BRPI0506790B1 - processo de preparação de uma cepa de escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples e processo de preparação de 1,2-propanodiol - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DE UMA CEPA DE MICROORGANISMOS EVOLUÍDOS E DE 1,2- PROPANODIOL, E, CEPA" A invenção refere-se a um novo processo de preparação de um cepa de microorganismos evoluídos para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples, o dito processo compreendendo a cultura sob pressão de seleção em um meio de cultura adequado que compreende uma fonte de carbono simples, de uma cepa bacteriana inicial compreendendo uma deleção do gene tpiA e uma deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanal) em lactato, a fim de fazer evoluir na dita cepa inicial um mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP em metilglioxal e depois em 1,2-propanodiol para os genes evoluídos que têm uma atividade 1,2-propanodiol síntase melhorada, e depois seleciona-se e isola-se a ou as cepas de microorganismos evoluídos que têm uma atividade 1,2 propanodiol síntase melhorada. A invenção refere-se igualmente aos microorganismos iniciais e os microorganismos eveoluidos assim obtidos e um processo de preparação de 1,2-propanodiol e eventualmente de acetona por cultura dos microorganismos evoluídos.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um novo processo de preparação de um microorganismo evoluído para a produção de 1,2-propanodiol, o microorganismo evoluído obtido desta forma e sua utilização para a preparação de 1,2-propanodiol.
[0002] O 1,2-propanodiol ou propileno glicol, diálcool em C3 é um produto químico utilizado em numerosos domínios. É um componente das resinas de poliésteres insaturados; dos detergentes líquidos; dos agentes de resfriamento, anticongelante e de fluidos de antigeadas de aviões.A utilização do propileno glicol está em ascensão desde os anos de 1993-1994 em substituição aos derivados etilênicos, que são reconhecidos como mais tóxicos que os derivados propilênicos.
[0003] O 1,2-propanodiol é atualmente produzido por via química para um processo de hidratação do óxido de propileno utilizando uma grande quantidade de água. A produção de óxido propileno pode ser efetuada de acordo com dois processos: um, que utiliza o epicloridrina, o outro, o hidroperóxido. Estas duas vias utilizam produtos altamente tóxicos. Além disso, a via do hidroperóxido gera co- produtos tais como o ter-butanol ou o 1 fenil etanol, que é necessário valorizar para tornar rentável a produção de óxido propileno. A via química produzida geralmente do 1,2-propanodiol racêmico enquanto existem duas formas de estereoisômeros: o (R) 1,2- propanodiol e o (S) 1,2-propanodiol, cujo interesse para outras aplicações não é negligenciável.
[0004] Estes inconvenientes ligados à produção química do 1,2-propanodiol fazem da via de produção biológica uma alternativa promissora. Vários microorganismos são capazes de produzir naturalmente o (S) ou (R) 1,2-propanodiol a partir do açúcar, tais como a glicose ou a xilose, que são metabolizadas pela via da glicólise, ou ainda, a partir de deoxihexoses que conduzem, então, à formação de (S) 1,2-propanodiol (Cameron D. C. et coll. (1998) Biotechnol. Prog.). Dentre os microorganismos mais eficientes citam-se Clostridium sphenoides (Tran Din K. et colI. 1986) e Thermoanaerobium thermosaccharolyticum (A/taras N. E and Cameron D. C. 2001). Este último é capaz de encerrar vários tipos de açúcares em (R) 1,2-propanodiol com um rendimento que varia de 0.13 a 0.28 g de 1,2-propanodiol produzido/g de glicose consumida. Nestes dois microorganismos, as enzimas responsáveis pela síntese de 1,2-propanodiol não foram identificadas, e a melhoria dos seus desempenhos é limitada pela falta de instrumentos genéticos disponíveis. Além disso, E. coli possui todos os genes necessários para a produção de 1,2-propanodiol, mesmo que E. coli não produza naturalmente o 1,2-propanodiol. Com efeito, o 1,2-propanodiol deve ser produzido a partir de metil glioxal, um composto altamente tóxico para a célula, mesmo a baixa concentração. Também, processos que utilizam cepas de E. coli geneticamente modificadas afim de que elas produzam o 1,2-propanodiol foram descritos notadamente em US 6.303.352, US 6.087.140 e WO 98/37204. Estes processos utilizam notadamente a superexpressão de uma ou mais enzimas implicados na via metabólica de produção do 1,2-propanodiol por clonagem dos seus genes nos plasmídeos e, então, impõem uma pressão de seleção com ajuda de antibióticos. Para melhorar os desempenhos das cepas alguns genes endógenos são igualmente deletados (ver por exemplo, Altaras N. E and Cameron D. C. (2000) Biotechnol Prog. 16, 940-946: Altaras N. E and Cameron D. (1999)Appl Env. Microb., 65, 1180-1185).
[0005] Um processo utilizando um microorganismo evoluído que co-produz o 1,2- propanodiol e a acetona, dois co-produtos vaporizáveis, que até então nunca foi descrito.
[0006] A presente invenção refere-se, então, a um processo de preparação de uma cepa de microorganismos evoluídos para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples, o dito processo compreendendo a cultura sob pressão de seleção em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples, uma cepa bacteriana inicial que compreende uma deleção do gene tpiA e uma deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanol) em lactato, a fim de fazer evoluir na dita cepa inicial um ou mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP metilglioxal e depois em 1,2- propanodiol para genes evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintaxe» melhorada, e depois se seleciona e isola-se a ou as cepas de microorganismos evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintaxe» melhorada.
[0007] O gene tpiA codifica para a triose fosfato isomerase que catalisa a conversão do DHAP de gliceraldeído 3 fosfato. A deleção deste gene tem por objeto assegurar a síntese de uma quantidade suficiente de metil glioxal. Teoricamente, a deleção do gene tpiA deve permitir assegurar que 50% do carbono da glicose metabolizada pelas células sejam afetadas na preparação do metil glioxal a partir do dihidroxi acetonefosfato.
[0008] A deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanol) em lactato tem por objeto inibir a conversão do metil glioxal em lactato, de modo que o essencial do metil glioxal presente produzido pela cepa inicial, como pela cepa evoluída obtida, seja empregado pela maquinaria celular das ditas cepas para a preparação de 1,2-propanodiol.
[0009] Os genes implicados na conversão do metil glioxal em lactato são escolhidos entre o gene gloA codificante para a glioxilase I (que catalisa a síntese de lactoil glutationa a partir de metilglioxal) e os genes aldA e aldB codificante para uma lactaldeído desidrogenase (que catalisa a síntese de (S) lactato a partir de (S) lactaldeído). De preferência, a cepa inicial compreende a deleção dos três genes gloA, aldA e aldB.
[0010] De modo vantajoso, efetua-se uma modificação suplementar da cepa inicial, que consiste em suprimir as vias naturais de fermentação de glicose que são consumidoras de equivalentes redutores sob a forma NADH a fim de eliminar estas vias metabólicas que competem com a produção 1,2-propanodiol.
