BRPI0511395B1

BRPI0511395B1 - Construção de ácido nucléico, e, método de melhoria do rendimento da fibra de uma planta produtora de fibra

Info

Publication number: BRPI0511395B1
Application number: BRPI0511395-4A
Authority: BR
Inventors: Gil Ronen; Evgenia Gold; Rodrigo Yelin; Rafael Meissner; Hagai Karchi; Sharon Ayal
Original assignee: Evogene Ltd.
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2019-03-06
Also published as: US9834781B2; CA2570195A1; EP2336330B1; US20150191740A1; EP2343373A1; CN101948846A; EP2186899A2; US10774339B2; EP2343373B1; BRPI0511395A; EP1766058A4; AU2005252469B2; WO2005121364A3; WO2005121364A2; US9012728B2; CA2877145C; US20200362363A1; AU2005252469A1; EP2186899A3; ZA200610567B

Abstract

polinucleotídeo isolado, oligonucleotídeo, estrutura de ácido nucléico, célula transgênica, planta transgênica, método de melhoria da qualidade da fibra e/ou do rendimento da planta produtora de fibra, método de melhoria de biomassa de uma planta, método de identificação de genes, método de proodução de planta resistente a insetos e método de produçao de fibras de algodao, apresentam polinucleotídeos isolados; cada um dos polinucleotídeos isolados compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96, caracterizado pelo fato que o polipeptídeo é capaz de regular o desenvolvimento da fibra de algodão; também fornecidos são métodos de utilização dos referidos polinucleotídeos para a melhoria da qualidade da fibra e/ou da produção de uma planta produtora de fibra, assim como métodos de utilização dos referidos polinucleotídeos para a produção de plantas que tenham aumentada biomassa/vigor/rendimento.

Description

“CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, E, MÉTODO DE MELHORIA DO RENDIMENTO DA FIBRA DE UMA PLANTA PRODUTORA DE FIBRA

A presente invenção rela-cionase a polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibra de planta e métodos para utilização desta.

A presente invenção relacionase a uma abordagem de novidade computacional que utiliza a genômica comparativa para identificar os genes que desempenham um papel no desenvolvimento da fibra.

Algodão e produtos derivados de algodão fornecem matérias-prima que são utilizadas para a produção de um grande número de produtos baseados no consumidor, além de fibras têxteis incluindo produtos alimentícios derivados de algodão, alimento de criação (granja), fertilizante e papel. A produção, a comercialização, o consumo e o comércio de produtos feitos à base de algodão geram um excesso de $ 100 bilhões anualmente, só nos Estados Unidos, fazendo do algodão a colheita de valor agregado número um.

Estima-se que o uso do algodão como uma fibra por parte dos seres humanos date de 7.000

Petição 870180151670, de 14/11/2018, pág. 9/14

2/114 anos na América Central e 5.000 anos na índia. Até mesmo com o crescimento de fibras sintéticas nos últimos 50 anos, o algodão ainda responde por aproximadamente 50% da fibra têxtil do mundo [Agrow Reports, Global Seed markets DS208, October 2000] .

Embora 90% do valor do algodão como uma colheita resida na fibra (fibra de algodão), o rendimento e a qualidade da fibra declinaram, especialmente na última década [Meredith (2000), Proc. World Cotton Research Conference II, Athens, Greece pp. 97-101]. Este declínio vem sendo atribuído à erosão geral na diversidade genética das variedades do algodão, além de uma aumentada vulnerabilidade da colheita às condições ambientais [Bowman et al. , Crop Sei. 36:577-581 (1996); Meredith, supra].

Há muitas variedades de planta de algodão, das quais fibras de algodão com uma vasta gama de características podem ser obtidas e usadas para diversas aplicações. Fibras de algodão também podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, algumas das quais são consideradas altamente desejáveis na indústria de fibras têxteis para a produção de crescentes produtos de alta qualidade e exploração ideal de tecnologias modernas de fiação. Propriedades comercialmente desejáveis incluem extensão, uniformidade na extensão, finura, quociente de maturação, partículas finas de fibra em número diminuído na produção da fibra, indicador do diâmetro da fibra, resistência do feixe de fibras, além de resistência única de fibra. Muito esforço vem sendo

3/114

FÍJ>

ο / exercido em causar a melhoria das características das fibras de algodão, principalmente colocando o foco na extensão da fibra e finura da fibra. Em particular, há uma grande demanda por fibras de algodão de extensões específicas.

Métodos para a melhoria das características ou do rendimento das fibras de algodão podem ser classificados nas três seguintes categorias:

1. Melhoria de variedade por meio de produção cruzada

Este método vem sendo utilizado mais amplamente até o presente momento. Atualmente, quase todas as variedades cultivadas de plantas de algodão são produzidas por intermédio do uso deste método. No entanto, a melhoria do rendimento da fibra de algodão com o uso de criação tradicional é relativamente lenta e ineficiente e o grau de variabilidade que pode ser atingido é limitado.

2. Tratamento com hormônios para plantas

Hormônios para plantas, tais como auxina, giberelina, citocinina e etileno vêm sendo amplamente utilizados em colheitas de campo ou em produtos de horticultura. A influência de hormônios para plantas, particularmente da giberelina, da auxina e do brassinolídeo, sobre as características da fibra das plantas de algodão é conhecida [como, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos de Número 5880110 como produtora de fibras de algodão com características da fibra melhoradas por meio de tratamento com brassinoesteróides]. No entanto, nenhum efeito

4/114 mensurável foi documentado, tornando o uso prático destes hormônios em larga escala altamente improvável.

3. Melhoria na variedade por intermédio de engenharia genética:

A ampla aceitação do algodão geneticamente modificado nos países produtores líderes e o fato de que não seja uma colheita alimentícia tornam-na um candidato atraente para a engenharia genética para melhoria do rendimento da fibra e/ou de sua qualidade.

Atualmente, um progresso notável vem ocorrendo na engenharia genética de plantas. Como resultado, diversos casos de melhoria bem-sucedida na variedade de plantas de colheita comercialmente importantes foram reportados (como, por exemplo, algodão, soja, milho, canola, tomate). Por exemplo, métodos de melhoria da resistência aos insetos por intermédio da introdução de uma codificação de gene para a toxina BT (ou seja, toxina de proteína inseticida produzida pelo Bacillus thuringiensis) em uma planta de algodão foram desenvolvidos e colocados em um uso prático. Além disso, plantas de algodão com resistência melhorada ao herbicida (Glifosato) passaram por processos de engenharia genética por intermédio da introdução de uma codificação de gene para ácido 5-enolpiruvil-chiquímico sintetase de 3-fosfatase.

A disponibilidade e o sucesso da engenharia genética em plantas, combinado com o fato de que o algodão é um excelente candidato para manipulação genética via técnicas recombinantes, levaram os

5/114 pesquisadores a postularem a idéia de que, se um gene associado a uma propriedade de fibra de algodão melhorada pudesse ser identificado, poderia ser regulada para cima com o uso de técnicas recombinantes, assim melhorando as características ou o rendimento das fibras de algodão.

De modo inverso, se um gene associado com um declínio em uma propriedade da fibra de algodão pudesse se identificado, poderia ser regulado para baixo com o uso de métodos de silenciamento de genes. Para este propósito, os mecanismos de alongamento e de formação de fibra devem ser elucidados no nível genético e os genes estritamente associados a estes mecanismos devem ser identificados.

A fibra de algodão é composta de uma única célula que foi diferenciada de uma célula epidérmica do revestimento da semente, desenvol-vendo-se através de quatro estágios, ou seja, início, alongamento, espessamento da parede da célula secundária e estágios de maturação. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão tem início na célula epidérmica do óvulo imediatamente em seguida à floração, depois do qual a fibra de algodão alonga-se rapidamente durante aproximadamente 21 dias. O alongamento da fibra é, então, terminado, e uma parede de célula secundária é formada e vai aumentando através da maturação de modo a se tornar uma fibra de algodão madura.

Diversos genes candidatos foram isolados, os quais estão associados ao alongamento e

5?

6/114 à formação das fibras de algodão. Por exemplo, cinco genes das plantas de algodão foram identificados, os quais são especificamente expressos no estágio de alongamento da fibra de algodão por intermédio do método de triagem por diferencial e método de exibição por diferencial, [Patente dos Estados Unidos n² . 5.880.100 de Patente dos Estados

Unidos de números de série

09/262.653] .

		WO0245485 descreve	métodos	e
meios para	modular a	qualidade	da fibra	em plantas
produtoras	de fibras,	tais	como	algodão,	por	meio	da
modulação da atividade	e/ou	da	expressão	da	sacarose
sintase (um	açúcar importante	para	a síntese	da	parede	da

nas referidas plantas.

As Patentes dos Estados Unidos de n². 6.472.588 e WO0117333 fornecem métodos para o aumento da qualidade da fibra de algodão produzida a partir de uma planta de algodão por meio de transformação com uma sacarose-fosfato sintase que codifica DNA. As qualidades da fibra incluem comprimento, extensão, proporção de maturidade da fibra, conteúdo imaturo da fibra, uniformidade da fibra e micronaire [0 índice micronaire (indicativo do complexo finura / maturidade da fibra)].

WO9508914 revela uma planta produtora de fibra compreendendo em seu genoma a estrutura genética heterológica. A estrutura genética compreende um promotor de fibra específica e uma seqüência codificadora que codifica uma peroxidase na planta, tal como uma

7/114 peroxidase no algodão.

WO9626639 fornece métodos por meio dos quais uma seqüência promotora específica no ovário é utilizada para expressar os hormônios modificadores de crescimento da planta no tecido do óvulo do algodão. Os métodos permitem a modificação das características de conjuntos de casulos em plantas de algodão e fornecem um mecanismo para a alteração das características de qualidade da fibra, como, por exemplo, dimensão e comprimento da fibra.

A Patente dos Estados Unidos n² . 5.981.834, a Patente dos Estados Unidos n^a. 5.597.718, a Patente dos Estados Unidos n² . 5.620.882, a Patente dos Estados Unidos n². 5.521.708 e a Patente dos Estados Unidos n² . 5.495.07 0, todas elas revelam um método para criação por intermédio de engenharia genética de uma planta produtora de fibra e a identificação de clones de cDNA úteis para a identificação de genes de fibra no algodão. Os clones de cDNA são úteis no desenvolvimento dos correspondentes clones genômicos a partir de plantas produtoras de fibras de modo a possibilitar a criação por meio de engenharia genética de algodão e de outras plantas que utilizam estes genes. As seqüências de codificação destes genes isolados são utilizadas na orientação do sentido ou do sentido contrário de modo a alterar as características da fibra de plantas produtoras de fibra transgênica.

As solicitações de patente dos

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Estados Unidos 2002049999 e 2003074697, ambas revelam plantas de algodão do gênero Gossypium com características de fibra de algodão melhoradas. A planta de algodão tem um cassete de expressão que contém um gene que realiza a codificação para uma enzima selecionada dentre um grupo que consiste em xiloglucano endo-transglicosilase, catalase e peroxidase, de forma que o gene é expresso em células de

fibra	de	algodão	de forma a melhorar as características da
fibra	de	algodão.
			WO	01/40250 fornece métodos
para	a	melhoria	da qualidade	da fibra de algodão por

intermédio da modulação da expressão do gene de fator de transcrição.

WO 96/40924 fornece novas estruturas de DNA que podem ser utilizadas como sondas moleculares ou podem ser alternativamente inseridas em uma planta hospedeira de modo a fornecer a modificação da transcrição de uma seqüência de DNA de interesse durante diversos estágios de desenvolvimento da fibra de algodão. As estruturas de DNA compreendem uma região reguladora com início transcripcional de fibra de algodão associada a um gene, que é expressa na fibra de algodão. Também é fornecida uma nova espécie de algodão tendo uma fibra de algodão que tenha uma cor natural. A cor foi obtida por intermédio da introdução e da expressão na célula da fibra de algodão de uma estrutura de gene com pigmento.

EP0834566 fornece um gene que controla o mecanismo de formação da fibra na planta de

9/114 algodão e o qual pode ser utilizado para melhoria útil feita industrialmente.

No entanto, além da sacarose sintase, não há evidências até a presente data de que a

expressão de nenhum gene	em	particular	desempenhe um	papel
essencial na	formação	da	fibra de	algodão ou	nas
características	melhoradas	da	fibra.
			Portanto,	permanece	uma

necessidade da identificação de outros genes associados às características da fibra de plantas de algodão e uma busca mais completa por genes relacionados à qualidade se faz necessária.

Ao mesmo tempo em que se reduz a presente invenção à prática, os presentes inventores projetaram e empregaram uma nova abordagem computacional que faz uso de genômica comparativa para identificar genes que desempenham um papel fundamental no desenvolvimento da fibra. Como demonstrado no presente documento, a expressão dos referidos genes correlaciona-se com a extensão da fibra e sua expressão em excesso é o suficiente para modificar o fio da semente do tomate, um modelo elementar para as fibras de algodão. Estes resultados sugerem que os polinucleotídeos da presente invenção podem ser utilizados para a geração de plantas de algodão transgênicas que são caracterizadas pelas fibras da extensão desejada.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, o qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que

10/114 codifica um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96, em que o polipeptídeo é capaz de regular o desenvolvimento da fibra de algodão.

De acordo com outros recursos em incorporações preferenciais da invenção descrita abaixo, a seqüência de ácido nucléico é selecionada dentre o grupo que consiste em seqüências com números de identificação: 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 16, 17, 20, 21, 22, 24, 25, 27 e 13.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, o polipeptídeo é conforme é estabelecido na seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96.

' De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a seqüência de aminoácidos é conforme é estabelecido na seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, o desenvolvimento da fibra de algodão compreende a formação da fibra.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais

11/114 descritas, o desenvolvimento o alongamento da fibra.

De acordo com um outro aspecto fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à seqüência com número de identificação:

ou 91, em que a seqüência de ácido nucléico é capaz de regular a expressão de pelo menos uma seqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada a ela em uma célula endotelial do óvulo.

recursos mencionados descritas, planta ou

De acordo ainda com outros a célula endotelial do óvulo é de uma fibra de de um filamento de ponta.De acordo ainda com um outro aspecto provido um oligonucleotideo capaz de especificamente hibridizar-se com o polinucleotídeo isolado.

De acordo com um outro aspecto provida uma estrutura de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a estrutura de ácido nucléico ainda compreendendo pelo menos um elemento regulador agindo como elemento de composição operavelmente ligado ao polinucleotídeo isolado.

12/114 descritas, a seqüência do polipeptídeo é selecionada dentre

o grupo	que consiste	na	seqüência com	número	de
identificação:	: 1, 2, 4, 5,	7,	9, 10, 16, 17, 20,	21, 22,	24,
25, 27 e	13 .
				De acordo ainda	com outros
recursos	nas	incorporações	preferenciais descritas,	o
elemento	regulador agindo	como elemento de composição	é
conforme	é	estabelecido	na seqüência com	número	de
identificação:	74, 75, 85	ou	91 ou equivalentes	funcionais
deste.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provida uma célula transgênica compreendendo uma estrutura de ácido nucléico.

De acordo ainda com um aspecto adicional da presente invenção, é provida uma planta transgênica compreendendo uma estrutura de ácido nucléico.

' De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é provido um método de melhorar a qualidade da fibra e/ou a produção de uma planta produtora de fibra, com o método compreendendo a regulagem de um nível de expressão ou de atividade de pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106,

107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124,

126, 95 ou 96 na planta produtora de fibra, por meio disso melhorando a qualidade e/ou a produção da planta produtora de fibra.

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De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a qualidade da planta produtora de fibra compreende pelo menos um parâmetro selecionado dentre o grupo que consiste na extensão da fibra, comprimento da fibra, peso da fibra por extensão de unidade, proporção de maturidade, uniformidade e micronaire.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a expressão de regulagem ou a atividade de pelo menos um polinucleotídeo é reguladora para cima.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a regulagem para cima é efetuada por intermédio da introdução no algodão da estrutura de ácido nucléico.

De acordo ainda com outros recursos méncionados nas incorporações preferenciais descritas, a expressão de regulagem ou a atividade de pelo menos um polinucleotídeo é reguladora para baixo.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, a regulagem para baixo é efetuada por intermédio do silenciamento de gene.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, o silenciamento de gene é efetuado por intermédio da introdução no algodão do oligonucleotídeo.

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De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas a planta produtora de fibra é selecionada dentre o grupo que consiste em algodão, árvore de algodão de seda (Kapok, Ceiba pentandra [vulgo: sumaúma]), salgueiro de deserto, arbusto de creosoto, Winterfat, pau-de-balsa (paude-jangada), rami, Kenaf (malvácea africana, da mesma família do algodão), cânhamo, rosela, juta, sisal, Abacá (cânhamo-de-manilha ou musa textilis nee) e linho.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é provido um método de melhorar a biomassa de uma planta, com o método compreendendo a regulagem de um nível de expressão ou de atividade de pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124,

126, 95	ou 96 na planta,	por meio disso	aumentando a
biomassa	da planta.
			De acordo ainda	com outros
recursos	mencionados	nas	incorporações	preferenciais
descritas	, a planta é	uma monocotiledônea.
			De acordo ainda	com outros
recursos	mencionados	nas	incorporações	preferenciais

descritas, a planta é uma dicotiledônea.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é provido um método de identificação de genes que estejam envolvidos no

15/114 desenvolvimento da fibra de algodão, com o método compreendendo o seguinte:

(a) fornecimento de seqüência de ácidos nucléicos expressa derivada de fibras de algodão;

(b) fornecimento de seqüência de ácidos nucléicos expressa derivada de um tecido ovular;

(c) montagem, por intermédio de uso de computador, da seqüência de ácidos nucléicos expressa de (a) e (b) para a geração de agrupamentos; e (d) identificação de agrupamentos dentre os agrupamentos que compreendem a seqüência expressa de ácidos nucléicos de (a) e (b) , por meio disso identificando os genes que estão envolvidos no desenvolvimento da fibra de algodão.

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, com o método ainda compreendendo a identificação de genes qué são diferencialmente expressos na fibra de algodão seguinte (d).

De acordo ainda com outros recursos mencionados nas incorporações preferenciais descritas, o diferencial expresso compreende o seguinte:

(a) expressão específica; e/ou (b) mudança na expressão no decorrer do desenvolvimento da fibra.

De acordo ainda com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de produzir uma planta resistente a insetos, compreendendo a regulagem de um nível de expressão ou de atividade de pelo

16/114 menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96 em um filamento de ponta de uma planta, por meio disso produzindo a planta resistente a insetos.

De acordo ainda com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de produção de fibras de algodão, com o método compreendendo o seguinte:

(a) geração de uma planta de algodão transgênica que expresse pelo menos um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96; e (b) colheita das fibras da planta de algodão transgênica, por meio disso produzindo as fibras de algodão.

A presente invenção aborda de forma bem-sucedida as falhas das configurações atualmente conhecidas, por intermédio do fornecimento de genes envolvidos no desenvolvimento da fibra de algodão e métodos de utilização destes.

