RU2758139C2 - Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf - Google Patents

Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf Download PDF

Info

Publication number
RU2758139C2
RU2758139C2 RU2019117750A RU2019117750A RU2758139C2 RU 2758139 C2 RU2758139 C2 RU 2758139C2 RU 2019117750 A RU2019117750 A RU 2019117750A RU 2019117750 A RU2019117750 A RU 2019117750A RU 2758139 C2 RU2758139 C2 RU 2758139C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ser
leu
gly
ala
thr
Prior art date
Application number
RU2019117750A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019117750A3 (ru
RU2019117750A (ru
Inventor
Дарио Нери
Роберто ДЕ ЛУКА
Сара ВУЛЬХФАРД
Original Assignee
Филоджен С.П.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1712916.4A external-priority patent/GB201712916D0/en
Application filed by Филоджен С.П.А. filed Critical Филоджен С.П.А.
Publication of RU2019117750A publication Critical patent/RU2019117750A/ru
Publication of RU2019117750A3 publication Critical patent/RU2019117750A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2758139C2 publication Critical patent/RU2758139C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгатам, содержащим интерлейкин 2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа) и молекулу антитела, которая связывает фибронектин, и может быть использовано в медицине для лечения злокачественной опухоли. Изобретение обеспечивает улучшение переносимости двойного иммуноцитокина без изменения эффективности за счет применения мутанта TNFальфа со сниженной активностью. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим интерлейкин 2 (IL2), мутантную форму фактора некроза опухоли, такого как фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и молекулу антитела. Молекула антитела предпочтительно связывается с антигеном, ассоциированным с неопластическим ростом опухоли и/или ангиогенезом, таким как экстрадомен A (EDA) и экстрадомен B (EDB) фибронектина. Конъюгаты можно использовать, например, для лечения злокачественной опухоли.
Уровень техники
Многие цитокины продемонстрировали высокую противоопухолевую активность в доклинических экспериментах, и они являются перспективными средствами для терапии злокачественной опухоли. Однако, несмотря на обнадеживающие результаты в моделях на животных, только несколько цитокинов, таких как пролейкин 1 (IL2), роферон A1 (интерферон альфа-2a [IFNα 2a]), интрон A1 (IFNα 2b), беромун 1 (рекомбинантный TNFα) были одобрены в качестве лекарственных средств против злокачественной опухоли. В настоящее время показания для цитокинов включают метастазирующий почечно-клеточный рак, злокачественную меланому, волосатоклеточный лейкоз, хроническую миелоидную лимфому, саркому и множественную миелому. Цитокины можно вводить либо отдельно, либо в комбинации с химиотерапией.
Следующей проблемой провоспалительных цитокинов является, в частности, то, что их применению в терапии часто препятствует значительная токсичность даже в низких дозах, которая препятствует повышению терапевтически активных доз (Hemmerle et al. (2013) Br. J. Cancer 109, 1206-1213).
В попытках увеличить терапевтический индекс определенных цитокинов, были предложены слитые белки антитело-цитокин (также обозначаемые как "иммуноцитокины"). В этих конъюгатах антитело служит в качестве "носителя" для селективного накопления в области заболевания, в то время как цитокиновый груз ответственен за терапевтическую активность (Pasche & Neri, 2012, Drug Discov. Today, 17, 583). Определенные иммуноцитокины на основе провоспалительных грузов (таких как IL2, IL4, IL12 и TNFα) демонстрируют выраженную противоопухолевую активность в моделях на мышах (Hess et al., 2014, Med. Chem. Comm., 5, 408) и дали обнадеживающие результаты у пациентов как с солидными опухолями, так и с гематологическими злокачественными опухолями (Eigentler et al., 2011, Clin. Cancer Res. 17, 7732-7742; Papadia et al., 2013, J. Surg. Oncol. 107, 173-179; Gutbrodt et al., 2013, Sci. Transl. Med. 5, 201-204; Weide et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 668-678; Danielli et al., 2015, Cancer Immunol. Immunother. 64, 113-121]. Антитело F8 (специфичное к альтернативно-сплайсированному домену EDA фибронектина, маркеру опухолевого ангиогенеза; Rybak et al. (2007) Cancer Res. 67, 10948-10957) используют для нацеливания на опухоль, как отдельно, так и слитым либо с TNF, либо с IL2 (Villa et al. (2008) Int. J. Cancer 122, 2405-2413; Hemmerle et al. (2013) Br. J. Cancer 109, 1206-1213; Frey et al. (2008) J. Urol. 184, 2540-2548).
Описаны конструкции, которые содержат три копии одного модифицированного цитокина суперсемейства TNF, который имеет сниженную активность в отношении его рецептора (WO2015/007903). Конструкции специфически доставляют к клеткам-мишеням посредством нацеливающей части. Модифицированные цитокины, используемые в этих конструкциях, включают мутантный TNF с активностью в диапазоне от 0,02% до 5% от активности TNF дикого типа, включая мутантные TNF с заменами Y87Q, I97S, Y115A, Y87F, Y115G или I97A. Также описан эффект R32G.
В некоторых случаях иммуноцитокины могут опосредовать устранение опухоли в моделях злокачественной опухоли на мышах при использовании в качестве единственных средств (Gutbrodt et al., 2013, Sci. Transl. Med. 5, 201-204]. Однако в большинстве случаев один продукт-иммуноцитокин не способен индуцировать полное устранение опухоли. Однако излечение злокачественной опухоли описано для комбинаций иммуноцитокинов с цитотоксическими средствами (Moschetta et al., 2012, Cancer Res. 72, 1814-1824], интактными антителами (Schliemann et al., 2009, Blood, 113, 2275-2283] и облучением внешним пучком (Zegers et al., 2015, Clin. Cancer Res., 21, 1151-1160).
Кроме того, несколько комбинаций иммуноцитокинов используются в терапии. Например, конъюгаты L19-IL2 и L19-TNFα были способны излечить нейробластому в модели заболевания на полностью сингенных мышах, в то время отдельные иммуноцитокины, используемые в качестве единственных средств, не приводили к устранению заболевания (Balza et al., 2010, Int. J. Cancer, 127, 101). Комбинация грузов IL2 и TNFα также продемонстрировала перспективные результаты в клинических испытаниях. Было показано, что слитые белки L19-IL2 и L19-TNF обладают высокой синергичностью при внутриочаговом лечении определенных солидных опухолей у мышей (Schwager et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133, 751-758). Соответствующие полностью человеческие слитые белки вводят внутрь очага повреждения пациентам с меланомой стадии IIIC (Danielli et al., 2015, Cancer Immunol. Immunother. 64, 113-121), и они демонстрируют лучшие результаты по сравнению с внутриочаговым введением интерлейкина-2 (Weide et al., 2011, Cancer - 116, 4139-4146) или L19-IL2 (Weide et al., 2014, Cancer Immunol. Immunother. 2, 668-678). Однако генетическое слияние цитокина с антителом не всегда приводит к увеличенной эффективности. Например, слияние интерлейкина-17 с антителом для нацеливания не снижало рост опухоли (Pasche et al., 2012, Angiogenesis 15, 165-169).
Также были предприняты попытки получить "двойные иммуноцитокины", в которых антитело является генетически слитым с двумя различными цитокинами. Например, интерлейкин-12 (IL12) и TNFα были включены в одну молекулярную структуру. Однако эти попытки не были успешными и не привели к программам клинических разработок. В частности, описана тройная слитая конструкция, состоящая из: (i) антитела L19 в формате scFv (специфичного к альтернативно-сплайсированному домену EDB фибронектина, маркеру опухолевого ангиогенеза); (ii) TNFα мыши; и (iii) IL12 мыши в одноцепочечном формате (Halin et al., 2003, Cancer Res., 63, 3202-3210). Этот слитый белок смогли экспрессировать и очистить до однородного состояния. Этот слитый белок также связывался со своим антигеном с высокой аффинностью и специфичностью, однако (в отличие от L19-TNFα и L19-IL12), он не локализовался в солидных опухолях in vivo, о чем свидетельствовали исследования количественного биораспределения у мышей, имеющих опухоль. Таким образом, поведение двойных иммуноцитокинов in vivo является чрезвычайно непредсказуемым.
Также описаны бифункциональные слитые белки цитокинов, в которых цитокины связаны с интактным целым антителом (или Fc-частью антитела) (Gillies et al., 2002, Cancer Immunol. Immunother. 51, 449). Эти слитые белки содержали интерлейкин-2/интерлейкин-12 (IL2/IL12) или интерлейкин-4/гранулолцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (IL4/GM-CSF). Активность цитокинов была сохранена в конструкциях, в которых цитокины были слиты тандемно с С-концом Fc или тяжелой (H) цепи антитела, а также в конструкциях, в которых один цитокин был слит с С-концом H-цепи, в то время как второй цитокин был слит с N-концом вариабельной области либо H, либо легкой (L) цепи. Связывание антигена слитыми белками антитело-цитокин сохранялось. Однако терапевтическая активность in vivo описана только для применений в генной терапии (т.е. опухолевые клетки, трансфицированные соответствующими иммуноцитокинами IL2/IL12), но не для терапевтических белков. Бифункциональные слитые белки цитокинов, содержащие другие типы нацеливающих частей, не описаны.
Имманентная сложность успешной экспрессии иммуноконъюгатов, содержащих два различных цитокина в одной молекуле (также называемых "двойными иммуноцитокинами") и бесперспективные результаты, полученные для таких молекул, как описано выше (например, в Halin et al (2003)), означают, что к этим молекулярным форматам отсутствует интерес в отношении клинических применений.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения установили, что применение мутанта фактора некроза опухоли (TNF) со сниженной активностью улучшает переносимость двойного иммуноцитокина, который содержит TNF и IL2, а также нацеливающую молекулу антитела, без изменения эффективности.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к конъюгату, содержащему интерлейкин-2 (IL2), мутант TNF, имеющий сниженную активность, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.
Другой аспект изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей такой конъюгат, а также к экспрессирующему вектору, содержащему такую нуклеиновую кислоту. Также предусматривается клетка-хозяин, содержащая такой вектор.
Другой аспект изобретения относится к конъюгату, описанному в настоящем описании, для применения в способе лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, на новообразованные сосуды in vivo, а также к конъюгату, описанному в настоящем описании, для применения в способе доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли у пациента.
Другой аспект изобретения относится к способу лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, на новообразованные сосуды у пациента, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата, описанного в настоящем описании, пациенту, а также к способу доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли у пациента, включающему введение пациенту конъюгата, описанного в настоящем описании.
Кроме того, другой аспект изобретения относится к применению конъюгата, описанного в настоящем описании, для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли. Аналогично предусматривается применение конъюгата, описанного в настоящем описании, для получения лекарственного средства для доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена активность уничтожения клеток конъюгатом huIL2-F8-huTNFα и конъюгатом huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A). Протестированные конъюгаты представляли собой huIL2-F8-huTNFα и huIL2-F8-huTNFα (R32A), которые содержали мутантный TNFα в положении 32, IL2 и антитело F8 против ED-A. Активность уничтожения клеток этим мутантным конъюгатом сравнивали с активностью уничтожения клеток, наблюдаемой в присутствии конъюгата huIL2-F8-huTNFα. Активность уничтожения клеток конъюгатом huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) была более низкой, чем у конъюгата huIL2-F8-huTNFα, как можно видеть из величин EC50. Величины EC50 представляют собой концентрацию лекарственного средства, требуемую для полумаксимальной активности.
На фиг.2 представлена эффективность нацеливания in vivo конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A), оцененная посредством анализа биораспределения. Конъюгат huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) селективно накапливался в опухоли в модели тератокарциномы F9 на мышах.
На фиг.3 представлен анализ биологической активности IL2 конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) на основе пролиферации клеток CTLL-2.
На фиг.4 представлен анализ биологической активности TNF конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) на основе уничтожения клеток HT1080.
На фиг.5 представлен количественный анализ биораспределения меченного радиоактивным йодом конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) у иммунокомпетентных мышей, имеющих опухоли тератокарциномы F9.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему (i) часть, являющуюся интерлейкином-2 (IL2), (ii) часть, которая представляет собой мутант фактора некроза опухоли (TNF), имеющий сниженную активность, и (iii) молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.