[0011] Citar-se-á em especial a deleção do gene IdhA codificando para a lactato desidrogenase que catalisa a síntese de lactato a partir de piruvato, e esta do gene adhE codificando para a álcool-aldeído desidrogenase que catalisa a síntese do etanol a partir de acetil-CoA.
[0012] Do mesmo modo, pode-se obrigar o microorganismo a utilizar o complexo piruvato desidrogenase para produzir, anaerobiose, o acetil-CoA e o NADH a partir do piruvato. Isto pode ser obtido deletando-se os genes pflA e, pflB codificando para o piruvato formato Iiase.
[0013] De acordo com um modo particular de realização da invenção, a cepa inicial compreende igualmente então, uma deleção de ao menos um gene escolhido dentre IdhA, pflA, pflB e adhE, de preferência a deleção dos quatro genes IdhA, pflA, pflB e adhE
[0014] De maneira ainda mais vantajosa, a cepa inicial de acordo com a invenção compreenderá igualmente, pelo menos um gene codificando para uma enzima que favorece em anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato.
[0015] De preferência, a enzima favorece, em anaerobiose, o metabolismo do piruvato para a produção de acetil-CoA e de NADH. Mais preferencialmente, esta enzima é um complexo piruvato desidrogenase.
[0016] De maneira vantajosa, o dito gene codificando para uma enzima que favorece, em anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato é pouco sensível à inibição pelo NADH.
[0017] Este gene pode ser um gene endógeno, codificando para uma proteína endógena, ou ainda um gene exógeno ou heterólogo, codificando para uma enzima endógena ou exógena.
[0018] No caso de um gene endógeno codificando para uma proteína endógena sensível à inibição pelo NADH, o processo de evolução de acordo com a invenção permitirá selecionar as cepas para a atividade «1,2-propanodiol síntese» melhorada cujo dito gene codificando para uma enzima que favorece, anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato codificado para uma enzima evoluída tornada pouco sensível à inibição pelo NADH.
[0019] De acordo com um outro modo de realização da invenção, pode-se introduzir na cepa inicial um gene heterólogo que codifica para uma enzima pouco sensível à inibição pelo NADH, ou codificando para uma enzima sensível, mas tornada pouco sensível pelo emprego do processo de evolução de acordo com a invenção.
[0020] Além disso, é, igualmente vantajoso, deletar o gene edd codificando para 6-fosfo-gliconata desidratase, primeira enzima implicada na via de Entner Doudoroff, para evitar a metabolização direta da glicose em gliceraldeído-3-fosfato e piruvato e assim forçar a conversão da glicose em 1,2-propanodiol e acetato.
[0021] De modo vantajoso, introduz-se na cepa evoluída, precedentemente isolada, obtida pelo processo de evolução de acordo com a invenção, um ou mais genes heterólogos codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona, para obter uma cepa evoluída modificada.
[0022] Esta nova modificação permite produzir com o 1,2-propanodiol da acetona, co-produzido valorizável. Esta modificação tem, além disso, a vantagem de melhorar os desempenhos de produção em 1,2-propanodiol. Com efeito, o acetato é um composto inibidor do crescimento bacteriano com baixa concentração (15 g/l) e bloqueia rapidamente a evolução dos desempenhos da cepa cultivada quemostaticamente em condições anaeróbicas.
[0023] A introdução na cepa evoluída dos genes codificando para as enzimas que catalisam a transformação do acetato em acetona acarreta uma diminuição da concentração residual em acetato durante a cultura quemostaticamente. Produz-se a acetona, composto muito menos inibidor do crescimento que o acetato, o crescimento da cepa e a produção de 1,2-propanodiol são favorecidos.
[0024] De maneira vantajosa, o ou os genes heterólogos codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato proveniente de C. acetobutylicum. Os genes codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona podem ser expressos cromossomicamente ou extracromossomicamente. Cromossomicamente, uma ou mais cópias podem ser introduzidos no genoma com ajuda dos métodos de recombinação conhecidos pelo especialista. Extra cromossomicamente, os genes podem ser levados por diferentes tipos de plasmídeos que diferem pela sua origem de replicação, seu número de cópias e sua estabilidade na célula. Podem estar presentes de 1 para 5 cópias, como a 20 ou até mais de 500 cópias que correspondem aos plasmídeos com baixo número de cópias com uma origem de replicação de tipo estrito (pSC101, RK2), aos plasmídeos com baixo número de cópia (pACYC, pRSF1010) ou com grande número de cópias (pSK bluescript II). Os genes podem ser expressos utilizando-se promotores de diferentes forças, indutíveis ou não indutíveis. Podem-se citar, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac, ou outros promotores conhecidos pelo especialista.A expressão dos genes alvos pode ser aumentada ou diminuída pelos elementos que estabilizam ou desestabilizam o RNA mensageiro (Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog., 15, 58-64) ou as proteínas (por exemplo GSTtags, Amersham Biosciences).
[0025] De acordo com um modo preferencial de realização da invenção, cultiva-se a cepa evoluída modificada obtida precedentemente sob pressão de seleção em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples a fim de fazer evoluir na dita cepa evoluída modificada um ou mais genes implicados na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona para uma atividade «acetona sintase» melhorada, e depois selecionam-se e isolam-se, as cepas de microorganismos evoluídos de segunda geração que têm uma atividade «1,2- propanodiol sintase» melhorada e uma atividade «acetona sintase» melhorada.
[0026] A presente invenção refere-se também a uma cepa inicial de acordo com a invenção tal como foi definida acima, a seguir e nos exemplos.
[0027] Ela refere-se, igualmente, a uma cepa evoluída que tem uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada susceptível de ser obtida pelo processo de acordo com a invenção, tal como definido acima, a seguir e nos exemplos, esta definição englobando as cepas evoluídas de segunda geração que têm sobretudo uma atividade «acetona sintase» melhorada.
[0028] A invenção refere-se por fim, a um processo de preparação de 1,2- propanodiol no qual cultiva-se uma cepa evoluída, de acordo com a invenção, em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte simples de carbono, e depois recupera-se o 1,2-propanodiol produzido e se for caso, a acetona, que são eventualmente purificados.
[0029] As cepas de microorganismos modificados, iniciais e evoluídos, de acordo com a invenção, podem ser procarióticas ou eucarióticas, suscetíveis de serem transformadas e cultivadas para permitir a produção de 1,2-propanodiol e se for o caso, de acetona.
[0030] O especialista será, precisamente, capaz de selecionar os ditos microorganismos em face de seus conhecimentos gerais no domínio da biologia celular e molecular, e, se for caso, identificar os genes destes microorganismos que correspondem aos genes de E. coli mencionados precedentemente.
[0031] Por cepa de microorganismo s, entende-se, de acordo com a invenção, um conjunto de microorganismos de uma mesma espécie que compreende ao menos um microorganismo da dita espécie. Assim, as características descritas para a cepa são aplicáveis a cada um dos microorganismos da dita cepa. Do mesmo modo, as características descritas para um dos microorganismos da cepa serão aplicadas ao conjunto dos ditos microorganismos que a compõem.