A menos que seja definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos usados no presente têm o mesmo sentido como compreendido de modo comum por alguém com habilidades ordinárias na técnica a qual esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no

17/114 presente possam ser utilizados na prática ou na realização de testes da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Em caso de conflitos, a especificação da patente, incluindo as definições,

prevalecerá.	Além disso,	os materiais,	os	métodos e	os
exemplos são	ilustrativos	somente e não	têm	a intenção	de
serem limitadores.
		A invenção	é	no presente
descrita por	intermédio de	exemplos somente,	com referência

aos desenhos que a acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os particulares mostrados são assim feitos por meio do uso de exemplos e para propósitos de discussão ilustrativa das incorporações preferenciais da presente invenção somente, assim como são apresentadas na causa de fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e prontamente compreendida ' dos princípios e dos aspectos conceituais da invenção. Com relação a isso, nenhuma tentativa é feita para mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhes do que se faz necessário para uma compreensão fundamental da invenção, a descrição, tomada em conjunto com os desenhos, tornando aparente àqueles com habilidades na técnica como as diversas formas da invenção podem ser incorporada na prática.

Nos desenhos:

a figura 1 é uma ilustração representando a metodologia bioinformática da presente invenção para realizar a identificação dos genes que podem ser

18/114 qualidade da fibra de algodão;

as figuras

2a-d são	gráficos	em barras	mostrando	a
expressão,	os	padrões	de genes	específicos	de
fibra (CT_	.11	figura	2b), genes	associados	de
alongamento	(CT_1,	figura 2c) e genes
associados	de	início (	CT_22, figura 2d) ;

é um gráfico representando a

CT_7 6 a figura 3 em variedades de plantas de algodão (G.

e G.

e Acala, hirsutum var

Tamcot, Coker

	barbadense var Pima por RT-PCR;	85)	, conforme	determinado
a figura 4	é uma ilustração	esquemática	do	plasmídio
	binário pPi;
as figuras	5a-l são fotografias	de	plantas	de	arabidopsis

do tipo selvagem e transgênicas que expressam em excesso os genes da presente invenção. A figura 5a mostra invólucros com duas semanas de idade

de plantas wt; a	figura	5b	mostra	invólucros	com
duas semanas de	idade	de	CT11	expressando	em
excesso plantas	de arabidopsis;	a figura	5e

mostra raízes com três semanas de idade de CT11;

a figura 5d mostra raízes com três semanas de idade de arabidopsis do tipo selvagem; a figura

5e mostra três semanas de idade de CT_20; a figura 5f mostra três semanas de idade de CT_22; a figura 5g mostra invólucros com 3 0 dias de idade de wt e de CT_9; a figura 5h mostra a

19/114 inflorescência em 3 0 dias de wt e de CT_ 9; a figura 5i mostra raízes com duas semanas de idade de CT9; a figura 5j mostra invólucros com 3 0 dias de idade de wt e de CT_40; a figura 5k mostra o invólucro com cinco semanas de idade de wt e de plantas com expressão em excesso de CT81; a figura 51 mostra uma folha de wt e plantas de arabidopsis com expressão em excesso de CT81;

as figuras 6a-e são fotografias representando plantas de tomate do tipo selvagem e transgênico com expressão em excesso de CT_20. A figura 6a mostra uma folha de planta do tipo selvagem; a figura 6b mostra uma folha de tomate transgênico CT_20; a figura 6c mostra fios de sementes de WT e plantas de tomate com expressão em excesso de CT—20; a figura 6d mostra a secção de uma semente de tomate de wt; a figura 6e mostra a secção de uma semente de tomate com expressão em excesso de CT_2 0; a figura 6f mostra fios de sementes de WT e CT_82;

as figuras 7a-b são fotografias representando plantas de tomate transgênico com expressão em excesso de GUS sob a expressão do promotor de CT_2 . A figura 7a é um corte através da fruta do tomate transgênico, com expressão em excesso de GUS sob o promotor de CT2 no estágio de maturação verde (aumento em 5 vezes) . A figura 7b é similar à figura 7a mostrando um aumento em 25 vezes; e

20/114 v?/ / ./ as figuras 8a-b são fotografias representando diversas ampliações de frutas ou de sementes de tomate de tipo selvagem e de tomate transgênico. A figura 8a é uma única semente de tomate do tipo selvagem coberta com fios de sementes, em uma ampliação de 10 vezes o tamanho real; a figura 8b mostra a semente de tomate com excesso de expressão de expansina sob 35S (ampliação de 10 vezes).

A presente invenção refere-se a polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam os mesmos que estão envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e que podem ser utilizados para melhorar a qualidade da fibra e/ou a produção/biomassa de uma planta produtora de fibra.

Os princípios e a operação da presente invenção podem ser melhor compreendidos com referência aos desenhos e às descrições que acompanham.

Antes de explicar pelo menos uma incorporação da invenção em detalhes, deve ser entendido que a invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na seguinte descrição ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de ter outras incorporações ou de ser praticada ou executada de diversas formas. Além disso, deve ser compreendido que a fraseologia e a terminologia empregadas no presente documento servem ao propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitadoras.

21/114

Algodão e produtos derivados de algodão fornecem matérias-primas que são utilizadas para produzir uma grande quantidade de produtos com base no consumidor; além de fibras têxteis, o algodão é utilizado para produzir gêneros alimentícios, alimentação de criação de fazenda ou granja, fertilizante e papel. A produção, o marketing, o consumo e a comercialização de produtos feitos à base de algodão geram um excesso de $100 bilhões anualmente apenas nos Estados Unidos, fazendo do algodão a safra com valor agregado número um.

No decorrer da década passada, a produção da fibra de algodão tem categoricamente diminuído, fazendo prontamente com que os cultivadores de algodão e os pesquisadores busquem abordagens que possam ser utilizadas para melhorar a produção e a qualidade.

aumento da qualidade da fibra e/ou a produção sob condições ambientais diversas aumentará a rentabilidade da produção da safra de algodão e fornecerá um novo espectro de propriedades do material para exploração por parte das indústrias de processamento.

Ao mesmo tempo em que se reduz a presente invenção à prática, os presentes inventores configuraram uma nova abordagem computacional que faz uso de genômica comparativa para identificar genes que desempenham um papel no desenvolvimento da fibra. Os genes identificados com o uso desta abordagem podem ser usados de forma bem-sucedida para a geração de plantas transgênicas que são caracterizadas por fibras de propriedades desejadas.

22/114

Assim sendo, de acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um método de identificação de genes que estejam envolvidos no desenvolvimento da fibra de algodão.

Conforme usado no presente documento, o termo algodão refere-se ao algodão de tipo selvagem, uma variedade cultivada (por exemplo, híbrida) ou uma planta de algodão transgênica (Gossypium).

Conforme uso no presente documento, a frase desenvolvimento da fibra refere-se ao desenvolvimento do fio da semente de algodão.

Conforme usado no presente documento, o termo desenvolvimento, quando usado no contexto de fibras de algodão, refere-se ao início da fibra e/ou ao alongamento desta, assim como ao espessamento e à maturação da parede de célula secundária da fibra.

' 0 método, de acordo com este aspecto da presente invenção, é realizado por intermédio do seguinte:

(b) fornecimento de seqüência de ácidos nucléicos expressa derivada de tecido de óvulo (ou seja, um tecido desenvolvido a partir de um ovário de uma semente de planta. Exemplos incluem, entre outros, carpelos, revestimento da semente, embrião [estado embrionário], endosperma);

(c) montagem, por intermédio de uso de computador, da seqüência de ácidos nucléicos expressa de (a) e (b) para a

23/114 (d) identificação de agrupamentos dentre os agrupamentos que por meio disso identificando os genes envolvidos no desenvolvimento da fibra nucléicos usada

Seqüência expressa de ácidos como fonte em potencial para a genes envolvidos no desenvolvimento da fibra de algodão de acordo com este aspecto da presente bibliotecas de RNA de mensageiro expresso [ou seja, etiquetas expressas de (EST), clones de cDNA, contingências, pré-mRNA, quais podem incluir seqüência genômica e/ou de cDNA.

As seqüências expressas de ácidos nucléicos, de acordo com este aspecto da presente invenção, podem ser restauradas de bases de dados préexistentes, publicamente disponíveis (vide Exemplo 1 da

seção de	Exemplos a	seguir ou bases de dados privadas).	a
De	forma alternativa,
seqüência	expressa	de ácidos	nucléicos utilizada	pela
presente	invenção	pode ser	gerada de bibliotecas	de

seqüências (por exemplo, bibliotecas de cDNA, bibliotecas de EST, bibliotecas de mRNA e outros).

Bibliotecas de cDNA são fontes adequadas para se obter informações com relação à seqüência expressa.

A geração de uma base de dados

24/114 de seqüências em tal caso é tipicamente afetada pela preparação da amostra do tecido ou da célula, do isolamento do RNA, construção e seqüenciamento de biblioteca de cDNA.

Será apreciado que as referidas bibliotecas de cDNA possam ser estruturadas a partir de RNA isolado da planta como um todo, de tecidos específicos ou de populações celulares.

			Uma	vez que	os	dados	da
seqüência	expressa	tiverem	sido	obtidos a	partir tanto	das
fibras de	algodão	, como	de	um tecido	de	óvulo,	as

seqüências podem ser agrupadas para formarem contingências. Vide Exemplo 1 da seção de Exemplos que vem a seguir.

As referidas contingências são, em seguida, reunidas de modo a identificar as seqüências homólogas (de fibras de algodão e de tecido de óvulo) presentes no mesmo agrupamento; as referidas contingências são consideradas como estando envolvidas no desenvolvimento da fibra de algodão.

Um grande número de (programas) montadores de leitura de fragmentos, ou seja, softwares de computador comumente usados, capazes de formar agrupamentos de seqüências expressas, encontram-se comercialmente disponíveis. Estes pacotes incluem, entre outros, The TIGR Assembler [Sutton G. et al. (1995) Genoma Science and

Technology 1:9-19], GAP [Bonfield JK. Et al. (1995)

Nucleic Acids Res. 23:4992-4999], CAP2 [Huang X. et al. (1996) Genomics 33:21-31], The Gebine Construction Manager [Laurance CB. Et al. (1994) Genomics 23:192-201], Bio Image

25/114

Sequence Assembly Manager, SeqMan [Swindell SR, e Plasterer

JN. (1997) Methods Mol. Biol. 70:75-89], LEADS e GenCarta (Compugen Ltd.

Israel).

envolvidos no identificados,

Uma vez que os genes que estão desenvolvimento da fibra de algodão são que vem a seguir, para identificar por meio disso os genes que são expressos de forma diferencial na fibra de algodão (ou ou durante o desenvolvimento da mudança na desenvolvimento da fibra de

Métodos de genes expressos de forma diferencial sao bem conhecidos na técnica.

Com o uso da metodologia mencionada acima, os presentes inventores foram capazes de identificar, de forma bem-sucedida, os genes que estão envolvidos no desenvolvimento da fibra

Conforme é ilustrado na de Exemplos a seguir, os genes identificados com o uso dos ensinamentos da presente categorias funcionais, de acordo com a homologia de sua seqüência às proteínas e enzimas conhecidas (Tabela 3, a seguir). Os dois genes foram classificados em uma categoria de comprometimento de destino celular: homólogo ao fator de transcrição MYB e ao GL3 que são conhecidos por estarem envolvidos no desenvolvimento de filamento de ponta em

26/114 arabidopsis. 0 padrão de expressão de ambos os genes e o fenótipo do transgene CT20 tanto na arabidopsis como nas plantas de tomate Tl apóiam seu envolvimento, principalmente, na fase de início. Dois outros genes (Tabela 3, acima) são fatores de transcrição das famílias de MYB e MADS BOX.

Muitos estudos destas duas famílias de fatores de transcrição como sendo genes homeóticos com papel-chave em diferentes processos de desenvolvimento, estando, dentre eles, o filamento de ponta e a morfogênese da fibra (Suo. J.

papel nos estágios iniciais de desenvolvimento da fibra apoiado também pelo padrão. de expressão de seu

RNA, qual é induzido antes e durante o dia da antese.

Um gene pertence às vias de amido de sacarose. Um trabalho recente demonstra que um outro gene pertence um fator limitador tanto no início da formação da fibra como em seu desenvolvimento. Um outro gene (Tabela 3, a seguir) é classificado como sendo de transporte de lipídeo cuja Expressão de RNA é altamente induzida durante o estágio inicial de alongamento da fibra

Diversos foram classificados ou como sendo genes envolvidos em desiccation, resposta à salinidade estimulada por ácido abscíssico e genes envolvidos em transferência de elétron. Dentre eles, 3 genes foram selecionados pelo padrão de expressão de RNA para serem induzidos no estágio de alongamento.

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Em vista do que foi exposto acima e, juntamente com os resultados experimentais, os quais correlatam a expressão do gene com a extensão da fibra, sugere-se que os genes da presente invenção possam ser usados para gerar uma planta produtora de fibras com qualidade de fibra comercialmente desejável.

Assim sendo, a presente invenção abrange polinucleotídeos identificados com o uso da presente metodologia e de seu polipeptídeo codificado, assim como os equivalentes funcionais dos polipeptídeos identificados no presente documento (ou seja, polipeptídeos que são capazes de regular o desenvolvimento da fibra de algodão, como pode ser determinado de acordo com os ensaios descritos na seção de Exemplos, a seguir) e suas seqüências de codificação. Os referidos equivalentes funcionais podem ser pelo menos cerca de 7 0 %, pelo menos cerca de 7 5 %,

pelo	menos	cerca	de	80	Q, 'O f	pelo	menos cerca	de	81 %	, pelo
menos	82 %,	pelo	menos	cerca de	83 %, pelo	menos cerca de
84 %,	pelo	menos	cerca	de	85 %,	pelo menos	cerca de	86 %,
pelo	menos	cerca	de	87	O, Ό /	pelo	menos cerca	de	88 %	, pelo
menos	cerca	de 89	%	, pelo	menos	cerca de 90	g, Ό /	pelo	menos
cerca	de 91	%, pelo	menos	cerca	de 92 %, pelo	menos	cerca
de 93	%, pelo menos	cerca	de 94	%, pelo menos cerca de 95 %
pelo	menos	cerca	de	75	Q, /	pelo	menos cerca	de	75 %	, pelo
menos	cerca de	75	O,	pelo menos 75 %,	digamos	100 %

homólogos à seqüência com número de identificação: 106, 107,

108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,

120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 ou 96.

28/114 rzh / /'

Equivalentes funcionais que codificam polinucleotídeos podem ser pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo

menos cerce	i de 7 5 %, digamos	100	% idênticos à	seqüência
com	número	de identificação: 1,	2,	3, 4, 5, 6, 7,	8, 9, 10,
11,	12, 16,	17, 18, 19, 20, 21,	22 ,	23, 24, 25 ou	27 .
		A	homologia (por	exemplo,

homologia por porcentagem) pode ser determinada com o uso de qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI), como, por exemplo, por meio do uso de parâmetros default.

A identificação (por exemplo, homologia por porcentagem) pode ser determinada com o uso de qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI), como, por exemplo, por meio do uso de parâmetros default.

Conforme usada no presente documento, a frase um polinucleotídeo isolado refere-se a

29/114 uma única ou dupla cepa de seqüência de ácidos nucléicos que é isolada e fornecida na forma de uma seqüência de RNA, uma seqüência complementar de polinucleotídeo (cDNA), uma seqüência genômica de polinucleotídeo e/ou seqüências de um polinucleotídeo composto (por exemplo, uma combinação dos mencionados acima).

Conforme usada no presente documento, a frase seqüência complementar de polinucleotídeo refere-se a uma seqüência, a qual resulta da transcrição reversa do mensageiro de RNA com o uso de transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal seqüência pode ampliada in vivo ou in vitro com o uso ser subsequentemente de uma polimerase de

DNA dependente de RNA.

Conforme usada no presente documento, genômica de polinucleotídeo refere-se uma seqüência cromossomo e, assim sendo, isso representa uma parte contígua de um cromossomo.

Conforme usada no presente documento, a frase seqüência de polinucleotídeo composto refere-se a uma seqüência, a qual é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma seqüência de composto pode incluir algumas seqüências hexagonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, assim como algumas seqüências intrônicas, interpondo-se entre elas. As seqüências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes, e irá,

30/114 tipicamente, incluir seqüências de sinal unidos conservados. As referidas seqüências intrônicas podem ainda incluir elementos de regulagem de expressão de ação de elemento de composição.

De acordo com uma incorporação preferencial deste aspecto da presente invenção, a

seqüência	de	ácido	nucléico é conforme	é	estabelecido na
seqüência	com	número	de identificação: 1,	2,	3, 4,	5, 6, 7,
8, 9, 10,	12,	13, 14	, 15, 16, 17, 19, 21,	22	, 23,	24, 25 ou

.

De acordo com uma outra incorporação preferencial deste aspecto da presente invenção, o polinucleotídeo isolado é conforme é estabelecido na seqüência com número de identificação: 1, 2,

3, 4, 5,	6, 7,	8, 9, 10, 11,	12, 16, 17, 18,	19,	20, 21, 22
23, 24, 2	5 ou	27 .
			De acordo ainda	com	uma outra
incorporação	preferencial	deste aspecto	da	presente
invenção,	o	polipeptídeo é	conforme é estabelecido na
seqüência	com	número de identificação: 106,	107,	108, 109,
110, 111,	112,	113, 114, 115,	116, 117, 118,	119,	120, 121,
122, 123,	124,	125, 126, 95 ou 96.
			De acordo ainda	com	uma outra
incorporação	preferencial	deste aspecto	da	presente

invenção, a seqüência de aminoácidos é conforme é estabelecido na seqüência com número de identificação: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,

119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 ou 96.

31/114

Os polinucleotídeos isolados deste aspecto da presente invenção também podem ser qualificados com o uso de um ensaio de hibridização por intermédio da incubação dos polinucleotídeos isolados descritos acima na presença de sonda ou escorvador de oligonucleotídeo sob condições de hibridização de moderadas a severas.

Condições de hibridização de moderadas a severas são caracterizadas por uma solução de 10 hibridização tal como uma contendo 10% de sulfato de dextrano, 1 M NaCl, 1% SDS e 5x 10⁶ cpm ³²P com sonda etiquetada, a 65 ²C, com uma solução de lavagem final de

0,2 x SSC e 0,1 % SDS e lavagem final a 65²C e, considerando que a hibridização moderada seja efetuada com 15 o uso de uma solução de hibridização contendo 10% de sulfato de dextrano, 1 M NaCl, 1 % SDS e 5 x 10⁶ cpm ³²P com sonda etiquetada, a 65 ²C, com uma solução de lavagem final de 1 x SSC e 0,1 % SDS e lavagem final a 50 ²C.

Assim sendo, a presente invenção abrange uma seqüência de ácidos nucléicos descrita logo acima; fragmentos desta, seqüências passíveis de serem hibridizadas com esta; seqüências homólogas a esta, seqüências que codificam polipeptídeos similares com diferente utilização de códon, seqüências alteradas caracterizadas pela mutação, como, por exemplo, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, seja ocorrendo de forma natural ou induzida pelo homem, seja de forma randômica ou de uma forma feita com alvo.