Термин "молекула антитела" описывает иммуноглобулин, как природный, так и частично или полностью синтетический. Также термин относится к любому полипептиду или белку, содержащему антигенсвязывающий центр антитела. Молекулы антител можно выделять или получать путем очистки из природных источников, или в ином случае их можно получать посредством генетической рекомбинации или химического синтеза, и они могут содержать неприродные аминокислоты.
Антитела могут быть модифицированы рядом способов, термин "молекула антитела" следует считать охватывающим какой-либо конкретный связывающий представитель или вещество, имеющие антигенсвязывающий центр антитела с требуемой специфичностью и/или связыванием с антигеном. Таким образом, этот термин охватывает фрагменты антитела, в частности, антигенсвязывающие фрагменты, и производные, включая любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий центр антитела, как природный, так и полностью или частично синтетический. Таким образом, он включает химерные молекулы, содержащие антигенсвязывающий центр антитела или эквивалент, слитый с другим полипептидом (например, принадлежащим к другому классу или подклассу антител). Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в EP-A-0120694 и EP-A-0125023, и в большом количестве более поздней литературы.
Как упоминалось выше, фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (i) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546; McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490), который состоит из домена VH или VL; (v) выделенные области CDR; (vi) F(ab')2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента; (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет связывание двух доменов с образованием антигенсвязывающего центра (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (PCT/US92/09965); (ix) "диантитела" - поливалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные посредством слияния генов (WO94/13804; Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448) и (x) формат одноцепочечных диантител, где каждый из доменов VH и VL в наборе соединен коротким или "негибким" пептидным линкером. Fv, scFv или молекулы диантител можно стабилизировать путем включения дисульфидных мостиков, связывающих доменов VH и VL (Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245). Одноцепочечный Fv (scFv) может находиться в минииммуноглобулине или малом иммунопротеине (SIP), например, как описано в (Li et al., (1997), Protein Engineering, 10: 731-736). SIP может содержать молекулу scFv, слитую с доменом CH4 секреторной изоформы IgE человека IgE-S2 (εS2-CH4; Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205), образующим гомодимерную молекулу минииммуноглобулина. Также можно получать миниантитела, содержащие scFv, связанный с CH3-доменом (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61). Другими примерами связывающихся фрагментов являются Fab', который отличается от Fab-фрагментов присоединением нескольких остатков на С-конце CH1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела, и Fab'-SH, который представляет собой Fab'-фрагмент, в котором остаток(и) цистеина константных доменов содержат свободную тиольную группу.
Время полужизни молекул антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, может быть увеличено посредством химической модификации, особенно посредством пегилирования, или путем включения в липосому.
Подходящие молекулы антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, включают диантитела или более предпочтительно scFv. Диантитела и scFv не содержат Fc-область антитела, что потенциально снижает эффекты антиидиотипической реакции. Предпочтительно, молекула антитела для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой scFv.
Когда молекула антитела представляет собой scFv, домены VH и VL антитела предпочтительно связаны линкером из 10-20 аминокислот, линкером из 14-20 аминокислот, предпочтительно линкером из 10-14 аминокислот. Подходящие линкеры известны в данной области и доступны квалифицированному специалисту. Например, линкер может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51.
Когда молекула антитела представляет собой диантитело, домены VH и VL могут быть связаны линкером из 5-12 аминокислот. Диантитело содержит две молекулы VH-VL, которые связаны с образованием димера. Домены VH и VL каждой молекулы VH-VL могут быть связаны линкером из 5-12 аминокислот.
Авторы настоящего изобретения показали, что конъюгат, содержащий IL2; мутантный TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, демонстрирует сниженную токсичность по сравнению с конъюгатом, содержащим IL2; TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина. Более того, авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2; мутантный TNFα и молекулу антитела, которая связывает изоформу экстрадомена B (ED-B) фибронектина, демонстрирует сниженную токсичность по сравнению с рекомбинантным TNFα. Другие конъюгаты, содержащие IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, имеют аналогичным образом сниженную токсичность.
Токсичность конъюгата, содержащего мутантый TNF, как описано в настоящем описании, может быть снижена по сравнению с соответствующим конъюгатом, содержащим TNF дикого типа. Сниженная токсичность может обеспечивать улучшенную переносимость у пациента, например, снижение одного или нескольких неблагоприятных симптомов, ассоциированных с введением конъюгата(ов) пациенту. Неблагоприятные симптомы, уменьшаемые в результате уменьшения токсичности, могут включать снижение массы тела, тошноту, рвоту, лихорадку, озноб, приливы, крапивницу, сыпь, легочную токсичность, диспноэ, гипотензию, анафилаксию, сывороточную болезнь, повышенный уровень креатинина, головную боль.
Более того, снижение токсичности мутанта TNF в конъюгате повышает синергический эффект части, представляющей собой IL2, которую можно вводить в более высокой дозе вследствие более низкой активности мутантного TNF. Таким образом, цитокины с подобранной эффективностью в конъюгате могут быть пригодными в терапевтических применениях.
Авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2 и мутантный TNFα, и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, может успешно нацеливаться на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Более того, авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2 и мутант TNFα, и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен B (ED-B) фибронектина, может успешно нацеливаться на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Другие конъюгаты, содержащие IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, аналогично могут быть пригодными для нацеливания IL2 и мутантного TNF на новообразованные сосуды опухоли и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли. Также показано, что конъюгат, содержащий IL2; TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, нацелен на новообразованные сосуды опухоли in vivo (PCT/EP2016/060128).
Многие антигены, ассоциированные с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, известны в данной области в качестве антител, способных связывать такие антигены. Кроме того, антитела против данного антитела можно получать с использованием хорошо известных способов, таких как способы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антиген может представлять собой компонент внеклеточного матрикса, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как фибронектины, включая изоформу экстрадомена A (ED-A) фибронектина (A-FN), изоформу экстрадомена B (ED-B) фибронектина (B-FN), тенасцин C, ED-A фибронектина, ED-B фибронектина или домен A1 тенасцина C. Антитела, которые связывают ED-A фибронектина, и таким образом, также A-FN, известны в данной области и включают антитело F8. Антитела, которые связывают ED-B фибронектина, или домен A1 тенасцина C (и, таким образом, также B-FN и тенасцин C), также известны в данной области и включают антитела L19 и F16, соответственно. Было показано, что антитела, которые связывают ED-B фибронектина, или домен A1 тенасцина C, включая антитела L19 и F16, способны к специфическому нацеливанию на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Таким образом, конъюгат, описанный в настоящем описании, содержащий IL2, мутант TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, предпочтительно демонстрирует сниженную токсичность при введении пациенту по сравнению с введением конъюгата, содержащего IL2, TNF и молекулу антитела, пациенту.
Другие антигены, которые ассоциированы с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, включают карбоангидразу IX (маркер почечноклеточного рака), A33 и CEA (надежные маркеры рака ободочной и прямой кишки), HER2 (маркер рака молочной железы), PSMA (маркер рака предстательной железы) и белок активации фибробластов (протеаза, присутствующая как в качестве мембраносвязанного белка, так и в качестве отделенного белка, на активированных фибробластах и определенных типах опухолевых клеток). Конъюгаты, содержащие IL2 и мутант TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антигены, такие как карбоангидраза IX, A33, CEA, HER2, PSMA или белок активации фибробластов, аналогичным образом являются пригодными для нацеливания IL2 и TNF на новообразованные сосуды опухоли и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли и будут демонстрировать сниженную токсичность.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может иметь CDR и/или домены VH и/или VL антител F8, L19 или F16, описанных в настоящем описании. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11. Более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домены VH и/или VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4. Еще более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, содержит домены VH и VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4. Антитело F8 предпочтительно имеет формат scFv или диантитела, наиболее предпочтительно формат scFv. Когда антитело F8 имеет формат scFv, молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5.
Другая молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23. Более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домены VH и/или VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25. Еще более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, содержит домены VH и VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25. Антитело L19 предпочтительно имеет формат scFv или диантитела, наиболее предпочтительно формат scFv. Когда антитело L19 имеет формат scFv, молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26.
Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать A-FN и/или ED-A фибронектина с той же аффинностью, что и антитело F8 против ED-A, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать B-FN и/или ED-B фибронектина с той же аффинностью, что и антитело L19 против ED-B, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать тенасцин C и/или домен A1 тенасцина C с той же аффинностью, что и у антитела F16 против тенасцина C, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью.
Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связываться с тем же эпитопом на A-FN и/или ED-A фибронектина, что и у антитела F8 против ED-A. Молекула антитела по настоящему изобретению может связываться с тем же эпитопом на B-FN и/или ED-B фибронектина, что и у антитела L19 против ED-B. Молекула антитела молекула по настоящему изобретению может связываться с тем же эпитопом на тенасцине C и/или домене A1 тенасцина C, что и у антитела F16.
В рамках настоящего изобретения можно получать и использовать варианты молекул антител, описанных в настоящем описании. Способы, требуемые для проведения замен в аминокислотных последовательностях CDR, доменах VH или VL антитела, в частности, каркасных областях доменов VH и VL, и молекулах антител, обычно доступны в данной области. Последовательности вариантов можно получать с заменами, для которых может быть предсказано или может не быть предсказано наличие минимального или благоприятного эффекта на активность, и тестировать в отношении способности связывать A-FN и/или ED-A фибронектина, B-FN и/или ED-B фибронектина, тенасцин C и/или домен A1 тенасцина C, и/или в отношении любого другого требуемого свойства.
Предусматривается, что от 1 до 5, например, от 1 до 4, в том числе от 1 до 3, или 1 или 2, или 3 или 4, аминокислотных изменений (вставка, делеция, замена и/или инсерция аминокислотного остатка) может быть внесено в одну или несколько CDR и/или домены VH и/или VL молекулы антитела, как описано в настоящем описании. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-A, FN-B или тенасцин C, может содержать CDR и/или домен VH и/или VL антитела F8, L19 или F16, описанного в настоящем описании, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в CDR и/или домене VH и/или VL. Например, молекула антитела, которая связывает FN-A, FN-B или тенасцин C, может содержать домен VH и/или VL антитела F8, L19 или F16, описанного в настоящем описании, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в каркасной области домена VH и/или VL. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-A или ED-A фибронектина, упоминаемая в настоящем описании, может содержать домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и/или домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в каркасной области домена VH и/или VL. Такая молекула антитела может связывать ED-A-изоформу или ED-A фибронектина с той же или по существу той же аффинностью, что и у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4, или может связывать ED-A-изоформу или ED-A фибронектина с более высокой аффинностью, чем у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-B или ED-B фибронектина, упоминаемая в настоящем описании, может содержать домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и/или домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25, с 5 или менее, например, с 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислоты в каркасной области домена VH и/или VL. Такая молекула антитела может связывать изоформу ED-B или ED-B фибронектина с такой же или по существу такой же аффинностью, что и у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25, или может связывать ED-B-изоформу или ED-B фибронектина с более высокой аффинностью, чем у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25.
Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домен VH и/или VL, который обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно любой из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с доменом VH и/или VL, в зависимости от ситуации, антитела F8, L19 или F16, указанного в SEQ ID NO: 2, 4, 24, 25, 33 и 34. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью антител F8, L19 или F16, указанных в SEQ ID NO: 5, 26, 35 и 46, соответственно.
Антигенсвязывающий центр является частью молекулы, которая распознает и связывает весь антиген-мишень или его часть. В молекуле антитела его называют антигенсвязывающим центром антитела или паратопом, и он содержит часть антитела, которая распознает и связывает весь антиген-мишень или его часть. Когда антиген является большим, антитело может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий центр антитела может быть предоставлен посредством одного или нескольких вариабельных доменов антитела. Предпочтительно антигенсвязывающий центр содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела.
Антигенсвязывающий центр может быть предоставлен посредством компоновки определяющих комплементарность областей (CDR). Структурой, содержащей CDR или набор CDR, как правило, является последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или значительная ее часть, в которой CDR или набор CDR расположен в области, соответствующей CDR или набору CDR встречающихся в природе вариабельных доменов VH и VL антитела, кодируемых реарранжированными генами иммуноглобулинов. Структуры и положение вариабельных доменов иммуноглобулинов могут быть определены в соответствии с Kabat et al. (1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services.) и ее переизданиями, в настоящее время доступной через Интернет (на immuno.bme.nwu.edu или при поиске "Kabat" с использованием любого поискового инструмента).