[0032] Os microorganismos modificados, de acordo com a invenção, são escolhidos dentre as bactérias, as leveduras e os cogumelos, e notadamente esses das seguintes espécies: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
[0033] Em um modo de realização preferida, a cepa bacteriana é uma cepa de Escherichia, em particular de E. coli.Em um outro modo de realização, a cepa bacteriana é uma cepa de Corynebacterium, em especial C. glutamicum.
[0034] Em outro modo de realização, a cepa de levedura é uma cepa de Saccharomyces, em particular S. cerevisiae.
[0035] A invenção é descrita acima, a seguir e nos exemplos, em relação a E. coli. Assim, os genes suscetíveis de serem deletados ou superexpressos para as cepas evoluídas, de acordo com a invenção, são definidos principalmente pelo emprego da denominação do gene de E. coli. Entretanto, este emprego tem uma significação mais geral de acordo com a invenção, e engloba os genes correspondentes de outros microorganismo s. Com efeito, utilizando-se as referências GenBank dos genes de E. coli, o especialista é capaz de determinar os genes equivalentes em outras cepas bacterianas que não o E. coli.
[0036] Os meios de identificação das sequências homólogas e suas porcentagens de homologia são bem conhecidos pelo especialista, compreendendo notadamente os programas BLAST que podem ser utilizados a partir do sítio http://www.ncbLnlm.nih.gov/BLAST/, com os parâmetros indicados por padrão neste sítio. As sequências obtidas podem então ser exploradas (e.g. alinhadas) utilizando- se, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebLac.uklclustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros indicados por padrão nestes sítios.
[0037] Utilizando-se as referências dadas em GenBank para os genes que são conhecidos, o especialista é capaz de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, em cogumelos, mamíferos, plantas, etc.Este trabalho de rotina é vantajosamente efetuado utilizando-se as sequências consensuais que podem ser determinadas realizando-se alinhamentos de sequências com genes provenientes de outros microorganismo s, e desenhando-se sondas degeneradas que permitem clonar o gene correspondente em um outro organismo. Estas técnicas de rotina de biologia molecular são bem conhecidas pela técnica e são descritas, por exemplo, em Sambrook e al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
[0038] Por «deleção», entende-se, de acordo com a invenção, uma supressão da atividade do gene «deletado». Esta supressão pode ser uma inativação do produto de expressão do dito gene referido, por um meio apropriado, ou ainda a inibição da expressão do gene referido, ou ainda a deleção de ao menos de uma parte do gene referido, de modo que, ou sua expressão não tenha acontecido (por exemplo, deleção de uma parte ou do conjunto da região promotora necessária à sua expressão) ou o produto de expressão tenha perdido a sua função (por exemplo a deleção na parte codificadora do gene referido). De maneira preferencial, a deleção de um gene compreende a supressão do essencial do gene, e se for caso, sua substituição por um gene marcador de seleção que permite facilitar a identificação, o isolamento e a purificação das cepas evoluídas, de acordo com invenção.
[0039] A inativação de um gene faz-se de preferência por recombinação homóloga (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645). O princípio de um protocolo é recordado resumidamente: um fragmento de DNA linear é introduzido na célula, fragmento este, obtido in vitro, compreendendo as duas regiões que flanqueiam o gene, e pelo menos um gene de seleção entre estas duas regiões (geralmente um gene de resistência a um antibiótico), o dito fragmento linear apresentando, então, um gene inativo. As células que sofreram um evento de recombinação e que integrou o fragmento introduzido são selecionadas por deposição em meio seletivo.Selecionam-se, em seguida, as células que sofreram uma ação de dupla recombinação, nas quais o gene nativo foi substituído pelo gene inativo.Este protocolo pode ser melhorado utilizando-se sistemas de seleções positiva e negativa, a fim de acelerar a detecção das ações de duplas recombinações.
[0040] A técnica utilizada preferencialmente para a introdução destes genes na cepa é a eletroporação, técnica bem conhecida pelo especialista. Recordando o protocolo, resumidamente: os genes heterólogos de interesse são clonados em um vetor de expressão entre um promotor e finalizador. Este vetor possui, além disso, um gene de resistência a um antibiótico, a fim de selecionar as células que o contém e uma origem de replicação funcional na cepa coifa para que possa manter-se. O protocolo necessita da preparação de células coifas eletrocompetentes, que são transformadas, em seguida, por electroporação pelo vetor.
[0041] De acordo com a invenção, os genes introduzidos por electroporação são, preferencialmente, os genes adc, ctfA e B, thl codificando, respectivamente, para a acetoacetato carboxilase, a coenzima A transferase e a tiolase da via natural de produção de acetona de Clostridium acetobutylicum, microorganismo reconhecido como extremamente poderosos para a produção de acetona por via biológica.
[0042] O processo de evolução de acordo com a invenção é um processo de preparação de microorganismos evoluídos que permitem uma modificação das vias metabólicas, que compreende preferivelmente as seguintes etapas:
[0043] Modificação de um microorganismo para obter um microorganismo inicial de maneira inibir a produção ou o consumo de um metabólito diferentemente consumido ou produzido quando as células do microorganismo inicial são cultivadas em um meio definido.
[0044] Cultura dos microorganismos iniciais modificados precedentemente obtidos no dito meio definido para fazê-lo evoluir, o meio definido que pode igualmente compreender um co-substrato necessário a esta evolução,
[0045] Seleção das células de microorganismos modificados capazes de desenvolver-se no meio definido, eventualmente com um co-substrato.
[0046] Tal processo de evolução é descrito notadamente no pedido de patente WO 04/076659, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.
[0047] Em espécie, a via metabólica evoluída é a via de biosíntese do 1,2- propanodiol, e se for caso a via de biossíntese da acetona.
[0048] Por «meio definido», entende-se de acordo com a invenção de um meio de composição molecular conhecida, adaptado ao crescimento do microorganismo. O meio definido é substancialmente isento de metabólito que suprime a produção ou o consumo realizando-se a modificação.
[0049] Por «co-substrato», entende-se de acordo com a invenção, uma molécula carbonada ou não, diferente do substrato, que está implicado em uma reação e que fornece um ou mais átomos ao substrato a fim de formar o produto. O co-substrato não tem propriedade mutagênica reconhecida.
[0050] Por «seleção», entende-se de acordo com a invenção, um processo de cultura, eventualmente em contínuo, conduzido aplicando-se taxas de diluição crescentes de tal forma a conservar no meio de cultura apenas os microorganismos que têm uma taxa de crescimento igual ou superior à taxa de diluição imposta. Isto feito, conservam-se os microorganismos que evoluíram de modo que a modificação realizada não afete mais o crescimento.
[0051] Por «gene evoluído», entende-se de acordo com a invenção uma sucessão de ácido nucléico delimitado por um codon start e um codon stop em fase e tendo, proveniente da seleção, ao menos um ácido nucléico diferente em relação à sequência inicial.
[0052] Por «proteína evoluída», entende-se de acordo com a invenção, uma sucessão de ácidos aminados (sequência protéica) tendo, proveniente da seleção, ao menos um ácido aminado diferente em relação à sequência protéica inicial.