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Visto que as seqüências de polinucleotídeos da presente invenção codificam polipeptídeos previamente não-identifiçados, a presente invenção também abrange novos polipeptídeos ou partes destes, os quais são codificados pelos polinucleotídeos isolados e os respectivos fragmentos de ácidos nucléicos destes, descritos logo acima.

Assim sendo, a presente invenção também abrange polipeptídeos codificados pelas seqüências de polinucleotídeos da presente invenção. As seqüências de aminoácidos destes novos polipeptídeos estão estabelecidas na seqüência com número de identificação: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 ou 96.

A presente invenção também abrange homólogos destes polipeptídeos, os referidos

homólogos	podem ser	pelo	menos	cerca	de	70 %,	pelo	menos
cerca	de	75 %, pelo	menos	cerca	de 8 0	%,	pelo	menos	cerca
de 81	O, !	pelo menos	cerca	de 82	%, pele	i menos cerca de	83 %
pelo	menos cerca de	84 %,	pelo	menos	cerca de	85 %,	pelo
menos	cerca de 86 %	, pelo	menos	cerca	de	87 %,	pelo	menos
cerca	de	88 %, pelo	menos	cerca	de 89	Q.	pelo	menos	cerca
de 9 0	o, o /	pelo menos	cerca	de 91	%, pele	i menos cerca de	92 %
pelo	menos cerca de	93 %,	pelo	menos	cerca de	93 %,	pelo
menos	cerca de 94 %	, pelo	menos	cerca	de	95 %,	pelo	menos
cerca	de	96 %, pelo	menos	cerca	de 97	%,	pelo	menos	cerca
de 9 8	O. Ό /	pelo menos	cerca	de 99	%, ou	mais digamos 100 %,

homóloga à seqüência com número de identificação: 26, 106,

33/114

107, 109, 110, 112,

114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e de polipeptídeos tendo mutações, tais como deleções, um ou mais aminoácidos, seja ocorrendo de forma natural ou induzida randômica ou de uma forma feita

AS pelo homem, seja de forma com alvo.

capacidades dos polinucleotídeos da presente invenção regularem o desenvolvimento da fibra determinadas diretamente com base extensão da fibra ou crescimento da fibra presente documento). No de algodão também pode tal como por intermédio para está e os uma fibra de habilidade (descrita entanto, o ser de o desenvolvimento da e de seus produtos de de algodão podem em pelo menos algodão, tal como da fibra ou taxa melhor mais abaixo ser um uma de no desenvolvimento da fibra determinado de forma indireta, sistemas fibra de bem estabelecido que as células de modelos de plantas do filamento fios da raiz compartilham características em usadas como si stemas e, de exemplo, de ponta comum com por exemplo, podem mode1o para ser em

Wagner. G.J. et. al . (2 004)], conforme demonstrado seguir.

Por meio da análise dos perfis

34/114 inventores foram capazes de das seqüências biomoleculares (ou seja, polinucleotídeos da presente invenção no início da da fibra e/ou em seu alongamento.

Estes resultados foram ainda mais substanciados por intermédio do estabelecimento de uma correlação entre a expressão do gene e a extensão da fibra (vide Exemplo 7).

Estes resultados sugerem que as seqüências biomoleculares da presente invenção (por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, promotores, oligonucleotídeos, anticorpos, também denominados agentes) podem ser usados para melhorar a qualidade da fibra e/ou a produção de uma planta produtora de fibra.

Assim sendo, de acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é provido um método de melhorar a qualidade da fibra e/ou a produção de uma planta produtora de fibra.

método deste aspecto da presente invenção é efetuado por intermédio da regulagem de um nível de expressão ou de atividade de pelo menos um polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção (descritos acima no presente documento) na planta produtora de fibra, por meio disso melhorando a qualidade e/ou a produção da planta produtora de fibra.

Conforme usada no presente documento, a frase planta produtora de fibra refere-se a plantas que compartilham a característica em comum de terem

35/114 uma forma alongada e serem abundantes em celulose nas paredes espessas das células, tipicamente denominadas paredes secundárias. As referidas paredes podem ou não podem ser lignifiçadas, e o protoplasto das referidas células podem ou não podem ser viáveis na maturidade. As referidas fibras têm muitos usos industriais, por exemplo, em madeira cerrada e em produtos fabricados com madeira, papel, fibras têxteis, material de tecido grosseiro para sacos e de boxe, cordame, escovas e vassouras, enchimento e estofamento, calafetagem, reforço de outros materiais, e fabricação de produtos derivados de celulose.

De acordo com uma incorporação preferencial deste .aspecto da presente invenção, a planta produtora de fibra é algodão.

O termo fibra é geralmente usado incluindo as células condutoras com paredes espessas, tais como ^z receptáculos e traqueóide e os agregados fibrilares de muitas células individuais. Portanto, o termo fibra refere-se a (a) células condutoras e não condutoras com parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraaxilar, incluindo aquelas do pólen, córtex, tecido de base, e epiderme; e (c) fibras a partir de pedúnculos, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (como, por exemplo, aquelas da Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de galhos cortados ou quebrados e vassouras).

Exemplos de plantas produtoras de fibra incluem, entre outros, safras agrícolas, como, por exemplo, algodão, árvore de algodão de seda (Kapok, Ceiba

36/114 pentandra [vulgo: sumaúma]), salgueiro de deserto, arbusto de creosoto, Winterfat, pau-de-balsa (pau-de-jangada), rami, Kenaf (malvácea africana, da mesma família do algodão), cânhamo, rosela, juta, sisal, Abacá (cânhamo-de-manilha ou musa textilis nee), linho, milha, cana-de-açúcar, paina (fibras sedosas extraídas das sementes da paineira), fibra de coco, bambu, spanish barbino e Agave spp. (por exemplo, sisal).

Conforme usada no presente documento, a frase qualidade da fibra refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que é agricolamente desejado ou necessário na indústria de fibras (descrito em maiores detalhes a seguir, no presente documento). Exemplos dos referidos parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por unidade de extensão, proporção de maturidade e uniformidade' (descrito em maiores detalhes, a seguir, no presente documento).

A qualidade da fibra de algodão (fios de linho usados para compressas) é tipicamente medida de acordo com o comprimento da fibra, sua resistência e adequação. Conseqüentemente, a qualidade dos fios de linho usados para compressas é considerada como sendo mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

Conforme usada no presente documento, a frase produção de fibra refere-se à quantia ou quantidade de fibras produzidas a partir da planta produ

37/114 tora de fibras.

Conforme usado no presente documento, o termo melhoria refere-se a pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 2 0 %, pelo menos cerca de 3 0 %, pelo menos cerca de 4 0 %, pelo menos cerca de 5 0 %, mudança na qualidade da fibra/produção em comparação com a de uma planta nativa (ou seja, não modificada com as seqüências biomoleculares da presente invenção).

Conforme usado no presente documento, o termo regulagem refere-se à regulagem para cima, regulagem para baixo ou a uma combinação destes. Por exemplo, quando um aumento no número de fibra é desejado, a presente invenção pode ser efetuada pela regulagem para cima de pelo menos um polinucleotídeo da presente invenção, que está envolvido na formação do início da fibra (por exemplo, sequências com números de identificação: 4, 10, 9, 12, 16 e 25). De forma alternativa, quando as fibras curtas são desejadas, como, por exemplo, no milho, então a presente invenção é efetuada por intermédio de regulagem para baixo de pelo menos um polinucleotídeo da presente invenção que está envolvido no alongamento da fibra (por exemplo, seqüências com números de identificação: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 27). De forma alternativa, a presente invenção pode ser efetuada por meio da regulagem para cima da expressão de pelo menos um polinucleotídeo (como, por exemplo, aquele envolvido no alongamento da fibra) e regulagem para baixo de pelo menos

38/114 um polinucleotídeo (como, por exemplo, aquele envolvido na formação do início da fibra) da presente invenção. Desta maneira, é possível obter uma planta produtora de fibras com produção de fibra melhorada de cada uma das que tem curta extensão.

A regulagem para cima de um nível de expressão de pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção pode ser efetuada no nível genômico (por exemplo, ativação de transcrição por intermédio dos promotores, otimizadores, ou outros elementos reguladores), no nível de transcrição, ou no nível protéico.

A seguir, eis uma lista não abrangente de agentes capazes de regularem para cima o nível de expressão e/ou a atividade das seqüências biomoleculares (ou seja, seqüências de ácido nucléico ou seqüências de proteínas) da presente invenção.

' Um agente capaz de fazer a regulagem para cima da expressão de um polinucleotídeo de interesse pode ser uma seqüência de polinucleotídeo exógena designada e estruturada para expressar pelo menos uma parte funcional desta (por exemplo, melhorando a produção/qualidade da fibra, aumentando a biomassa etc.). Conseqüentemente, a seqüência de polinucleotídeo exógena pode ser uma Seqüência de DNA ou de RNA que codifica uma molécula de polipeptídeo, que é capaz de melhorar a produção ou a quantidade da fibra. De forma alternativa, o polinucleotídeo exógeno pode ser uma região reguladora que age como elemento de composição (por exemplo, seqüência com

39/114 número de identificação: 74,

75,

91) , que pode ser introduzido na planta de modo a aumentar a expressão de qualquer polinucleotídeo que estiver envolvido no desenvolvimento da fibra (por exemplo, sintase, como é descrito na Patente dos

Estados Unidos

6,472.588) .

Para expressar polinucleotídeos exógenos em células de plantas, uma seqüência de polinucleotídeos da presente invenção ligada a uma 10 estrutura de ácido nucléico adequada para a expressão das células das plantas. A referida estrutura de ácido nucléico inclui uma região reguladora que age como elemento de composição, como, por exemplo, uma seqüência promotora para direcionar a transcrição da seqüência de polinucleotídeos 15 na célula de uma forma constitutiva ou passível de ser induzida. O promotor pode ser homólogo ou heterólogo à planta/célulà transformada.

Seqüências promotoras preferenciais que podem ser usadas, de acordo com este 20 aspecto da presente invenção são os promotores de células endoteliais.

Por exemplo, as seqüências promotoras de cada uma das seqüências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser preferivelmente utilizadas 25 na estrutura de ácido nucléicos da presente invenção.

De acordo com uma incorporação preferencial deste aspecto da presente invenção, o promotor é pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo

40/114 ζΆ, Μ!

/ '

menos	cerca	de	82 %	, pelo	menos	cerca	de	83 %,	pelo	menos
cerca	de 84	%,	pelo	menos	cerca	de 85	Q. /	pelo	menos	cerca
de 8 6	%, pelo	menos cerca de 87 %	, pelo	menos cerca de	88 %,
pelo	menos cerca de	89 %,	pelo	menos	cerca de	90 %,	pelo
menos	cerca	de	91 %	, pelo	menos	cerca	de	92 %,	pelo	menos
cerca	de 93	O, O l	pelo	menos	cerca	de 94	O, t	pelo	menos	cerca
de 9 5	%, pelo menos	cerca	de 9 6	%, pelo	menos cerca de	97 %

pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou 100 % idêntico à seqüência com número de identificação: 85 ou 91, que é capaz de regular a expressão de pelo menos uma seqüência de polinucleotídeos operavelmente ligada a este em uma célula de óvulo endotelial (ou seja, capaz de exercer um efeito regulador sobre a codificação da seqüência a ele ligada).

Como é claramente ilustrado na seção de Exemplos que vem a seguir, as referidas seqüências promotoras são capazes de regular a expressão da codificação da seqüência de ácido nucléico (por exemplo, GUS) passível de ser operada que está ligada a ele.

Outros exemplos de promotores de uma fibra de algodão otimizada incluem aqueles dos genes expressos na fibra de algodão E6 (John et al. , Plant Mol. Biol., 30:297-306 (1996) e John et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., 93:12768-12773 (1996) e) , H6 (John et al. , Plant Physiol., 108:669-676, (1995)), FbL2A (Rinehart et al. , Plant Physiol., 112:1331-1341 (1996) e John et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:12768-12773 (1996)), rac (Delmer et al. , Mol. Gen. Genet., 248:43-51 (1995)); CelA (Pear et /ο/41/114 al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 93:12637-12642 (1996)); CAP (Kawai et al., Plant Cell Physiol. 39:1380-1383 (1998)); ACP (Song et al. , Biochim. Biophys. Acta 1351:305-312 (1997); e LTP (Ma et al., Biochim. Biophys. Acta 1344:111114 (1997)) . Outros promotores específicos de uma fibra de algodão são revelados na Patente dos Estados Unidos de n^a . : 5.495.070 .

Outros promotores que podem ser utilizados de acordo com este aspecto da presente garantem a expressão somente em como a folha, tubérculo da raiz, semente, pedúnculo, flor ou tipos de células como, por exemplo, parênquimas, epidérmicas, específicas, filamento de ponta ou células vasculares.

Os promotores preferenciais são revelados em WO 2004/111183, para Evogene Ltd.

Os promotores preferenciais para melhorar a expressão no tecido vascular incluem o promotor CAD 2 (Sarnaj et al., Plant, 204:437-443 (1998)), o promotor Pt4Cll (Hu et al. , Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, promotor C4H (Meyer et al. , Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 95:6619-6623 (1998)), os promotores

PtX3H6 e

PtX14A9 (Loopstra et al., Plant Mol. Biol., :277-291 :729-735 o promotor RolC (Graham, Plant Mol., o promotor Hvhspl7 (Graham, Plant Mol.

Biol., 33:729-735 (1997)), o promotor Hvhspl7 (o promotor

Rvhspl7 (Raho et al . , J. Expt. Bot. , 47:1587-1594 (1996)),

42/114 e o promotor COMT (Capellades et al., Plant Mol. Biol., 31:307-322 (1996) ) .

Os promotores preferenciais que melhoram a expressão no tecido do pedúnculo incluem promotores de medula (Datta, Theor. Appl. Genet., 97:20-30 (1998) e Ohta et al., Mol. Gen. Genet, 225:369-378 (1991)), e o promotor da peroxidase aniônica (Klotz et al. , Plant Mol. Biol., 36:509-520 (1998)). Os promotores preferenciais que melhoram a expressão no pólen, córtex e no sobreiro, mas não no xilema nem na medula, incluem o promotor Psam-1 (Mijnsbrugge et al. , Plant e Cell Physiol., 37:1108-1115 (1996) ) .

Os promotores preferenciais que melhoram a expressão em sementes incluem os promotores phas (Geest et al. , Plant Mol. Biol. 32:579-588 (1996));

o promotor GluB-1 (Takaiwa et al., Plant Mol. Biol. 30:1207-1221 (1996)); o promotor de gama-zein (Torrent et al. Plant Mol. Biol. 34:139-149 (1997)), e o promotor de oleosina (Sarmiento et al. , The Plant Journal 11:783-796 (1997) ) .

Outras seqüências promotoras que mediam a expressão constitutiva, passível de ser induzida, específica do tecido ou específica do estágio de desenvolvimento, são reveladas em WO 2004/081173 para Evogene Ltd.

Promotores truncados ou sintéticos, incluindo regiões específicas de nucleotídeos que conferem expressão melhorada do tecido também podem ser

43/114 utilizados, conforme é exemplificado por intermédio da identificação de elementos reguladores dentro de promotores maiores, conferindo uma expressão melhorada do xilema (Seguin et al. , Plant Mol. Biol., 35:281-291 (1997);

Torres-Schumann et al. , The Plant Journal, 9:283-296 (1996);

e Leyva et al., The Plant Cell, 4:263-271 (1992)).

A estrutura de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um plasmidio, um BACmid [Um BACmid é um plasmidio que porta o genoma completo do bacilovírus] , um fagemidio, um cosmidio, um bacteriófago, um vírus ou um cromossomo artificial. Preferivelmente, a estrutura de ácido nucléico da presente invenção é um vetor de plasmídeo, mais preferivelmente um vetor binário.

A frase vetor binário refere-se a um vetor de expressão que porta uma região modificada T de plasmídeo de Ti, capaz de ser multiplicada tanto nas células de E coli e nas células de Agrobacterium, e geralmente compreendendo gene(s) relator(es) para transformação da planta entre duas regiões mais amplas. Um vetor binário adequado para a presente invenção inclui PBI2113, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, pBIlOl (Clonetech), pPI (vide Exemplo 5 da seção de Exemplos, a seguir) ou modificações deste.

A estrutura de ácido nucléico da presente invenção pode ser utilizada para transformar uma célula hospedeira (por exemplo, célula bacteriana, de planta) ou planta.

Conforme usado no presente

44/114 documento, os termos transgênico ou transformado são usados de forma intercambiável com referência a uma célula ou a uma planta para dentro da qual material genético clonado tenha sido transferido.

Em transformação estável, a molécula de ácido nucléico da presente invenção é integrada ao genoma da planta, e como tal, isso representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, a molécula de ácido nucléico é expressa pela célula transformada, mas não integrada, dentro do genoma, e, como tal, representa um traço transitório.

Há diversos métodos de introduzir genes estrangeiros tanto em plantas monocotiledôneas dicotiledôneas (Potrykus, I.

(1991) .

Annu Rev

Plant

Physiol Plant Mol Biol

42,

205-225;

Shimamoto,

K. et

274-276) .

Os principais métodos da de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais:

gene mediada por

Agrobactérias [Agrobacterium-mediated gene et al. (1987). Annu Rev

Plant

J. and Rogers, S. G. (1989) . Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pp. 2-25, J. Schell and L.K. Vasil, eds. ,

Academic Publishers, San Diego, CaL.; and Gatenby, A.A. (1989). Regulation and Expression of Plant Genes in Microorganisms, pp. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung

45/114 and C. J. Arntzen, eds., Butterworth Publishers, Boston,

Mass.

(ii) Captação Direta de DNA [Direct DNA uptake]. Vide, por exemplo,: Paszkowski, J.

Cell Culture and

Plants, Vol. 6,

Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,

Schell

Vasil, eds.,

Academic Publishers, San

Diego,

Toriyama, K.

et al. (1998). Bio/Technol

6,

1072-1074 (métodos para a captação direta de DNA para o interior de protoplastos [methods for direct uptake of DNA into

Vide também:

Zhang et

Rep 7, 379-384;

and Fromm, transformation of maize af ter gene transfer by electroporation.

Nature 319, 791-793 (Captação de DNA induzida por breve choque elétrico de células de plantas [DNA uptake induced by brief electric shock of plant cells]). Vide também: Klein et al. (1988). Bio/Technology 6,

559-563; McCabe, D. E. et al. (1988). Stable Transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology 6, 923-926; and Sanford; J. C. (1990).

Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209 (Injeção de DNA em células de plantas ou em tecidos de plantas por intermédio de bombardeamento de partículas [injection into plant cells or tissues by particle bombardeamento]) . Vide também: Neuhaus, J. M. et al. (1987) .

Theor Appl Genet 75, 30-36; and Neuhaus, J. M. and Spangenberg, G. C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (uso de sistemas de micropipetas [use of micropipette systems]).