Под областью CDR, или CDR, подразумевают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в соответствии с определением Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services (Kabat et al., (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington и последующие издания). Антитело, как правило, содержит 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин "CDR" или "несколько CDR" может указывать, в зависимости от ситуации, на одну из этих областей, или несколько или даже все, из этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает.
Среди шести коротких последовательностей CDR третья CDR тяжелой цепи (HCDR3) имеет более высокую вариабельность размера (большее разнообразие, в основном вследствие механизмов организации генов, которая его обеспечивает). Ее длина может составлять только 2 аминокислоты, хотя наибольший известный размер составляет 26. Функционально, HCDR3 участвует в определении специфичности антитела (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).
Антигенсвязывающий центр молекулы антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11, CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23, или CDR антитела F16, указанные в SEQ ID NO: 27-32. Наиболее предпочтительно, антигенсвязывающий центр молекулы антитела для применения, как описано в настоящем описании, имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11, или CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23.
В данной области доступны различные способы получения молекул антител против антигена-мишени. Молекулы антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, особенно человека, мыши, химерные или гуманизированные, которые могут быть получены стандартными способами, хорошо известными специалисту в данной области. Наиболее предпочтительно, молекула антитела для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой молекулу антитела человека.
Является возможным использование моноклональных и других антител и технологии рекомбинантных ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые связывают антиген-мишень. Такие способы могут вовлекать встраивание ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или CDR молекулы антитела, в константные области, или константные области плюс каркасные области, другого иммуноглобулина (см., например, EP-A-184187, GB 2188638A или EP-A-239400, и большое количество последующих источников литературы). Гибридому или другую клетку, продуцирующую антитело, также можно подвергать генетической мутации или другим изменениям, которые могут изменять или могут не изменять специфичность продуцированных антител.
Доступные в данной области способы инженерии антител позволили выделить антитела человека и гуманизированные антитела. Например, гибридомы человека можно получать, как описано в Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. Фаговый дисплей - другой общеизвестный способ получения специфических связывающих представителей - подробно описан во многих публикациях, таких как WO92/01047 (дополнительно рассмотрена ниже) и патенты США US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 и Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. Для выделения антител человека можно использовать трансгенных мышей, у которых гены антител мыши инактивированы и функционально заменены генами антител человека, в то время как остальные компоненты иммунной системы мыши остаются интактными (Mendez et al., (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156).
Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно из мыши, можно использовать способы, которые описаны, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988), или способ получения из гибридом, описанный Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497.
Моноклональные антитела можно получать, например, из клетки животного, иммунизированного против антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, B-FN, тенасцин C, ED-A фибронектина, ED-B фибронектина или домен A1 тенасцина C, в соответствии с обычными способами, посредством генетической рекомбинации, начинающейся с последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности кДНК, кодирующей A-FN, B-FN или тенасцин C, или их фрагмент, или посредством пептидного синтеза, начинающегося с последовательности аминокислот, содержащейся в пептидной последовательности A-FN, B-FN или тенасцина C, и/или их фрагмента.
Синтетические молекулы антител можно получать посредством экспрессии с генов, полученных синтезом олигонуклеотидов и сборки их в подходящие экспрессирующие векторы, например, как описано Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86 или Krebs et al. (2001) Journal of Immunological Methods, 254 67-84.
Альтернативно, одну или несколько молекул антител против антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, ED-A, B-FN, ED-B, тенасцин C или домен A1 тенасцина C, можно получать путем приведения в контакт библиотеки молекул антител и антигена или его фрагмента, например, фрагмента, содержащего или состоящего из ED-A, ED-B или домена A1 тенасцина C, или их пептидного фрагмента, и отбора одной или нескольких молекул из библиотеки, способных связываться с антигеном.
Библиотеку антител можно подвергать скринингу с использованием итеративного скрининга колоний на фильтре (ICFS). При ICFS бактерии, содержащие ДНК, кодирующую несколько специфичностей связывания, выращивают в жидкой среде и после достижения стадии экспоненциального роста несколько миллиардов их распределяют на подложку для роста, состоящую из подходящим образом предварительно обработанного мембранного фильтра, который инкубируют до тех пор, пока не появляются полностью смыкающиеся колонии бактерий. Вторая подложка-ловушка состоит из другого мембранного фильтра, предварительно увлажненного и покрытого требуемым антигеном.
Затем мембрану-ловушку помещают на чашку, содержащую подходящую культуральную среду, и накрывают фильтром для роста вверх поверхностью, покрытой бактериальными колониями. Полученный таким образом "сэндвич" инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 16 ч. Таким образом, является возможной достижение экспрессии генов, кодирующих фрагменты антител, такие как scFv, обладающие распространяющимся действием, так чтобы эти фрагменты, специфически связывающиеся с антигеном, который присутствует на мембране-ловушке, улавливались. Затем мембрану-ловушку можно обрабатывать для идентификации связанных фрагментов антител, таких как scFv, например, с использованием колориметрических способов, обычно используемых для этой цели.
Положение идентифицированных фрагментов, например, в качестве окрашенных пятен, на фильтре-ловушке, позволяет вернуться к соответствующим бактериальным колониям, которые присутствуют на мембране для роста и продуцируют уловленные фрагменты антител. Колонии собирают и выращивают, и бактерии распределяют на новую культуральную мембрану, повторяя методики, описанные выше. Затем проводят аналогичные циклы до тех пор, пока положительные сигналы на мембране-ловушке не будут соответствовать единичным положительным колониям, каждая из которых соответствует потенциальному источнику фрагментов моноклональных антител, направленных против антигена, используемого в селекции. ICFS описан, например, в WO02/46455.
Библиотеку также можно экспонировать на частицах или молекулярных комплексах, например, реплицирующихся генетических упаковках, таких как частицы бактериофага (например, T7), или других системах дисплея in vitro, причем каждая частица или молекулярный комплекс содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен VH антитела, экспонированный на нем, и необязательно также экспонированный домен VL при его наличии. Фаговый дисплей описан в WO92/01047 и, например, в патентах США US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 и US6521404.
После селекции молекул антител, способных связывать антиген и экспонироваться на бактериофаге или других частицах библиотеки или молекулярных комплексах, нуклеиновая кислота может быть извлечена из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, экспонирующих указанную отобранную молекулу антитела. Такую нуклеиновую кислоту можно использовать для последующей продукции молекулы антитела или вариабельного домена VH или VL антитела посредством экспрессии с нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, взятую из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, экспонирующих указанную отобранную молекулу антитела.
Способность связывать антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C или другой антиген-мишень или изоформа, можно далее тестировать, например, в отношении способности конкурировать с антителом, специфичным к A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцину C или домену A1 тенасцина C, таким как антитело F8, L19 или F16.
Новые области VH или VL, содержащие происходящие из CDR последовательности для применения, как описано в настоящем описании, также можно получать с использованием случайного мутагенеза одного или нескольких отобранных генов VH и/или VL для получения мутаций по всему вариабельному домену. В некоторых вариантах осуществления одну или две аминокислотных замены вносят в целый вариабельный домен или набор CDR. Другим способом, который можно использовать, является прямой мутагенез областей CDR генов VH или VL.
Вариабельные домены, используемые, как описано в настоящем описании, можно получать или извлекать из любого вариабельного домена эмбрионального типа или реаранжированного вариабельного домена человека, или они могут представлять собой синтетический вариабельный домен на основе консенсусных или фактических последовательностей известных вариабельных доменов человека. Вариабельный домен может происходить из не являющегося человеческим антитела. Последовательность CDR для применения, как описано в настоящем описании (например, CDR3), можно встраивать в репертуар вариабельных доменов, лишенных CDR (например, CDR3), с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Например, в Marks et al. (1992) описаны способы получения репертуаров вариабельных доменов антител, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5'-конец или вблизи него области вариабельного домена, используют совместно с консенсусными праймерами к третьей каркасной области генов VH человека с получением репертуара вариабельных доменов VH, лишенных CDR3. Кроме того, в Marks et al. описано, как этот репертуар можно комбинировать с CDR3 конкретного антитела. С использованием аналогичных способов происходящие из CDR3 последовательности по настоящему изобретению можно подвергать шаффлингу с репертуарами доменов VH или VL, лишенных CDR3, и полученные путем шаффлинга полные домены VH или VL комбинировать с совместимыми доменами VL или VH с получением молекул антител для применения, как описано в настоящем описании. Затем репертуар можно экспонировать в подходящей системе-хозяине, такой как система фагового дисплея WO92/01047, или любого из последующих источников литературы, включая Kay, Winter & McCafferty (1996), так что можно отбирать подходящие молекулы антител. Репертуар может состоять из любого числа из 104 индивидуальных представителей и выше, например по меньшей мере 105, по меньшей мере 106, по меньшей мере 107, по меньшей мере 108, по меньшей мере 109 или по меньшей мере 1010 представителей.
Антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C, можно использовать в скрининге молекул антител, например, молекул антител для применения, как описано в настоящем описании. Скрининг может представлять собой скрининг репертуара, как описано в настоящем описании.
Аналогично, одну или несколько, или все три CDR можно пересаживать в репертуар доменов VH или VL, которые затем подвергают скринингу в отношении молекулы антитела или молекул антител в отношении антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C. Можно использовать одну или несколько из HCDR1, HCDR2 и HCDR3 антител F8, L19 или F16, или набор HCDR антител F8, L19 или F16, и/или можно использовать одну или несколько из LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антител F8, L19 или F16, или набор LCDR антител F8, L19, или F16.
Значительная часть вариабельного домена иммуноглобулина может содержать по меньшей мере три области CDR вместе с встроенными в них каркасными областями. Эта часть также может включать по меньшей мере приблизительно 50% любой или обеих из первой и четвертой каркасных областей, причем 50% представляют собой C-концевые 50% первой каркасной области и N-концевые 50% четвертой каркасной области. Дополнительные остатки на N-конце или C-конце значительной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, которые в норме не ассоциированы со встречающимися в природе областями вариабельных доменов. Например, конструкция молекул антител по настоящему изобретению, полученных способами рекомбинантных ДНК, может обеспечивать внесение N- или C-концевых остатков, кодируемых линкерами, внесенными для облегчения клонирования или других стадий манипулирования. Другие стадии манипулирования включают внесение линкеров для связывания вариабельных доменов, описанных в настоящем описании, с другими белковыми последовательностями, включая константные области антител, другие вариабельные домены (например, при получении диантител) или поддающиеся обнаружению/функциональные метки, как более подробно описано в настоящем описании.
Хотя молекулы антител могут содержать пару доменов VH и VL, также можно использовать единичные связывающие домены на основе последовательностей либо домена VH, либо домена VL, как описано в настоящем описании. Известно, что единичные домены иммуноглобулинов, особенно домены VH, способны связывать антигены-мишени специфическим образом. Например, см. обсуждение dAb выше.
В случае любого из единичных связывающих доменов, эти домены можно использовать для скрининга комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменную молекулу антитела, способную связывать антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C. Этого можно достигать способами скрининга посредством фагового дисплея с использованием так называемого иерархического двойного комбинаторного подхода, как описано в WO92/01047, в котором индивидуальную колонию, содержащую либо H-цепь, либо L-цепь, используют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или H), и полученную двухцепочечную молекулу антитела подвергают селекции в соответствии со способами фагового дисплея, такими как способы, описанные в указанной ссылке. Этот способ также описан в Marks 1992.
Фрагменты целых антител для применения, как описано в настоящем описании, можно получать, начиная с любых из молекул антител, описанных в настоящем описании, например, молекул антител, содержащих домены VH и/или VL или CDR любых антител, описанных в настоящем описании, способами, такими как расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных связей посредством химического восстановления. Иным образом, фрагменты антител можно получать способами генетической рекомбинации, аналогично известными специалисту в данной области, или также посредством пептидного синтеза с использованием, например, автоматизированных устройств для синтеза пептидов, таких как устройства, предоставляемые компанией Applied Biosystems, и т.д., или посредством синтеза и экспрессии нуклеиновых кислот.
Конъюгат, как описано в настоящем описании, содержит IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, как описано в настоящем описании. Предпочтительно молекула антитела представляет собой scFv или диантитело, наиболее предпочтительно scFv, как описано в настоящем описании.
Предпочтительно IL2 представляет собой IL2 человека.
Предпочтительно IL2 содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12. Как правило, IL2 обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 12. IL2 в конъюгатах по изобретению сохраняет биологическую активность IL2 человека, например, способность ингибировать пролиферацию клеток.