[0053] Os genes e proteínas podem ser identificados por suas sequências primárias, mas igualmente homólogas de sequências ou alinhamentos que definem grupos de proteínas.
[0054] Os PFAM (Protein families database of alignments and Hidden Markov Models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representam uma ampla coleção de alinhamentos de sequências protéicas.Cada PFAM permite visualizar alinhamentos múltiplos, de ver domínios protéicos, de avaliar a repartição entre os organismos, de ter acesso às outras bases de dados, de visualizar estruturas conhecidas de proteínas.
[0055] Os COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins; http://www.ncbLnlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando-se as sequências protéicas provenientes de 43 genomas completamente sequenciados que representam 30 linhagens filogenéticos maiores.Cada COG é definido a partir de ao menos três linhagens o que permite assim identificar domínios conservados antigos.
[0056] De acordo com a invenção, os termos «cultura» e «fermentação» são empregados indiferentemente para designar o crescimento da bactéria em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples.
[0057] Por fonte de carbono simples, de acordo com a presente invenção, entendem-se fontes de carbono utilizáveis pelo especialista para o crescimento normal de um microorganismo, de uma bactéria em especial que podem ser arabinose, a frutose, a galactose, a lactose, a maltose, o açúcar e a xilose. Uma fonte de carbono simples muito particularmente preferida é a glicose.
[0058] A definição das condições de cultura dos microorganismos de acordo com a invenção (fermentação) está ao alcance do especialista. Fermentam-se notadamente as bactérias a uma temperatura compreendida entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C, e mais particularmente de cerca de 30°C para C. glutamicum e S. cerevisiae e de cerca de 34°C para E. coli.
[0059] A fermentação é conduzida geralmente em fermentadores com um meio mineral de cultura de composição conhecido definido e adaptado em função das bactérias utilizadas, contendo ao menos uma fonte de carbono simples e se for caso um co-fator necessário para a produção do metabólito.
[0060] Em particular, o meio mineral de cultura para E. coli poderá assim ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad Sci. EUA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou meio tal como um foi definido por Schaefer e al. (1999, Anal Biochem. 270: 88-96), e mais particularmente o meio de cultura mínimo descrito abaixo:o pH do meio é ajustado a 7,4 com a soda.* solução de oligoelemento: Ácido cítrico a 4g/L, Mn S04 a 3g/L, Na CI a 1 g/L, Co CI2 a 0,1 g/L, Zn SO4 a 0,10 g/L, Cu SO4 a 10mg/L, H3 BO3 a 10mg/L, Na Mo 04 a 10mg/L.
[0061] De maneira análoga, o meio mineral de cultura para C. glutamicum poderá assim ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl e al., 1989, Appl. Microbiol.Biotechnol. 32: 205-210) a um meio tal como definido por Riedel e al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).
[0062] A fermentação é realizada de preferência em anaerobiose e quemostaticamente ou seja, alimentada continuamente, a uma taxa de diluição fixa, com o dito meio de cultura mínimo que contém uma concentração em fonte de carbono fixa e sendo desgaseificada ao nitrogênio.
[0063] A concentração em fonte de carbono do meio de alimentação da fermentação é aumentada apenas quando um regime permanente limitado pela concentração em fonte de carbono residual é atingido e estável durante vários dias.
[0064] O modo de cultura quemostático é o modo de cultura preferencial pois é o que favorece a melhoria dos desempenhos de crescimento e de produção em 1,2- propanodiol da cepa modificada e conduzida a isolar os microorganismos evoluídos.
[0065] Por atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada, entende-se de acordo com a invenção, o conjunto das atividades enzimáticas melhoradas implicadas na via de conversão do DHAP em 1,2-propanodiol. A atividade enzimática melhorada no microorganismo evoluído consiste em um aumento da quantidade de 1,2-propanodiol pelo microorganismo evoluído em relação às quantidades produzidas pelo microorganismo inicial correspondente, em condições de cultura idênticas.
[0066] Por atividade «acetona sintase» melhorada, entende-se de acordo com a invenção, o conjunto das atividades enzimáticas melhoradas implicadas na via de conversão do acetato e o acetil-coA em acetona. A atividade enzimática evoluída no microorganismo evoluído de segunda geração consiste em um aumento da quantidade de acetona produzida pelo microorganismo evoluído de segunda geração em relação ao microorganismo evoluído transformado correspondente, nas condições de cultura idênticas.
[0067] A invenção refere-se também ao isolamento e a caracterização dos genes evoluídos nas cepas evoluídas obtidas pelo processo de acordo com a invenção, e as proteínas evoluídas codificadas pelos ditos genes evoluídos. Estes genes evoluídos podem ser introduzidos e em um organisma coifa sob o controle de elementos de regulação apropriados para a sua expressão no dito organismo a fim de permitir a produção da proteína evoluída correspondente.
[0068] A melhoria de desempenhos dos microorganismos modificados, em particular da cepa E. coli MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ao longo da cultura em chemostat, sugere que estas condições de cultura permitem selecionar um complexo piruvato desidrogenase endógena funcional em condições anaerobioses, condições de grandes produções de NADH. Com efeito, sabe-se que o complexo piruvato desidrogenase que catalisa a transformação do piruvato em acetil-CoA liberando-se do NADH é funcional apenas aeróbico, enquanto que quando se está em condição de anaerobiose é o piruvato formato Liase que é funcional e catalisa a transformação do piruvato em acetil-CoA e formato (Snoep J. L., de Graef M. R., Westphal A. H., de Kok A. Teixeira de Mattos o M. J. and Neijssel O. M. (1993)). Ora uma das modificações efetuadas, na cepa modificada de E. coli construída para a produção de 1,2-propanodiol, para produzir o NADH por decarboxilação do piruvato, é a deleção dos genes pfltA e pflB codificando para a atividade piruvato formato Liase. A única possibilidade para a célula modificada é metabolizar o piruvato em acetil-CoA pelo complexo piruvato desidrogenase produzindo-se um NADH. O complexo piruvato desidrogenase da cepa modificada evoluída foi caracterizado e é menos sensível ao NADH do que o complexo piruvato desidrogenase da cepa selvagem.
[0069] A presente invenção conduz à seleção de um complexo piruvato desidrogenase funcional em anaerobiose que permite produzir dois NADH por oxidação do gliceraldeído-3-Fosfato em acetato, NADH que podem ser reoxidados apenas pela via de redução do hidroxiacetona-fosfato em 1,2-propanodiol. A seleção de um complexo enzimático pouco sensível ao NADH favorece a velocidade de produção do 1,2-propanodiol.
[0070] A presente invenção conduzida vantajosamente a seleção de mutações do gene Ipd (cuja sequência selvagem é conhecida hppt//genolist.pasteur.fr/Colibri) codificando para a lipoamida desidrogenase do complexo piruvato desidrogenase. Em particular, a presença de uma mutação pontual que provoca a substituição da alanina 55 por uma valina foi identificada. Esta enzima é conhecida para ser responsável pela inibição do complexo piruvato desidrogenase pelo NADH. Esta enzima modificada é igualmente parte da presente invenção.