46/114

Vide Patente dos Estados Unidos de n² . : 5.464.765 (transformação de varredor de carbureto de silício ou de fibras de vidro de culturas celulares, Embriões ou tecido de calo [glass fibers or silicon carbide whisker transformation of cell cultures, Embryos ou callus tissue]). Vide também: DeWet, J. M. J. et al. (1985). Exogenous gene transfer in maize (Zea mays) using DNA-treated pollen, Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. P.

Chapman et al., eds., Longman, New York-London, pp. 197-209; e Ohta, Y. (1986). High-Efficiency Genetic Transformation of Maize by a Mixture of Pollen and Exogenous DNA. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (incubação direta de DNA com

pólen em	germinação	[direct	incubation	of DNA	with
germinating	pollen]).
		0	sistema mediado por	uma
agrobactéria inclui o	uso de	vetores de	plasmídeos	que

contêm segmentos de DNA definidos, os quais se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie da planta e do sistema de transferência da Agrobactéria. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento do disco de folha, o qual pode ser realizado com qualquer explante de tecido que forneça uma boa fonte para o início da diferenciação da planta como um todo (Horsch, R. B. et al. (1988) . Leaf disc transformation. Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). Uma abordagem suplementar emprega o sistema de transferência de agrobactéria em combinação com infiltração a vácuo. 0

47/114 sistema da agrobactéria é especialmente útil na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

Há diversos métodos de fazer a transferência direta de DNA para o interior de células de plantas. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico, abrindo míniporos de forma a permitir a entrada de DNA. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado no interior das células com o uso de micropipetas. No bombardeamento da micropartícula, o DNA é injetado de forma mecânica para o interior das células, como, por exemplo, dos cristais de sulfato de magnésio ou das partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados para o interior das células ou dos tecidos das plantas.

Em seguida à transformação estável, a propagação da planta ocorre. 0 método mais comum de propagação de planta é feito por intermédio da semente. A desvantagem da regeneração por intermédio da propagação da semente, no entanto, é a falta de uniformidade na safra por causa de heterozigosidade, visto que as sementes são produzidas por plantas, de acordo com as variações genéticas regidas pelas regras de Mendelian. Em outras palavras, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com seus traços próprios e específicos. Portanto, é preferível que a regeneração seja efetuada de forma tal que a planta regenerada tenha traços e características idênticos àqueles da planta-mãe transgênica. 0 método preferencial de regeneração de uma planta transformada é

48/114 feito por intermédio de micropropagação, o qual provê uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

A micropropagação é um processo de cultivar plantas de segunda geração a partir de uma única amostra de tecido estirpado de uma planta-mãe selecionada ou cultivar [sic] [cultivo]. Este processo permite que a reprodução da massa de plantas tenham o tecido preferencial e que expressem uma proteína de fusão. As plantas recém-geradas são geneticamente idênticas à planta original e têm todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta com qualidade em um curto período de tempo, além de oferecer uma multiplicação rápida de cultivars [sic] [cultivos] selecionados com a preservação das características da planta transformada original ou da planta transgênica original. As vantagens deste método de clonagem de plantas incluem a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.

A micropropagação é um procedimento com múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou condições de crescimento entre os estágios. O processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: estágio um, cultivo inicial do tecido; estágio dois, multiplicação da cultura do tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quatro, cultivo em estufa e endurecimento. Durante o estágio um, a cultura do tecido é estabelecida e certificada livre de

49/114 contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido sejam produzidas para atingir as metas de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecidos 5 recentemente cultivadas são divididas e cultivadas na forma de plantinhas individuais. No estágio quatro, as plantinhas transformadas são transferidas para uma estufa para que passem por endurecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada de forma que elas possam 10 continuar a crescer no ambiente natural.

Embora a transformação estável esteja preferivelmente presente, a transformação transitória de, por. exemplo, células das folhas, células meristemáticas ou a planta como um todo também é levada em 15 consideração pela presente invenção.

A transformação transitória pode ser efetuada por intermédio de quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por intermédio de infecção viral com o uso de vírus modificados 20 de plantas.

Vírus que foram mostrados como sendo úteis para a transformação de hospedeiros de plantas

incluem o vírus	de	mosaico	de	couve-flor CaMV,	vírus	do
mosaico do	tabaco	TMV,	além	de bacilovírus	BV.	A
25 transformação	de	plantas com o	uso do vírus da	planta	é

descrita, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos de n² . :

4.855.237 (vírus de mosaico dourado do feijão [bean golden mosaic virus], BGMV); EPA 67.553 TMV; Solicitação Japonesa fíO1

50/114

Publicada de N².: 63-14693 TMV; EPA 194.809 BV; EPA 278.667 BV; and Gluzman, Y. et al. (1988). Communications in

Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor

Laboratory, New York, pp. 172-189. 0 uso de partículas de pseudo-vírus na expressão de DNA estrangeiro em muitos hospedeiros, incluindo plantas, é descrito em WO 87/06261.

A estrutura de vírus de RNA de planta para a introdução e a expressão de seqüências de ácido nucléico não-virais exógenas em plantas é demonstrada 10 pelas referências acima, assim como por: Dawson, W. 0. et al. (1989). A tobacco mosaic virus-hybrid expresses e loses an added gene. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986) Science 231, 1294-1297; and Takamatsu, N. et al. (1990). Production of enkephalin in tobacco protoplasts 15 using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Left 269, 73-76.

Caso um vírus transformador seja um vírus de DNA, uma pessoa com habilidade na técnica pode realizar modificações adequadas ao próprio vírus. De forma alternativa, o vírus pode, em primeiro lugar, ser 20 clonado para dentro de um plasmídeo bacteriano para se obter facilidade de estruturação do vetor viral desejado com o DNA estrangeiro. 0 vírus pode, em seguida, ser estirpado do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser fixada ao DNA 25 viral, o qual é, em seguida, replicado pelas bactérias. A transcrição e a tradução do DNA produzirão a proteína de revestimento, a qual encapsularão o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um

51/114 cDNA e inserido em um plasmídeo. 0 plasmídeo é, em seguida, usado para formar todas as estruturas genéticas da planta. 0 vírus de RNA é, em seguida, transcrito a partir da seqüência viral do plasmídeo, seguida da tradução dos genes virais, de forma a produzir as proteínas de revestimento que encapsulam o RNA viral.

A estrutura de vírus de RNA de planta para a introdução e a expressão em plantas de seqüências de ácido nucléico, não-virais, exógenas, tais como aquelas inclusas na estrutura da presente invenção, é demonstrada nas referências acima, assim como na Patente dos Estados Unidos de n^a: 5.316.931.

Em uma incorporação, é fornecido para inserção um ácido nucléico viral de planta, compreendendo uma deleção da proteína de revestimento nativa que codifica a seqüência a partir do ácido nucléico viral, uma proteína de revestimento de planta viral nãonativa (estrangeira) que codifica a seqüência, e um promotor não-nativo, preferivelmente, o promotor subgenômico da proteína de revestimento não-nativa que codifica a seqüência, e capaz de expressão no hospedeiro da planta, acondicionamento do ácido nucléico viral da planta recombinante, além de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro por parte do ácido nucléico viral da planta recombinante. De forma alternativa, a proteína de revestimento nativa que codifica a seqüência pode ser formada não passível de ser transcrita, por intermédio da inserção da seqüência de ácido nucléico não-nativa dentro

52/114 dela, de forma tal que uma proteína não-nativa seja produzida. A estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante pode conter um ou mais adicionais promotores subgenômicos não-nativos. Cada promotor subgenômico não5 nativo é capaz de transcrever ou de expressar os genes adjacentes ou as seqüências de ácido nucléico no hospedeiro da planta e incapaz de recombinação uma com a outra e com promotores subgenômicos nativos. Além do mais, a estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante pode conter um ou mais elementos reguladores que agem como elementos de composição, como, por exemplo, os otimizadores, os quais se ligam a um elemento que efetua a regulagem e regulam a transcrição de uma seqüência de codificação localizada downstream em relação a esta. Seqüências de ácido nucléico não-nativas podem ser inseridas em posição adjacente à do promotor subgenômico viral da planta nativa ou os promotores subgenômicos virais da planta nativa e nãonativa se mais do que uma seqüência de ácido nucléico for incluída. As seqüências de ácido nucléico não-nativas são transcritas ou são expressas na planta hospedeira sob o controle do(s) promotor(es) subgenômico(s), de forma a produzir os produtos desejados.

Em uma segunda incorporação, a estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante é 25 fornecida como na primeira incorporação, exceto pelo fato de que a proteína de revestimento nativa que codifica a seqüência fica localizada em posição adjacente àquela dos promotores subgenômicos da proteína de revestimento não

53/114 nativa em vez de adjacentes à proteína de revestimento nãonativa que codifica a seqüência.

Em uma terceira incorporação, a estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante é fornecida compreendendo um gene de proteína de revestimento nativo colocado em posição adjacente a seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não-nativos inseridos na estrutura viral de ácido nucléico. Os promotores subgenômicos não-ativos inseridos na estrutura viral de ácido nucléico. Os promotores subgenômicos não-ativos inseridos são capazes de transcrever ou de expressar os genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de fazer recombinação uns com os outros e com os promotores subgenômicos nativos. Seqüências de ácido nucléico não-nativas podem ser inseridas em posição adjacente à da planta subgenômica nãonativa sob d controle dos promotores subgenômicos de forma a produzir o produto desejado.

Em uma quarta incorporação, a estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante é fornecida como na terceira incorporação, exceto pelo fato de que a proteína de revestimento nativa que codifica a seqüência é substituída por uma proteína de revestimento não-nativa que codifica a seqüência.

Os vetores virais são encapsulados por proteínas de revestimento expressas codificadas pelas estruturas de ácido nucléico virais das plantas recombinantes, conforme é descrito acima no

54/114 presente documento, de forma a produzir um vírus de planta recombinante. A estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar as plantas hospedeiras apropriadas. A estrutura de ácido nucléico viral da planta recombinante é capaz de realizar a replicação em um hospedeiro, espalharse de forma sistêmica dentro do hospedeiro, além de fazer a transcrição ou a expressão de um ou mais genes estrangeiros (ácido nucléico isolado) no hospedeiro de forma a produzir a proteína desejada.

Além do exposto acima, a molécula de ácido nucléico da presente invenção também pode ser introduzida em um genoma de cloroplasto, por meio deste possibilitando a expressão do cloroplasto.

Uma técnica para a introdução de seqüências de ácido nucléico exógenas no genoma dos cloroplastos'é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos: em primeiro lugar, as células de plantas são quimicamente tratadas de forma a reduzirem o número de cloroplastos por célula a cerca de um. Em seguida, o ácido nucléico exógeno é introduzido no interior das células, preferivelmente via bombardeamento de partícula, com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de ácido nucléico exógeno no interior dos cloroplastos. O ácido nucléico exógeno é selecionado por uma pessoa comum com habilidade na técnica para que seja capaz de ter integração com o interior do genoma do cloroplasto via recombinação homóloga, a qual é prontamente afetada pelas enzimas

55/114 inerentes ao cloroplasto. Para este fim, o ácido nucléico exógeno compreende, além de um gene de interesse, pelo menos uma seqüência de ácido nucléico derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o ácido nucléico exógeno compreende um marcador passível de ser selecionado, o qual, por intermédio de procedimentos de seleção seqüencial, serve para permitir que um artífice apure se todo o genoma do cloroplasto em seguida à referida seleção, ou substancialmente todas as cópias destes, incluem o ácido nucléico exógeno. Maiores detalhes com relação a esta técnica são encontrados nas Patentes dos Estados Unidos de N^a : 4.945.050 e 5.693.507, as quais são incorporadas no presente documento por meio de referência

Um polipeptídeo pode, dessa forma ser produzido por intermédio do sistema de expressão de proteína do cloroplasto e tornar-se integrado na membrana interna do cloroplasto.

A regulagem para baixo de um gene de interesse pode ser efetuada no nível genômico e/ou no nível de transcrição com o uso de uma variedade de moléculas que interferem na transcrição e/ou na tradução (por exemplo, anti-sentido, siRNA), ou no nível da proteína, usando, por exemplo, anticorpos, técnicas de imunização e similares.

Por exemplo, um agente capaz de regular para baixo uma atividade de um polipeptídeo de interesse é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de ligar, especificamente, um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, o anticorpo liga especificamente

56/114 pelo menos um epítope do polipeptídeo de interesse. Conforme usado no presente documento, o termo epítope refere-se a qualquer antigênico determinante sobre um antígeno ao qual está ligado o paratope de um anticorpo.

A regulagem para baixo no nível do RNA pode ser efetuada por intermédio de estratégias de silenciamento com base em RNA, as quais são eficazes em' plantas. Vide, por exemplo, Kusaba (2004) RNA interference in crop plants. Curr. Opin. Biotechnol. 15 (2) :139-43,- Matzke (2001) RNA based silencing strategies in plants. Curr. Opin. Genet. 11:221-7.

Por exemplo, um agente capaz de realizar a regulagem para baixo de um polinucleotídeo de interesse é uma pequena molécula de RNA de interferência (siRNA) no processo da interferência do RNA (RNAi).

Os dsRNAs podem ser transferidos para as plantas de diversos modos (revisado em Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring planta genome by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38): bombardeamento de microprojétil com dsRNA ou vetores de expressão de RNA de grampo de fio contendo íntron (ihpRNA); infiltração do tecido da planta com uma cepa de Agrobactéria portando um T-DNA que expressa um ihpRNA transgene; silenciamento de gene induzido por vírus (VIGS), no qual a seqüência-alvo é integrada às seqüências virais que são utilizadas para infectar a planta, ou são expressas a partir de transgenes introduzidos pela Agrobactéria, além de por meio de transformação estável com ihpRNA expressando

57/114 transgenes. As diversas técnicas de RNAi têm, cada uma delas, vantagens e desvantagens no que diz respeito ao quão persistente é seu efeito e a gama das plantas às quais elas podem ser aplicadas, como, por exemplo, o bombardeamento pode ser aplicado a qualquer planta, mas produz somente efeitos transitórios. De forma alternativa, a transformação com transgenes que expressam ihpRNA oferece silenciamento de gene estável e passível de ser herdado, mas requer técnicas eficientes de transformação de plantas. Os transgenes de ihpRNA mostraram-se muito eficazes para uma ampla gama de genes*alvo em diversas espécies de plantas (revisado em Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring plant genome by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38; Wesley S, Helliwell C, Smith N, et al. 2001.

Construct design for efficient, effective and highthroughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581-590), indicando que o mecanismo de RNAi é, provavelmente, conservado em todas as espécies de plantas. Isso é apoiado por um relatório recente de RNAi no musgo não-vascular Physcomttrella patens (Bezanilla M, Pan A, Quatrano R. 2003.

RNA interference in the moss Physcomttrella patens. Plant

Physiol 133: 470-474) .

Estruturas genéticas antisentido para promotores específicos de fibra (por exemplo, para a seqüência com número de identificação: 85, 91) podem ser utilizadas para inibir ou diminuir a expressão de um ou mais genes de fibras em células de fibras. O uso de estruturas anti-sentido é descrito na Patente dos Estados

58/114

Unidos de n^e . : 5.495.	. 070	e em Smith, et al.	Nature 334 724-
726.	, 1988; Bird, et	al.	Bio/Technology 9:	635-639, 1991;
Van	der Krol, et al.	Gene	72: 45-50, 1988.
			Será apreciado	que a geração
5 da	planta produtora	de	fibras com traços	desejados, de

acordo com a presente invenção, também possa ser efetuada por intermédio do cruzamento de cada uma das plantas geneticamente modificadas (mencionadas) acima com as plantas de tipo selvagem, híbridas ou transgênicas, com o 10 uso de métodos que são bem conhecidos na técnica.

Uma vez que as plantas transgênicas da presente invenção são geradas, as fibras são colhidas (por exemplo, por meio de coleta mecânica e/ou coleta feita com as mãos) e tanto a produção como a 15 qualidade da fibra são determinadas.

A seguir são descritos os métodos de qualificação das fibras de algodão.

Comprimento da fibra

Instrumentos tais como o fibrógrafo e sistemas de HVI (instrumentação de alto volume) são utilizados para realizar a medição do comprimento da fibra. Os instrumentos de HVI computam o comprimento em termos de comprimento de

média e	média	da	metade	superior	(UHM) . A média é o
comprimento	médio	de	todas as	fibras ao	passo que a UHM é o
25 comprimento	médio	da	metade	mais longa	na distribuição da

fibra.

Resistência da fibra

Conforme foi mencionado, a

resistência da fibra é

59/114

Al) geralmente definida como sendo a força necessária para quebrar um conjunto de fibras ou de uma única fibra. Na realização de testes de HVI, a força de quebra é convertida em força em gramas por unidade têxtil. Esta é a força 5 necessária para quebrar um conjunto de fibras que tem uma unidade têxtil em tamanho. Na realização de testes com o HVI, a resistência é dada em gramas por unidades têxteis (gramas/tex). As fibras podem ser classificadas como de baixa resistência (por exemplo, 19-22 g/tex), resistência média (por exemplo, 23-25 g/tex), alta resistência (por

exemplo,	26-28 g/tex),	e resistência	muito	alta	(por
exemplo,	29-36 g/tex).
		Micronaire	- A	leitura	do

micronaire de uma fibra é obtida a partir de um teste de fluxo de ar poroso. O teste é conduzido da seguinte maneira.

Uma amostra pesada de algodão é comprimida até um determinado volume e fluxo de ar controlado é passado através da amostra. A resistência ao fluxo de ar é lida como unidades de micronaire.

As leituras do micronaire refletem uma combinação de maturidade e adequação. Visto que o diâmetro da fibra de fibras dentro de uma determinada variedade de algodão seja razoavelmente consistente, o índice de micronaire terá maior probabilidade de indicar a variação de maturidade em vez das variações em finura. Uma leitura de micronaire de 2,6-2,9 é baixa, enquanto 3,0-3,4 está abaixo da média, 3,5-4,9 é a média e 5,0 e acima deste valor são altos. Para a maioria das aplicações têxteis, um micronaire de 3,5-4,9 é usado. Qualquer coisa mais alta do

60/114 /// que isso é, geralmente, não desejável. Será apreciado, propriedades de fibra. Assim sendo, é entendido que uma propriedade de fibra que seja desvantajosa em uma aplicação possa vir a ser vantajosa em uma outra.

de Exemplos a seguir, as seqüências biomoleculares da número e o comprimento do filamento de ponta/fio da folha, assim como do fio da semente. Visto que as referidas seqüências moleculares gerar plantas transgênicas com número/comprimento de filamento de ponta aumentado herbívoros, guiam o caminho dos que intimidam melhor os polinizadores ou afetam a folha ou a perda de água através de refletância à luz aumentada. Além disso, as referidas píantas transgênicas podem ser usadas para a produção dividida em categorias de proteínas recombinantes e elementos químicos no tricoma, conforme é descrito em detalhes em

WO 2004/111183 para Evogene Ltd.