Предпочтительно TNF предпочтительно представляет собой TNF человека. Когда фактор некроза опухоли представляет собой TNFα, TNFα предпочтительно представляет собой TNFα человека.
Мутантный TNF в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой мутант TNF, который сохраняет биологическую функцию TNF человека, например, способность ингибировать клеточную пролиферацию, но сохраняет сниженную активность.
Мутант TNF может содержать одну или несколько мутаций, которые снижают активность относительно TNF дикого типа, который лишен одной или нескольких мутаций, т.е. мутантный TNF является менее эффективным, чем TNF дикого типа. Например, мутант TNF может содержать мутацию в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15 или положению 52 в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления R в указанном положении может быть замещен другой аминокислотой, предпочтительно аминокислотой, отличной от G, например, неполярной аминокислотой, предпочтительно A, F или V, наиболее предпочтительно A. Последовательности примеров подходящих мутантных TNF указаны в SEQ ID NO: 37, 39, 54-55, 56-57, соответственно.
В настоящем описании показано, что тип остатка в положении мутантного TNF, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15 или положению 52 в SEQ ID NO: 17, влияет на выход белка при экспрессии рекомбинантной системы. Например, присутствие W в этом положении приводит по существу к отсутствию экспрессии в рекомбинантной системе и присутствие A в этом положении приводит к неожиданно высоким выходам в рекомбинантной системе.
TNFα человека состоит из цитоплазматического домена из 35 аминокислот, трансмембранного домена из 20 аминокислот и внеклеточного домена из 177 аминокислот. Внеклеточный домен из 177 аминокислот расщепляется с образованием растворимой формы из 157 аминокислот, которая является биологически активной и которая образует нековалентно связанный тример в растворе. В контексте настоящего изобретения TNFα человека представляет собой мутант TNFα, который предпочтительно представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα человека или внеклеточный домен TNFα человека. Последовательность растворимой формы внеклеточного домена TNFα человека представлена в SEQ ID NO: 15. Как правило, мутантный TNFα обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 15, с одной или несколькими мутациями, которые снижают активность, например, мутацией в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15. Последовательность внеклеточного домена TNFα человека представлена в SEQ ID NO: 17. В этом случае мутантный TNFα может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 17, с одной или несколькими мутациями, которые снижают активность, например, мутацией в положении, соответствующем положению 52 в SEQ ID NO: 17.
Авторы изобретения показали, что конъюгат по настоящему изобретению, и в частности, TNFα, присутствующий в конъюгате по настоящему изобретению, где остаток аргинина TNFα в положении 32 SEQ ID NO: 15 или в положении 52 SEQ ID NO: 17 замещен аланином, демонстрирует сниженную активность. Таким образом, мутантный TNFα может содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15 или 17, за исключением того, что остаток в положении 32 SEQ ID NO: 15 или в положении 52 SEQ ID NO: 17 представляет собой остаток аланина, а не остаток аргинина. Эта последовательность представлена в SEQ ID NO: 37 или 39. Таким образом, мутантный TNFα предпочтительно содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 37. Как правило, мутантный TNFα обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 37, с A в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 37. Таким образом, альтернативно TNFα может содержать или состоять из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39. В этом случае TNFα может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 39, с A в положении, соответствующем положению 52 в SEQ ID NO: 39.
Наиболее предпочтительно, IL2 содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12, и/или TNFα содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37.
Мутантные белки TNFα можно тестировать в анализах in vivo и in vitro. Подходящие анализы включают, но не ограничиваются ими, анализы активности и анализы связывания. Замена или делеция остатка аргинина в положении 32 (Arg 32) описана в документах уровня техники. Например, была предложена замена остатка аргинина на серин, глутамин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гистидин, триптофан, треонин или тирозин (US 7101974; US 5422104; WO1988/006625; Yamagishi et al., Protein Eng. (1990) 3:713-9)). Более того, также была предложена делеция Arg32 в EP158286. Мутанты, в которых Arg 32 заменен триптофаном, продемонстрировали утрату цитотоксической активности (Van Ostade et al.The Embo Journal (1991) 10:827-836). Мутанты, где аргинин в положении 29, и/или 31, и/или 32 заменен на триптофан или тирозин, продемонстрировали значительное отличие аффинности связывания между рецептором p75 TNF человека и рецептором p55-TNF человека (US 5422104). В US 7101974 описаны варианты TNFα, которые взаимодействуют с TNFα дикого типа с образованием смешанных тримеров, неспособных активировать передачу сигнала рецептором. В этом последнем примере Arg32 заменен на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или гистидин.
Предпочтительно, молекула антитела связана с мутантом IL2 и TNF, предпочтительно мутантом TNFα, через линкеры, например, пептидные линкеры. Альтернативно молекула антитела и IL2 и/или мутантный фактор некроза опухоли могут быть соединены прямо, например, через химическую связь. Когда молекула антитела связана с IL2 и мутантом фактора некроза опухоли посредством одного или нескольких пептидных линкеров, конъюгат может представлять собой слитый белок. Под "слитым белком" подразумевают полипептид, который представляет собой продукт трансляции в результате слияния двух или более генов или кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот в одну открытую рамку считывания (ORF).
Химическая связь может представлять собой, например, ковалентную или ионную связь. Примеры ковалентных связей включают пептидные связи (амидные связи) и дисульфидные связи. Молекула антитела и мутант IL2 и/или TNF, предпочтительно мутант TNFα, могут быть ковалентно связаны, например, пептидными связями (амидные связи). Таким образом, молекула антитела, в частности, scFv-часть молекулы антитела, и IL2 и/или мутант TNF, предпочтительно мутант TNFα, могут быть получены в качестве слитого белка.
Когда молекула антитела представляет собой двухцепочечную или мультицепочечную молекулу (например, диантитело), IL2 и/или мутант TNF могут быть конъюгированы в качестве слитого белка с одной или несколькими полипептидными цепями в молекуле антитела.
Пептидный линкер, соединяющий молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF, может представлять собой гибкий пептидный линкер. Подходящие примеры последовательностей пептидных линкеров известны в данной области. Линкер может иметь длину 10-20 аминокислот, предпочтительно 10-15 аминокислот. Наиболее предпочтительно, линкер имеет длину 11-15 аминокислот. Линкер может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 49. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления IL2 и мутант TNF могут быть связаны с молекулой антитела линкерами, указанными в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно. В других предпочтительных вариантах осуществления IL2 и мутант TNF могут быть связаны с молекулой антитела линкерами, указанными в SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 14, соответственно.
Например, в конъюгатах, проиллюстрированных в примере 2, IL2 конъюгирован с доменом VH scFv F8 и TNFα или мутант TNFα конъюгирован с доменом VL scFv F8, каждый через пептидный линкер, как показано в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 36, соответственно. В конъюгате, проиллюстрированном в примере 4, IL2 конъюгирован с доменом VH scFv L19 и TNFα или мутант TNFα конъюгирован с доменом VL scFv L19, каждый через пептидный линкер, как показано в SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 44, соответственно.
Однако ожидается, что конъюгат, содержащий IL2 и мутант TNF, предпочтительно мутант TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, может продемонстрировать такие же или сходные свойства нацеливания на опухоль, и/или терапевтическую эффективность, что и фактор некроза опухоли и IL2, конъюгированные с молекулой антитела. Таким образом, когда молекула антитела представляет собой или содержит scFv, IL2 может быть связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и мутантный TNF может быть связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер. Альтернативно, когда молекула антитела представляет собой или содержит scFv, мутантный TNF может быть связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и IL2 может быть связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер. Ожидается, что конъюгат может иметь такие же или сходные свойства нацеливания на опухоль, и/или терапевтическую эффективность, и/или активность уничтожения клеток, как если бы как IL2, так и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, были конъюгированы с доменом VH антитела. В качестве следующей альтернативы, IL2 и мутантный TNF, предпочтительно мутантный TNFα, могут, таким образом, быть связаны с C-концом домена VL антитела, например, в формате scFv, через пептидный линкер. В качестве еще одной альтернативы, IL2 и мутантный TNF, предпочтительно мутантный TNFα, могут быть связаны с N-концом домена VH антитела, например, в формате scFv, через пептидный линкер. В последних двух конъюгатах, IL2 и TNF могут быть расположены в любом порядке и/или необязательно могут быть связаны друг с другом через пептидный линкер. Подходящие пептидные линкеры описаны в настоящем описании.
Конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 36, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 36. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 432 SEQ ID NO: 36 представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 36, может содержать остаток A в положении 432.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, с мутацией R на A в положении 432 или SEQ ID NO: 16 с мутацией R на A в положении 452, или они могут представлять собой варианты одной из этих последовательностей. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 16. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 432 в варианте SEQ ID NO: 1 is A и остаток в положении, соответствующем положению 452 в варианте SEQ ID NO: 16, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 16, может содержать остаток A в положении 432 или 452 соответственно.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 38, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 38. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 452 SEQ ID NO: 38, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 38, может содержать остаток A в положении 452.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из одной из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 58-63, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, одной из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 58-63. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 432 в варианте SEQ ID NO: 58, 60 или 62, представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 452 в варианте SEQ ID NO: 59, 61 или 63, представляет собой W, F или V, соответственно.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 40. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 427 SEQ ID NO: 40, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 40, может содержать остаток A в положении 427.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 41. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 447 SEQ ID NO: 41, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 41, может содержать остаток A в положении 447.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 42, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 42. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 428 SEQ ID NO: 42, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 42, может содержать остаток A в положении 428.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 448 SEQ ID NO: 43, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 43, может содержать остаток A в положении 448.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 44, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 44. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 430 SEQ ID NO: 44, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 44, может содержать остаток A в положении 430.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 45, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 45. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 450 SEQ ID NO: 45, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 45, может содержать остаток A в положении 450.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70 с мутацией R на A в положении 430 или SEQ ID NO: 71 с мутацией R на A в положении 450, или могут представлять собой вариант одной из этих последовательностей. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 430 в варианте SEQ ID NO: 70, представляет собой A и остаток в положении, соответствующем положению 450 в варианте SEQ ID NO: 71, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71, может содержать остаток A в положении 430 или 450 соответственно.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 64-69, или могут представлять собой их вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 64-69. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 430 в варианте SEQ ID NO: 64, 66 или 68 представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 450 в варианте SEQ ID NO: 65, 67 или 69, представляет собой W, F или V, соответственно.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 47. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 431 SEQ ID NO: 47, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 47, может содержать остаток A в положении 431.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 48, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 48. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 451 SEQ ID NO: 48, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 48, может содержать остаток A в положении 451.
Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 72-77, или могут представлять собой их вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 72-77. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 431 в варианте SEQ ID NO: 72, 74 или 76, представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 451 в варианте SEQ ID NO: 73, 75 или 77, представляет собой W, F или V, соответственно.
Не ограничиваясь каким-либо теоретическим объяснением, конъюгат, описанный в настоящем описании, содержащий мутантный TNF, может образовывать гомотример в растворе. Такой тримерный конъюгат может содержать три молекулы активного IL2 на одну молекулу активного TNF со сниженной активностью (в тримерной структуре). Это может быть преимущественным, поскольку иммуноцитокины на основе IL2 обычно используют в клинике в более высоких дозах по сравнению с иммуноцитокинами на основе TNFα. Например, было обнаружено, что рекомендованная доза L19-IL2 составляет 4 мг у пациентов со злокачественной опухолью [Johannsen et al. (2010) Eur. J. Cancer], в то время как рекомендованная доза L19-TNFα находится в диапазоне доз 1-1,5 мг [Spitaleri et al. (2012) J. Clin. Oncol. Cancer Res.]. Более того, можно использовать более высокие дозы конъюгатов, описанных в настоящем описании, поскольку мутант TNF имеет сниженную активность по сравнению с конъюгатом, содержащим TNF дикого типа и IL2. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут иметь преимущественные свойства в отношении режимов введения.
Также предусматривается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конъюгат, как описано в настоящем описании. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать ДНК и/или РНК и могут быть частично или полностью синтетическими. Отсылка к нуклеотидной последовательности, указанной в настоящем описании, охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью и охватывает молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой U заменен на T, если контекст не требует иного.