[0071] A presente invenção permite melhor os desempenhos dos microorganismos modificados, em particular da cepa E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB igualmente, por evolução, ao longo da cultura anaeróbica quemostática, enzimas endógenos implicadas na via de conversão do DHAP em 1,2-propanodiol. A evolução destas enzimas tem por consequência um aumento da taxa de crescimento e a concentração final em 1,2-propanodiol.
[0072] De maneira preferencial de acordo com invenção, a cepa evoluída não compreende a evolução do gene gldA. De acordo com um modo particular, a cepa de evolução compreende uma deleção do gene gldA.
[0073] Descrição das figuras
[0074] Figura 1: esquema do metabolismo da cepa modificada E. coli para a produção de 1,2-propanodiol e de acetona de acordo com a invenção
[0075] Legenda:
[0076] LDH: lactato desidrogenase
[0077] ADH: aldeído-álcool desidrogenase
[0078] PFL: piruvato formato Liase
[0079] PDHc: complexo piruvato desidrogenase
[0080] Figura 2: Evolução da cepa E. coli MG1655 11 tpiA, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB em cultura quemostática sobre glicose: concentração de glicose (figura 2A) e outros produtos (figura 2B).
[0081] Figura 3: comparação da atividade enzimática do complexo piruvato desidrogenase da cepa selvagem e a cepa evoluída de acordo com a invenção, em função de concentrações crescentes em NADH.
[0082] Os exemplos de realização abaixo permitem ilustrar a invenção, sem buscar limitar seu alcance.
[0083] Exemplo 1: construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB capaz de produzir unicamente o 1,2-propanodiol e o acetato por fermentação da glicose:
[0084] a) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA:: cm:
[0085] A inativação do gene tpiA é realizada inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol ao mesmo tempo, deletando-se a maior parte do gene em causa. A técnica utilizada é descrita por Datsenko, K.A. ; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products. Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645.
[0086] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a substituição do gene tpiA:
[0087] DtpiAr de 100 bases (SEQ ID N° 1):
[0088] atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtt tctaacct gcgtaCATATGMTATCCTCCTTAG
[0089] com:
[0090] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4109007- 4109087) do gene tpiA (sequência 4108320 a 4109087), sequência de referência no sítio http://genolistpasteudr/Colibri/.
[0091] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat/. Acad Sci. USA 97 : 6640-6645)
[0092] DtpiAf de 100 bases (SEQ ID N° 2):
[0093] cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcacc accaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0094] com:
[0095] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4108320- 4108400) do gene tpiA
[0096] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol levada pelo plasmídeo pKD3
[0097] Os oligonucleotídeos DtpiAr e DtpiAf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é então introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) no qual o sistema À Red (Y,β, exo) expresso favorece amplamente recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos cdh e YIIQ.
[0098] cdh (SEQ ID N° 3):
[0099] ggtgatgatagttatcgccg (homóloga a sequência de 4107536 a 4107555)
[0100] YIIQ (SEQ ID N° 4):
[0101] cgtgccatcgacagcagtcc (homóloga a sequência de 4109599 a 4109580)
[0102] O cassete de resistência cloranfenicol é, em seguida, eliminado e depois. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação (Cheperanov P. P. and Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassetes with opção of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158, 9-14). Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente.
[0103] b) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔpIfAB:: cm:
[0104] A inativação dos genes pflA e pflB é realizada inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol ao mesmo tempo deletando-se a maior parte dos genes referidos. A técnica utilizada é descrita por Datsenko, K.A e Wanner, B.L. (2000).
[0105] Dois oligonucleotides são utilizados para realizar a substituição dos genes pflA e pflB:
[0106] DplfB r de 100 bases (SEQ ID N° 5):
[0107] ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgta tcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0108] com:
[0109] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (952235 952315) do gene pflB (sequência 950495 a 952777), sequência de referência no sítio http://genolistpasteur.fr/Colibri/.
[0110] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl Acad Sci. EUA 97: 6640-6645)
[0111] DplfAf de 100 bases (SEQ ID N° 6):
[0112] gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaact caataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
[0113] com:
[0114] uma região (caracteres minúsculas) homóloga a sequência (949470- 949550) situada a montante do gene pflA (sequência de 949563 a 950303)
[0115] uma região (caracteres maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portada pelo plasmídeo pKD3
[0116] Os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) nas qual a enzima Red recombinase expresso permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2.
[0117] pflAB 1 (SEQ ID N° 7):
[0118] agacattaaaaati:1tacgtgcagctacccg (homóloga a sequência de 948462 a 948491)
[0119] pflAB 2 (SEQ ID N° 8):
[0120] gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homólogo a sequência de 953660 a 983689)
[0121] c) construção de uma cepa modificada E. coli MG 1655 ΔtpiA, ΔpIfAB:
[0122] A deleção dos genes pflA e pflb por substituição dos genes por um cassete de resistência ao cloranfenicol na cepa MG1655 ΔtpiA foi realizada pela técnica de transdução com o fago P1. O protocolo é constituído de duas etapas: por um lado, a preparação do Lisado de fago sobre a cepa MG1655 ΔplfAB::cm e por outro lado, transdução da cepa MG1655 ΔtpiA por este Lisado de fago.
[0123] Preparação do Lisado de fago:
[0124] - Semeamento por 100μl de uma cultura a noite da cepa MG 1655 (ΔpIfAB.:cm) de 10 ml LB + Cm 301μg/ml + glicose 0,2% + CaCl2 5 mM
[0125] - Incubação 30 min a 37°C sob agitação
[0126] - adição de 100 μl de Lisado de fago P1 preparado na cepa selvagem MG1655 (cerca de 1.109 fago/ml)
[0127] - Agitação a 37°C durante 3 horas até a lise total das células
[0128] - Adição de 200 μl de clorofórmio e vortex
[0129] - Centrifugação 10 min à 4500g para eliminar os detritos celulares
[0130] - Transferência do sobrenadante em um tubo estéril e adição do 200 μl de clorofórmio
[0131] - Conservação do Lisado a 4°C
[0132] Transdução
[0133] - Centrifugação 10 min à 1500g de 5 ml de uma cultura a noite da cepa MG 1655 (ΔtpiA ) em meio LB
[0134] - Suspensão da pelota celular em 2,5 ml de MgS04 10 mM, CaCI2 5 mM
[0135] - Tubos de controle: 100 μl células
[0136] 1001 μl fagos P1 da cepa MG1655 (ΔpIfAB .:cm)
[0137] - Tubo de ensaio: 100 μl de células + 100 μl de fagos P1 da cepa MG1655 (ΔplfAB.:cm)
[0138] - Incubação 30 min a 30°C sem agitação
[0139] - Adição de 100 μl de citrato de sódio 1 M em cada tubo e depois vortex
[0140] - Adição de 1 ml de LB
[0141] - Incubação 1 hora à 37°C sob agitação
[0142] - Deposição sobre caixas LB + Cm 30 μg/ml após centrifugação 3 min a 7000 vpm dos tubos.
[0143] - Incubação a 37°C até o dia seguinte.
[0144] Verificação da cepa
[0145] Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção da região que contém (pflAB::cm) é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 por um lado, e cdh e YIIQ por outro lado, a fim de verificar igualmente a deleção do gene tpiA na cepa ΔpflAB::cm. A cepa retida é designada MG1655 Δ (pflAB ::cm, ΔtpiA).
[0146] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB.
[0147] d) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔpflAB::cm:b
[0148] como precedentemente a inativação do gene adhE é realizada inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte do gene referido pela técnica descrito por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0149] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0150] DadhE r de 100 bases (SEQ ID N° 9):
[0151] atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatat gccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG
[0152] com:
[0153] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1297263- 1297343) do gene adhE (sequência 1294669 a 1297344), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.frfColibrif).
[0154] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000))
[0155] DadhEf de 100 bases (SEQ ID N° 10):
[0156] caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagc gcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0157] com:
[0158] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1294694- 1294774) do gene adhE
[0159] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0160] Os oligonucleotídeos DadhEr e DadhEf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos ychGf e adhECr.
[0161] ychGf (SEQ ID N° 11):
[0162] ggctcatlgcaccaccatccag (homóloga a sequência de 1294357 a 1294378)
[0163] adhECr (SEQ ID N° 12):
[0164] gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homóloga a sequência de 1297772 a 1297749)
[0165] e) construção de uma cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE:
[0166] A deleção do gene adhE na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB é efetuada como precedentemente com ajuda da técnica transdução com ajuda do fago P1 (ver protocolo ao c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔadhE::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiAΔpflAB é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos ychCf e adhECr para verificar a mutação do gene adhE e também com ajuda dos oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 por um lado, e cdh e YIIQ por outro lado, a fim de verificar igualmente a deleção dos genes fliA e B, e tpiA na cepa ΔadhE::cm.
[0167] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com os mesmos oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é chamada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE.
[0168] f) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana:
[0169] A inativações do gene IdhA (coordenadas 1439878 a 1440867) na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago é realizado com a cepa E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, IdhA::kana fornecido por Clark D.P. (Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli: micropiology, 143, 187-195.). Transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE é realizado com ajuda do Lisado de fago da cepa E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, IdhA::kana. Os transdutantes são selecionados na kanamicina e a inserção do cassete kanamicina no gene IdhA é verificada com ajuda dos oligonucleotídeos hslJC e IdhAC2.
[0170] hslJC (SEQ ID N° 13):
[0171] gccatcagcaggcttagccg (homólogo a sequência 1439345 a 1439767)
[0172] IdhAC2: (SEQ ID N°14):
[0173] gggtattgtggcatgtttaaccg (homólogo a sequência 1441007 a 1441029)
[0174] A cepa obtida é denominada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana.
[0175] g) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔgloA::cm:
[0176] A inativação do gene gloA é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0177] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0178] GLOAD f de 100 bases (SEQ ID N°15):
[0179] atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgg gcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0180] com:
[0181] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1725861- 1725941) do gene gloA (sequência 1725861 a 1726268), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/.
[0182] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, KA. and Wanner, B.L. (2000))
[0183] GLOA 0 R (SEQ ID N°16)
[0184] ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccaca aacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0185] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1726188 - 1726268) do gene gloA (1725861 - 1726268)
[0186] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0187] Os oligonucleotídeos GLOADr e GLOADf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos Nem A C d e Rnt C r.
[0188] NemAQd (SEQ ID N°. 17):
[0189] gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homólogo de 1725331 a 1725361)
[0190] Rnt Cr (SEQ ID N°. 18):
[0191] gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (homólogo à sequência de 1726765 a 1726795)
[0192] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA:
[0193] A inativação do gene gloA na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔgloA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos NemAQd e Rnt Cr para verificar a mutação do gene gloA e também com ajuda dos oligonucleotídeos, pflAB1 e pf1AB2, cdh e YIIQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, a fim de verificar igualmente respectivamente a deleção dos genes pflA e B, tpiA, adhE, e IdhA na cepa ΔgloA::cm.
[0194] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA.
[0195] i) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔaIdA:: cm
[0196] A inativação do gene aIdA é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0197] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0198] AidA D f de 100 bases (SEQ ID N°19)
[0199] atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggat tg atgtggtaGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0200] com:
[0201] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1486256 - 1486336) do gene aIdA (sequência 1486256 - 1487695), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
[0202] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)).
[0203] aIdAD r de 100 bases (SEQ ID N°20)
[0204] ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgcca ataccgg affiCATATGAATATCCTCCTTAG
[0205] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1487615 - 1487695) do gene aIdA (1486256 a 1487695)
[0206] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0207] Os oligonucleotídeos AIdA D r e aIdAD f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e ainserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos Ydc F Cf e gapCCr.
[0208] YdcF Cf. (SEQ ID N° 21):
[0209] tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homólogo de 1485722 a 1485752)
[0210] gapCCr (SEQ ID N° 22):
[0211] cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homólogo a sequência de 1488195 a 1488225)
[0212] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, Alda.
[0213] A inativação do gene aIdA na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo de c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa. MG1655 ΔaIdA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos Ydc F C f e gapCCr para verificar a mutação do gene aIdA e também com ajuda dos oligonucleotídeos, NemAQd e Rnt Cr, pflAB1 e pf1AB2, cdh e YIlQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, a fim de verificar de mesmo modo, respectivamente a deleção dos genes gloA, pflA e B, tpiA, adhE na cepa ΔaIdA::cm.
[0214] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA.
[0215] g) construção de uma cepa modificada E. Coli MG1655 ΔaldB::cm:
[0216] A inativação do gene aldB é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0217] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0218] AldB D f de 100 bases (SEQ ID N°23)
[0219] tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccag catcatctt gtGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0220] com:
[0221] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (3752603 - 3752683) do gene aldB (sequência 3752603 a 3754141), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteudr/Colibril)
[0222] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)).
[0223] aldBD r de 100 bases (SEQ ID N°24):
[0224] atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcc cgctatg acaaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0225] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (3754061 - 3754141) do gene aldB (3752603 a 3754141)
[0226] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3.
[0227] Os oligonucleotídeos AldB D r e aldB D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pkD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pK046) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos aldB Cf e YiaYCr.
[0228] aldB C f (SEQ ID N°. 25):
[0229] catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (homólogo a sequência de 3752057 para 3752095)
[0230] YiaYCr (SEQ ID N°. 26):
[0231] tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homólogo a sequência de 3754644 a 3754674)
[0232] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB.
[0233] A inativação do gene aldB na cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔaldB::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada com ajuda deste lisate. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos aldB C f e YiaYCr para verificar a mutação do gene aldB e também com ajuda dos oligonucleotídeos, a NemAQd e Rnt Cr, pflAB1 e pflAB2, cdh e YIIQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, Ydc F C f e gapCCr, a fim de verificar do mesmo modo, respectivamente a deleção dos genes gloA, pflA e B, tpiA, adhE, aIdA na cepa ΔaldB::cm.
[0234] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é chamada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB.
[0235] Exemplo 2: Cultura e evolução da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB em chemostat:
[0236] Para otimizar a produção de 1,2-propanodiol a partir da glicose pela cepa E. coli MG 16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, uma cultura da cepa quemostática, em um meio de cultura mínimo, suplementado em nitrato de sódio em extrato de levedura, durante várias semanas, é realizada em condição de anaerobiose.
[0237] No início da cultura, a concentração inicial em glicose no bidon de alimentação da cultura é de 20 g/l, a taxa de diluição é de 0,04h-1 e um fluxo de nitrogênio contínuo é mantido para realizar as condições de anaerobiose. A concentração celular e as produções em 1,2-propanodiol e acetato são fracas. Após várias semanas de cultura, o crescimento e as concentrações em produtos aumentam, um regime permanente é atingido caracterizado por uma concentração em glicose residual e concentrações em produtos constantes (figura 2).
[0238] Exemplo 3: Caracterização de um complexo piruvato desidrogenase evoluído pouco sensível ao NADH:
[0239] A evolução do complexo piruvato desidrogenase (PDHc) para um PDHc pouco sensível ao NADH é destacada, ao mesmo tempo, por uma dosagem da atividade da enzima evoluída in vitro, e, por comparação da sequência de um dos genes. (ipd) codificando para a lipoamida desidrogenase do PDHc evoluído com este do gene do PDHc nativo.
[0240] a) dosagem da atividade enzimática do complexo piruvato desidrogenase:
[0241] A dosagem da atividade enzimática do PDHc in vitro da cepa E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é efetuada de acordo com o protocolo descrito por Schwartz e Reed (Schwartz E. R. and Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistry, 6,1434-1439).
[0242] Um volume de 100 ml de cultura celular é retirado do quemostato em frascos previamente desgaseificados e recolocados em uma coifa anaeróbico. As células são centrifugadas 10 minutos a 6000 vpm. A pelota é colocada em suspensão em cerca de 100 ml de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH7.9, 0.5 mM tiamina pirofosfato, e depois centrifugados novamente, 10 minutos a 6000 vpm. A lavagem é efetuada uma segunda vez nas mesmas condições.A pelota celular é colocada em suspensão em 800 μl de tampão.A suspensão celular é desintegrada por meio de um aparelho com ultra-sons em 4 ciclos de tratamento (30 segundos a 30%), entrecortados por 2 minutos de repouso em gelo.Os detritos celulares são eliminados por centrifugação 5 minutos a 13400 vpm, o sobrenadante é o extrato acelular bruto. Os sais presentes no extrato acelular, suscetíveis de interferir na dosagem enzimática são eliminados por passagem do extrato através de uma coluna PD10 equilibrada com o tampão fosfato de potássio pH 7,9, 0,5mM de tiamina pirofosfato. O extrato é eluído com 3,5ml do mesmo tampão que precedentemente. O eluído recuperado é o extrato acelular bruto.
[0243] A atividade enzimática do estrato acelular bruto é medido inicialmente na ausência de NADH, e depois em segundo momento, na presença de concentrações crescentes de NADH de 0.14 mM a 2.7 mM. Os resultados obtidos são comparados com os apresentadas na literatura para a cepa de E. coli selvagem figura n° 3 (Snoep J. L., de Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii and Escherichia coli: implicações for their activity in vivo, FEMS microbiology letters, 114,279-284).
[0244] Os resultados obtidos indicam que o PDHc da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída é menos sensíveis ao NADH que a cepa selvagem de E. coli. Para um relação [NAD+]/[NADH ] = 33, uma inibição total da atividade do PDHc da cepa selvagem é observada, enquanto que 80% da atividade do PDHc evoluída é medida.
[0245] b) Determinação da sequência do gene Ipd codificando para o lipoamida desidrogenase do complexo do desidrogenase da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0246] O DNA cromossômico da cepa E. Coli*MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é extraídos a partir de 1 ml de uma cultura a noite em LB. Após centrifugação, as células são lavadas com a água estéril e depois explodidas por choque térmico 5 minutos a 94°C. O DNA cromossômico é recuperado no sobrenadante após centrifugação. O gene Ipd (sequência 127912 a 129336) codificando para a lipoamida desidrogenase (E3) do complexo piruvato desidrogenase é amplificado por PCR com ajuda dos dois oligonucleotídeos seguintes:
[0247] AceEf (SEQ ID N° 27)
[0248] cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (homólogo a sequência 127504 a 127532)
[0249] YacH r (SEQ ID N° 28)
[0250] aagttcaggagagccgccc (homólogo a sequência 127513 a 129531)
[0251] Um produto PCR de 2000 de pares de bases correspondente ao gene Ipd é obtido e sequenciado. Os resultados obtidos mostram a presença de uma mutação pontual que provoca a substituição alanina 55 por uma valina.
[0252]
[0253] Exemplo 4: A via de conversão do metil glioxal em 1,2-propanodiol da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída não implica o glicerol desidrogenase:
[0254] A fim de mostrar que a melhora dos desempenhos da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída não é ligada a uma evolução do glicerol desidrogenase codificada pelo gene gldA, uma cepa E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída no qual o gene gIdA foi deletado foi construído.
[0255] a) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔgIdA::cm:
[0256] A inativação do gene gldA é realizada como indicado no exemplo 1 inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, em que se deleta a maior parte dos genes ditos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0257] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0258] gldA D f de 100 bases (SEQ ID N° 29)
[0259] gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctga tctggcgt cgcgGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0260] com:
[0261] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4135512 a 4135592) do gene gldA sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).
[0262] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)
[0263] gldA 0 r de 100 bases (SEQ ID N°30):
[0264] atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaa tacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG
[0265] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4136535-- 4136615) do gene gldA (4135512 à 4136615)
[0266] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3.
[0267] Os oligonucleotídeos gldA D r e gldA D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG 1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos YijF D e TalCr.
[0268] YijF D (SEQ ID N° 31):
[0269] gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (homóloga a sequência de 4135140 a 4135174)
[0270] TalCr (SEQ ID N° 32):
[0271] cacgcatattccccattgccgggg (homóloga a sequência de 4137216 a 4137239)
[0272] Um produto PCR de 2100 pb é obtido para o gene selvagem como para o gene deletado e substituído pelo gene de resistência ao cloranfenicol. Também, os produtos PCR obtidos são digeridos e depois pela enzima de restrição Sall. Dois fragmentos de cerca de 1000 pb é obtido para o produto PCR selvagem enquanto que o produto PCR que contém o gene de resistência ao cloranfenicol não é digerido.
[0273] b) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída.
[0274] A inativação do gene gldA na cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída foi realizada como no exemplo 1 com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 galdA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada com ajuda deste lisate. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos YijF D e TalCr para verificar a mutação do gene gldA.
[0275] c) Cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0276] As duas cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída são cultivadas com pH não regulado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio em extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/1 em condição anaerobiose durante 10 dias. O perfil de produtos de fermentação obtido mostra que a deleção do gene gldA não acarreta uma diminuição da produção de 1.2 propanodiol (tabela 1).
[0277] Tabela 1: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0278] Exemplo 5: Melhora do rendimento de conversão da glicose em 1.2 propanodiol por deleção do gene edd codificando para o 6-fosfo-gluconato desidratase na cepa ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída:
[0279] a) construção de uma cepa modificada MG 1655 Δedd::cm:
[0280] A inativação do gene edd é realizada como indicado no exemplo 1 inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0281] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0282] edd D f de 100 bases (SEQ ID N° 33)
[0283] ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattca cgtcctgt tcGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0284] com:
[0285] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1930817 a 4) do gene edd (sequência 1930817 a 1932628), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
[0286] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pkD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L.(2000)
[0287] edd D r de 100 bases (SEQ ID N°34):
[0288] atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatct cgcccggatCATATGAATATCCTTAG
[0289] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1932548 - 1932628) do gene edd (sequência 1930817 a 1932628).
[0290] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portada pelo plasmídeo pkD3
[0291] Os oligonucleotídeos edd D r e edd D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pkD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pK046) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos eda d e zwf r:
[0292] Eda d (SEQ ID N°. 35):
[0293] CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC (homóloga a sequência de 1930439 a 1930462)
[0294] Zwf r (SEQ ID N°. 36):
[0295] GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (homóloga a sequência de 1932968 a 1932996)
[0296] b) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída:
[0297] A inativação do gene edd na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, Δald::cm evoluída foi realizada como no exemplo 1 com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 Δedd::cm, e a transdução da cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos eda d e zwf r para verificar a mutação do gene edd.
[0298] c) Cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0299] As duas cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída são cultivadas com pH não regulado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio e extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/l em condição de anaerobiose durante 10 dias. O perfil de produtos de fermentação obtido mostra que a deleção do gene edd acarreta um aumento do rendimento de conversão da glicose em 1,2-propanodiol de 0,13 g/g a 0,35 g/g (tabela 2). A deleção do gene edd na cepa E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída permite, então, melhorar os desempenhos da cepa.
[0300] Tabela 2: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0301] Exemplo 6: Construção de uma cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) capaz de produzir o 1,2-propanodiol et a acetona:
[0302] O plasmídeo denominado pSOS95T é um vetor recíproco de expressão para E. coli/C. acetobutylicum que leva o operon acetona de Clostridum acetobutylicum constituído de quatro genes adc, ctfAB, thl codificando respectivamente para acetoacetato carboxilase, a coenzima A transferase e a tiolase sob a dependência do promotor tiolase. Estas três enzimas catalisam a transformação do acetil-CoA e o acetato em acetona e dióxido de carbono. O plasmídeo pSOS95T foi obtido por inserção no plasmídeo pSOS95 (Gene bank número de acessão AY187686) do gene thl de C. acetobutylicum codificando para a tiolase, no sítio BamH1 situado entre o promotor tiolase e o gene ctfA. O plasmídeo pSOS95T é introduzido na cepa E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluído por electroporação.
[0303] Células eletrocompetentes da cepa E. coli*MG1655 E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm são preparadas a partir de uma cultura a noite da cepa em LB. Uma cultura de 10 ml LB em erlenmeyer é semeada ao 100o pela cultura à noite e incubada a 37°C. Quando a densidade óptica a 550 nm da cultura atinge um valor compreendido entre 0.4 e 0.6, 1 ml de cultura é centrifugado. As células são lavadas com a água, e depois com uma solução de glicerol a 10%, com de sobrenadantes em 0.05 ml de uma solução de glicerol a 10%. As células são electroporadas imediatamente (25 μF, 200 Q, 2.5KV) (Gene pulsar, Biorad) com 5 μl da preparação plasmídica pSOS95T (Qiagen, Hilden germany). Após 1 hora de expressão fenotípica em meio SOC. (Sambrook J., Fristch E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, N.Y.) a 37°C, os transformantes são selecionados em meio de gelose com carbenicilina 100 μg/ml a 37°C.
[0304] Os transformantes são recolocados em cultura líquida na presença de carbenicilina durante uma noite para realizar uma extração de DNA plasmídica (Qiagen, Hilden Germany) a fim de controlar a presença do plasmídeo pSOS95T e de verificar por digestão enzimática que lhe é correto.
[0305] Exemplo 7: Cultura da cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída capaz de produzir o 1,2-propanodiol e a acetona:
[0306] A cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída é cultivada com pH não controlado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio e extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/l em condição anaerobiose (tabela 3). A dosagem dos produtos de fermentação mostra que a cepa E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída produz uma mistura de 1,2-propanodiol, de acetato e de acetona.
[0307] Quadro 3: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída:
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Claims (8)
1. Processo de preparação de uma cepa de Escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples caracterizado pelo fato de compreender: - a cultura sob pressão de seleção, a pressão de seleção compreendendo aplicar taxas aumentadas de diluição de tal forma que conserva no meio de cultura apenas aqueles micro-organismos que exibem uma taxa de crescimento igual a ou maior do que taxa de diluição imposta em um meio de cultura adequado que compreende uma fonte de carbono simples, de uma cepa bacteriana inicial compreendendo uma deleção dos genes tpiA, pflAB, adhE, ldhA, gloA, aldA e aldB, a fim de fazer evoluir, na cepa inicial, um ou mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP em metilglioxal e depois em 1,2-propanodiol para os genes evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada, e depois - seleciona-se e isola-se a ou as cepas de E. coli evoluídas que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial compreende adicionalmente uma deleção do gene edd.
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa evoluída compreende adicionalmente pelo menos um gene que codifica um complexo piruvato desidrogenase endógeno, compreendendo uma mutação pontual em que a alanina 55 é substituída por valina, tal que referido complexo piruvato desidrogenase é pouco sensível à inibição pelo NADH.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que se introduz na cepa evoluída um ou vários genes heterólogos que codificam uma ou várias enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona, os referidos genes sendo selecionados dentre adc, ctfA e B, e thl de Clostridium acetobutylicum.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cepa evoluída modificada obtida conforme a reivindicação 4 é: - cultivada sob pressão de seleção, a referida pressão de seleção compreendendo aplicar taxas aumentadas de diluição de tal forma que conserva no meio de cultura apenas aqueles micro-organismos que exibem uma taxa de crescimento igual a ou maior do que taxa de diluição imposta em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples, a fim de fazer evoluir, na cepa evoluída modificada, um ou mais genes implicados na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona para uma atividade «acetona sintase» melhorada, e depois - os micro-organismos evoluídos de segunda geração que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada e uma atividade «acetona sintase» melhorada são então selecionados e isolados.
6. Processo de preparação de 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que cultiva-se uma cepa evoluída conforme definida na reivindicação 5, em um meio de cultura adequado contendo uma fonte simples de carbono, e depois recupera-se o 1,2-propanodiol produzido.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que 1,2-propanodiol e acetona são recuperados.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o 1,2-propanodiol e/ou a acetona são purificados.
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