De forma interessante inesperada, os presentes inventores descobriram que as seqüências de polinucleotídeos da presente invenção capazes de aumentar a biomassa de uma planta. Será apreciado que a habilidade que os polipeptídeos da presente de aumentar a produção/a biomassa/vigor da à sua capacidade de promover o aumento no tamanho da célula da planta ou no volume desta (conforme é

61/114 descrito no presente documento).

Assim sendo, a presente invenção também leva em consideração um método de aumento da biomassa/vigor/produção de uma planta (plantas coníferas, musgo, algas, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, assim como com as outras plantas listadas em www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae). Isso é efetuado por meio da regulagem da expressão e/ou da atividade de pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção, conforme é descrito acima.

Conforme usada no presente documento, a frase biomassa da planta refere-se à quantia ou quantidade de tecido produzido a partir da planta em uma estação de crescimento/cultivo, o que também poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo.

' Conforme usada no presente documento, a frase vigor da fibra refere-se à quantia ou quantidade de tecido produzido a partir da planta em um tempo determinado. Portanto, o aumento no vigor poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por tempo de cultivo ou por área de cultivo.

Conforme usada no presente documento, a frase produção da planta refere-se à quantia ou quantidade de tecido produzido e colhido como o produto produzido pela planta. Portanto, o aumento da produção poderia afetar o benefício econômico que alguém possa obter a partir da planta em uma determinada área de cultivo e/ou

62/114 sendo, a

presente em um determinado tempo de cultivo.

Assim de alto valor agrícola para a promoção da produção de safras comercialmente desejadas (por exemplo, biomassa de órgão vegetativo, tal como madeira de álamo ou órgão reprodutor, tal como o numero de sementes ou a

Conforme usado no presente documento, o termo cerca de refere-se

Objetos adicionais, vantagens e novos recursos da presente aparentes para uma pessoa com habilidades o exame dos seguintes exemplos, comuns na técnica mediante de ser limitadores. Além disso, cada uma das diversas incorporações e dos diversos aspectos da presente conforme delineado acima, no presente documento, e conforme reivindicado' na seção encontra apoio experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS seguintes exemplos, os acima, ilustram a invenção de uma forma não limitadora.

Geralmente, a nomenclatura usada no presente documento e os procedimentos de laboratório utilizados na presente incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e técnicas de DNA recombinante.

explicadas na literatura. Vide, por exemplo: Molecular

63/114

Cloning: A laboratory Manual Sambrook et al., (1989);

Current Protocols in Molecular Biology Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al. , Recombinant DNA, Scientific American Books,

New York; Birren et al. (eds) Genome Analysis; A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); as metodologias são conforme estabelecidas nas Patentes dos Estados Unidos de números: 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e

5.272.057; Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volumes

I-III Cellis, J. E., ed. (1994); Current Protocols in Immunology Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), Basic and Clinicai Immunology (8^th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W. H.

Freeman e Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e na literatura científica, Unidos de 3.850.578; 3.935.074;

vide, por números:

3.853.987;

3.984.533;

exemplo, as

3.791.932;

3.867.517 ;

3.996.345;

Patentes

3.839.153;

3.879.262;

4.034.074;

dos Estados

3.850.752;

3.901.654;

4.098.876;

4.879.219;

5.011.771 e 5.281.521;

Oligonucleotide

Synthesis Gait,

M.J., ed.

(1984);

Nucleic acid

Hybridization Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985);

Transcription and Translation Hames, B. D., and Higgins S.

64/114

J., Eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, R. I., ed.

(1986); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A Practical Guide to Molecular Cloning Perbal, B., (1984) and Methods in Enzymology Vol. 1-317, Academic Press; PCR Protocols: A Guide to Methods and Apllications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996); todos os quais são incorporadas, por meio de referência, como se fossem estabelecidos por completo no presente documento. Outras referências gerais são fornecidas em todo o decorrer deste documento. Acredita-se que os procedimentos contidos no presente documento sejam bem conhecidos na técnica e são providos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nestes são incorporadas no presente documento por meio de referência.

EXEMPLO 1 '

Identificação in silico de genes de algodão envolvidos na formação da fibra

Procedimentos Experimentais

Comparação entre espécies de seqüências expressas - Duas ferramentas principais foram utilizadas durante o estágio de processamento dos dados. Grandes números de perfis de gene foram consultados em uma base de dados da ORACLE comportando a plataforma GeneCarta da Compugen (Compugen Ltd. Israel). Estes dados foram carregados em planilhas do MicroSoft Excel para um futuro refinamento manual. Com o uso destes dados, uma comparação

65/114 // genômica cruzada de espécies foi efetuada, tendo como alvo a definição de órgãos de outras espécies de plantas para as bibliotecas de EST que se encontram publicamente disponíveis podem ser utilizadas tanto como modelos como novas fontes de informações para definir novos genes com papel-chave na formação da fibra (Figura 1) . Esta análise comparativa fez uso principalmente das bases de dados do algodão, da arabidopsis e do tomate.

Agrupamento e agrupamento entre espécies das seqüências de EST - As bases de dados genômicas do algodão incluem menos de 50.000 ESTs (Genbank edição # 135) originando-se, primariamente, de duas espécies: Gossypium arboreum (~ 35.000 ESTs) e Gossypium hirsutum L. (~ 9.000 ESTs, Tabela 1, a seguir). Estes ESTs foram agrupados e reunidos com o uso da plataforma de software LEADS™ (Compugen Ltd, Israel) em duas abordagens alternativas

Na primeira abordagem, os ESTs de duas espécies foram agrupados e reunidos (por meio disso, mimetizando o processo evolucionário, visto que G. arboreum é um ancestral de G. hirsutum) . Este processo revelou 6478 agrupamentos, dentre eles, 3243 novos agrupamentos (sem mRNA na base de dados pública) que foram definidos como sendo agrupamentos de alta qualidade (Tabela 1, a seguir).

Na segunda abordagem, ESTs de cada espécie foram agrupados e montados separadamente. A comparação entre as duas abordagens mostrou que usar a primeira abordagem acrescenta informações valiosas para os

66/114 grupos de algodão sem uma base significativa na análise. A base de dados genômica do tomate contém 126.156 ESTs originários de cerca de 30 bibliotecas bem definidas, que através do processo de agrupamento e montagem revelaram 14.034 grupos, dentre os quais um grupo grande de 12.787 grupos novos de alta qualidade (Tabela 1). Os dados genômicos do arabidopsis incluem 99.417 ESTs (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/), 8573 cDNA de comprimento total (Rikken e genbank mRNAs ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/) e a seqüência completa de

DNA. Usando o programa LEADS, 23.148 grupos e 6777 avulsos (ESTs sozinhos com os quais nenhum outro EST foi agrupado) foram revelados, todos os quais foram apoiados por seqüências de ESTs, ao contrário do consórcio público (TAIR, www.arabidopsis.org/).

Procuraram-se bibliotecas de

ESTs de outras plantas e órgãos que dividem processos biológicos semelhantes, como fibras de algodão.

que tais ESTs sirvam como modelos e como novas informação para a identificação de genes

Espera-se fontes de que estão envolvidos no desenvolvimento da fibra. Para esta finalidade, criou-se uma lista de genes conhecidos que são suspeitos de estarem envolvidos na formação da fibra. Estes genes originaram-se de arabidopsis e foram mostrados em vários estudos como tendo um papel-chave na formação do tricoma (por exemplo, GL2, CPC, bHLH, TTGI, GL1, revisados em Larkin J.C. et al. , 2003, Schellmann S. et al, 2002).

Uma extensa análise genômica comparativa revelou que os

67/114 genes do tomate com alta homologia com os genes das fibras do algodão e com os genes do tricoma de arabidopsis têm um conteúdo significante de EST no tricoma da folha e nas bibliotecas de desenvolvimento específico da flor. Mais 5 análises compararam os dados genômicos destas três espécies

- algodão, Arabidopsis e tomate (focando as bibliotecas de tomates citadas acima) como parâmetros-chave na presente busca na base de dados (figura 1).

Tabela 1 - Bases de dados do Algodão, Tomate e Arabidopsis

Espécie	Descrição EST Lib	Contagem de EST	mRNA	Após LEADS (grupos)
G. arboreum	Fibra 6DPA	37.726	12	16.294 grupos na produção misturada*
G. hirsutum	Fibra 7-10DPA	7.944	236
G. hirsutum	Óvulo da flor IDPA	1.272	870
L. esculentum	Todas as bibliotecas	115.859	7	25.678 grupos na produção misturada
L. hirsutum	Bibliotecas de tricomas	2.409	7
L. pennellii	Bibliotecas de tricomas	2.723	24.450
A. thaliana	Todas as bibliotecas	160.698	mRNA	25.678 grupos

*grupos derivados de espécies diferentes, algodão G. arboreum e G. hirsutum, tomate L. esculentum, L. hirsutum e L. pennellii.

Identificação In silico dos genes de algodão com um papel no desenvolvimento da fibra. 15 Para descobrir se os dados genômicos do tomate podem ser usados como fonte relevante de dados genômicos para estudar o desenvolvimento das fibras do algodão, uma extensa comparação genômica foi efetuada para identificar genes do tomate e do algodão que tenham alta homologia com genes20 chave determinando o desenvolvimento do tricoma do arabidopsis (por exemplo, GL2, CPC, bHLH, TTG1, GL1).

68/114

Genes homólogos foram identificados no algodão e tomate. Devido a todos os ESTs do algodão serem produzidos de fibras de algodão, foi ►

impossível fazer a previsão in silico do perfil de 5 expressão destes genes. Porém, amplas fontes de tecido usadas para a produção da base de dados EST do tomate permitiram a identificação de tecidos nos quais genes específicos do tricoma são expressos.

No tomate, revelou-se que os 10 ESTs do tricoma e óvulo estão enriquecidos em grupos representando grupos específicos de tricomas. De maneira interessante, descobriu-se que as fibras do algodão são produzidas de células de revestimento do óvulo. Já que as sementes do tomate são recobertas com tecido semelhante a 15 pêlos, supôs-se que estes pêlos estão ligados por desenvolvimento aos tricomas e formação de . fibras de algodão.

No tomate, descobriu-se que -1100 grupos incluíam pelo menos um EST das bibliotecas de 20 tricomas. Dentre eles, cerca de 1000 seqüências incluíam seqüências também originárias das bibliotecas de flores de tomate (nas quais o tecido .do óvulo está presente). Comparando-se este grupo de genes com os dados do algodão, revelaram-se -2300 genes do algodão com alta homologia com 25 os genes de tricoma de tomate. Procurando-se no banco de dados usando estes dois grupos de genes, juntamente com outras informações bioinformáticas [homologia de espécies cruzadas, Ontologia de Gene (OG)], revelaram-se 80 grupos

69/114 de algodão com previsão de terem um papel-chave na formação

de fibras	. Estes genes foram	selecionados	baseados nos
seguintes	critérios:
Grupos de	algodão com pelo menos	2 ESTs;
Homologia	com grupos de tomate	com escore-e	maior do que
le-5 ;
Homologia	com grupos de tomate	com pelo menos	um EST vindo

de bibliotecas de tricomas ou um EST vindo de óvulos contendo tecidos;

Os seguintes critérios foram considerados como vantajosos, embora não necessários:

Grande número de ESTs em um grupo;

Fator de transcrição/proteínas sinalizadoras de transdução;

Anotação de gene relacionada com expansão celular, pressão de turgor, síntese de parede celular.

	Os novos	genes	juntamente	com
os genes	controle de algodão que	estão	envolvidos	na
formação	de fibras foram analisados	por	seu perfil	de
expressão	de RNA nas plantas do algodão
EXEMPLO 2
Expressão	de mRNA e análise de genes identificados	de

acordo com os ensinamentos da presente invenção

Para estudar o perfil de exde RNA de genes candidatos identificados como descritos no Exemplo 1 acima, uma transcrição reversa foi efetuada, seguida de PCR de tempo real (RT-qPCR).

Procedimentos Experimentais

Análise de Tempo Real Quanti

70/114 tativo (qRT PCR) - Para verificar os níveis de especificidade de expressão e associação de traços, a Transcrição Reversa após PCR quantitativo (Tempo Real) (RTqPCR) foi realizada. O RNA total foi extraído em estágios diferentes do desenvolvimento da fibra (do dia da antese até o dia 2 0 - pós-antese) . Para estudar a especificidade da expressão, RNA de outros tecidos de plantas de algodão foram coletados e analisados para expressão de controle (por exemplo, folhas jovens, caules jovens, caules maduros, raízes jovens, sépalas, pétalas, e estame) . Para este propósito, o RNA foi extraído do tecido de algodão usando o protocolo de extração de RNA Hot Borate de acordo com. www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ /ultramicrorna.html. A transcrição reversa foi realizada usando 1,5 pg de RNA total, usando a enzima transcriptase reversa U Super Script II (Invitrogen) , 225 ng de hexâmeros randômicos dè desoxinucleotídeos (Invitrogen), 500 μΜ dNTPs mix (Tukara, Japão) , 0,2 volume de x 5 RT tampão (Invitrogen), 0,01 M DTT, 60U RNAsina (Promega), água duplamente destilada tratada DEPC foi adicionada até 37,5

pL . Reações	RT	foram	incubadas	por 50 minutos a	42²C,
seguidas de	70²C	por	15	minutos.	0 cDNA foi diluído 1:	2 0 em
Tris EDTA,	pH=8 .	5	ml	do cDNA	diluído foram usados	para
qRT-PCR.
				0	RT-PCR quantitativo	foi
realizado em cDNA (5	pl), usando	1 X SYBR GREEN PCR master

mix (Applied Biosystems), sondadores anteriores e reversos

0,3 μΜ cada. 0 PCR ABI7000 tempo real foi usado com as

71/114 minutos, 95²C por 10 minutos, 40 vezes de 95²C por 15 seguido de 95²C por 15 segundos, vezes de 60²C por 10 segundos + ciclo. Para cada gene, uma curva pool de

1:60, deveria segundos

60²C por

0,5²C de e 1 minuto a segundos, incremento a

60²C, e 70 cada

RTs de todas as amostras, em 5 diluições (diluições ter R>=0,98 com uma eficiência

Os níveis de expressão (Qty)

O gráfico da curva medidos no qPCR foram calculados usando-se amplificação e o CT amostras cruzaram dissociação obtidas produtos sondador.

O método adicionais

As reações correspondente (o da PCR não desej foram inspecionadas início) Qty=E-C.

) da	reação	de
ciclo	no qual	as
\ As	curvas	de
para	ausência	de
os ou	dímeros	de

duas vezes.

foram repetidas pelo menos de cálculo baseia-se no fato de que as eficiências específicos foram especificamente com os

Para normalizar diferentes tecidos, proj etados para nível de sondadores hibridizar seguintes genes de origem: Actin

D88414 seqüência com número de seqüência com número de identificação: 68

69, respectivamente), GAPDH (GenBank Accession N² COTCWPPR,

72/114 seqüência parcial, seqüência com número de identificação:

29; Sondadores reversos e anteriores são ajustados em seqüência com número de identificação: 97 e 98, respectivamente), e RPL19 (GenBank Accession N^s AI729179, seqüência com número de identificação: 30; Sondadores reversos e anteriores são ajustados em seqüência com número λ de identificação: 99 e 100, respectivamente).

Usando esta metodologia, foi possível identificar genes que mostram expressão elevada durante o prolongamento da fibra, assim como genes que mostram especificidade única das fibras de algodão. Os genes que mostraram expressão elevada durante a antese que diminuiu durante o prolongamento da fibra foram considerados bons candidatos para serem envolvidos na 15 diferenciação e iniciação da fibra. Notadamente, a metodologia de quantificação descrita acima não forneceu níveis de expressão absoluta, mas forneceu bons parâmetros para escore da expressão do gene relativo juntamente com o desenvolvimento da fibra com diferenças de mais de 1000 20 dobras nos níveis máximos de expressão atingidos por diferentes genes que foram detectados (Tabela 2, abaixo). Resultados

8 genes de algodão foram avaliados para perfil de expressão em diferentes tecidos de algodão (Gossypium hirsutum, var. Acala) . De acordo com os resultados de expressão genética, 23 genes tiveram previsão de melhorar a qualidade e produção da fibra. O perfil de expressão de todos os genes candidatos está apresentado na Tabela 2.

73/114

Tabela 2

Seqüência com N^s de Identificação do Gene	-DPA*	0-1 DPA	12-14 DPA	15-17 DPA	18-20 DPA	2-3 DPA	4-5 DPA	6-8 DPA	9-11 DPA	Folhas maduras	Caules maduros	Pétalas	Sépalas	Estame	Folhas jovens	Raízes jovens	Caules jovens
CT1/1	0,053“	0,049	2,034	2,138	2,477	0,295	0,976	1,347	1,118	0,53	0,029	9,368	0,336	0,277	0,347	0,002	0,202
CT2/2	0,025	0,040	0,870	0,735	0,819	0,060	0,183	0,238	0,267	0,014	0,000	0,001	0,008	0,01	0,021	0,068	0,025
CT3/3	0,082	0,070	0,511	0,632	0,819	0,057	0,084	0,116	0,092	0,109	0,032	0,038	0,086	0,020	0,142	0,037	0,063
CT4/4	1,313	0,719	0,389	0,561	0,419	0,622	0,666	0,757	0,774	0,001	0,001	0,004	0,000	0,044	0,001	0,003	0,003
CT6/5	0,093	0,075	0,580	0,732	0,916	0,066	0,095	0,104	0,110	0,113	0,028	0,037	0,085	0,026	0,148	0,037	0,044
CT7/6	0,074	0,055	0,362	0,297	0,197	0,112	0,219	0,228	0,263	0,066	0,001	0,125	0,007	0,001	0,055	0,000	0,049
CT9/7	0,276	0,980	1,166	0,715	0,960	0,980	1,265	1,103	2,095	0,012	0,000	0,019	0,032	0,004	0,008	0,000	0,012
CT11/8	0,148	0,163	0,132	0,163	0,121	0,142	0,131	0,163	0,097	0,000	0,000	0,000	0,000	0,068	0,000	0,000	0,000
CT20/9	0,074	0,035	0,021	0,013	0,016	0,045	0,042	0,032	0,033	0,051	0,051	0,459	0,076	0,572	0,037	0,069	0,067
CT22/10	2,989	1,631	0,870	0,838	0,749	1,693	1,268	1,017	1,589	0,541	0,636	0,168	0,408	0,521	0,463	1,308	0,762
CT26/11	0,022	0,001	0,017	0,001	0,018	0,017	0,028	0,039	0,017	-	-	0,006	-	0,001	-	-	0,000
CT27/12	0,010	0,009	0,009	0,009	0,010	0,008	0,005	0,005	0,003	-	0,007	0,008	0,005	0,001	0,001	0,001	0,007
CT40/16	0,016	0,016	0,014	0,023	0,024	0,012	0,013	0,016	0,017	0,007	0,000	0,002	0,022	0,005	0,005	0,001	0,004
CT49/17	0,056	0,114	0,156	0,131	0,111	0,161	0,283	0,315	0,332	0,031	0,002	0,011	0,007	0,007	0,060	0,005	0,047
CT70/18	1,406	2,247	8,460	7,782	10,709	2,152	5,313	7,361	4,796	1,065	0,492	9,976	0,671	1,207	1,904	1,177	1,294
CT71/19	0,095	0,403	1,736	2,079	2,670	0,338	0,685	1,139	0,809	0,627	1,708	1,258	1,268	6,599	1,301	0,004	0,480
CT74/20	2,971	2,555	3,474	4,398	5,859	3,135	4,301	4,272	6,983	0,017	0,002	0,203	0,015	0,136	0,030	0,003	0,464
CT75/21	1,727	0,282	16,012	15,856	20,171	3,812	8,935	-	20,295	4,473	3,644	83,72	6,317	28,659	8,534	0,872	2,759
CT76/22	0,000	0,002	0,041	0,039	0,080	0,007	0,020	0,015	0,036	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	-	0,000	0,000
CT77/23	0,005	0,011	0,555	0,892	1,434	0,057	0,161	0,166	0,123	0,016	0,026	0,020	0,009	-	0,023	0,001	0,003
CT81/24	0,161	0,196	3,455	4,880	14,028	0,210	0,354	0,515	1,153	9,477	26,444	1,165	0,913	0,021	6,614	0,004	1,089
CT82/25	0,024	0,022	0,005	0,004	0,006	0,018	0,016	0,014	0,011	0,053	0,034	0,017	0,045	0,036	0,004	-	0,000
CT84/27	0,007	0,005	0,136	0,167	0,371	0,004	0,014	0,027	0,031	0,036	0,346	0,034	0,196	0,101	0,061	0,071	0,035
CT88/13	0,002	0,371	0,841	2,978	3,045	14,725	14,725	17,514	28,290	0,001	0,034	0,005	0,000		0,005	0,004	0,007

74/114

Transcrição reversa após PCR quantitativa foi realizada usando PCR em tempo real, em tecidos de algodão jovem ou maduro (G. hirsutum var Acala). Quantidades relativas de mRNA de cada gene estão apresentadas em todos os tecidos examinados. dpa-dias pós-antese, de tecidos de óvulos e fibras (até 10 dpa) ou apenas tecido da fibra (após 10 dpa)

Dois critérios principais foram usados para selecionar genes de algodão como candidatos que podem estar envolvidos no desenvolvimento de fibras de acordo com o perfil de RNA. Genes mostrando um alto grau de especificidade de expressão de fibra e genes mostrando nível de expressão, que muda concomitantemente com o desenvolvimento da fibra (Tabela 3, abaixo).

Vinte e três genes satisfizeram este critério de seleção:

				CT-	1 (seqüência	com	número	de
identificação:	1	e	106) ,	CT_2	(seqüência	com	número	de
identificação:	2	e	107) ,	CT_3	(seqüência	com	número	de
identificação:	3	e	108) ,	CT_4	(seqüência	com	número	de
identificação:	4	e	109) ,	CT_6	(seqüência	com	número	de
identificação:	5	e	110) ,	CT_7	(seqüência	com	número	de
identificação	6	e	111) ,	CT_9	(seqüência	com	número	de
identificação:	7	e	112) ,	CT_11	(seqüência	com	número	de
identificação:	8	e	113) ,	CT_2 0	(seqüência	com	número	de
identificação:	9	e	114)	, CT_	22 ( 10 e	> 115) , CT_	_2 6

(seqüência com número de identificação: 11 e 116), CT_27 (seqüência com número de identificação 12 e 117), CT_40

75/114

(seqüência	com	número	de	identificação:	16	e	118) , CT_49
(seqüência	com	número	de	identificação:	17	e	119), CT_70
(seqüência	com	número	de	identificação:	18	e	120) , CT_71
(seqüência	com	número	de	identificação:	19	e	121), CT_74
(seqüência	com	número	de	identificação:	20	e	122) , CT_75
(seqüência	com	número	de	identificação:	21	e	123), CT_76
(seqüência	com	número	de	identificação:	22	e	124) , CT_7 7
(seqüência	com	número	de	identificação:	23	e	125) , CT_81
(seqüência	com	número	de	identificação:	24	e	126), CT_82
(seqüência	com	número	de	identificação:	25	e 95) , CT_84
(seqüência	com	número	de	identificação:	27	e	96) e CT_88
(seqüência	com	número de identificação: 13	e	26	)
				CT-4, 22,	20,		27, 40, 82
(seqüência	com	números	de	identificação::	4,	10, 9, 12, 16

e 25, respectivamente) foram escolhidos principalmente como genes candidatos que podem ter um papel na iniciação da fibra (Tabela 3) enquanto CT 27 (seqüência com número de identificação: 12) , que é um gene homólogo

para GL3,	também foi usado como controle (na Figura
2d CT 22,	seqüência com número de identificação: 10 é

mostrado).

			CT-	1, 2, 3, 6, 7, 9, 49,	70,
71, 74, 75,	76, 77;	81,	. 84	(seqüência com número	de
identificação:	1, 2, 3,	5,	6, 7,	17, 18, 19, 20, 21, 22,	23 ,

e 27, respectivamente, vide Figuras 2a, c) tiveram previsão de estarem envolvidos no prolongamento da fibra e qualidade (força e sutileza) de acordo com seu padrão de expressão (Tabela 3, Figura 2C CT é mostrada).

76/114

CT11, 40, 74 e CT 26 (seqüência com número de identificação: 8, 16, 20 e 11, respectivamente, vide Figuras 2a, b) , que são homólogos a Glabrousl de Arabidopsis (GenBank Accession η² AB006078) 5 são genes específicos de fibra que mostraram expressão uniforme e fibra-específica durante todos os estágios de desenvolvimento da fibra (Tabela 3, na figura 2B CT 11 é mostrado como exemplo). O perfil de expressão de todos os genes escolhidos está mostrado na Tabela 2, acima.

CT#	Anotação do gene	Iniciação	Qualidade e prolongamento da fibra	Expressão de fibra estável e específica	Específico para fibra	Processo biológico
CT_2	Ácido sucrose-6-fosfato hidrolase		V		Sim	metabolismo de carboidratos
CT 7	Suposta aciltransferase		V			desconhecido
CT_9	Proteína hipotética		V		Sim	processamento de RNAt
CT49	Proteína hipotética		V			desconhecido
CT_1	GDSL-motif lípase/proteína semelhante a hidrolase		V			desconhecido
CT_3	Suposta , proteína mitocondrial		V			desconhecido
CT_6	Aspartil protease		V			proteólise e peptidólise
CT....70	Cisteína protease		V			privação de água
CT_71	Proteína responsável pela desidratação		V			dessecação
CT_75	Suposta proteína de transferência de lipídeos		V
CT_76	Suposto receptor de quinase		V		Sim	fosforilação de proteína aminoácido
CT77	Proteína hipotética		V		Sim
CT_81	Proteína semelhante a APETAL-2		V			organização da parede celular e biogênese
CT.84	Proteína hipotética		V			biossíntese da família aromática do aminoácido
CT_4	Proteína semelhante ao citocromo P450	V			Sim	transporte de elétrons
CT_20	Homólogo de proteína relacionada ao MYB	V				regulação da transcrição
CT 22	Proteína hipotética	V				desconhecido

77/114

Continuação da tabela 3
CT_27	Proteína semelhante ao fator de transcrição bHLH	V			regulação da transcrição
CT_82	Proteína semelhante ao MADS Box	V			regulação da transcrição
CT_11	Fator de transcrição de MADS-Box semelhante ao criptógamo		V	Sim	regulação da transcrição
CT_26	Homólogo de proteína relacionada ao MYB		V	Sim	comprometimento do futuro celular
CT_40	Precursor da proteína 3 transferência de lipídeos (LTP 3)		V	Sim	transporte de lipídeos
CT_74	Proteína transposon semelhante ao EM/SPM		V	Sim	organização da parede celular e biogênese

Os genes selecionados foram super-expressados em arabidopsis transgênico e tomate, usando o promotor CaMV constituinte de 35S (seqüência com número de identificação: 31) . Plantas transgênicas foram 5 mais avaliadas para modificações da epiderme, densidade e comprimento de tricoma e produção de pêlos da semente (como descrito abaixo).

EXEMPLO 3

Análise da expressão do gene usando microarranjos publicamente disponíveis

Mais informações sobre a expressão dos genes selecionados (Exemplo 2, acima) foram recuperadas por análise estatística dos dados de microarranjos de arabidopsis. Essencialmente, os melhores 15 homólogos dos novos genes candidatos no arabidopsis foram comparados com um conjunto de 77 experimentos de microarranjos de diferentes tecidos de Arabidopsis (Bancos de dados AtGenExpress, o principal investigador para AFGN: Prof. Dr. Lutz Nover, Botanisches Institut, Molekulare 20 Zellbiologie, FB, Biologie und Informatik der J. W. Goethe

78/114

Az. /

Universtãt Frankfurt; Biozentrum N200 30G, Marie-Curie

Strasse 9, 60439 Frankfurt am Main, www.arabidopsis.org/info/expression/ATGenExpress.j sp) .

Seqüências de polinucleotídeos que eram altamente expressadas em células prolongadas ou meristemas de inflorescências foram selecionadas para mais análises.

A Tabela 4 abaixo lista os tecidos que exibiram os maiores níveis de expressão 10 genética.

Tabela 4

	Tecidos com alta expressão	< Mudança de dobras/ especificidade	Relacionado à fibra
CT 1	sementes, síliquas	10-20	Células alongadas
CT.11	carpelos, flores, sementes, silíquas	Específica do tecido	Específico da flor
CT 2	raiz, muda e sépalas	Específica do tecido	Células alongadas
CT 22	carpelo, flor, inflorescência, broto	4-10	Inflorescência
CT 4	pétalas, estame	>10	Células alongadas
CT49	silíquas	>2	Células alongadas
CT_7	carpelos, flores, inflorescência, pétalas, broto, silíquas	10-30	Inflorescência
CT_70	' flor, raiz, estame	Quase específica do tecido
CT_76	carpelos, flores, inflorescência, broto, silíquas	>2	Células alongadas e inflorescência
CT_77	sementes, pólen, estame, pétalas, sépalas, silíquas	10-50	Inflorescência
CT 82	inflorescência, broto, estame	3-6	Células alongadas
CT 88	pétalas, estame

EXEMPLO 4 fibra

Estabelecendo de genes candidatos e uma correlação comprimento da

Para definir expressão de RNA dos genes selecionados e o comprimento de fibra, fibras de 4 linhas de algodão

79/114 foram analisadas .

Estas fibras foram selecionadas mostrando qualidade de fibra muito boa e alto diferentes níveis de qualidade e índices de fios de várias linhas de G. hirsutum:

boa qualidade de fios

Acala), índice médio de fios qualidade fraca

Tamcot).

Extração de RNA estágios de desenvolvimento da representando diferentes características da fibra, a 5,

10, 15 e 20 DPA foram amostrados, e o

RNA foi extraído como descrito no Exemplo 2.

fibra das linhas acima foi medido usando-se um fibrógrafo.

computar o comprimento em termos de comprimento Média da

Metade Superior. Esta média da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição de fibras. O fibrógrafo mede em comprimentos de palmos a um ponto de porcentagem fornecido (www.cottoninc.com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Lenght).

Resultados

Quatro linhass diferentes de cultivadas em Rehovot, Israel, durante

Os valores UHM de

Tabela 5

80/114

	Comprimento (UHM)
Pima S5	1,40+0 a
Acala	1,23+0,01 b
Coker 310	1,1810,01 c
Tamcot	1,1510,02 c

Cinco genes foram testados para correlação entre a expressão genética e o comprimento da fibra (apresentado como CT_7 6 na figura 3) . Os resultados estão resumidos na Tabela 6 abaixo:

Tabela 6

		Dia de Amostragem de Tecido (DPA)
		0	5	10	15
		Quantidades relativas de mRNA	Quantidades relativas de mRNA	Expressão relativa relacionada aTO	Quantidades relativas de mRNA	Expressão relativa relacionada aTO	Quantidades relativas de mRNA	Expressão relativa relacionada aTO
CT-1	Tamcot	0,75	2,99	4,0	4,71
Coker 310	0,51	4,80	9,3	7,56
Acala	0,64	5,08	7,9	8,01
CT_2	Tamcot	0,03	0,19	7,6	8,17
Coker 310	0,03	0,35	11,4	15,04
Acala	0,02	0,36	17,7	15,28
Pima S5	0,02	0,41	23,6	17,58
CT_40	Tamcot	0,28					0,47	1,67
Coker 310	0,37 _z					0,46	1,24
Acala	0,30					0,67	2,25
Pima S5	0,37					1,03	2,75
CT_76	Tamcot	0,01	0,03	5,4	0,01	2,3	0,00	0,10 .
Coker 310	0,01	0,08	8,9	0,04	5,1	0,00	0,10
Acala	0,01	0,12	16,6	0,06	9,1	0,00	0,12
Pima S5	0,01	0,13	122,4	0,18	177,9	0,12	99,51
CT_81	Tamcot	0,50	1,33	2,68	5,03	10,15	1,11	2,24
Coker 310	0,31	2,64	8,65	4,51	14,76	0,84	2,75
Acala	0,49	4,38	8,98	6,36	13,05	3,65	7,49

				Transcrição reversa	após	PCR
quantitativa foi	realizada	usando PCR em	tempo	real,	nos
tecidos	de 0,	5,	10 e 15 DPA de algodão (	;G. hirsutum	var.
Tamcot,	Coker	e	Acala, e	G. barbadense	var.	Pima	S5) .

Quantidades relativas de mRNA e expressão relativa

81/114 os tecidos examinados.

EXEMPLO 5

Clonagem dos genes selecionados em um vetor binário sob regulação constituinte e expressão recombinante do mesmo

Análise ORF www.generunner.com/) . Os ORFs de cada gene foram comparados ao banco de dados

GenBank, usando

Blast (www.ncbi.nlm.gov/BLAST/). Comparando os

ORFs homólogos mais altos, a posição do códon de mostraram de iniciação

ATG previsto.

pPI

Para a clonagem de genes

RNAs totais de vários estágios de desenvolvimento das células com produtoras de fibras foram extraídos, usando de RNA de Tecido de Algodão Hot Borate de acordo eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/rnaextraction.html.

Moléculas de DNA complementar (cDNA) foram produzidas a partir do mRNA usando enzima transcriptase reversa M-MuLV fornecido pelo fabricante. A amplificação do cDNA foi feita para genes, das seqüências acima, clones CT números 1, 2,

3, 6, e 88, por PCR usando a enzima de leitura PFU DNA polimerase

82/114

(Promega www.promega.com/pnotes/68/7381_07.html) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Sondadores para cada gene foram projetados para medir todo o ORF. Locais adicionais de restrição de endonuclease foram adicionados 5 ao final 5' de cada sondador para facilitar mais clonagem dos CTs para o vetor binário (pPI) . A Tabela 7 abaixo lista os sondadores usados para clonar cada um dos genes:

Tabela 7

CT N⁹	Sondador Anterior/seqüência com número de identificação:	Sondador Reverso/seqüência com número de identificação:	local de restriçã 0 upstrea m	local de restrição downstre am
CT_1	ACCCGGGATGGATGGTTATTGTAGCAGA AGG/32	GCCGAGCTCGAATCAAATGAGGGCAAT GCC/33	Smal	SaCI
CT_2	AATCTAGACAAGTACAGAAGCTCAATTC CC/34	TGATAATCATGTGGAAGCAACC/35	Xbal
CT_3	CAGCCCGGGTGATGGAACTGAGCATTC AG/36	CGTGAGCTCTGATTAGAGTTTCCAGTG CATG/37	Smal	SaCI
CT_6	TTTCCCGGGTTGTTGTCATGGCTTCTCT GC/38	ATGGAGCTCATATTCATGGCCAAAACAC /39	Smal	SaCI
CT_7	G CACCCGGGAAAGGAAATGGCAGGCGTC/ 40	TTTCGATATCCACAGTACCCTACTTCCA TGC/41	Smal	EcoRV
CT_9	TACCCGGGTACCATTACTCTACTACAGC . TGC/42	GAGAGCTCAACAGACAAAGACCAGACT GG/43	Smal	SaCI
CT_11	ACCCCCGGGCAAGTGATCAAAGAGAAT GG/44	CATGAGCTCTTTCTCCAACTCCTCTACC C/45	Smal	SaCI
CT_20	CCCCCGGGTCCCTATTGCATGCCTTTC/4 6	TTGAGCTCACTCGATCTTACTCATCC/47	Smal	SaCI
CT_22	AGCCCGGGAGATAGAGAGATGGGAGGT CC/48	TCGAGCTCTGGGGCAACAATCATTTAC C/49	Smal	SaCI .
CT_27	TCCCCGGGCATCTGATCTAATTGTT GGTGG/50	TTGGATATCGCACCTTATGACATGG GATC/51	Smal	EcoRV
CT_40	TTCCCGGGTACAAACATGGCTAGTT CCG/52	TCGAGCTCATCAACCTCACTGCACC TTG/53	Smal	SaCI
CT_71	TAGTCACTCCTGTTCTAGATGAAG/54	CTGAGCTCCAGGATTTTTACTTAGG GACCC/55	Xbal	SaCI
CT_74	TACCCGGGCATACAGAGATGGAGAG GC/56	ACGAGCTCAAAGGTGTTTGCTTASG GTCC/57	Smal	SaCI
CT_75	AGCCCGGGAGAAAGATGATGAAAAG GGG/58	AAGATATCAAATCCCATGCAAAACC CC/59	Smal	EcoRV
CT_76	AACCCGGGCGGCAACTTAAAAGAAA ACC/60	AAGAGCTCCTTTGTTGGCTTCTCAA G/61	Smal	SaCI
CT_81	GACCCGGGACTGTAAAAAAGCATAG G/62	GCGAGCTCAGCTTAAGGATGATGG GGAG/63	Smal	SaCI
CT_82	ATCCCGGGGATGGTGAGAGGCAAA ATTC/64	ACGAGCTCTAGCAATGGCGATAAC GTAC/65	Smal	SaCI
CT_84	ATCCCGGGTTCCATGAAAAGGGTCT CG/66	GTGAGCTCTATCGTCGTTGTCCTTC AGC/67	Smal	SaCI

83/114

Os produtos finais diretos resultantes de PCR foram purificados com o uso do Kit de

Purificação PCR (Qiagen, Alemanha), digerido com as devidas (Roche) e foram clonados no vetor binário pPI (Figura

4) , enquanto substitui o gene relator existente de GUS. O pPI é uma versão modificada de pBI101,3 (Clontech, Accession

No. U12640).

O pPI foi

estruturado por intermédio da de plasmídeo do vetor de seqüência de sinal entre os pares-base

4658-4811), no local de restrição (enquanto reconstitui o local HindIII, a evitar a possibilidade do efeito de leitura completa do promotor-Nos upstream. Para substituir o gene GUS por cada um dos genes

CT no vetor 'binário pPI, o pPI foi digerido com [enzima de restrição 5' as enzimas primária é

Smal ou Xbal e a enzima é Saci ou

EcoRV (Rochecom o uso do protocolo fornecido pelo vetor binário aberto foi purificado por um de produto de PCR de cada um dos genes CT e 100 ng de vetor de plasmídeo aberto de pPI estavam ligados em 10 pL de volume 25 de reação de ligação com o uso de enzima de ligase T4 DNA (Roche), seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Produtos de ligação foram introduzidos nas células de E.

coli .

84/114

Expressão recombinante em bactérias - 60 pL de E. coli, células qualificadas de cepa DH5-a (cerca de 10⁹ células/mL) foram transformadas com o uso de 1 pl de mistura de reação de ligação por intermédio

	5	de eletroporação, com	. o	uso de um eletroporador	MicroPulser
		(Biorad),	0,2 cm cadinhos para	o transporte	de	vidro
		liquefeito (Biorad)	e	programa	de eletroporação	EC	:-2
•		(Biorad).	Células de	E .	coli foram	cultivadas em 0,8	ml	LB
		de meio	líquido a	37²	C durante	1 hora e	0,2	ml	da
	10	suspensão	da célula	foram laminadas em placas	de ágar	LB

suplementadas com os antibióticos kanamycin 50 mg/1 (Sigma).

As placas foram então incubadas a 3 7 ²C durante 16 horas. As colônias de bactérias foram cultivadas e a expressão foi confirmada por meio de ampliação por PCR com o uso de sondadores que foram projetados para ampliar a seqüência inserida no vetor binário. Os sondadores utilizados para a

ampliação do' DNA das inserções no vetor binário pPI foram os seguintes:

' - GGTGGCTCCTACAAATGCCATC- 3·' (adiante, seqüência com número de identificação: 70) e 5'AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3' (reverso, seqüência com número de identificação: 71).

Os produtos de PCR foram separados em géis de agarose a 1,5% e os tamanhos dos 25 produtos foram estimados por intermédio de comparação com a escada de DNA (MBI Fermentas) . Produtos de PCR com o tamanho previsto foram seqüenciados com o uso dos mesmos sondadores previamente utilizados para a ampliação de PCR

85/114 (Vide Tabela quais foram

7, acima).

designados

Sondadores com base na gene, foram utilizados inserida foi realizado os cada para completar o de forma a verificar se os clones

foram introduzidos na como para eliminar a possibilidade de que os erros na do PCR.

As seqüências seqüenciador de DNA foram determinadas

ABI 377 (Amersham Biosciences

Em cada uma com das 19 pPI ancorando os genes CT, o uso do estruturas o constitutivo, promotor de Vírus

Couve-flor 35S , f oi clonado.

do promotor do

Vírus Mosaico de

Couve-flor

35S, originada do vetor pBI121

(Clontech, Accession No por meio da digeridas com as mesmas

EXEMPLO 6 com as endonucleases e ligada enzimas

Cada de nas estruturas (seqüência com binárias, número de da que ancoram os genes de e em plantas de tomate uma das dezenove estruturas binárias, compreendendo o promotor upstream 35S

86/114 de cada um dos genes CTs foi transformado em plantas de

Arabidopsis ou em plantas de tomate via transformação por Agrobacterium tumefacience.

μΐ de Agrobacterium tumefaciens GV301 ou células qualificadas de LB4404 (cerca de 10⁹ células/ml) foram transformadas com 2 0 ng de plasmídeo binário via eletroporação, com o uso do

eletroporador MicroPulsed (Biorad), 0,2 cm cadinhos para o transporte de vidro liquefeito (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad).

Células de Agrobacterium foram cultivadas em um meio líquido de 0,8 ml LB a 28² C durante horas e 0,2 ml da suspensão da célula foram laminadas em placas de ágar LB suplementadas com o antibiótico gentamycin 5 0 mg/l (para cepas de Agrobacterium GV3 01) ou streptomycin 300 mg/L (para cepas de Agrobacterium LB4404) e kanamycin '50 mg/l (Sigma) . As placas foram, em seguida,

incubadas a 28 ²C durante 48 horas. As colônias de

Agrobacterium foram cultivadas e a ampliação por PCR foi realizada nas células de Agrobacterium com o uso de sondadores que foram projetados para ampliar a seqüência inserida no vetor binário.

Os sondadores utilizados para a ampliação por PCR foram os seguintes: 5' 25 GGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3' (adiante, seqüência com número de identificação: 70) e 5'- AAGTTGGGTAACGCCAGGGT -3 ' (reverso, seqüência com número de identificação: 71).

Produtos de PCR foram separados

87/114 em géis de determinados

Produtos de agarose a 1,5% e tamanhos ao se comparar a escada de

PCR com o tamanho previsto com o uso de foi realizado de produto foram

DNA (MBI Fermentas) .

foram seqüenciados sondadores, os quais foram

PCR. 0 seqüenciamento da utilizados para a de modo a verificar se os clones foram introduzidos nas efetuado com o uso

Tranformação e cultivo

Arabidopsis thaliana corretos células de Agrobacterium.

seqüenciamento de do seqüenciador ABI da planta:

Transformação com genes putativos

377

DNA foi (Amersham de plantas de thaliana Columbia (plantas TO) foram transformadas com o uso do procedimento Floral

Dip descrito por Clough e Bent e por Desfeux et al. , com menores. Em síntese, Plantas TO foram semeadas

250 ml cheios com uma mistura de crescimento turfa úmida. Os potes foram cobertos com chapa e um domo plástico, mantidos a 4 -C durante em com de potes de base em alumínio

4 dias, em seguida, foram descobertos e incubados em uma câmara de cultivo a 18-24 ²C sob ciclos de 16/8 horas alternando ciclos de luz e de escuridão. As plantas TO estavam prontas para a transformação seis dias antes da antese. Colônias 25 únicas de Agrobacterium que portam as estruturas binárias foram cultivadas em meio de LB suplementado com kanamycin (50 mg/l) e gentamycin (50 mg/l). As culturas foram incubadas a 28 ²C durante 48 horas sob agitação vigorosa e,

88/114 em seguida, foram centrifugadas a 4.000 rpm durante minutos .

Os grânulos compreendendo as células de

Agrobacterium foram novamente suspensos em um meio de com metade da

112 pg/l de vitaminas

B5 Gambourg (Sigma)

0,2 ml/1 Silwet L-77 (Especialistas de duplamente destilada, a pH de 5,7. A plantas planta em uma suspensão de Agrobacterium, de tal forma que o tecido da planta segundos. Cada colocada em uma acima do solo ficasse submerso de planta

T0 inoculada de plástico, e foi imediatamente então coberta com domo plástico claro de forma a manter a umidade e foi mantida no escuro à temperatura durante 18 horas, de modo a facilitar transformadas seja, descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação.

foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até que as síliquas ficassem de cor marrom e secas. As sementes foram colhidas de plantas e mantidas em temperatura ambiente até a semeação. Para gerar plantas transgênicas Tl que ancoram 25 os genes, as sementes colhidas de plantas transgênicas T0 foram esterilizadas na superfície por intermédio de embeber as referidas plantas em etanol a 70 % durante 1 minuto, seguido de embebimento em hipocloreto de sódio a 5 % e

89/114 /qo tríton a 0,05 % durante 5 minutos. As sementes que tiveram a superfície esterilizada foram completamente lavadas em água estéril destilada e, em seguida, foram colocadas em placas de cultura contendo sementes semi-esterilizadas 5 foram completamente lavados em água estéril destilada e, em seguida, colocadas em placas de cultura contendo MurashigSkoog (Duchefa) com metade da força; sacarose a 2 de planta a carbenicylin incubadas a ²C durante transferidas para uma sala de de kanamycin;

placas de horas e, cultivo a 25 e 200 cultura mm de foram em seguida, ²C durante uma semana adicional de vitais T1 de para placas de cultura frescas durante uma outra semana removidas das placas de cultura e plantadas em mistura para crescimento em potes de

250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas para crescer em uma estufa até atingirem a maturidade.

tomate Micro-Tom com genes putativos de algodão cultivo de plantas transgênicas de tomate (Lycopersicon esculentum, var MicroTom) foi efetuada de acordo com Curtis et al. 1995, e Meíssner et. al. 2000.

EXEMPLO 7

Cultivo de plantas transformadas de Arabidopsis e caracterizações de fenótipo

Plantas TI de arabidopsis foram cultivadas conforme foi descrito acima e os fenótipos

90/114 foram caracterizados.

Análise por PCR de plantas transgênicas - Sementes de Arabidopsis T2 foram semeadas diretamente na mistura de crescimento diretamente em potes 5 de 250 ml. Plantas transgênicas positivas passaram por triagem com relação à resistência a kanamycin em folhas com duas semanas de idade por meio de uso de PCR. Os sondadores

utilizados para a ampliação por PCR do kanamycin foram os seguintes: 5'- CTATTCGGCTATGACTGGGC -3' (adiante, seqüência com número de identificação:

72) e 5'- ATGTCCTGATAGCGGTCCGC

-3' (reverso, seqüência com número de identificação: 73).

Desempenho da raiz - De modo a visualizar o desempenho da raiz, as sementes de T2 foram esterilizadas na sua superfície por meio de embebimento em 15 etanol a 70 % durante 1 minuto, e, em seguida, por meio de embebimento em hipocloreto de sódio a 5 % e tríton a 0,05 % durante 5 minutos. As sementes que tiveram sua superfície

esterilizada foram completamente lavadas em água estéril destilada e, em seguida, colocadas em placas de cultura contendo Murashig-Skoog com a metade da força (Duchefa); sacarose a 2%; ágar de planta a 0,8%; 50 mm de kanamycin; e 200 mm de carbenicilina (Duchefa) . As placas de cultura foram incubadas a 4 ²C durante 48 horas e, em seguida, foram transferidas para uma sala de cultivo a 25 ²C até que atingissem o tamanho certo para a caracterização fenotípica.

Resultados

Tabela 8 - Análise de plantas T2 de Arabidopsis que portam os genes putativos de algodão

91/114

CT	Função do gene putativo	Geração de T	Número de plantas independentes	Fenótipo de T2
CT.11	Fator de transcrição MADS-box criptógamo	2	5	Folhas curvadas e estreitas, com longos pecíolos, as raízes são mais longas e mais densas (Figuras 5a-c)
CT_9	Proteína hipotética	2	5	As folhas da roseta e as inflorescentes são mais longas e maiores, em comparação com as do controle. As raízes são mais longas e mais densas. 0 fenótipo assemelha-se ao fenótipo de plantas de Arabidopsis que expressam em excesso expansina, conforme foi caracterizado por Hyung-Taeg Cho e Danei J. Cosgrove no PNAS u , [15 de agosto] August 15, 2000. (Figuras 5a-c)
CT_20	Proteína relacionada de MYB	1	1	Folhas de classificação pequena e com pêlos (fios) (Figuras 5d e θ)
CT_40	Proteína de transferência de lipídio 3	2	5	Folhas mais longas e mais curvas (Figura 5j)
CT_22	Proteína hipotética			Folhas estreitas, com longos pecíolos. (Figuras 5d e f)
CT_81	Proteína similar a APÉTAL2	1	1	As folhas de roseta são quase o dobro em comparação com as do tipo selvagem (Figuras 5k e I)
CT_1	Proteína similar à hidrolase	1	6	Folhas estreitas. Com longos pecíolos. (tal como CT 22, não mostrado)

EXEMPLO 8

Cultivo de plantas transformadas de MicroTom e caracterizações de fenótipo

Procedimentos Experimentais

Plantas de tomate transgênico A planta foi transformada, tal conforme foi descrito no Exemplo 6, acima. Em seguida à transformação, plantas de tomate T1 MicroTom foram cultivadas em uma mistura contida em potes de 1000 ml.

92/114

Resultados

Tabela 9 - Análise de plantas do tomate Micro-Tom TI e T2 e sementes que portam os genes putativos de algodão

CT	Função do gene putativo	Geração deT	Número de plantas independentes	Comprimento do pêlo (fio) da semente de T1 (wt => 0,3 mm)	Fenótipo de T2
CT20	Proteína homóloga a MYB	1	10	0,366 ± 0,006 mm (Figuras 6c-e)	Folhas pequenas e enrugadas, com o filamento da ponta nas folhas sendo mais longos e mais densos. (Figura 6ab)
CT75	Proteína de transferência de lipídeos, putativa	1	2	0,347 ± 0,019 mm	Grande inflorescente
CT 6	Aspartil protease	1	1	0,343 ±0,019
CT_82	Proteína similar a MADS-box	1	3	0,423 ± 0,013 mm (Figura 5f)	Plantas normais

Discussão (Exemplos 1-8)

Identificação in-silico de

genes envolvidos no desenvolvimento da fibra de algodão Pouco se sabe sobre o controle genético da iniciação e prolongamento da fibra de algodão. Uma vez que a fibra de 10 algodão e os tricomas de Arabidopsis des envolvem-se de uma única célula epidermal, assume-se que eles dividem uma regulação genética semelhante (Revisado em Wagner G.J. et al. 2 004) . No Arabidopsis, um grande número de estudos revelou extensa informação sobre os mecanismos genéticos 15 que regulam a iniciação e o prolongamento do tricoma.

Vários estudos demonstraram as semelhanças entre o tricoma e a fibra mostrando que os promotores específicos da fibra de algodão no arabidopsis e no tabaco conferem a expressão

93/114 específica do tricoma (Kim e Triplett, 2001; Hsu et al 1999;

Liu et al, 2000; Wang et al, 2004) . A maioria das pesquisas que estudam o desenvolvimento da fibra usa o tricoma de arabidopsis como um genes do algodão em menor escala (Kim e Triplett, 2001;

Wang et al, 2004) .

Neste estudo, os atuais

o tricoma de tomate e bibliotecas de flores EST como sistemas modelos para estudar o desenvolvimento da das bibliotecas de

EST dos grupos homólogos para conhecer os genes de tricoma de arabidopsis mostrou que o tricoma do tabaco e bibliotecas de flores

EST contribuíram significantemente para este conjunto de grupos.

Este resultado foi confirmado enquanto se analisava o perfil das bibliotecas de EST dos novos grupos de algodão que foram selecionados por seu padrão de expressão de RNA como genes de fibra de algodão.

e 10 grupos continham ESTs que se originaram da flor e bibliotecas de tricomas, respectivamente. Além disso, o grupo dos grupos de tricomas de tomate (tricomas ESTs/total

ESTs > 0,1) compreende uma grande parte dos genes de tomate que mostram alto grau de homologia ao algodão (-5 0%) mesmo quando sua porcentagem na população total é de apenas ~5%.

Isto pode indicar que os dois órgãos dividem processos de desenvolvimento comuns. Mesmo quando haja um grande grupo de estudos sobre o controle genético do tomate e o desenvolvimento do tricoma, nenhuma publicação poderia ser

94/114 encontrada para usar estes órgãos como fonte de dados desenvolvimento da fibra de algodão. Todos os genes dados únicos EST suspensor das sementes de em desenvolvimento www.mdcb.ucla.edu/Research/Goldberg/ ests/intro-index.htm). Todas as seqüências, exceto uma,

tinham altas homologias com seqüências originadas do suspensor, que é um tecido maternal. Este resultado apóia os resultados in silico e identifica o papel destes grupos

de algodão	no desenvolvimento da fibra,	que	também	se
originou	das	células	maternais.
			Identificação	de	genes	do
algodão	com	um papel	no desenvolvimento da	fibra	através	da
análise	do	perfil	de expressão de RNA	- A	fase	de

diferenciação/iniciação é representada pela expressão do gene no momento ou antes da antese. A fase de prolongamento,

principalmente no Hirsutum cultivars, é representada por uma taxa de crescimento muito rápido principalmente durante

5 a 20 DPA. Um padrão é representado por genes como CT 1, 2 e 3 expressados em seus níveis mais altos, levemente antes e durante o período de pico de expansão de fibra cerca de

DPA. Outro padrão de expressão genética está representado pelo CT4 0, 11 ou 7 0 que têm o mesmo nível de expressão durante todo o desenvolvimento da fibra. Da mesma forma, os genes conhecidos codificando a endoxiloglucano transferase ou Suc sintase também mostram níveis de RNA não variantes através do desenvolvimento da

95/114 fibra (Shimizu et al, 1997) .

principalmente antes da antese até 1 DPA, sugere-se que os genes com um pico de expressão durante da fibra. CT que indicam seu envolvimento neste estágio.

Uma limitação da atual base de dados do extraídos biblioteca algodão

EST de ESTs que foram da que tarde, entre flor foi em um retirada maioria dos estágio de do ovário 1 iniciação (há uma

DPA, mas é de baixa

ESTs foi retirada apenas mais

DPA. Esta maioria dos genes escolhidos terem que indicam sua associação com o estágio de prolongamento.

Papel dos genes selecionados

no desenvolvimento da fibra, possíveis mecanismos

Os grupos de 23 fibras associadas podem ser categorias funcionais de acordo com homologia com proteínas conhecidas e enzimas (Tabela 3, acima). A classificação foi feita de acordo com

GO (www.geneontology.org/). 0 maior únicas sem homologia a grupo compreende nenhuma proteína conhecida.

O restante dos grupos foram classificados de acordo com categorias conhecidas por serem associadas com o desenvolvimento da fibra. Dois genes (Tabela 3, acima) foram classificados em uma categoria de comprometimento do

96/114 futuro celular: um novo gene que pertence ao fator de transcrição MYB e que sabe-se estar fenótipo apoia seu genes MYB um gene homólogo do algodão para o GL3 envolvido no desenvolvimento do tricoma do transgene CT2 0 no arabidopsis e no tomate Tl

Evidência acumulativa liga os do algodão com o desenvolvimento da fibra (Suo,

J.

et al, 2003;

Cerdoni M.L.

et al, 2003; Loguerico L.L. et al,

1999) . Pela um número de genes que trabalham na mesma via relacionada com a fase de iniciação, pode-se induzir a iniciação. Kirik três genes da fase de eles aumentaram o número de tricomas e raízes relacionados com a fase de puderam ser usados para uniformidade de células epidérmicas meristemas vegetativos como troncos e folhas pode ser usada como proteção contra insetos (como já foi mostrado na canola estresses que prove www.westerngrains.com/news/nr_05 0413.html) o envolvimento direto de qualquer gene MYB com o

Dois outros genes (Tabela 3, acima) são fatores de transcrição das famílias MYB e MADS BOX. Muitos estudos demonstraram a função destas duas famílias de fatores de transcrição como genes homeóticos desenvolvimento da fibra.

97/114 com papel fundamental em diferentes desenvolvimento, entre eles o tricoma e a fibra papel também processos de morfogênese da (Suo J. et al. , 2003 ;

Ferrario S et em de desenvolvimento da fibra apoiado por seu padrão de expressão de RNA, que e induzido antes e durante o dia da antese. Um gene

Tabela 3, acima) foi classificado pelas vias do metabolismo

do amido e sucrose. Um trabalho recente demonstra que outro gene (SUS), que, pertencendo a esta limitante

75, foram expressão via, é um fator fibra. CT_40, classificados como transporte de do RNA é altamente induzida durante um inicial de prolongamento da fibra dado o fato de fibra.

estágio que os

Vários

70, 71) foram classificados tanto como genes envolvidos resposta de salinidade estimulada pelo ácido abscísico e genes

envolvidos na de elétrons.

Dentre eles, genes (CT e 49) foram selecionados de do

RNA para serem induzidos no estágio de prolongamento.

Vários estudos consideram a troca de mecanismos da bomba de próton e potássio como fator-chave (Smart

L.B et al, de vários genes relacionados ao metabolismo do amido e sucrose que melhorar a formação da parede celular com genes de transporte de lipideos ou genes relacionados à dessecação, com o prolongamento da fibra como genes

98/114 que podem influenciar na pressão celular, podendo resultar em fibras mais longas superexpressas de um único gene.

EXEMPLO 9

Clonagem e análises de seqüências promotoras upstream de 5 genes da presente invenção

A expressão genética diferencial em tecidos fibrosos versus outros tecidos do

algodão é o resultado de regulação genética complicada. As regiões genômicas upstream de 23 genes selecionados estão previstas para possuir atividades promotoras que dirigem a expressão genética direta para células fibrosas de uma maneira quantitativa e qualitativa única. Uma expressão genética precisa, dirigida para células fibrosas, é crucial para o desenvolvimento das plantas do algodão com melhor desempenho da fibra, sem afetar negativamente outros tecidos da planta.

Procedimentos Experimentais

Clonagem de seqüências promotoras - As seqüências genômicas upstream de CT2 e CT6 20 foram clonadas do DNA genômico do algodão (Gossypium hirsutum L. var Acala) , como segue. 0 DNA genômico total foi extraído de tecidos de folhas da planta de plantas de algodão de 4 semanas de cultivo (Gossypium hirsutum L., var Alcala) , usando o kit de extração de DNA (mini kit de 25 plantas Dneasy, Qiagen, Alemanha). 0 PCR Inverso (IPCR), digestão de DNA, auto-ligação, e reação de PCR foram realizados no DNA genômico, seguindo o protocolo comum (www.pmci.unimelb.edu.au/core_facilities/manual/mb390.asp)

99/114 com as seguintes modificações. Para evitar erros no IPCR, a seqüência genômica da seqüência 5 de um cDNA relevante (por exemplo, incluindo introns) foi inicialmente identificada para produzir a Ilha Genômica (IG) .

usando sondadores de oligonucleotídeos diretos desenhados com base na seqüência de grupo de cDNA (para CT_2 e CT_6, de IG foram acertadas em seqüência com número de para CT-2 e CT_6. Sondadores foram com número de identificação:

14-15 (CT_2) e 101-102 CT_6).

ciclo térmico de DNA, exemplo:

92²C/3 min 31 x [94 ²C/10 min).

em um usando protocolos comuns de PCR. Por ²C/30 seg 56²C/30 seg 72²C/3 min]

Os produtos

PCR foram

PCR, usando o

Em alguns casos, uma técnica diferente [UP-PCR (Dominguez e

Lopez-Larrea, 1994)] foi usada quando o

IPCR resultou técnica UP-PCR desconhecida de seqüências de grupos conhecidos. De maneira geral, o procedimento envolveu quatro sondadores de oligonucleotídeos:

dois sondadores específicos de seqüências (SPs, externo e interno) (listados abaixo), ambos com a mesma orientação de final 3 para a região

100/114 desconhecida, mas desejada, de n² 5 do gene, e dois sondadores marchadores universais

5'TTTTTTTTTTTCTTTCTTGTCCCCCTCT (seqüência com número de com número de reações foram conduzidas usando as seguintes misturas de reações: mistura de amostra (SM)

DNA genômico de espécies

água duplamente

Mistura de polimerase (PM) um volume final de pL.

dNTPs (Roche,

Suíça, mmol cada) , Mix de Enzimas Expand Long

Template

Suíça,

1U) , 10 x tampão fornecido com a enzima e água duplamente destilada foi adicionada ao volume final de 8 pL.

Os SMs foram colocados em um termociclo (Biometra, EUA), onde foram sujeitos a um programa de amplificação de 1 minuto a 90 ²C, mantido (pausa)

a 80 ²C até que PM fosse adicionado, 30 segundos a 15 ²C, minutos a 25 ²C, 3 minutos a 68 ²C, mantido a 90 ²C até o SP externo (2 pL de concentração 10 pM) ser adicionado. Ό

20	processo	foi	seguido	de uma reação	de	PCR	externa	de 3 0
	segundos	a 92	²C, 10	segundos a 94	^ec,	30 segundos	a 65,5
	²C, 3 minutos	a 68 ²C,	por 30 ciclos	seguidos	pela extensão
	final de	10 minutos a	68 ²C.
				0 produto	de	PCR	externo
25	diluído	5000-	-25000 vezes foi usado	como	modelo	, e a
	amplificação	do PCR	foi efetivada	usando sondadores sWP

interno específico e SP (30 mol cada) , 1U Ex Taq (Takara) em volume de reação de 5 0 pL. A reação de PCR interno foi li

101/114 sujeita a um programa de amplificação de 2 minutos a 92 ²C, seguido por 3 0 segundos a 94 ²C, 3 0 segundos a 58 ²C, e 3 minutos a 72 ²C por 3 0 ciclos e uma extensão final de 10 minutos a 72 ²C. Os produtos IPCR/Up-PCR foram purificados (Kit de Purificação PCR, Qiagen, Alemanha) e seqüenciados (sequenciador ABI 377, Amersham Biosciences Inc).

Sondadores externos:

SWP28- 5'- TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3' número de identificação: 78)

SP (externo)- 5'- CTGGGGTTACTTGCTAATGG-3' com com número de identificação: 79) com número de com número de identificação de CT_2 resultante do procedimento acima é fornecida na seqüência com número de

Os sondadores para CT_6 foram

Sondadores externos:

SWP28- 5'- TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3' (seqüência com número de identificação: 78

SP (Externo)- 5' - GGCTTTGGGATGTTTGAGGTGG-3' (seqüência com número de identificação: 82)

Sondadores internos (Embutidos):

102/114

SWP- 5'- TTTTTGTTTGTTGTGGG-3' (seqüência com número de identificação 83)

SP (Interno)- 5'- GGTGGTGGGCTCTTGCAACAG-3' (seqüência com número de identificação 84)

A seqüência genômica interna de CT_2 resultante do procedimento acima é fornecida na seqüência com número de identificação 85.

Para a clonagem dos promotores putativos e de 5' UTRs, a ampliação por PCR foi realizada com o uso de um novo conjunto de sondadores (abaixo) com extensão de 8-12 bp que incluía um local de restrição (HindIII, Sall, Xbal, BamHI, ou Smal) na extremidade do sondador de n² . 5' . Com relação a cada um dos promotores, promotor foram selecionados.

forma que os produtos de PCR upstream do estruturado sinais de plasmídeo

4811) no pBHOl, 3 gene relator de por intermédio não existem na

Além do mais, sondadores foram do os locais de de resultantes sejam clonados plasmídio pPI no foi da inserção de uma tendo origem do vetor de

Ace No. U47295; bp 4658

HindIII do vetor binário os sondadores

UTR (P+U) e clonagem no pPI, além da seqüência ampliada e clonada. Os

103/114 locais de restrição dentro de cada um dos sondadores são mostrados em negrito:

CT_2 :

P + U adiante (HindIII): 5'- ARRCAAGCTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGG

-3' (seqüência com número de identificação: 86)

P + U reverso (BamHI): 5'- TTGGATCCTTGGGCATTGAGCTTCTGTAC 3' (seqüência com número de identificação: 87)

A seqüência P + U de CT_2 é conforme é estabelecida na seqüência com número de identificação: 88.

CT6:

P + U adiante (HindIII): 5'- TTAAAGCTTTGGGCTCTTGCAACAGAGGC

-3' (seqüência com número de identificação: 89)

P + U reverso (BamHI) : 5'AAGGATCCGACGACGACAACAACAACAAC -

	3' (seqüência com	número de	identificação:	90)
15			A	seqüência	P +	U de CT_6	é
	conforme é estabelecida	na	seqüência	com	número	de
	identificação: 91	•
			0	DNA Genômico ou	o produto	do
	IPCR/UP-PCR foi	utilizado	como modelo	de	DNA para	• a
20	ampliação de	PCR com	o	uso de	sondadores	de
	oligonucleotides	recentemente	designados.	. Os	produtos	de

PCR foram purificados (Kits de Purificação de PCR,

Qiagen,

Alemanha) e digeridos com os locais de restrição que existem nos sondadores (Roche, Suiça). Os produtos 25 digeridos de PCR foram novamente purificados e clonados no vetor binário pPI, o qual foi digerido com as mesmas enzimas de restrição. 0 produto de PCR e o vetor de plasmídeo aberto foram ligados com o uso de enzima de ligase

104/114

Suíça).

EXEMPLO 10 células com tumefação de Agrobacterium com que ancoram

O vetor binário pPi, incluindo ou o promotor CT2 ou o promotor CT6, upstream ao gene relator de GUS foram utilizados para a células de Agrobacterium.

Os vetores binários foram introduzidos à Agrobacterium células qualificadas de LB4404 intermédio de com o uso de um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm cadinhos para o transporte de vidro liquefeito (Biorad) e programa de eletroporação (Biorad).

As foram cultivadas em meio líquido de

LB horas e, em seguida, sobre ágar

LB suplementado com ou streptomicina (300 mg/l; para as cepas de Agrobacterium

LB4404) e kanamycin horas.

Colônias de Agrobacterium que se desenvolveram nos meios seletivos foram analisadas pelo PCR com o uso dos com números de designados para no plasmídeo de pPI.

Os produtos resultantes de PCR foram isolados e seqüenciados de acordo com feita no Exemplo 4 acima, de forma a verificar se as seqüências corretas foram

105/114 devidamente introduzidas às células de Agrobacterium.

EXEMPLO 11

Promotores específicos nas folhas de tomate e nas frutas de tomate.

foi efetuada de forma a ilustrar a expressão específica em ponta e em frutas de tomate.

Procedimentos

Experimentais de plantas de tomate Micro-Tom com promotor putativo de de plantas de

Arabidopsis thaliana com promotor putativo de

Conforme descrito acima.

de GUS de

Arabidopsis plantas de arabidopsis foi efetuada conforme descrito anteriormente

(Jefferson R.A. et. al. 1987, Meissner et. al. 2000).

Coloração por meio de GUS de folhas de tomate - A coloração por meio de GUS de plantas de tomate foi efetuada conforme foi descrito anteriormente (Jefferson R.A. et. al. 1987, Meissner et. al. 2000) .

A fixação do tecido foi efetuada da seguinte maneira. As folhas de tomate foram imersas em acetona fria a 9 0 % e, em seguida, foram incubadas em gelo durante 15-20 minutos seguidos da remoção da acetona. Daí em diante, o tecido foi enxaguado duas vezes com a Solução de Trabalho [100 mm de fosfato de sódio

106/114 mm, EDTA (BioLab) pH minutos no removida e substituída por solução de coloração com cola X [Solução de trabalho + ácido glicurônico 5-bromo-4cloro-3-indolil-p-D (X-GlcA, (BioLab) incubado envoltos efetuada etanol etapa de

Duchefa) solubilizado em

0,75 mg/ml,

Ditiotreitol (BioLab) 100 mm] e durante toda a noite a 37 com chapa de alumínio).

por intermédio do mergulho do tecido da planta a 50 ²C durante

-120 minutos.

em da planta tenha se tornado transparente, com a exclusão das armazenadas em etanol a 70 % (BioLab) à temperatura frutas de tomate - A coloração por meio de GUS de frutas de tomate foi efetuada conforme descrito anteriormente (Jefferson RA. et. al. 1987, Meissner et. al. 2000). Em síntese: fatias finas de fruta de tomate foram mergulhadas em solução de coloração [100 mm fosfato de sódio (Sigma,

EUA) solução tampão pH = 8, ferricianeto (Sigma, EUA) 5 mm, 25 ferricianeto (Sigma, EUA) 5 mm, EDTA (BioLab) pH=8 15 mm, metanol (BioLab) 20 %, ácido glicorônico 5-bromo-4-cloro-3indolil-p-D (X-GlcA, Duchefa) solubilizado em N,NDimetilformamida (BioLab) 0,75 mg/ml] no escuro (tubos

107/114 embalados com chapas de alumínio) e incubados durante a noite toda a 37 ²C. A descoloração foi efetuada por intermédio do mergulho do tecido da planta em etanol a 70% e aquecimento a 5 0 ²C durante -20 minutos. A etapa de

Tabela 10

Promotor	Número de plantas independentes T1	Folha	Filamento da ponta da folha	Casca da semente da fruta jovem	Casca da semente do verde maduro	Casca da semente da fruta madura
CT2	quatro	0	2	3	5	3
CT6	um	0	1	1	2,5	1

Os números representam o grau em média, 0 - não expresso, 5

- alta expressão

EXEMPLO 12

Fios das sementes de tomate como um sistema de modelo para as fibras de algodão.

A modificação genética do algodão é longa e consome uma grande quantidade de tempo.

Portanto, de modo a encontrar genes que sejam capazes de

108/114 melhorar a produção e a qualidade da fibra de algodão, existe uma necessidade por um sistema de modelo para desenvolvimento da fibra de algodão em outras plantas.

As células do tricoma e os pêlos (fios) das raízes compartilham características em comum com as células de fibra de algodão, além de serem amplamente aceitos como sistemas de modelo para

desenvolvimento da fibra de algodão [Revisado em Wagner.

espessura, assim são uma tarefa and de como

Wang et al. 2004] .

Entretanto, as mudanças crescimento, no comprimento e outros parâmetros estruturais, fácil devido ao tamanho pequeno, na na nao acessibilidade remota e à falta de uniformidade em tamanhos de células do tricoma.

De modo a sobrepor estas

limitações, ós fios das sementes de tomate foram analisados com relação a seu possível uso como um tecido-modelo para o desenvolvimento da fibra de algodão. Para este fim, o elemento relator de GUS foi derivado de CT2, conforme foi descrito acima.

A transformação do tomate, da estrutura binária, da regeneração da planta e da coloração por meio de GUS foi efetuada de acordo com o que foi 25 descrito acima.

Os fios das sementes de tomate (figura 8a) são células epidérmicas de material, que recobrem a superfície do óvulo das sementes. Em aspectos

109/114 anatômicos, os fios das sementes de tomate encontram-se muito mais próximos das fibras de algodão do que as células do filamento das pontas ou os fios (pêlos) da raiz.

Quatro frutas de tomate transgênicas independentes que expressam em excesso o gene

de GUS	sob	o	promotor	específico	de	algodão	CT_2 foram
produzidas.	A	coloração	por meio	de	GUS de	frutas no
estágio	maduro-	-verde (a	fruta está	em	tamanho	total logo

antes do processo de amadurecimento) foi observada unicamente no envelope da semente, no qual os pêlos (fios) estão sendo desenvolvidos (Figuras 7a e b).

Cinco frutas de tomate transgênicas independentes que expressam em excesso 35Sexpansina (AF043284) foram produzidas e o comprimento do

pêlo (fio) da semente foi medido e comparado com aquele do tipo selvagem. 0 fio da semente das plantas transgênicas foi mais longo, de modo significativo, do que aquele do tipo selvagem (figuras 8a-b).

Tabela 11

Planta	Número de plantas independentes	Comprimento do pêlo (fio) da semente (mm)
WT	3	0,300 ± 0,019
35S:expansão	5	0,357 ± 0,017 (Figura 8b)

É apreciado que determinados recursos da invenção, os quais, para propósitos de clareza, descritos no contexto de incorporações em separado, também possam ser fornecidos em combinação em uma única incorporação. De modo oposto, diversos recursos da invenção, 25 os quais são, para colocar de forma breve, descritos no contexto de uma única incorporação, podem também ser

110/114 fornecidos em separado ou em qualquer sub-combinação apropriada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com incorporações específicas desta, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações se tornarão aparentes àqueles que têm habilidades na abranger todas as referidas dentro do espírito e do amplo escopo contidas no anexo.

e os números de acesso do GenBank incorporados no presente documento em sua completude por meio de referência na especificação, até a mesma extensão como se cada número de cada publicação individual, patente ou solicitação de patente ou número de acesso do

GenBank foi especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado no presente documento por meio de referência.

Além disso, a citação ou a identificação de qualquer referência nesta solicitação não deve ser interpretada como uma admissão de que a referida referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção.

Legenda das figuras

Figura 1

1.1: Algodão

1.2: Algodão DB

111/114

1.3: Combinação de potenciais - Novo traço - genes relacionados (> 1.100 genes)

1.4: Lista de filtros por: Anotação, Ontologia, qualidade do agrupamento, grau de homologia

1.5: Homologia

1.6: Arabidopsis

1.7: Arabidopsis DB

1.8: Revisão da Literatura, TAIR, GenBank [Banco Genético]

1.9: Genes de Controle

1.10: Lista refinada de novos genes envolvidos no

1.11:

Tomate

1.12:

Tomate DB

1.13:

1.14:

genes com perfil de biblioteca similar

Figura 4

4.1:

NOS pro'

4.2:

NTP - II

4.3 :

NOS ter

4.5: GUS

4.6: NOS ter

RB: Borda de T - DNA

H:

Enzima

S:

Enzima

X:

Enzima

Sm: Enzima Sma-1 de restrição

112/114

Sc: Sacl/Sstl/Ecll36ll

R-I: Enzima Hind-III de

LB: Broda esquerda de T

Referências Citadas por

J. F.

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Nome do citadas

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Claims

1. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada pelo fato de que consiste da SEQ ID NO: 21, e pelo menos um promotor heterólogo para expressão em uma célula de planta.

2. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor heterólogo é um promotor de célula endotelial.

3. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido promotor heterólogo é um promotor de fibra de algodão otimizada.

4. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido promotor heterólogo consiste da SEQ ID NO: 74, 75, 85 ou 91.

5. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido promotor consiste da SEQ ID NO:85 ou SEQ ID NO:91.

6. “CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido promotor regula a expressão do referido polinucleotídeo em uma célula endotelial de óvulo que é parte de uma fibra de planta ou uma tricoma.

7. “MÉTODO DE MELHORIA DO RENDIMENTO DA FIBRA DE UMA PLANTA PRODUTORA DE FIBRA, caracterizado pelo fato de que o método é efetuado

Petição 870180151670, de 14/11/2018, pág. 10/14

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introduzindo na planta produtora de fibras a construção de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, melhorando o rendiment o da fibra da planta produtora de fibra. 8. “MÉTODO DE MELHORIA DO RENDIMENTO DA FIBRA DE UMA PLANTA PRODUTORA DE FIBRA, de

acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o rendimento da fibra inclui extensão da fibra.

9 . “MÉTODO DE MELHORIA DO RENDIMENTO DA FIBRA DE UMA PLANTA PRODUTORA DE FIBRA, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida planta produtora de fibra é selecionada dentre o grupo consistindo no algodão, na árvore de algodão de seda (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro de deserto, arbusto de creosoto, Winterfat, balsa, rami, quenafe, cânhamo, rosela, juta, sisal, abacá e fibra do linho.