Кроме того, предусматриваются конструкции в форме плазмид, векторов (например, экспрессирующих векторов), кассет транскрипции или экспрессирующих кассет, которые содержат такие нуклеиновые кислоты. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие надлежащие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, последовательности терминаторов, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности в зависимости от ситуации. Векторы могут представлять собой плазмиды, например фагмиду, или могут быть вирусными, например, фаговыми, в зависимости от ситуации. Для дальнейших деталей см., например, Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные способы и протоколы для манипулирования нуклеиновыми кислотами, например, в препарате конструкций нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, и анализа белков подробно описаны в Ausubel et al. (1999) 4th eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.
Также предусматривается рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или несколько конструкций, как описано выше. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, клетки растений, нитчатые грибы, дрожжевые и бакуловирусные системы и трансгенные растения и животные.
Конъюгаты, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием такой рекомбинантной клетки-хозяина. Способ получения может включать экспрессию нуклеиновой кислоты или конструкции, как описано выше. Экспрессию удобно осуществлять культивированием рекомбинантной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования конъюгата. После продуцирования конъюгат можно выделять и/или очищать с использованием любого подходящего способа, а затем использовать надлежащим образом. Конъюгат может быть составлен в виде композиции, включающей по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент.
Системы для клонирования и экспрессии полипептида в множестве различных клеток-хозяев хорошо известны. Экспрессия антител, включая их конъюгаты, в прокариотических клетках является общеизвестной в данной области. Для обзора см., например, Plückthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551. Обычным бактериальным хозяином является E.coli.
Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве возможности продуцирования конъюгатов, например, Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194); Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick & Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418. клеточные линии млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка, клетки миеломы мыши NS0, клетки миеломы крысы YB2/0, клетки почки эмбриона человека, клетки сетчатки эмбриона человека и многие другие.
Также описан способ, включающий введение нуклеиновой кислоты или конструкции, описанной в настоящем описании, в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любой доступный способ. Для эукариотических клеток доступные способы могут включать трансфекцию с фосфатом кальция, способ с DEAE-декстраном, электропорацию, опосредуемую липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например, вируса коровьей оспы, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Для введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, в частности, эукариотическую клетку можно использовать вирусную систему или систему на основе плазмиды. Плазмидная система может поддерживаться эписомно, или может быть встроена в хромосому клетки хозяина или в искусственную хромосому. Включение может осуществляться либо путем случайного, либо путем направленного встраивания одной или нескольких копий в один или несколько локусов. Для бактериальных клеток подходящие способы могут включать трансформацию с хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.
Нуклеиновая кислота или конструкция может встраиваться в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Встраивание можно обеспечивать включением последовательностей, которые осуществляют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными способами.
Термин "выделенный" относится к состоянию, когда конъюгаты, описанные в настоящем описании, антитела для применения, как описано в настоящем описании, или нуклеиновая кислота, кодирующая такие конъюгаты, в основном являются соответствующими настоящему изобретению. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, антитела для применения, как описано в настоящем описании, или нуклеиновая кислота, кодирующая такие конъюгаты, могут быть предоставлены в выделенной и/или очищенной форме, например, из среды, в которой они получены (такой как культура клеток), в по существу чистой или однородной форме, или, в случае нуклеиновой кислоты, свободными или по существу свободными от нуклеиновых кислот с последовательностью, отличной от последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией. Выделенные представители и выделенные нуклеиновые кислоты свободны или по существу свободны от материала, с которым они встречаются в среде, в которой они получены (например, клеточной культуре), когда такое получение осуществляется посредством технологии рекомбинантных ДНК, практикуемой in vitro или in vivo. Конкретные конъюгаты и нуклеиновые кислоты могут быть составлены с разбавителями или адъювантами, и, тем не менее, для практических целей быть выделенными, например, представители могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями при использовании в терапии. Конкретные конъюгаты могут быть гликозилированными, либо естественным образом, либо посредством систем гетерологичных эукариотических клеток (например, клетки CHO или NS0 (ECACC 85110503), или они могут быть негликозилированными (например, если получены посредством экспрессии в прокариотической клетке).
Также можно использовать гетерогенные препараты конъюгатов, как описано в настоящем описании. Например, такие препараты могут представлять собой смеси конъюгатов, содержащих молекулы антител с полноразмерными тяжелыми цепями или тяжелыми цепями, лишенными C-концевого лизина, с различной степенью гликозилирования и/или с дериватизированными аминокислотами, такими как аминокислоты, образованные в результате циклизации N-концевой глутаминовой кислоты с образованием остатка пироглутаминовой кислоты.
Фибронектин представляет собой антиген, являющийся результатом альтернативного сплайсинга, и известен ряд альтернативных форм фибронектина, включая альтернативно сплайсированные изоформы фибронектина, включая альтернативно сплайсированные изоформы A-FN и B-FN, содержащие домены ED-A или ED-B, соответственно, которые являются известными маркерами ангиогенеза. Молекула антитела, описанная в настоящем описании, может селективно связываться с изоформами фибронектина, селективно экспрессируемыми в новообразованных сосудах. Молекула антитела может связывать изоформу A-FN фибронектина, например, она может связывать домен ED-A (экстрадомен A). Молекула антитела может связывать ED-B (экстрадомен B).
Экстрадомен-A (EDA или ED-A) фибронектина также известен как ED, экстраповтор A типа III (EIIIA) или EDI. Последовательность ED-A человека опубликована Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 и Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. Последовательность ED-A человека также доступны в базе данных SwissProt в качестве аминокислот 1631-1720 (фибронектин типа Ill 12; экстрадомен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P02751. Последовательность ED-A мыши доступна в базе данных SwissProt в качестве аминокислот 1721-1810 (фибронектин типа Ill 13; экстрадомен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P11276.
Изоформа ED-A фибронектина (A-FN) содержит экстрадомен-A (ED-A). Последовательность A-FN человека может быть определена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина человека, которая доступна в базе данных SwissProt под номером доступа P02751. Последовательность A-FN мыши может быть определена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина мыши, которая доступна в базе данных SwissProt под номером доступа P11276. A-FN может представлять собой изоформу ED-A фибронектина человека. ED-A может представлять собой экстрадомен A фибронектина человека.
ED-A представляет собой последовательность из 90 аминокислот, которая встроена в фибронектин (FN) посредством альтернативного сплайсинга и расположена между доменами 11 и 12 FN (Borsi et al. (1987), J. Cell. Biol., 104, 595-600). ED-A в основном отсутствует в плазматической форме FN, но в большом количестве присутствует в ходе эмбриогенеза, ремоделирования тканей, фиброза, трансплантации сердца и роста солидной опухоли.
Изоформа B-FN фибронектина является одним из наиболее известных маркеров ангиогенеза (US 10/382107, WO01/62298). Экстрадомен "ED-B" из 91 аминокислоты встречается в изоформе B-FN и идентичен у мыши, крысы, кролика, собаки и человека. B-FN накапливается вокруг структур новообразованных сосудов в агрессивных опухолях и других тканях, претерпевающих ангиогенез, таких как эндометрий в пролиферативной фазе и некоторые глазные структуры в патологических условиях, но в остальных случаях не поддается обнаружению в нормальных тканях взрослого организма.
Тенасцин-C представляет собой большой гексамерный гликопротеин внеклеточного матрикса, который модулирует адгезию клеток. Он вовлечен в такие процессы, как пролиферация клеток и миграция клеток, и ассоциирован с изменениями архитектуры тканей, происходящими в ходе морфогенеза и эмбриогенеза, а также в процессе образования опухоли или ангиогенеза. В результате альтернативного сплайсинга может образовываться несколько изоформ тенасцина-C, что может приводить к включению (множества) доменов в центральной части этого белка, в диапазоне от домена A1 до домена D (Borsi L et al Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567, WO2006/050834). Молекула антитела, описанная в настоящем описании, может связывать тенасцин-C. Молекула антитела может связывать домен A1 тенасцина-C.
Злокачественная опухоль, упоминаемая в настоящем описании, может представлять собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует или для которой показана экспрессия антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как компонент внеклеточного матрикса, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.
Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует или для которой показана экспрессия изоформы ED-A фибронектина, изоформы ED-B фибронектина и/или альтернативно сплайсированного тенасцина C. Более предпочтительно злокачественная опухоль экспрессирует изоформу ED-A фибронектина. Например, злокачественная опухоль может представлять собой любой тип солидной или несолидной злокачественной опухоли или злокачественной лимфомы. Злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака кожи (в частности, меланомы), рака головы и шеи, рака почки, саркомы, герминомы (такой как тератокарцинома), рака печени, лимфомы (такой как лимфома Ходжкина или неходжскинская лимфома), лейкоза (например, острого миелоидного лейкоза), рака кожи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака тела матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака ободочной и прямой кишки, рака шейки матки, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака желудка и рака головного мозга. Злокачественные опухоли могут быть семейными или спорадическими. Злокачественные опухоли могут быть метастазирующими или не метастазирующими. Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из меланомы, рака головы и шеи, рака почки и саркомы. Указание на злокачественную опухоль, упоминаемую выше, обычно относится к злокачественной трансформации рассматриваемых клеток. Таким образом, рак почки, например, относится к злокачественной трансформации клеток почки. Рак может находиться в первичном расположении, таком как почка в случае рака почки, или в отдаленном положении в случае метастазов. Опухоль, упоминаемая в настоящем описании, может быть результатом любой из злокачественных опухолей, упоминаемых выше. Предпочтительно, опухоль является результатом меланомы, рака головы и шеи, рака почки или саркомы. Опухоль, которая является результатом конкретной злокачественной опухоли, включает как первичную опухоль, так и метастазы указанной злокачественной опухоли. Таким образом, опухоль, которая является результатом рака головы и шеи, например, включает как первичную опухоль головы и шеи, так и метастазы рака головы и шеи, находящиеся в других частях тела пациента.
Конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут обладать противоопухолевой активностью и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли. Не ограничиваясь каким-либо теоретическим объяснением, ожидается, что конъюгаты будут демонстрировать мощную противоопухолевую активность в результате превосходных свойств нацеливания на опухоль, как продемонстрировано в примерах 3 и 4 ниже. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, конструируют для применнеия в способах лечения пациентов, предпочтительно пациентов-людей. Конъюгаты по настоящему изобретению, в частности, можно использовать для лечения злокачественной опухоли.
Таким образом, изобретение относится к способам лечения, включающим введение конъюгата, описанного в настоящем описании, к фармацевтическим композициям, содержащим такие конъюгаты, и к применению таких конъюгатов для изготовления лекарственного средства для введения, например, в способе получения лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающем составление конъюгата с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть приспособлены специалистом в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранного активного соединения(ий).
Конъюгаты, описанные в настоящем описании, обычно вводят в форме фармацевтической композиции, которая может содержать по меньшей мере один компонент в дополнение к молекуле антитела. Таким образом, фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, и для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать, в дополнение к активному ингредиенту, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала зависит от пути введения, который может представлять собой инъекцию, например, внутривенную, внутриопухолевую или подкожную. Предпочтительно, конъюгат по настоящему изобретению вводят внутрь опухоли.
Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, вазелин, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, декстроза или другой раствор сахаридов или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Для внутривенной инъекции или инъекции в пораженную область, активный ингредиент может иметь форму парентерально приемлемого водного раствора, который является свободным от пирогенов и имеет подходящее значение pH, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области способны получить подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как хлорид натрия инъекционный, раствор Рингера инъекционный, лактатный раствор Рингера инъекционный. При необходимости можно добавить консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Специалистам в данной области известно множество способов получения фармацевтических составов. См. например Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Композицию, содержащую конъюгат, описанный в настоящем описании, можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения злокачественной опухоли, одновременно или последовательно, или в качестве комбинированного препарата с другим терапевтическим средством или средствами, для лечения злокачественной опухоли. Например, конъюгат по изобретению можно использовать в комбинации с существующим терапевтическим средством от злокачественной опухоли.
Конъюгат, описанный в настоящем описании, можно использовать для производства лекарственного средства. Лекарственное средство может быть предназначено для раздельного или комбинированного введения индивидууму и, таким образом, может содержать конъюгат и дополнительный компонент в качестве комбинированного препарата или в качестве раздельных препаратов. Раздельные препараты можно использовать для облегчения раздельного и последовательного или одновременного введения, и они позволяют введение компонентов различными путями.
Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить млекопитающим, предпочтительно людям. Введение может осуществляться в "терапевтически эффективном количестве", являющемся достаточным для того, чтобы демонстрировать пользу для пациента. Такая польза может представлять собой по меньшей мере смягчение по меньшей мере одного симптома. Таким образом, "лечение" определенного заболевания относится к смягчению по меньшей мере одного симптома. Фактическое вводимое количество и скорость и расписание введений, будут зависеть от природы и тяжести подвергаемого лечению заболевания, конкретного подвергаемого лечению пациента, клинического состояния отдельного пациента, причины нарушения, области доставки композиции, типа конъюгата, способа введения, расписания введения и других факторов, известных медицинским специалистам. Ответственность за назначение лечения, например, решение о дозировке и т.д. несут врачи общей практики и другие медицинские врачи, и оно может зависеть от тяжести симптомов и/или прогрессирования заболевания, подвергаемого лечению. Подходящие дозировки антитела хорошо известны в данной области (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; и Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugate and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Можно использовать конкретные дозировки, указанные в настоящем описании или в Physician's Desk Reference (2003) в зависимости от типа вводимого лекарственного средства. Терапевтически эффективное количество или подходящую дозу конъюгата для применения, как описано в настоящем описании, можно определять путем сравнения его активности in vitro и активности in vivo в модели на животных. Известны способы экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других исследуемых животных для человека. Точная доза зависит от ряда факторов, включая то, предназначено ли антитело для диагностики, предупреждения или лечения, размер и положение области, подлежащей лечению, точную природу конъюгата. Для системного применения типичная доза конъюгата находится в диапазоне от 10 мкг до 500 мкг/кг. Можно вводить изначальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или несколько более низких доз. Она представляет собой дозу для однократного лечения взрослого пациента, которую можно пропорционально корректировать для детей и младенцев, а также корректировать в зависимости от формата конъюгата пропорционально молекулярной массе. Лечение можно повторять с интервалами раз в сутки, два раза в неделю, раз в неделю или месяц по усмотрению врача. Лечение может осуществляться каждые от двух до четырех недель для подкожного введения и каждые от четырех до восьми недель для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лечение является периодическим и период между введениями составляет две недели или более, например, приблизительно три недели или более, приблизительно четыре недели или более, или приблизительно один месяц. В других вариантах осуществления изобретения лечение можно проводить до и/или после хирургической операции и можно проводить или применять непосредственно в анатомической области хирургического лечения.
Следующие аспекты и варианты осуществления изобретения станут понятными специалистам в данной области с учетом настоящего описания, включающего следующий экспериментальный раздел.
Все документы, упоминаемые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для всех целей.
"И/или", когда используется в настоящем описании, следует понимать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов с или без другого. Например, "A и/или B" следует понимать как конкретное описание каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, как если бы каждый из них был указан в настоящем описании индивидуально.
Если контекст не указывает на иное, описание и определение признаков, как указано выше, не ограничивается каким-либо конкретным аспектом или вариантом осуществления изобретения и применим в равной степени ко всем аспектам и вариантам осуществления, которые описаны.
Определенные аспекты и варианты осуществления изобретения далее проиллюстрированы в качестве примера и с отсылкой на чертежи, описанные выше.
Примеры
Пример 1 - Получение и анализ конъюгата huIL2-F8-huTNFα, конъюгатов huIL2-F8-мутант huTNFα, конъюгата huIL2-L19-huTNFα и конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα.
Различные конъюгаты с мутантами TNFα человека получали и охарактеризовывали посредством FPLC, SDS-PAGE и MS. Результаты обобщенно представлены в таблице 1. Небольшая экспрессия или отсутствие экспрессии мутанта R32W наблюдали в случае любого из иммуноцитокинов IL2-L19-TNFα или IL2-F8-TNFα. Выход мутанта R32A был неожиданно высоким для обоих иммуноцитокинов.
Белок Мутация Буфер для диализа Выход
(мг/л)		 Профиль FPLC SDS-PAGE MS SEQ ID NO
1 IL2-L19-TNF α - PBS 1,6 Π Π Π 70
2 IL2-L19-TNF α R32W PBS 0,4 Π Π Π 64
3 IL2-L19-TNF α R32A PBS 2,2 Π Π Π 44
4 IL2-F8-TNF α - PBS 1,4 Π Π Π 1
5 IL2-F8-TNF α R32W PBS - Ο Ο Ο 58
6 IL2-F8-TNF α R32A PBS 3,4 Π Π Π 36
7 IL2-F8-TNF α R32F MES 1,9 Π Π Π 60
8 IL2-F8-TNF α R32V MES 3,2 Π Π Π 62
Таблица 1
Пример 2 - Эффект формата конъюгата на активность уничтожения клеток
Слитые белки смогли экспрессировать и очистить до однородного состояния. Очищенный конъюгат huIL2-F8-huTNFα (SEQ ID NO: 1) и конъюгат huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 36) анализировали с использованием стандартного эксперимента на системе ÄKTA-FPLC с колонкой Superdex 200 HR 10/30 и охарактеризовывали посредством анализа SDS-PAGE в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях.
Для тестирования значимости мутации TNFα в конъюгате активности уничтожения клеток активность двух слитых белков тестировали в анализе уничтожения клеток с использованием клеточной линии фибробластов L M. Анализ проводили в присутствии 2 мкг/мл актиномицина D (Sigma-Aldrich). Клетки высевали в 96-луночные планшеты в культуральную среду, дополненную возрастающими концентрациями huIL2-F8-huTNFα (SEQ ID NO: 1) или huIL2-F8-huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 36), как указано на фиг.1. Антитело F8 имело формат scFv во всех протестированных конъюгатах. Результаты представлены на фиг.1. Результаты выражены в качестве процента жизнеспособности клеток по сравнению с клетками, обработанными только актиномицином D (использованным в качестве отрицательного контроля). Результаты демонстрируют, что активность уничтожения клеток конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) была более низкой по сравнению с конъюгатом huIL2-F8-huTNFα, как можно видеть из величин EC50, приведенных на фиг.1. Величина EC50 отражает концентрацию лекарственного средства, требуемую для полумаксимальной активности.
Пример 3 - Анализ биораспределения конъюгата huIL2-F8- мутант huTNF (R32A)
Эффективность нацеливания in vivo конъюгата huIL2-F8-мутант huTNF (R32A) оценивали посредством анализа биораспределения. Слитый белок очищали эксклюзионной хроматографией, а затем метили радиоактивным йодом посредством йода-125. Всего 12 мкг (~9,6 мКи) препарата слитого белка инъецировали в хвостовую вену иммунокомпетентных мышей 129Sv, имеющих подкожно имплантированные тератокарциномы мыши F9. Через 24 ч после инъекции мышей умерщвляли. Органы взвешивали и определяли радиоактивность с использованием гамма-счетчика Packard Cobra. Уровень радиоактивности в соответствующих органах регистрировали и выражали в качестве процента инъецированной дозы на грамм ткани (%ID/г). Результаты демонстрируют предпочтительное и селективное накопление конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) в опухоли (фиг.2).
Пример 4 - Получение и анализ конъюгатов huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A)
Охарактеризация белка
Слитый белок huIL2-L19-huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 44) очищали из клеточной культуральной среды до однородного состояния посредством хроматографии с белком A и анализировали посредством SDS-PAGE, ESI-MS и эксклюзионной хроматографии (Superdex200 10/300GL, GE Healthcare).
Биологическую активность TNF и IL2 определяли на клетках HT1080 и CTLL2, соответственно.
Конъюгат huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) имел хорошие характеристики в биохимических анализах, селективно локализовался в солидных опухолях in vivo и проявлял согласованную активность in vitro частей IL2 и TNF при использовании клеточных анализов на основе пролиферации лимфоцитов CTLL-2 мыши (фиг.3) и на основе уничтожения опухолевой клеточной линии человека HT-1080 (фиг.4).
Исследования биораспределения
Эффективность нацеливания на EDB in vivo конъюгата huIL2-L19-мутант huTNF (R32A) оценивали посредством анализа биораспределения. 10 мкг меченного радиоактивным йодом слитого белка инъецировали в латеральную хвостовую вену мышей, имеющих опухоль F9. Мышей умерщвляли через 24 ч после инъекции, органы извлекали, взвешивали и определяли радиоактивность органов и опухолей с использованием счетчика Cobra γ и выражали в качестве процента от исходной дозы на грамм ткани (%ID/г±SEM), (n=3 мыши на группу). Результаты демонстрируют предпочтительное и селективное накопление конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) в опухоли (фиг.5).
Список последовательностей
1. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [растворимая форма] (SEQ ID NO: 1)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [раствориая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - TNFα человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
2. Аминокислотная последовательность домена VH F8 (SEQ ID NO: 2)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
3. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 3)
GGGGSGGGGSGGGG
4. Аминокислотная последовательность домена VL F8 (SEQ ID NO: 4)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
5. Аминокислотная последовательность scFv F8 (SEQ ID NO: 5)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
6. Аминокислота последовательности CDR F8
CDR1 VH F8- LFT (SEQ ID NO: 6)
CDR2 VH F8 - SGSGGS (SEQ ID NO: 7)
CDR3 VH F8 - STHLYL (SEQ ID NO: 8)
CDR1 VL F8 - MPF (SEQ ID NO: 9)
CDR2 VL F8 - GASSRAT (SEQ ID NO: 10)
CDR3 VL F8 - MRGRPP (SEQ ID NO: 11)
7. Аминокислотная последовательность IL2 человека (huIL2) в конъюгатах (SEQ ID NO: 12)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
8. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 13)
GDGSSGGSGGAS
9. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 14)
SSSSGSSSSGSSSSG
10. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена TNFα человека (huTNFα) (SEQ ID NO: 15)
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
11. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 16)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер- VH F8- линкер - VL F8 - линкер - TNFα человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности почеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
12. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена TNFα человека (huTNFα) (SEQ ID NO:17)
GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
13. Аминокислотная последовательность CDR L19
CDR1 VH L19 - Ser Phe Ser Met Ser (SEQ ID NO: 18)
CDR2 VH L19 - Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys (SEQ ID NO: 19)
CDR3 VH L19 - Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO: 20)
CDR1 VL L19 - Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala (SEQ ID NO: 21)
CDR2 VL L19 - Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 22)
CDR3 VL L19 - Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr (SEQ ID NO: 23)
14. Аминокислотная последовательность домена VH L19 (SEQ ID NO: 24)
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
Thr Val Ser Ser
15. Аминокислотная последовательность домена VL L19 (SEQ ID NO: 25)
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
16. Аминокислотная последовательность scFv(L19) (SEQ ID NO: 26)
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
17. Аминокислотная последовательность CDR F16
CDR1 VH F16- RYGMS (SEQ ID NO: 27)
CDR2 VH F16- AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 28)
CDR3 VH F16- AHNAFDY (SEQ ID NO: 29)
CDR1 VL F16- QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO: 30)
CDR2 VL F16- GKNNRPS (SEQ ID NO: 31)
CDR3 VL F16- NSSVYTMPPVV (SEQ ID NO: 32)
18. Аминокислотная последовательность домена VH F16 (SEQ ID NO: 33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSR
19. Аминокислотная последовательность домена VL F16 (SEQ ID NO: 34)
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
20. Аминокислотная последовательность scFv(F16) (SEQ ID NO: 35)
Линкерная последовательность доменов VH и VL показана подчеркиванием
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
21. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 36)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнута и выделена полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32A) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
22. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα человека (R32A) (huTNFα R32A) (SEQ ID NO: 37). R32A подчеркнут полужирным шрифтом.
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
23. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52A) (huTNFα R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 38)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52A) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
24. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52A) человека (huTNFα R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 39). R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
25. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 40)
Аминокислотная последовательность конъюгатаа huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер -VH F16 - линкер -VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
26. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 41)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер -VH F16 - линкер -VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
27. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 42)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер -VH L19 - линкер -VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
28. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 43)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
29. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 44)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
30. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 45)
Аминокислотная последовательность huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
31. Аминокислотная последовательность scFv(F16) (SEQ ID NO: 46)
Линкерная последовательность доменов VH и VL показана подчеркиванием
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
32. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 47)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
33. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 48)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
34. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 49)
GGGGSGGGGSGGGG
35. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 50)
GDGSSGGSGGAS
36. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 51)
GGGSGGGSGG
37. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα человека (R32W) (huTNFα R32W) (SEQ ID NO: 52). R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
38. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52W) человека (huTNFα R52W) (SEQ ID NO: 53). R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
39. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα (R32F) человека (huTNFα R32F) (SEQ ID NO: 54). R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
40. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52F) человека (huTNFα R52F) (SEQ ID NO: 55). R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
41. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα (R32V) человека (huTNFα R32V) (SEQ ID NO: 56). R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
42. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52V) человека (huTNFα R52V) (SEQ ID NO: 57). R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.
GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
43. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 58)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32W) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
44. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52W) (huTNFα R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 59)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52W) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
45. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 60)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32F) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
46. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52F) (huTNFα R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 61)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52F) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
47. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 62)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32V) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
48. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52V) (huTNFα R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 63)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52V) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
49. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 64)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
50. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 65)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
51. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 66)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
52. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 67)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и the R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. The human TNFα mutant в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
53. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 68)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
54. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 69)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
55. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [растворимая форма] (SEQ ID NO: 70)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - TNFα человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
56. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 71)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер -TNFα человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
57. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 72)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
58. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 73)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
59. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 74)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
60. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 75)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
61. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 76)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
62. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 77)
Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> PHILOGEN S.P.A.
<120> Иммуноконъюгаты IL2 и мутантного TNF
<130> NRS/FP7322332
<150> GB1618888.0
<151> 2016-11-09
<150> GB1712916.4
<151> 2017-08-11
<160> 77
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 557
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNF-альфа
[растворимая форма]
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
405 410 415
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
420 425 430
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
435 440 445
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
450 455 460
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
465 470 475 480
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
485 490 495
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
500 505 510
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
515 520 525
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
530 535 540
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 2
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VH F8
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен
VH с доменом VL антитела
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VL F8
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 240
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность scFv F8
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met
210 215 220
Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 6
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VH F8
<400> 6
Leu Phe Thr
1
<210> 7
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VH F8
<400> 7
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VH F8
<400> 8
Ser Thr His Leu Tyr Leu
1 5
<210> 9
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VL F8
<400> 9
Met Pro Phe
1
<210> 10
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VL F8
<400> 10
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VL F8
<400> 11
Met Arg Gly Arg Pro Pro
1 5
<210> 12
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность IL2 человека (huIL2) в
конъюгатах
<400> 12
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 13
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу
антитела и IL2 и/или мутанта TNF
<400> 13
Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу
антитела и IL2 и/или мутанта TNF
<400> 14
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 157
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного
домена TNF-альфа человека (huTNF-альфа)
<400> 15
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 16
<211> 577
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNF-альфа
[внеклеточный домен]
<400> 16
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
405 410 415
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
420 425 430
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
450 455 460
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
465 470 475 480
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
485 490 495
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
500 505 510
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
515 520 525
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
530 535 540
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
565 570 575
Leu
<210> 17
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена TNF-альфа
(huTNF-альфа)
<400> 17
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
20 25 30
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
35 40 45
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
85 90 95
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
130 135 140
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
165 170 175
Leu
<210> 18
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VH L19
<400> 18
Ser Phe Ser Met Ser
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VH L19
<400> 19
Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 20
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VH L19
<400> 20
Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VL L19
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VL L19
<400> 22
Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VL L19
<400> 23
Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 24
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VH L19
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VL L19
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 236
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность scFv(L19)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 27
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VH F16
<400> 27
Arg Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VH F16
<400> 28
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VH F16
<400> 29
Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 VL F16
<400> 30
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 VL F16
<400> 31
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 VL F16
<400> 32
Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val
1 5 10
<210> 33
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VH F16
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg
115
<210> 34
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность домена VL F16
<400> 34
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 35
<211> 235
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность scFv(F16)
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser
115 120 125
Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val
130 135 140
Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys
165 170 175
Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
180 185 190
Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu
195 200 205
Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
<210> 36
<211> 557
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]
<400> 36
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
405 410 415
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala
420 425 430
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
435 440 445
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
450 455 460
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
465 470 475 480
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
485 490 495
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
500 505 510
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
515 520 525
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
530 535 540
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 37
<211> 157
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность растворимая форма внеклеточного
домена мутанта TNF-альфа (R32A) человека (huTNF-альфа R32A)
<400> 37
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 38
<211> 577
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R52A) (huTNF-альфа R52A) [внеклеточный домен]
<400> 38
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
405 410 415
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
420 425 430
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
450 455 460
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
465 470 475 480
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
485 490 495
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
500 505 510
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
515 520 525
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
530 535 540
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
565 570 575
Leu
<210> 39
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта
TNF-альфа (R52A) человека (huTNF-альфа R52A) [внеклеточный домен]
<400> 39
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
20 25 30
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
35 40 45
Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
85 90 95
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
130 135 140
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
165 170 175
Leu
<210> 40
<211> 552
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]
<400> 40
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
260 265 270
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
275 280 285
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
290 295 300
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
325 330 335
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
340 345 350
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val
355 360 365
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser
370 375 380
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg Ser Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
405 410 415
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys
450 455 460
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val
465 470 475 480
Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
485 490 495
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro
500 505 510
Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
515 520 525
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln
530 535 540
Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550
<210> 41
<211> 572
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]
<400> 41
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
260 265 270
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
275 280 285
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
290 295 300
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
325 330 335
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
340 345 350
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val
355 360 365
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser
370 375 380
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro Gln Arg Glu
385 390 395 400
Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val
405 410 415
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
420 425 430
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala
435 440 445
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
450 455 460
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
465 470 475 480
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
485 490 495
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
500 505 510
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
515 520 525
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
545 550 555 560
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570
<210> 42
<211> 553
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]
<400> 42
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
165 170 175
Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
260 265 270
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
275 280 285
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
290 295 300
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
305 310 315 320
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
340 345 350
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile
355 360 365
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser
370 375 380
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg Ser Ser
385 390 395 400
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
405 410 415
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu
420 425 430
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
435 440 445
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
450 455 460
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
465 470 475 480
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
485 490 495
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
500 505 510
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
515 520 525
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
530 535 540
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550
<210> 43
<211> 573
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность мутанта huIL2-L19-huTNF-альфа
(R52A) [внеклеточный домен]
<400> 43
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
165 170 175
Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
260 265 270
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
275 280 285
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
290 295 300
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
305 310 315 320
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
340 345 350
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile
355 360 365
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser
370 375 380
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro Gln Arg
385 390 395 400
Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala
405 410 415
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
420 425 430
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala
435 440 445
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
450 455 460
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
465 470 475 480
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
485 490 495
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
500 505 510
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
515 520 525
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
530 535 540
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
545 550 555 560
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570
<210> 44
<211> 555
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]
<400> 44
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg
385 390 395 400
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
405 410 415
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn
420 425 430
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
435 440 445
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
450 455 460
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
465 470 475 480
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
485 490 495
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
500 505 510
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
515 520 525
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
530 535 540
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 45
<211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]
<400> 45
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala
405 410 415
Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala
420 425 430
His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn
435 440 445
Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
450 455 460
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
465 470 475 480
Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
515 520 525
Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu
530 535 540
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 46
<211> 239
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность scFv(F16)
<400> 46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met
210 215 220
Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
<210> 47
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]
<400> 47
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val
385 390 395 400
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
405 410 415
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala
420 425 430
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
435 440 445
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
450 455 460
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
465 470 475 480
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
485 490 495
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
500 505 510
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
515 520 525
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
530 535 540
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 48
<211> 576
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]
<400> 48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly
385 390 395 400
Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu
405 410 415
Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
420 425 430
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
435 440 445
Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
450 455 460
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
465 470 475 480
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
485 490 495
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
500 505 510
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
515 520 525
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
530 535 540
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
545 550 555 560
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 49
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу
антитела и IL2 и/или мутант TNF
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкер, связывающего домен
VH с доменом VL антитела
<400> 50
Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен
VH с доменом VL антитела
<400> 51
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 52
<211> 157
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного
домена мутанта TNF-альфа (R32W) человека (huTNF-альфа R32W)
<400> 52
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 53
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта
TNF-альфа (R52W) человека (huTNF-альфа R52W)
<400> 53
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
20 25 30
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
35 40 45
Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
85 90 95
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
130 135 140
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
165 170 175
Leu
<210> 54
<211> 157
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного
домена мутанта TNF-альфа (R32F) человека (huTNF-альфа R32F)
<400> 54
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 55
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта
TNF-альфа (R52F) человека (huTNF-альфа R52F)
<400> 55
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
20 25 30
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
35 40 45
Leu Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
85 90 95
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
130 135 140
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
165 170 175
Leu
<210> 56
<211> 157
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность растворимая форма внеклеточного
домена мутанта TNF-альфа (R32V) человека (huTNF-альфа R32V)
<400> 56
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 57
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта
TNF-альфа (R52V) человека (huTNF-альфа R52V)
<400> 57
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
20 25 30
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
35 40 45
Leu Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
85 90 95
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
130 135 140
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
165 170 175
Leu
<210> 58
<211> 557
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]
<400> 58
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
405 410 415
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp
420 425 430
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
435 440 445
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
450 455 460
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
465 470 475 480
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
485 490 495
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
500 505 510
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
515 520 525
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
530 535 540
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 59
<211> 577
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R52W) (huTNF-альфа R52W) [внеклеточный домен]
<400> 59
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
405 410 415
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
420 425 430
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
450 455 460
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
465 470 475 480
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
485 490 495
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
500 505 510
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
515 520 525
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
530 535 540
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
565 570 575
Leu
<210> 60
<211> 557
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]
<400> 60
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
405 410 415
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe
420 425 430
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
435 440 445
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
450 455 460
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
465 470 475 480
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
485 490 495
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
500 505 510
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
515 520 525
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
530 535 540
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 61
<211> 577
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R52F) (huTNF-альфа R52F) [внеклеточный домен]
<400> 61
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
405 410 415
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
420 425 430
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
450 455 460
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
465 470 475 480
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
485 490 495
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
500 505 510
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
515 520 525
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
530 535 540
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
565 570 575
Leu
<210> 62
<211> 557
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]
<400> 62
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
405 410 415
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val
420 425 430
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
435 440 445
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
450 455 460
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
465 470 475 480
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
485 490 495
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
500 505 510
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
515 520 525
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
530 535 540
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 63
<211> 577
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант
huTNF-альфа (R52V) (huTNF-альфа R52V) [внеклеточный домен]
<400> 63
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
165 170 175
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
305 310 315 320
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
325 330 335
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
340 345 350
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
355 360 365
Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
370 375 380
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro
405 410 415
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
420 425 430
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
450 455 460
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
465 470 475 480
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
485 490 495
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
500 505 510
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
515 520 525
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
530 535 540
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
565 570 575
Leu
<210> 64
<211> 555
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]
<400> 64
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg
385 390 395 400
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
405 410 415
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala Asn
420 425 430
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
435 440 445
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
450 455 460
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
465 470 475 480
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
485 490 495
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
500 505 510
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
515 520 525
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
530 535 540
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 65
<211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R52W) [внеклеточный домен]
<400> 65
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala
405 410 415
Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala
420 425 430
His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn
435 440 445
Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
450 455 460
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
465 470 475 480
Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
515 520 525
Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu
530 535 540
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 66
<211> 555
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]
<400> 66
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg
385 390 395 400
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
405 410 415
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe Ala Asn
420 425 430
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
435 440 445
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
450 455 460
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
465 470 475 480
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
485 490 495
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
500 505 510
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
515 520 525
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
530 535 540
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 67
<211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R52F) [внеклеточный домен]
<400> 67
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala
405 410 415
Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala
420 425 430
His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn
435 440 445
Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
450 455 460
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
465 470 475 480
Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
515 520 525
Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu
530 535 540
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 68
<211> 555
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]
<400> 68
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg
385 390 395 400
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
405 410 415
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val Ala Asn
420 425 430
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
435 440 445
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
450 455 460
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
465 470 475 480
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
485 490 495
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
500 505 510
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
515 520 525
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
530 535 540
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 69
<211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант
huTNF-альфа (R52V) [внеклеточный домен]
<400> 69
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala
405 410 415
Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala
420 425 430
His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn
435 440 445
Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
450 455 460
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
465 470 475 480
Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
515 520 525
Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu
530 535 540
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 70
<211> 555
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNF-альфа [растворимая форма]
<400> 70
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg
385 390 395 400
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
405 410 415
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn
420 425 430
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
435 440 445
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
450 455 460
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
465 470 475 480
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
485 490 495
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
500 505 510
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
515 520 525
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
530 535 540
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 71
<211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNF-альфа [внеклеточный домен]
<400> 71
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
290 295 300
Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly
355 360 365
Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala
405 410 415
Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala
420 425 430
His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn
435 440 445
Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
450 455 460
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
465 470 475 480
Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
515 520 525
Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu
530 535 540
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 72
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]
<400> 72
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val
385 390 395 400
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
405 410 415
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala
420 425 430
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
435 440 445
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
450 455 460
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
465 470 475 480
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
485 490 495
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
500 505 510
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
515 520 525
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
530 535 540
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 73
<211> 576
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R52W) [внеклеточный домен]
<400> 73
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly
385 390 395 400
Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu
405 410 415
Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
420 425 430
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
435 440 445
Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
450 455 460
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
465 470 475 480
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
485 490 495
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
500 505 510
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
515 520 525
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
530 535 540
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
545 550 555 560
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 74
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]
<400> 74
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val
385 390 395 400
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
405 410 415
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe Ala
420 425 430
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
435 440 445
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
450 455 460
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
465 470 475 480
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
485 490 495
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
500 505 510
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
515 520 525
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
530 535 540
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 75
<211> 576
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R52F) [внеклеточный домен]
<400> 75
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly
385 390 395 400
Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu
405 410 415
Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
420 425 430
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
435 440 445
Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
450 455 460
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
465 470 475 480
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
485 490 495
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
500 505 510
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
515 520 525
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
530 535 540
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
545 550 555 560
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<210> 76
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]
<400> 76
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val
385 390 395 400
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
405 410 415
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val Ala
420 425 430
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
435 440 445
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
450 455 460
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
465 470 475 480
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
485 490 495
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
500 505 510
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
515 520 525
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
530 535 540
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
545 550 555
<210> 77
<211> 576
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант
huTNF-альфа (R52V) [внеклеточный домен]
<400> 77
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
165 170 175
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
305 310 315 320
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr
355 360 365
Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly
385 390 395 400
Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu
405 410 415
Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
420 425 430
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
435 440 445
Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
450 455 460
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
465 470 475 480
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
485 490 495
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
500 505 510
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
515 520 525
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
530 535 540
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
545 550 555 560
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
565 570 575
<---

Claims (40)

1. Слитый белок для лечения злокачественной опухоли, содержащий интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,
где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;
где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V;
где молекула антитела представляет собой одноцепочечный Fv (scFv) или диантитело и содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.
