節にスコアを付け、正常、中程度、又は重度として報告した。処置群当たり合計７３の各関節を評価した；データは表１に要約されている。対照ＩｇＧ処置群では僅か６％であったのに比して、抗ＯＳＭで処置した動物では、検査した４７％の関節が正常であるか、又は穏やかな滑膜炎を示していた。同様に、抗ＯＳＭ処置マウスでは、対照ＩｇＧ処置群の２１％に比べて、検査した関節の５８％が殆ど又は全く関節の損傷を示さなかった。処置の１日目に関節の赤さと膨張の明瞭な徴候を有する２匹の抗ＯＳＭ処置マウスの関節は、続いて、関節炎の完全な改善を示し、軟骨又は滑膜の何れにも細胞の浸潤と目に見える異常を示さなかった（データは示していない）。
【００６８】
【表１】

例７：小有機分子アンタゴニストの同定
明確な細胞毒性を引き起こさずにレポーター細胞株からのＯＳＭ誘導性生物学的応答を阻害することによって、ＯＳＭの小有機分子アンタゴニストを同定した。対照として、ＴＮＦα応答性細胞株に対する前記化合物の影響も試験した。
【００６９】
例７ａ：ヒトＯＳＭの発現及び精製
ＥＭＢＬのｈＯＳＭ（受付番号Ｍ２７２８８）配列からデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧ−３’（配列認識番号５）および５’−ＡＴＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＴ−３’（配列認識番号６）を用い、活性化された白血球のｃＤＮＡライブラリーからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、２５アミノ酸のリーダー配列を除去したヒトＯＳＭ（ｈＯＳＭ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングしてｐＣＲ２．１ｈＯＳＭを得た。
【００７０】
「Ｑｕｉｃｋｃｈｎａｇｅ」位置指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＴＧの代わりにＡＣを挿入し、以下に図示された配列（配列番号７）：

を作り出すことによって、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中のＸａ因子内部に、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作った。
【００７１】
ｐＣＲ２．１ｈＯＳＭ中のＯＳＭインサートの配列を確認した後、ＢｓｍＢｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線部）を含有するフォワードプライマー５'−ＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣ−３'（配列番号８）、及びＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含有するリバースプライマー５'−ＡＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＧＧ−３'（配列番号９）を用いて、該ベクターから成熟型のヒトＯＳＭをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物は、リーダー配列がなく、且つタンパク質の成熟化の時点で除去されるＣ末端の３１アミノ酸がない成熟型のヒトＯＳＭを含有する。ＰＣＲ後に、増幅されたＤＮＡ断片を精製し、制限酵素ＢｓｍＢＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで制限消化された修飾ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：ＧＳＴをコードするＤＮＡを含有する）中にサブクローニングして、ｐＧＥＸ１９６と表記されるプラスミドを作成した。配列を確認した後、大腸菌ＢＬＲ−ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）の中にプラスミドｐＧＥＸ１９６を形質転換した。形質転換した細胞は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した２×ＹＴ＋Ｇ培養液（トリプトン１６ｇ／Ｌ；酵母抽出物 １０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ；ＮａＯＨによりｐＨ７．０；２％グルコース）中で培養した。
【００７２】
精製されたタンパク質を調製するために、大腸菌ＢＬＲ−ＤＥ３中のｐＧＥＸ１９６を一晩培養したものを１：１００に希釈し、Ａ_{６００ｎｍ}が０．８になるまでこの培養物を３７℃で増殖させた。０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加することによって、ＧＳＴ−ｈＯＳＭ融合タンパク質の発現を誘導し、さらに２時間培養を続けた。
【００７３】
バッチ精製によって、大腸菌の培養からＧＳＴ−ｈＯＳＭを単離した。３０００ｒｐｍで遠心することにより３Ｌの細菌培養を採取し、プロテイナーゼ阻害剤錠（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含有する５０ｍＬの氷冷したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）の中に生じた沈殿物を再懸濁した。５ｍＬのリゾチームを添加し、細胞懸濁物を氷上で５分間インキュベートした。細胞を４℃で音波処理して、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００と１０ｍＭ ジチオスレイトールを添加した。続いて、溶解物を攪拌しながら４℃で１０分間混合した後、１４０００ｇで遠心した。グルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ ｎｏ． Ｇ４５１０）に上清を加え、攪拌しながら４℃で３０分間混合した。該懸濁物を軽く遠心し、上清を吸引除去し、沈降したアガロースを氷冷したＰＢＳで２度洗浄した。溶出用緩衝液（２０ｍＭ グルタチオン、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ；ここでもｐＨ８．０）を加え、氷上で５分間、該懸濁物をインキュベートした。上清を集めて、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）によって、画分を分析した後、クマシーブリリアントブルー色素で染色して、精製したタンパク質の完全性を確認した。
【００７４】
Ｘａ因子とクマシーブリリアントブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示される最適な量のｈＯＳＭを産するトロンビンとを用いて、タンパク質分解至適化実験をセットアップした。イオン交換クロマトグラフィーによってＧＳＴとＯＳＭ産物の分離を達成し、Ｎ末端の配列決定と質量分析計によって精製したＯＳＭ産物を確認した。
【００７５】
例７ｂ：ＨｅｐＧ２ Ｂ６：ＯＳＭ誘導ｓＰＡＰアッセイ
以下に記載されているｓＰＡＰ（分泌胎盤アルカリホスファターゼ）ｃＤＮＡの上流にある６つの機能的ＳＴＡＴ３応答要素（ＲＥ）を安定的にＨｅｐＧ２細胞株（ＥＣＡＣＣ）にトラスフェクトしてＨｅｐＧ２Ｂ６を形成させた。ＳＴＡＴ３（転写のシグナルトランスデューサー及びアクチベーター）は、ＩＬ−６サイトカインファミリー細胞間シグナリングカスケードの中間体である。細胞表面受容体ＳＴＡＴ３の二量体化に続いて、リン酸化が行われた後、核の中のＤＮＡ ＲＥに結合し、下流のＤＮＡ（この構築物ではＤＮＡはｓＰＡＰである）を活性化する。このように、この株は、オンコスタチンＭの中で一晩インキュベートすることによってｓＰＡＰの産生を引き起こすことができる。
【００７６】
ＳＴＡＴ応答性分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ｓＰＡＰ）レポーター遺伝子を以下のごとく構築した。まず、３コピーのパリンドロームのＳＴＡＴ３応答要素（Ｗｅｇｅｎｋａ Ｕ．Ｍ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９３ Ｖｏｌ １３ ｐ２７６−２８８ ｐ２７７の表１）と５’ＸｈｏＩ部位を含有するオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｔｋＳＰＡＰのユニークなＳａｌＩ部位にクローニングしてｐＩＩＰ３−ｔｋ−ＳＰＡＰを作った。フィブリノーゲンβプロモーター中に見出されるＳＴＡＴ３応答要素をコードする合成オリゴヌクレオチド６コピー（Ｄａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１９９３；１３：１１８３−１１９３ 図１６、ＩＬ６ＲＥコンセンサスモチーフとＧＡＴテールのないＴＴＧリーダーを含むｈβＧＦ配列）を、さらに、ｐ１１Ｐ３−ｔｋ−ＳＰＡＰのＸｈｏ１中にクローニングして、ｐｌｌｘ６／ｌｌＰ３−ｔｋ−ＳＰＡＰを作成した。応答要素ｐｌｌｘ６／ｌｌＰ３−ｔｋ−ＳＰＡＰの数を確認するために配列を決定した後、Ｎｒｕ１とＸｂａ１で消化して、９つのＳＴＡＴ応答要素とｔｋ−ＳＰＡＰをコードする配列とを含有するＤＮＡの断片を単離した。続いて、プラスミドのｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｒｕ１とＸｂａ１部位の間にこれを移して（ＣＭＶプロモーターと置き換えている）、９つのＳＴＡＴ３応答要素、及びＨｅｐＧ２細胞株を確立するためのＮｅｏＲ選択可能マーカーとを含有するＳＰＡＰ遺伝子レポーターを作出した。
【００７７】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ ＮＥＡＡ、及び１０％ＨＩウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中にて、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気、湿度９２％でＨｅｐＧ２細胞（ＥＣＡＣＣ）を増殖させた。ＳＴＡＴ−ｓＰＡＰレポーターを用いたトランスフェクションのために、１０ｃｍの組織培養皿の中に、１％の密集度で細胞を播種し、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＴＡＴ−ｓＰＡＰレポーターベクター１０μｇをトランスフェクトした。１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８個体細胞株の存在下で、クローン選択を行った後、ＩＬ−６がＳＴＡＴｓＰＡＰレポーター遺伝子からｓＰＡＰ発現の増加を引き起こす能力をスクリーニングした。
【００７８】
１００μＬの培地（ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）、１０％ＨＩ ＦＣＳ、１％の非必須アミノ酸、ｍＭグルタミン、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８、（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから））中ウェル当たり３×１０^４細胞の最終濃度になるように、９６ウェルのプレート中にＨｅｐＧ２Ｂ６細胞を播種した。４８時間、細胞を平衡化させた。推定抗ＯＳＭ固体化合物をＤＭＳＯ中の２０ｍＭのストック希釈物に調製し、ＤＭＳＯで１：３の連続希釈を行った。続いて、ＨｅｐＧ２６Ｂアッセイ培地（これは、１０％ ＨＩ ＦＣＳに置き換えた、１％の熱で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有することを除いて上記培地と同じである）でさらにこれを希釈した。化合物は、最終濃度１％のＤＭＳＯで、最高濃度２００μＭから最終濃度０．０９μＭまで１：３で希釈した（すなわち、２００、６６．６７、２２．２２、７．４１、２．４７、０．８２、０．２７、０．０９、及び０μＭ）。古い培地をウェルから取り除き、２ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）も含有する希釈された化合物で置換し、さらに２０時間細胞をインキュベートした。各希釈は３個ずつ行った。各ウェルから２０μＬの培地を除去し、基質としてｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸；Ｓｉｇｍａ）を用いてｓＰＡＰ活性をアッセイした。内在性アルカリホスファターゼはＬ−ホモアルギニンでブロックする。基質の光学密度は、４０５−６５０ｎｍで読む。化合物の濃度は、産生したｓＰＡＰの測定値としてＯＤに対してプロッティングし、ＩＣ５０値を決定するために分析することができる。
【００７９】
例７ｃ：Ａ５４９細胞：ＴＮＦα誘導ｓＰＡＰアッセイ
本アッセイでは、アルカリホスファターゼに連結されたＥ−セレクチン遺伝子のサイトカイン応答領域を含むレポーター遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＡ５４９細胞を用いた（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３２８：７０７−７１５，１９９７）。このトランスフェクトされた細胞株は、ＴＮＦαとの一晩のインキュベーションによってｓＰＡＰを産生するように誘導され得る。
【００８０】
１００μＬの培地中ウェル当たり５×１０^４細胞の最終濃度になるように、９６ウェルのプレート中に５４９細胞を播種した。２４時間、細胞を平衡化させた。推定抗ＯＳＭ固体化合物をＤＭＳＯ中の２０ｍＭのストック希釈物に調製し、ＤＭＳＯで１：３の連続希釈を行った。続いて、これを培地（ＤＭＥＭ、１、１％の熱で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性、１％非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、５００μｇ／ｍＬＧ４１８（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）でさらにこれを希釈して１％の最終濃度のＤＭＳＯ中０．０９−２００μＭの濃度応答を得た。ウェルから古い培地を取り除き、３ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）も含有する希釈された化合物で置換し、さらに２０時間細胞をインキュベートした。各希釈は３個ずつ行った。各ウェルから２０μＬの培地を除去し、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いてｓＰＡＰ活性をアッセイした。内在性アルカリホスファターゼはＬ−ホモアルギニン（Ｓｉｇｍａ）でブロックする。基質の光学密度は、４０５−６５０ｎｍで読む。化合物の濃度は、産生したｓＰＡＰの測定値としてＯＤに対してプロッティングし、ＩＣ５０値を決定するために分析することができる。
【００８１】
例７ｄ：細胞生存アッセイ
細胞の生存は、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；４９０ｎｍで直接測定できる可溶性ホルマザン産物へのＭＴＳ）を還元する代謝的に活性な細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素の能力として測定した。
【００８２】
０．０４６μｇ／ｍＬのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ；Ｓｉｇｍａ）を含有する２ｍｇ／ｍＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の溶液をダルベッコＰＢＳ中で調製した。ｓＰＡＰ活性アッセイ用培地を除去した後、２０μＬ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳを添加した。続いて、さらに４５分間、細胞をインキュベートした。続いて、６３０ｎｍの参照を用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８３】
例７ｅ：アンタゴニスト
Ｎ−（１Ｈ−ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン−４−イル）ベンズアミド（Ｄａｖｏｌｌ ａｎｄ Ｋｅｒｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２５８９，１９６１）（ＧＷ ３４０４４２Ｘ）は、０．３μＭのＩＣ_５０で濃度依存的なＯＳＭ誘導ｓＰＡＰ放出の阻害をもたらしたが（図１６）、ＴＮＦα誘導ｓＰＡＰを阻害するのにはずっと強度が低かった（約９２μＭのＩＣ_５０値）（図１７）。それ故、該化合物は、ＴＮＦαに比べて、ＯＳＭに対する選択性が１００倍を超える。
【００８４】
例８ａ：抗ヒトＯＳＭ抗体の作成と試験
以下のように、マウスの中でヒトＯＳＭ（Ｒ＋Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対してモノクローナル抗体を生じせしめた：第０、３、５、及び２４日目に、ＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩ、ハミルトン、ＭＴ）中に乳化した１μｇの組換えヒトＯＳＭ抗原（皮下）とフロイントの完全アジュバント中１μｇの抗原（腹腔内）（２７日目に、マウスには、生理的食塩水中１μｇの抗原の腹腔内投与を与えた）との組合せ、又は第０、３、５、２４、及び５３日目に、腹腔内にＲＩＢＩアジュバントに乳化した１μｇの抗原の何れかで、組換えヒトＯＳＭを用いてＳＪＬ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｎｃ． Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）を免疫した（第５４目に、マウスの腹腔内に生理的食塩水中の１．５μｇの抗原を投与した）。
【００８５】
歳後の免疫化から２４時間後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を採取し、融合のための準備をした。融合操作は、Ｓｕ Ｊ−Ｌら：：Ｈｙｂｒｉｄａｏｍ １９９８；１７（１）：４７−５３に記載されているとおりであった。簡潔に述べれば、ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、脾臓細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ｂｃｌ−２−１３（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ＫＥ， ｅｔ ａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９９７；１６（４）：３８７−３９５）とを５：１又は１：１の比率で融合した。等しい容量の１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１×Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とＥＸＣＥＬＬ−６１０（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）から構成されるハイブリドーマ増殖用培地中に、１×１０^６細胞／ｍＬで融合細胞を再懸濁した。続いて、１ｍＬ／ウェルで、２４ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に細胞を播種した。２４時間後に、ハイブリドーマ増殖用中の１ｍＬの２×ＨＡＴ選別培地；１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ_２での培養から２週間後に、ＥＬＩＳＡによって、抗ＯＳＭ抗体の分泌について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。選択したハイブリドーマに対して、制限希釈クローニング（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）を行った。
【００８６】
結合したヒトＯＳＭを含有する９６ウェルのプレート中でハイブリドーマの上清と希釈した血清をインキュベートした。アルカリホスファターゼ抗マウス抗体によって、抗ｈＯＳＭ抗体を検出した。陽性の結果を与えた抗体についての２回反復測定したＯＤ値が表２に示されている。
【００８７】
【表２】

３つの上清と１つを除く全てのマウス血清がＥＬＩＳＡで陽性の結果を与えた。ＥＬＩＳＡデータを用いて、抗体濃度のおよその測定値を決定し、続いて、例７ｂに記載されたＨｅｐＧ２ Ｂ６ ｓＰＡＰアッセイで、２ｎｇ／ｍＬのＯＳＭに対して陽性抗体を滴定した。要約すれば、ＨｅｐＧ２Ｂ６細胞とインキュベートする前に、４℃で、抗体をサイトカインと共に一晩インキュベートした。例７ｂに記載されているようにｓＰＡＰ産生をアッセイした。ハイブリドーマ上清及びマウスの血清によるｓＰＡＰ産生の阻害が図１８に示されている。
【００８８】
例９ａ：ＯＳＭ上に存在する受容体に対する中心的結合残基の同定
まず、サイトカインのＩＬ−６ファミリーの関連メンバーと参照することによって、ｈＯＳＭ上の受容体結合部位を同定した。部位１と３は、受容体のサイトカイン特異的な鎖への結合に関与していると考えられているのに対して、部位２は、共通の受容体成分ｇｐ１３０への結合に関与していると考えられている。ＩＬ−６ファミリーサイトカインの白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）中の部位２の突然変異研究（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，１１９７１−１１９７８）、インターロイキンー６（ＩＬ−６）（Ｐａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，１９４２−１９５１、及びＳａｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３ １３５７−１３６７）は、部位２の中の残基への変化は、ｇｐ１３０への結合の変化をもたらすことができるということを示唆している。そのｇｐ１３０との相互作用に重要であるＯＳＭの残基を調査するために、部位２の領域中のＯＳＭの表面に露出しているでろう残基を同定することが必要であった。ｎｍｒ実験（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ７２７３−２８２）及びＬＩＦの公表された構造（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｃｅｌｌ ７７ １１０１−１６）からの情報を用いて、ＯＳＭの相同性モデルを構築した。このモデルで部位２領域中の表面位置を占める残基を突然変異誘発のために選択した。成長ホルモン（ＯＳＭの相同体）とその受容体との間に形成された複合体の構造を決定した（Ｄｅ Ｖｏｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５ ３０６）。ＯＳＭのモデルを成長ホルモンと重ね合わせることによって、ＯＳＭとｇｐ１３０との間で相互作用している可能性がある部位がさらに同定された。これらのモデル研究に基づいて、ｇｐ１３０とのその相互作用を調べるために、ＯＳＭ中の２７部位を突然変異のために選択した。表３を参照されたい。これらの各部位では、アラニン残基が野生型残基と置きかえられた。
【００８９】
【表３】

例９ｂ：変異体ＯＳＭ−ＧＳＴ融合分子の合成
２７の各突然変異について、一対の突然変異オリゴヌクレオチドがデザインされた。これらは、長さが約３３塩基であり、好ましくは、何れかの末端にＧ又はＣ残基を有していた。ｌａｃ（／ＩＰＴＧ誘導性）プロモーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の制御下で、「野生型」ＯＳＭ ＤＮＡ（配列番号１２参照）を含有するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来の発現にこれらをアニーリングさせ、ネイティブＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて伸長させた。Ｄｐｎ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて最初のテンプレートＤＮＡを消化し、新たに合成したプラスミド（これはＤｐｎ１の基質ではなかった）を大腸菌株ＤＨ５α（ＧｉｂｃｏＢＢＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に形質転換した。少ないコロニーのセット（典型的には４つ）を取り出し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列を決定した。各変異に対する代表的な変異体クローンを、組換えタンパク質を発現させるために、同様に構築した野生型と平行して、大腸菌株ＢＬＲ（非ＤＥ３：Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換した。０．５Ｌの培養液を確立し、約０．５のＯＤ５５０に誘導した。３時間誘導した後、細胞を遠心によって沈降させ、ライソザイムと音波処理を組合せた方法を用いて溶解させた。組換え変異タンパク質は、ＧＳＴとの融合として発現されたので、融合物を結合するために、グルタチオンセファロースカラムを用いた。続いて、フリーのグルタチオンを用いて、カラムから融合タンパク質を溶出した後、室温で４時間１０ｍＭのＤＴＴの中でインキュベートして、グルタチオン付加物を除去し、−８０℃で保存した。
【００９０】
例９ｃ：ＯＳＭ−ＧＳＴがＥＬＩＳＡにおいて野生型ＯＳＭのｇｐ１３０−Ｆｃへの結合と拮抗する能力に対する点変異の影響
野生型ＯＳＭ（例７ａに従って作成）；５０μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬ炭酸／重炭酸緩衝液ｐＨ９．４中）によって、一晩（４℃）Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｆ６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコートした。プレートを洗浄し（ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で×６、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｐｌａｔｅ洗浄機を使用）、叩いて乾燥させ、非特異的結合を減少させるためにブロックした（２００μＬ／ウェル、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）。１時間インキュベートした後に（室温、揺動する台の上）、プレートを叩いて乾燥させ、例９ｂで得た野生型（ｗｔ）又は変異体ＯＳＭ−ＧＳＴを添加した（５０μＬ／ウェル、２０−０．００２μｇ／ｍＬ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で滴定）。ポジティブコントロールとして、ポリクローナル抗ヒトＯＳＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）もテストした（２０−０．０２μｇ／ｍＬ）。ｇｐ１３０−Ｆｃ（３００ｎｇ／ｍＬ以下になるように作成）と１％のＢＳＡ／ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）中の抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（１：５００、Ｓｉｇｍａ）との複合体は、テストされる物質の直後に添加した。５時間インキュベートした後に（室温、揺動する台の上）、プレートを洗浄し（×６）、製造者の指示どおりにＥＬＩＳＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて展開し、４９０ｎｍでＯＤを測定した。各プレート上で、１％ＢＳＡ／ＰＢＳの存在下ｇｐ１３０−Ｆｃ／コンジュゲートとＯＳＭにより総結合を決定し、ＯＳＭの不存在下ｇｐ１３０−Ｆｃ／コンジュゲートにより非特異的結合、又はｇｐ１３０−Ｆｃの不存在下でのコンジュゲートのＯＳＭへの結合を決定した。
【００９１】
ヒトｇｐ１３０の細胞外ドメインをコードするＤＮＡは、ヒトｇｐ１３０のＧｅｎＢａｎｋ得データベース配列（受付番号Ｍ５７２３０）からデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマー、

を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
【００９２】
前記フォワードプライマーはＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位、及びその後にｇｐ１３０コード配列の開始と相補的なＤＮＡ配列が続いているコンセンサス５’未翻訳配列を含有していた。前記リバースプライマーは、その後に、ｇｐ１３０コード配列の細胞外ドメインの３’末端と相補的なＤＮＡ配列が続いているＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有していた。該ＰＣＲ断片を精製し、ｐＣＲ２．１ｇｐ１３０を与えるためにｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。
【００９３】
プラスミドｐＣＲ２．１ｇｐ１３０を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｇｐ１３０断片を精製し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド中のＢａｍＨＩとＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ部位の中にサブクローニングした。続いて、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドを消化し、得られたｇｐ１３０Ｆｃ断片を精製し、バキュロウイルス発現ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブクローニングして、ｐＢＡＣｇｐＦｃと表記されるプラスミドを作成した。
【００９４】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、昆虫細胞の中で融合タンパク質ｇｐ１３０Ｆｃを発現した後、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、クマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び市販の抗ｇｐ１３０と抗ｈＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって確認した。ＩＣ_５０を得るために、３−６実験で変異及び野生型ＯＳＭ−ＧＳＴをテストした。ＯＳＭとｇｐ１３０−Ｆｃの存在下、拮抗するリガンドの不存在下での平均ＯＤ（すなわち、総結合）は１．１５７（レンジ０．８２５−１．８０７）であり、非特異的結合は、０．０８未満であった。抗ＯＳＭ抗体は、全てのアッセイで濃度依存的な阻害をもたらした（１μｇ／ｍＬで７４±１％阻害）。野生型ＯＳＭ−ＧＳＴは、プレートに結合したＯＳＭと競合して、６つの独立した実験で決定された０．１３９±０．０２５８μｇ／ｍＬのＩＣ５０で、濃度依存的な阻害を与えた（図１９）。変異ＯＳＭ−ＧＳＴがプレートに結合したｗｔＯＳＭと競合する効力は、表４にまとめられている。ｗｔＯＳＭとｇｐ１３０の結合を競合する能力が実質的に減少した変異は、Ｌ１３Ａ、Ｑ１６Ａ、Ｑ２０Ａ、Ｇ１２０Ａ、Ｎ１２３Ａ、及びＮ１２４Ａであった。これらのうち、Ｑ２０ＡとＱ１６Ａは最も弱かった：テストした最大濃度（１０μｇ／ｍＬ）で、Ｑ２０Ａは６６±２．３％の阻害を引き起こし、Ｑ１６Ａは１５±８％の阻害にすぎなかった（図１９）。
【００９５】
表４：野生型及び変異ＯＳＭ−ＧＳＴがＥＬＩＳＡにおいてプレートに結合したｗｔＯＳＭとｇｐ１３０−Ｆｃへの結合を競合する効力。ＩＣ_５０値は３−６の独立した実験で決定された。
【００９６】
【表４】

例９ｄ：ＨｅｐＧ２ Ｂ６インビトロアッセイにおけるＯＳＭ駆動ｓＰＡＰ産生に対するＯＳＭ中の点変異の影響
上記例７ｂに記載したアッセイを利用した。ＯＳＭ−ＧＳＴ変異体は、濃度が明らかな例９ｂで作成したインタクトなＯＳＭ変異体を用いて、１００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈した。対照用に野生型ＯＳＭ−ＧＳＴを含有せしめた。１％の熱で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性のＨｅｐＧ２ Ｂ６溶媒で希釈を行った。続いて、１：３の連続希釈を行った（１００；３３．３３；１１．１１；３．７；１．２３；０．４ｎｇ／ｍＬ）。１００μＬの溶媒中、９６穴のプレートの各ウェルの中に３×１０^４個のＨｅｐＧ２ Ｂ６を分配した。４８時間、細胞を平衡化させた。続いて、溶媒を取り除き、１００μＬの希釈されたＯＳＭ−ＧＳＴ変異体で置換した。さらに２０時間細胞をインキュベートした。各希釈は３個ずつ行った。２０μＬの溶媒を除去し、基質としてｐＮＰＰを用いてｓＰＡＰをアッセイした。内在性ＡＬＰはＬ−ホモアルギニンでブロックした。Ｏ．Ｄ．は、４０５−６５０ｎｍで読んだ。実験は、２回繰り返した。
【００９７】
多くの変異体は、野生型と同じように、ｓＰＡＰの放出を駆動することができた。３つの変異体は、極めて低レベルのｓＰＡＰを産生した。ＥＣ_５０は、これらの変異体からは得られなかった。（図２０）は、ｓＰＡＰの産生を駆動する効率がより低い「変異体９（Ｑ１６Ａ）、１３（Ｑ２０Ａ）、及び２０（Ｇ１２０Ａ）から得られたＯ．Ｄ．プロットを示している。野生型ＯＳＭ−ＧＳＴを比較のために示す。これらのデータは、ＥＣ_５０値を算出するために使用した。各変異体に対する実際のＥＣ_５０、及び野生型のパーセントとしての表記が表５に示されている。
【００９８】
【表５】

この表を調べると、ＥＬＩＳＡにおいて野生型とは相当異なるそれらの変異体のうち３つは、ｓＰＡＰアッセイでもより効力が低く、６−Ｌ１３Ａ；１０−Ｌ１７Ａ；２２−Ｎ１２３Ａ、及び４番目の２３−Ｎ１２４Ａは、任意的なスコアリングシステムにより、同等の効力グレードに区分される。このように、両タイプのアッセイは、良好な一致を示している。変異体の幾つかは、ｓＰＡＰ産生の駆動において野生型より「効力」が低かったが、ｓＰＡＰを全く駆動しなかった変異体（Ｑ１６Ａ、Ｑ２０Ａ、Ｇ１２０Ａ）での実験を除く２つの実験の間には変動があった。該アッセイ結果は、Ｇ１２０Ａ、Ｑ１６Ａ、及びＱ２０ＡはＯＳＭのｇｐ１３０への結合に影響を与えることを示している。Ｎ１２３ＡとＮ１２４Ａもｇｐ１３０との相互作用に幾らかの影響を有するようである。
【００９９】
例１０：胃炎におけるＯＳＭの役割
Ｈ．ピロリは、胃炎、消化性潰瘍性疾患、及び胃癌を引き起こすと推測されているらせん状のグラム陰性細菌である。Ｈ．ピロリＣａｇ＋株は、Ｈ．ピロリＣａｇ−株よりも潰瘍の発生率が高い。ディファレンシャル遺伝子発現分析によって、宿主のＨ．ピロリ感染に対する応答を調べるために、Ｈ．ピロリ株（より病原性の強いＣａｇ＋、及びＣａｇ−）を胃内皮細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ（ＥＣＡＣＣ）と共にインビトロで培養した。４５分、３時間、及び２４時間の３つの時点でｍＲＮＡを単離し、由来する放射性プローブを（サイトカイン、サイトカイン受容体、及び接着分子を含むおよそ１３６のヒト遺伝子を含有する）高密度ｃＤＮＡ遺伝子アレイにハイブリダイズさせた。得られた遺伝子発現のプロフィールの分析によって、Ｈ．ピロリ株に応答した多数の遺伝子の誘導／抑制が明らかになった。オンコスタチンＭは、病原性が弱いＨ．ピロリ（Ｃａｇ−）に暴露された細胞又は未処置の対照に比べて、病原性が強いＨ．ピロリ（Ｃａｇ＋）株に暴露された細胞中で誘導されることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 滑膜生検培養物によるエクソビボでのオンコスタチンＭの分泌を示すＥＬＩＳＡを示す図。
【図２】炎症性であるが、非炎症性でない滑膜培養物によるエクソビボでのオンコスタチンＭの自発的分泌を示す図。
【図３】 ＰＭＡで分化されたＴＨＰ−１細胞によるｒｈＯＳＭのＴＮＦα産生の効果を示す図。
【図４】 ＯＳＭとＴＮＦαとのエクソビボでのコラーゲン放出を促進する協働作用を示す図。
【図５】 ＯＳＭとＴＮＦαとのエクソビボでのコラーゲン放出を促進する協働作用を示す図。
【図６】 抗Ｌ−セレクチン抗体を介したＯＳＭの分泌を示す図。
【図７】 フコイダンで誘導されたＯＳＭの分泌を示す図。
【図８】 ｇｐ１３０Ｐ及びＥ−セレクチン抗体を用いたＲＡの血管内皮細胞の染色を実証した顕微鏡写真。
【図９】 ｇｐ１３０Ｐ及びＥ−セレクチン抗体を用いたＲＡの血管内皮細胞の染色を実証した顕微鏡写真。
【図１０】 対照及びＣＩＩ−関節炎マウスから得た関節中のＯＳＭのｍＲＮＡを示す図。
【図１１】 ヤギ抗ＯＳＭ抗体又は対照ヤギＩｇＧで処置した関節炎ＤＢＡ−１マウスを示す図（１１Ａは臨床スコア、１１Ｂは肢の厚さ）。
【図１２】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データを示す図（対照マウスは、ＰＭＮ及び単核細胞による関節への著しい浸潤を示した）。
【図１３】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データを示す図（関節の軟骨の表面破壊は、広い好中球の浸潤を特徴とした）。
【図１４】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データを示す図；細胞の浸潤レベルが顕著に減少しており関節の軟骨が損傷されていないことを実証する、正常／穏やかな関節炎の抗ＯＳＭ処理した動物の代表的な関節。
【図１５】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データを示す図；細胞の浸潤レベルが顕著に減少しており関節の軟骨が損傷されていないことを実証する、正常／穏やかな関節炎を有する抗ＯＳＭ処理した動物の代表的な関節。
【図１６】 ＯＳＭに誘導されたｓＰＡＰ放出の濃度依存性阻害を示すＮ−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミドに対するＨｅｐＧ２ Ｂ６ ｓＰＡＰ及びＭＴＳアッセイを示す図。
【図１７】 Ａ５４９細胞からのＴＮＦα誘導性ｓＰＡＰの放出の限られた阻害を示すＮ−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミドに対するＴＮＦα ｓＰＡＰ及びＭＴＳアッセイを示す図。
【図１８】 ＨｅｐＧ２ Ｂ６アッセイにおけるｓＰＡＰ産生の抗体阻害を示す図（Ｍ２―Ｍ４は、４匹のマウス個体から採取したマウスの血清を表し、ＯＭ５−６．１、ＯＭ５−６．１０、ＯＭ６−１０．１１１は実験的に得られたハイブリドーマの上清を表す）。
【図１９】 野生型及びプレートに結合した野生型ＯＳＭとの変異ＯＳＭ−ＧＳＴ融合体とのＥｌｉｓａにおけるｇｐ１３０−ｆｃへの結合の拮抗を示す図。
【図２０】 ＨｅｐＧ２細胞におけるｓＰＡＰ産生を引き起こす活性が最少である３つの変異ＯＳＭ−ＧＳＴのＯ．Ｄ．プロットを示す図。

Claims (8)

1. 炎症性関節症を治療又は予防するための医薬を製造するための、ヒトＯＳＭに対する抗体の使用。
2. 前記炎症性関節症が慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎からなる群から選択される、請求項 1 に記載の使用。
3. 前記抗体が F(ab') ₂ 、 Fab 、 Fv 、 ScFv から選択される抗体断片である、請求項 1 または２に記載の使用。
4. 前記抗体がヒト化又はキメラ化されている請求項 1 または２に記載の使用。
5. 慢性関節リウマチの治療のための、請求項２に記載の使用。
6. 前記抗体が免疫抑制剤、耐性誘導剤、又は抗炎症剤と併用される、請求項 1 〜５の何れか１項に記載の使用。
7. 前記抗体がＣＤ＋４ Ｔ細胞阻害剤、抗ＣＤ２３抗体、又はＴＮＦアンタゴニストと併用される、請求項 6に記載の使用。
8. 前記医薬が軟骨からのコラーゲンの放出を阻害又は抑制するために使用される、請求項 1に記載の使用。

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