2. Слитый белок по п.1, где мутант TNFα человека имеет мутацию R на A в указанном положении.
3. Слитый белок по п.1, где TNFα человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39.
4. Слитый белок по п.1, где антитело связывает экстрадомен-A (ED-A) фибронектина и
(i) молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11,
(ii) молекула антитела содержит домены VH и VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4; и/или
(iii) где молекула антитела содержит аминокислотную последовательность scFv F8, указанную в SEQ ID NO: 5.
5. Слитый белок по п.1, где антиело связывает экстрадомен-B (ED-B) фибронектина и
(i) молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23,
(ii) молекула антитела содержит домены VH и VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25, и/или
(iii) молекула антитела содержит аминокислотную последовательность scFv L19, указанную в SEQ ID NO: 26.
6. Слитый белок по любому из пп.1-5, где молекула антитела представляет собой одноцепочечный Fv (scFv).
7. Слитый белок по п.6, где
(i) IL2 связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и мутант TNF связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер,
(ii) мутант TNF связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и IL2 связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер, или
(iii) IL2 и мутант TNF связаны с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер или IL2 и TNFα связаны с N-концом scFv через пептидный линкер;
и где последовательность пептидного линкера имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности, указанной в одной из SEQ ID NO: 13, 14 или 49.
8. Слитый белок по п.4, где
(i) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с мутацией R на A в положении 432 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 с мутацией R на A в положении 452 или
(ii) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38.
9. Слитый белок по п. 5, где
(i) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 с мутацией R на A в положении 430 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 с мутацией R на A в положении 450, или
(ii) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45.
10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-9.
11. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок по любому из пп.1-9.
12. Способ лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и TNF на новообразованные сосуды in vivo, включающий введение слитого белка пациенту;
где слитый белок содержит интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,
где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;
где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V; и
где молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.
13. Способ по п. 12, где злокачественная опухоль представляет собой меланому, рак головы и шеи, рак почки или саркому.
14. Способ доставки IL2 и TNF в новообразованные сосуды опухоли у пациента, включающий введение слитого белка пациенту;
где слитый белок содержит интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,
где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;
где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V; и
где молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.
15. Способ по п. 14, где опухоль является результатом меланомы, рака головы и шеи, рака почки или саркомы.
RU2019117750A 2016-11-09 2017-11-08 Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf RU2758139C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1618888.0 2016-11-09
GB201618888 2016-11-09
GBGB1712916.4A GB201712916D0 (en) 2017-08-11 2017-08-11 IL2 and TNF mutant immunoconjugates
GB1712916.4 2017-08-11
PCT/EP2017/078652 WO2018087172A1 (en) 2016-11-09 2017-11-08 Il2 and tnf mutant immunoconjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019117750A RU2019117750A (ru) 2020-12-10
RU2019117750A3 RU2019117750A3 (ru) 2021-04-01
RU2758139C2 true RU2758139C2 (ru) 2021-10-26

Family

ID=60413164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019117750A RU2758139C2 (ru) 2016-11-09 2017-11-08 Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11103592B2 (ru)
EP (2) EP3896084A1 (ru)
JP (1) JP6925431B2 (ru)
AU (1) AU2017358578B2 (ru)
CA (1) CA3043146C (ru)
ES (1) ES2893249T3 (ru)
MX (1) MX2019005242A (ru)
NZ (1) NZ754407A (ru)
RU (1) RU2758139C2 (ru)
WO (1) WO2018087172A1 (ru)
ZA (1) ZA201903387B (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3502139A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 Philogen S.p.A. Antibodies to tumour antigens
EP3584258A1 (en) * 2018-06-19 2019-12-25 IEO - Istituto Europeo di Oncologia Srl Antibodies anti tumor associated antigens and method for obtaining them
EP3818084A1 (en) 2018-07-02 2021-05-12 The General Hospital Corporation Antibody tumor-targeting assembly complexes
WO2020070150A1 (en) * 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
EP3660039A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020131697A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Revitope Limited Twin immune cell engager
WO2020223108A1 (en) 2019-05-02 2020-11-05 The General Hospital Corporation Teac and attac immunooncology compositions and methods
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
WO2022018126A1 (en) 2020-07-22 2022-01-27 Philogen S.P.A. Treatment of pulmonary hypertension
KR102614063B1 (ko) * 2020-12-24 2023-12-19 대화제약 주식회사 엑스트라도메인 b 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체
WO2023175077A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Philogen S.P.A Anti-ed-a antibodies for the treatment of pulmonary hypertension

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005087797A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Microbia, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
RU2363707C2 (ru) * 2001-02-19 2009-08-10 Мерк Патент Гмбх Искусственные белки с пониженной иммуногенностью
WO2013045125A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Philogen S.P.A. Immunocytokine combination therapy

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879226A (en) 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
AU1346488A (en) 1987-02-26 1988-09-26 Cetus Corporation Arginine-depleted human tumor necrosis factor
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9206318D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
CA2055168A1 (en) 1990-11-21 1992-05-22 Walter Fiers Tnf-muteins
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5962255A (en) 1992-03-24 1999-10-05 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing recombinant vectors
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5872215A (en) 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
PT1719528E (pt) 2000-02-24 2012-01-06 Philogen Spa Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas
US7101974B2 (en) 2000-03-02 2006-09-05 Xencor TNF-αvariants
IT1317108B1 (it) 2000-12-06 2003-05-26 Philogen Srl Processo per la selezione di frammenti anticorporali anti-angiogenesi,frammenti anticorpali anti-angiogenesi cosi' ottenuti e loro uso.
AU2005304031B2 (en) 2004-11-09 2009-04-23 Philogen Spa Antibodies against tenascin-C
WO2015007903A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Vib Vzw Targeted modified tnf family members
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card
GB201507908D0 (en) 2015-05-08 2015-06-24 Philogen Spa IL2 and TNF immunoconjugates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2363707C2 (ru) * 2001-02-19 2009-08-10 Мерк Патент Гмбх Искусственные белки с пониженной иммуногенностью
WO2005087797A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Microbia, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2013045125A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Philogen S.P.A. Immunocytokine combination therapy

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNAU J. et al., Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein expression and purification, 2006, V. 48, N. 1, p.1-13; *
CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369; *
FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein Eng., 2000, v.13, n.8, p.575-581; *
HALIN C. ET AL., Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment, fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor alpha, CANCER RESEARCH, 2003, v. 63, n. 12, p.3202 - 3210 *
HALIN C. ET AL., Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment, fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor alpha, CANCER RESEARCH, 2003, v. 63, n. 12, p.3202 - 3210; *
KONTERMANN R. E. et al., Bispecific antibodies, Drug Discovery Today, 2015, V. 7, N. 20, p.838-847; *
MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-Vargula Luciferase, Analytical biochemistry, 1997, v. 249, n. 2, p.147-152. *
OSTADE X VAN ET AL., Localization of the active site of human tumour necrosis factor (hTNF) by mutational analysis, EMBO JOURNAL, 1991, v. 10, n. 4, p.827 - 836; *
OSTADE X VAN ET AL., Localization of the active site of human tumour necrosis factor (hTNF) by mutational analysis, EMBO JOURNAL, 1991, v. 10, n. 4, p.827 - 836; ШИНГАРОВА Л.Н. и др., МУТАНТЫ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, Т. 22, Н. 4, с.243-251; KONTERMANN R. E. et al., Bispecific antibodies, Drug Discovery Today, 2015, V. 7, N. 20, p.838-847; *
PRETTO F. ET AL., Preclinical evaluation of IL2-based immunocytokines supports their use in combination with dacarbazine, paclitaxel and TNF-based immunotherapy, CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, 2014, v. 63, n. 9, p. 901 - 910; *
RUDIKOFF S. et al., Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity, Proc Natl Acad Sci USA, 1982, v.79, n.6, p. 1979-1983; *
TOKURIKI N. ET AL., Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604; *
TOKURIKI N. ET AL., Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604; RUDIKOFF S. et al., Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity, Proc Natl Acad Sci USA, 1982, v.79, n.6, p. 1979-1983; FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein Eng., 2000, v.13, n.8, p.575-581; ARNAU J. et al., Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein expression and purification, 2006, V. 48, N. 1, p.1-13; CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369; MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-Vargula Luciferase, Analytical biochemistry, 1997, v. 249, n. 2, p.147-152. *
ШИНГАРОВА Л.Н. и др., МУТАНТЫ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, Т. 22, Н. 4, с.243-251; *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201903387B (en) 2020-09-30
EP3896084A1 (en) 2021-10-20
JP6925431B2 (ja) 2021-08-25
EP3538547B1 (en) 2021-07-07
JP2019535315A (ja) 2019-12-12
MX2019005242A (es) 2019-09-10
EP3538547A1 (en) 2019-09-18
AU2017358578A8 (en) 2019-07-04
RU2019117750A3 (ru) 2021-04-01
US20200061203A1 (en) 2020-02-27
ES2893249T3 (es) 2022-02-08
US11103592B2 (en) 2021-08-31
WO2018087172A1 (en) 2018-05-17
CA3043146C (en) 2021-11-23
AU2017358578A1 (en) 2019-06-27
AU2017358578B2 (en) 2022-12-08
CA3043146A1 (en) 2018-05-17
US20210369857A1 (en) 2021-12-02
RU2019117750A (ru) 2020-12-10
NZ754407A (en) 2023-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11274133B2 (en) IL2 and TNF immunoconjugates
RU2758139C2 (ru) Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf
US8455625B2 (en) Fusion protein of antibody L19 against fibronectin ED-B and interleukin 12
US10858411B2 (en) IL22 immunoconjugates
US20160200789A1 (en) Il4 conjugated to antibodies against extracellular matrix components
US20200270322A1 (en) Novel interleukin 4 immunoconjugates
EP3660039A1 (en) Il2 immunoconjugates
WO2020249757A1 (en) Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha