BRPI0506790B1 - processo de preparação de uma cepa de escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples e processo de preparação de 1,2-propanodiol - Google Patents
processo de preparação de uma cepa de escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples e processo de preparação de 1,2-propanodiol Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0506790B1 BRPI0506790B1 BRPI0506790-1A BRPI0506790A BRPI0506790B1 BR PI0506790 B1 BRPI0506790 B1 BR PI0506790B1 BR PI0506790 A BRPI0506790 A BR PI0506790A BR PI0506790 B1 BRPI0506790 B1 BR PI0506790B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- strain
- propanediol
- evolved
- gene
- genes
- Prior art date
Links
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 67
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 29
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 117
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 86
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 51
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N p-hydroxy-phenacyl alcohol Natural products OCC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 claims description 27
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 27
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 claims description 26
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 24
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 24
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 101150090240 edd gene Proteins 0.000 claims description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 13
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101150019439 aldB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101150115690 gloA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 claims description 6
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 claims description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 101150081631 aldA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- 101100385572 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) ctfA gene Proteins 0.000 claims description 2
- -1 pflAB Proteins 0.000 claims description 2
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 abstract description 50
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- ABVQGNDUHAQLBS-UHFFFAOYSA-N 2-oxopropanal propanal Chemical compound CCC=O.CC(=O)C=O ABVQGNDUHAQLBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 57
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 57
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 53
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 53
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 42
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 25
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 20
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 18
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 13
- 101150033931 gldA gene Proteins 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 11
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 11
- 101150049339 pflA gene Proteins 0.000 description 10
- 101100083037 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) act gene Proteins 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001583810 Colibri Species 0.000 description 7
- 101001137986 Mus musculus Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 7
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 7
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 7
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 5
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 5
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 101150032129 egsA gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 4
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- BMIGFEFUTZHBQG-UHFFFAOYSA-N CCCO.CC(C=O)=O Chemical compound CCCO.CC(C=O)=O BMIGFEFUTZHBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M acetoacetate Chemical compound CC(=O)CC([O-])=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010022393 phosphogluconate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 2
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- UQIHHGNTYLFRNX-ALKRTJFJSA-N (2s)-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-2-(2-hydroxypropanoylamino)-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O UQIHHGNTYLFRNX-ALKRTJFJSA-N 0.000 description 1
- BSABBBMNWQWLLU-VKHMYHEASA-N (S)-lactaldehyde Chemical compound C[C@H](O)C=O BSABBBMNWQWLLU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-M (S)-lactate Chemical compound C[C@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-M 0.000 description 1
- WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethanol Chemical compound CC(O)C1=CC=CC=C1 WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017083 AIDA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000186312 Brevibacterium sp. Species 0.000 description 1
- 235000017399 Caesalpinia tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100108073 Drosophila melanogaster Actn gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 230000004619 Entner-Doudoroff pathway Effects 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001130148 Escherichia coli (strain K12) D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical class C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000145710 Gluconobacter sp. Species 0.000 description 1
- 229910003887 H3 BO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010057617 Lactaldehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 101710181816 Pyruvate-formate-lyase deactivase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000388430 Tara Species 0.000 description 1
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241001148118 Xanthomonas sp. Species 0.000 description 1
- OHVGNSMTLSKTGN-BTVCFUMJSA-N [C].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O Chemical compound [C].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O OHVGNSMTLSKTGN-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 241001147717 [Clostridium] sphenoides Species 0.000 description 1
- JABXMSSGPHGCII-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propane-1,2-diol Chemical compound CC(O)=O.CC(O)CO JABXMSSGPHGCII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N alpha-ketodiacetal Natural products O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N alpha-methylbenzylalcohol Natural products CC1=CC=CC=C1CO XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 230000010485 coping Effects 0.000 description 1
- 101150002108 ctfA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 101150017109 fliA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- YUDNQQJOVFPCTF-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetone phosphate Chemical compound CC(=O)COP(O)(O)=O YUDNQQJOVFPCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150050362 thl gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229920006337 unsaturated polyester resin Polymers 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
- C12P7/28—Acetone-containing products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DE UMA CEPA DE MICROORGANISMOS EVOLUÍDOS E DE 1,2- PROPANODIOL, E, CEPA" A invenção refere-se a um novo processo de preparação de um cepa de microorganismos evoluídos para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples, o dito processo compreendendo a cultura sob pressão de seleção em um meio de cultura adequado que compreende uma fonte de carbono simples, de uma cepa bacteriana inicial compreendendo uma deleção do gene tpiA e uma deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanal) em lactato, a fim de fazer evoluir na dita cepa inicial um mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP em metilglioxal e depois em 1,2-propanodiol para os genes evoluídos que têm uma atividade 1,2-propanodiol síntase melhorada, e depois seleciona-se e isola-se a ou as cepas de microorganismos evoluídos que têm uma atividade 1,2 propanodiol síntase melhorada. A invenção refere-se igualmente aos microorganismos iniciais e os microorganismos eveoluidos assim obtidos e um processo de preparação de 1,2-propanodiol e eventualmente de acetona por cultura dos microorganismos evoluídos.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um novo processo de preparação de um microorganismo evoluído para a produção de 1,2-propanodiol, o microorganismo evoluído obtido desta forma e sua utilização para a preparação de 1,2-propanodiol.
[0002] O 1,2-propanodiol ou propileno glicol, diálcool em C3 é um produto químico utilizado em numerosos domínios. É um componente das resinas de poliésteres insaturados; dos detergentes líquidos; dos agentes de resfriamento, anticongelante e de fluidos de antigeadas de aviões.A utilização do propileno glicol está em ascensão desde os anos de 1993-1994 em substituição aos derivados etilênicos, que são reconhecidos como mais tóxicos que os derivados propilênicos.
[0003] O 1,2-propanodiol é atualmente produzido por via química para um processo de hidratação do óxido de propileno utilizando uma grande quantidade de água. A produção de óxido propileno pode ser efetuada de acordo com dois processos: um, que utiliza o epicloridrina, o outro, o hidroperóxido. Estas duas vias utilizam produtos altamente tóxicos. Além disso, a via do hidroperóxido gera co- produtos tais como o ter-butanol ou o 1 fenil etanol, que é necessário valorizar para tornar rentável a produção de óxido propileno. A via química produzida geralmente do 1,2-propanodiol racêmico enquanto existem duas formas de estereoisômeros: o (R) 1,2- propanodiol e o (S) 1,2-propanodiol, cujo interesse para outras aplicações não é negligenciável.
[0004] Estes inconvenientes ligados à produção química do 1,2-propanodiol fazem da via de produção biológica uma alternativa promissora. Vários microorganismos são capazes de produzir naturalmente o (S) ou (R) 1,2-propanodiol a partir do açúcar, tais como a glicose ou a xilose, que são metabolizadas pela via da glicólise, ou ainda, a partir de deoxihexoses que conduzem, então, à formação de (S) 1,2-propanodiol (Cameron D. C. et coll. (1998) Biotechnol. Prog.). Dentre os microorganismos mais eficientes citam-se Clostridium sphenoides (Tran Din K. et colI. 1986) e Thermoanaerobium thermosaccharolyticum (A/taras N. E and Cameron D. C. 2001). Este último é capaz de encerrar vários tipos de açúcares em (R) 1,2-propanodiol com um rendimento que varia de 0.13 a 0.28 g de 1,2-propanodiol produzido/g de glicose consumida. Nestes dois microorganismos, as enzimas responsáveis pela síntese de 1,2-propanodiol não foram identificadas, e a melhoria dos seus desempenhos é limitada pela falta de instrumentos genéticos disponíveis. Além disso, E. coli possui todos os genes necessários para a produção de 1,2-propanodiol, mesmo que E. coli não produza naturalmente o 1,2-propanodiol. Com efeito, o 1,2-propanodiol deve ser produzido a partir de metil glioxal, um composto altamente tóxico para a célula, mesmo a baixa concentração. Também, processos que utilizam cepas de E. coli geneticamente modificadas afim de que elas produzam o 1,2-propanodiol foram descritos notadamente em US 6.303.352, US 6.087.140 e WO 98/37204. Estes processos utilizam notadamente a superexpressão de uma ou mais enzimas implicados na via metabólica de produção do 1,2-propanodiol por clonagem dos seus genes nos plasmídeos e, então, impõem uma pressão de seleção com ajuda de antibióticos. Para melhorar os desempenhos das cepas alguns genes endógenos são igualmente deletados (ver por exemplo, Altaras N. E and Cameron D. C. (2000) Biotechnol Prog. 16, 940-946: Altaras N. E and Cameron D. (1999)Appl Env. Microb., 65, 1180-1185).
[0005] Um processo utilizando um microorganismo evoluído que co-produz o 1,2- propanodiol e a acetona, dois co-produtos vaporizáveis, que até então nunca foi descrito.
[0006] A presente invenção refere-se, então, a um processo de preparação de uma cepa de microorganismos evoluídos para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples, o dito processo compreendendo a cultura sob pressão de seleção em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples, uma cepa bacteriana inicial que compreende uma deleção do gene tpiA e uma deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanol) em lactato, a fim de fazer evoluir na dita cepa inicial um ou mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP metilglioxal e depois em 1,2- propanodiol para genes evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintaxe» melhorada, e depois se seleciona e isola-se a ou as cepas de microorganismos evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintaxe» melhorada.
[0007] O gene tpiA codifica para a triose fosfato isomerase que catalisa a conversão do DHAP de gliceraldeído 3 fosfato. A deleção deste gene tem por objeto assegurar a síntese de uma quantidade suficiente de metil glioxal. Teoricamente, a deleção do gene tpiA deve permitir assegurar que 50% do carbono da glicose metabolizada pelas células sejam afetadas na preparação do metil glioxal a partir do dihidroxi acetonefosfato.
[0008] A deleção de ao menos um gene implicado na conversão do metil glioxal (propanol) em lactato tem por objeto inibir a conversão do metil glioxal em lactato, de modo que o essencial do metil glioxal presente produzido pela cepa inicial, como pela cepa evoluída obtida, seja empregado pela maquinaria celular das ditas cepas para a preparação de 1,2-propanodiol.
[0009] Os genes implicados na conversão do metil glioxal em lactato são escolhidos entre o gene gloA codificante para a glioxilase I (que catalisa a síntese de lactoil glutationa a partir de metilglioxal) e os genes aldA e aldB codificante para uma lactaldeído desidrogenase (que catalisa a síntese de (S) lactato a partir de (S) lactaldeído). De preferência, a cepa inicial compreende a deleção dos três genes gloA, aldA e aldB.
[0010] De modo vantajoso, efetua-se uma modificação suplementar da cepa inicial, que consiste em suprimir as vias naturais de fermentação de glicose que são consumidoras de equivalentes redutores sob a forma NADH a fim de eliminar estas vias metabólicas que competem com a produção 1,2-propanodiol.
[0011] Citar-se-á em especial a deleção do gene IdhA codificando para a lactato desidrogenase que catalisa a síntese de lactato a partir de piruvato, e esta do gene adhE codificando para a álcool-aldeído desidrogenase que catalisa a síntese do etanol a partir de acetil-CoA.
[0012] Do mesmo modo, pode-se obrigar o microorganismo a utilizar o complexo piruvato desidrogenase para produzir, anaerobiose, o acetil-CoA e o NADH a partir do piruvato. Isto pode ser obtido deletando-se os genes pflA e, pflB codificando para o piruvato formato Iiase.
[0013] De acordo com um modo particular de realização da invenção, a cepa inicial compreende igualmente então, uma deleção de ao menos um gene escolhido dentre IdhA, pflA, pflB e adhE, de preferência a deleção dos quatro genes IdhA, pflA, pflB e adhE
[0014] De maneira ainda mais vantajosa, a cepa inicial de acordo com a invenção compreenderá igualmente, pelo menos um gene codificando para uma enzima que favorece em anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato.
[0015] De preferência, a enzima favorece, em anaerobiose, o metabolismo do piruvato para a produção de acetil-CoA e de NADH. Mais preferencialmente, esta enzima é um complexo piruvato desidrogenase.
[0016] De maneira vantajosa, o dito gene codificando para uma enzima que favorece, em anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato é pouco sensível à inibição pelo NADH.
[0017] Este gene pode ser um gene endógeno, codificando para uma proteína endógena, ou ainda um gene exógeno ou heterólogo, codificando para uma enzima endógena ou exógena.
[0018] No caso de um gene endógeno codificando para uma proteína endógena sensível à inibição pelo NADH, o processo de evolução de acordo com a invenção permitirá selecionar as cepas para a atividade «1,2-propanodiol síntese» melhorada cujo dito gene codificando para uma enzima que favorece, anaerobiose, o metabolismo do piruvato em acetato codificado para uma enzima evoluída tornada pouco sensível à inibição pelo NADH.
[0019] De acordo com um outro modo de realização da invenção, pode-se introduzir na cepa inicial um gene heterólogo que codifica para uma enzima pouco sensível à inibição pelo NADH, ou codificando para uma enzima sensível, mas tornada pouco sensível pelo emprego do processo de evolução de acordo com a invenção.
[0020] Além disso, é, igualmente vantajoso, deletar o gene edd codificando para 6-fosfo-gliconata desidratase, primeira enzima implicada na via de Entner Doudoroff, para evitar a metabolização direta da glicose em gliceraldeído-3-fosfato e piruvato e assim forçar a conversão da glicose em 1,2-propanodiol e acetato.
[0021] De modo vantajoso, introduz-se na cepa evoluída, precedentemente isolada, obtida pelo processo de evolução de acordo com a invenção, um ou mais genes heterólogos codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona, para obter uma cepa evoluída modificada.
[0022] Esta nova modificação permite produzir com o 1,2-propanodiol da acetona, co-produzido valorizável. Esta modificação tem, além disso, a vantagem de melhorar os desempenhos de produção em 1,2-propanodiol. Com efeito, o acetato é um composto inibidor do crescimento bacteriano com baixa concentração (15 g/l) e bloqueia rapidamente a evolução dos desempenhos da cepa cultivada quemostaticamente em condições anaeróbicas.
[0023] A introdução na cepa evoluída dos genes codificando para as enzimas que catalisam a transformação do acetato em acetona acarreta uma diminuição da concentração residual em acetato durante a cultura quemostaticamente. Produz-se a acetona, composto muito menos inibidor do crescimento que o acetato, o crescimento da cepa e a produção de 1,2-propanodiol são favorecidos.
[0024] De maneira vantajosa, o ou os genes heterólogos codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato proveniente de C. acetobutylicum. Os genes codificando para uma ou mais enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona podem ser expressos cromossomicamente ou extracromossomicamente. Cromossomicamente, uma ou mais cópias podem ser introduzidos no genoma com ajuda dos métodos de recombinação conhecidos pelo especialista. Extra cromossomicamente, os genes podem ser levados por diferentes tipos de plasmídeos que diferem pela sua origem de replicação, seu número de cópias e sua estabilidade na célula. Podem estar presentes de 1 para 5 cópias, como a 20 ou até mais de 500 cópias que correspondem aos plasmídeos com baixo número de cópias com uma origem de replicação de tipo estrito (pSC101, RK2), aos plasmídeos com baixo número de cópia (pACYC, pRSF1010) ou com grande número de cópias (pSK bluescript II). Os genes podem ser expressos utilizando-se promotores de diferentes forças, indutíveis ou não indutíveis. Podem-se citar, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac, ou outros promotores conhecidos pelo especialista.A expressão dos genes alvos pode ser aumentada ou diminuída pelos elementos que estabilizam ou desestabilizam o RNA mensageiro (Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog., 15, 58-64) ou as proteínas (por exemplo GSTtags, Amersham Biosciences).
[0025] De acordo com um modo preferencial de realização da invenção, cultiva-se a cepa evoluída modificada obtida precedentemente sob pressão de seleção em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples a fim de fazer evoluir na dita cepa evoluída modificada um ou mais genes implicados na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona para uma atividade «acetona sintase» melhorada, e depois selecionam-se e isolam-se, as cepas de microorganismos evoluídos de segunda geração que têm uma atividade «1,2- propanodiol sintase» melhorada e uma atividade «acetona sintase» melhorada.
[0026] A presente invenção refere-se também a uma cepa inicial de acordo com a invenção tal como foi definida acima, a seguir e nos exemplos.
[0027] Ela refere-se, igualmente, a uma cepa evoluída que tem uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada susceptível de ser obtida pelo processo de acordo com a invenção, tal como definido acima, a seguir e nos exemplos, esta definição englobando as cepas evoluídas de segunda geração que têm sobretudo uma atividade «acetona sintase» melhorada.
[0028] A invenção refere-se por fim, a um processo de preparação de 1,2- propanodiol no qual cultiva-se uma cepa evoluída, de acordo com a invenção, em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte simples de carbono, e depois recupera-se o 1,2-propanodiol produzido e se for caso, a acetona, que são eventualmente purificados.
[0029] As cepas de microorganismos modificados, iniciais e evoluídos, de acordo com a invenção, podem ser procarióticas ou eucarióticas, suscetíveis de serem transformadas e cultivadas para permitir a produção de 1,2-propanodiol e se for o caso, de acetona.
[0030] O especialista será, precisamente, capaz de selecionar os ditos microorganismos em face de seus conhecimentos gerais no domínio da biologia celular e molecular, e, se for caso, identificar os genes destes microorganismos que correspondem aos genes de E. coli mencionados precedentemente.
[0031] Por cepa de microorganismo s, entende-se, de acordo com a invenção, um conjunto de microorganismos de uma mesma espécie que compreende ao menos um microorganismo da dita espécie. Assim, as características descritas para a cepa são aplicáveis a cada um dos microorganismos da dita cepa. Do mesmo modo, as características descritas para um dos microorganismos da cepa serão aplicadas ao conjunto dos ditos microorganismos que a compõem.
[0032] Os microorganismos modificados, de acordo com a invenção, são escolhidos dentre as bactérias, as leveduras e os cogumelos, e notadamente esses das seguintes espécies: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
[0033] Em um modo de realização preferida, a cepa bacteriana é uma cepa de Escherichia, em particular de E. coli.Em um outro modo de realização, a cepa bacteriana é uma cepa de Corynebacterium, em especial C. glutamicum.
[0034] Em outro modo de realização, a cepa de levedura é uma cepa de Saccharomyces, em particular S. cerevisiae.
[0035] A invenção é descrita acima, a seguir e nos exemplos, em relação a E. coli. Assim, os genes suscetíveis de serem deletados ou superexpressos para as cepas evoluídas, de acordo com a invenção, são definidos principalmente pelo emprego da denominação do gene de E. coli. Entretanto, este emprego tem uma significação mais geral de acordo com a invenção, e engloba os genes correspondentes de outros microorganismo s. Com efeito, utilizando-se as referências GenBank dos genes de E. coli, o especialista é capaz de determinar os genes equivalentes em outras cepas bacterianas que não o E. coli.
[0036] Os meios de identificação das sequências homólogas e suas porcentagens de homologia são bem conhecidos pelo especialista, compreendendo notadamente os programas BLAST que podem ser utilizados a partir do sítio http://www.ncbLnlm.nih.gov/BLAST/, com os parâmetros indicados por padrão neste sítio. As sequências obtidas podem então ser exploradas (e.g. alinhadas) utilizando- se, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebLac.uklclustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros indicados por padrão nestes sítios.
[0037] Utilizando-se as referências dadas em GenBank para os genes que são conhecidos, o especialista é capaz de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, em cogumelos, mamíferos, plantas, etc.Este trabalho de rotina é vantajosamente efetuado utilizando-se as sequências consensuais que podem ser determinadas realizando-se alinhamentos de sequências com genes provenientes de outros microorganismo s, e desenhando-se sondas degeneradas que permitem clonar o gene correspondente em um outro organismo. Estas técnicas de rotina de biologia molecular são bem conhecidas pela técnica e são descritas, por exemplo, em Sambrook e al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
[0038] Por «deleção», entende-se, de acordo com a invenção, uma supressão da atividade do gene «deletado». Esta supressão pode ser uma inativação do produto de expressão do dito gene referido, por um meio apropriado, ou ainda a inibição da expressão do gene referido, ou ainda a deleção de ao menos de uma parte do gene referido, de modo que, ou sua expressão não tenha acontecido (por exemplo, deleção de uma parte ou do conjunto da região promotora necessária à sua expressão) ou o produto de expressão tenha perdido a sua função (por exemplo a deleção na parte codificadora do gene referido). De maneira preferencial, a deleção de um gene compreende a supressão do essencial do gene, e se for caso, sua substituição por um gene marcador de seleção que permite facilitar a identificação, o isolamento e a purificação das cepas evoluídas, de acordo com invenção.
[0039] A inativação de um gene faz-se de preferência por recombinação homóloga (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645). O princípio de um protocolo é recordado resumidamente: um fragmento de DNA linear é introduzido na célula, fragmento este, obtido in vitro, compreendendo as duas regiões que flanqueiam o gene, e pelo menos um gene de seleção entre estas duas regiões (geralmente um gene de resistência a um antibiótico), o dito fragmento linear apresentando, então, um gene inativo. As células que sofreram um evento de recombinação e que integrou o fragmento introduzido são selecionadas por deposição em meio seletivo.Selecionam-se, em seguida, as células que sofreram uma ação de dupla recombinação, nas quais o gene nativo foi substituído pelo gene inativo.Este protocolo pode ser melhorado utilizando-se sistemas de seleções positiva e negativa, a fim de acelerar a detecção das ações de duplas recombinações.
[0040] A técnica utilizada preferencialmente para a introdução destes genes na cepa é a eletroporação, técnica bem conhecida pelo especialista. Recordando o protocolo, resumidamente: os genes heterólogos de interesse são clonados em um vetor de expressão entre um promotor e finalizador. Este vetor possui, além disso, um gene de resistência a um antibiótico, a fim de selecionar as células que o contém e uma origem de replicação funcional na cepa coifa para que possa manter-se. O protocolo necessita da preparação de células coifas eletrocompetentes, que são transformadas, em seguida, por electroporação pelo vetor.
[0041] De acordo com a invenção, os genes introduzidos por electroporação são, preferencialmente, os genes adc, ctfA e B, thl codificando, respectivamente, para a acetoacetato carboxilase, a coenzima A transferase e a tiolase da via natural de produção de acetona de Clostridium acetobutylicum, microorganismo reconhecido como extremamente poderosos para a produção de acetona por via biológica.
[0042] O processo de evolução de acordo com a invenção é um processo de preparação de microorganismos evoluídos que permitem uma modificação das vias metabólicas, que compreende preferivelmente as seguintes etapas:
[0043] Modificação de um microorganismo para obter um microorganismo inicial de maneira inibir a produção ou o consumo de um metabólito diferentemente consumido ou produzido quando as células do microorganismo inicial são cultivadas em um meio definido.
[0044] Cultura dos microorganismos iniciais modificados precedentemente obtidos no dito meio definido para fazê-lo evoluir, o meio definido que pode igualmente compreender um co-substrato necessário a esta evolução,
[0045] Seleção das células de microorganismos modificados capazes de desenvolver-se no meio definido, eventualmente com um co-substrato.
[0046] Tal processo de evolução é descrito notadamente no pedido de patente WO 04/076659, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.
[0047] Em espécie, a via metabólica evoluída é a via de biosíntese do 1,2- propanodiol, e se for caso a via de biossíntese da acetona.
[0048] Por «meio definido», entende-se de acordo com a invenção de um meio de composição molecular conhecida, adaptado ao crescimento do microorganismo. O meio definido é substancialmente isento de metabólito que suprime a produção ou o consumo realizando-se a modificação.
[0049] Por «co-substrato», entende-se de acordo com a invenção, uma molécula carbonada ou não, diferente do substrato, que está implicado em uma reação e que fornece um ou mais átomos ao substrato a fim de formar o produto. O co-substrato não tem propriedade mutagênica reconhecida.
[0050] Por «seleção», entende-se de acordo com a invenção, um processo de cultura, eventualmente em contínuo, conduzido aplicando-se taxas de diluição crescentes de tal forma a conservar no meio de cultura apenas os microorganismos que têm uma taxa de crescimento igual ou superior à taxa de diluição imposta. Isto feito, conservam-se os microorganismos que evoluíram de modo que a modificação realizada não afete mais o crescimento.
[0051] Por «gene evoluído», entende-se de acordo com a invenção uma sucessão de ácido nucléico delimitado por um codon start e um codon stop em fase e tendo, proveniente da seleção, ao menos um ácido nucléico diferente em relação à sequência inicial.
[0052] Por «proteína evoluída», entende-se de acordo com a invenção, uma sucessão de ácidos aminados (sequência protéica) tendo, proveniente da seleção, ao menos um ácido aminado diferente em relação à sequência protéica inicial.
[0053] Os genes e proteínas podem ser identificados por suas sequências primárias, mas igualmente homólogas de sequências ou alinhamentos que definem grupos de proteínas.
[0054] Os PFAM (Protein families database of alignments and Hidden Markov Models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representam uma ampla coleção de alinhamentos de sequências protéicas.Cada PFAM permite visualizar alinhamentos múltiplos, de ver domínios protéicos, de avaliar a repartição entre os organismos, de ter acesso às outras bases de dados, de visualizar estruturas conhecidas de proteínas.
[0055] Os COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins; http://www.ncbLnlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando-se as sequências protéicas provenientes de 43 genomas completamente sequenciados que representam 30 linhagens filogenéticos maiores.Cada COG é definido a partir de ao menos três linhagens o que permite assim identificar domínios conservados antigos.
[0056] De acordo com a invenção, os termos «cultura» e «fermentação» são empregados indiferentemente para designar o crescimento da bactéria em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples.
[0057] Por fonte de carbono simples, de acordo com a presente invenção, entendem-se fontes de carbono utilizáveis pelo especialista para o crescimento normal de um microorganismo, de uma bactéria em especial que podem ser arabinose, a frutose, a galactose, a lactose, a maltose, o açúcar e a xilose. Uma fonte de carbono simples muito particularmente preferida é a glicose.
[0058] A definição das condições de cultura dos microorganismos de acordo com a invenção (fermentação) está ao alcance do especialista. Fermentam-se notadamente as bactérias a uma temperatura compreendida entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C, e mais particularmente de cerca de 30°C para C. glutamicum e S. cerevisiae e de cerca de 34°C para E. coli.
[0059] A fermentação é conduzida geralmente em fermentadores com um meio mineral de cultura de composição conhecido definido e adaptado em função das bactérias utilizadas, contendo ao menos uma fonte de carbono simples e se for caso um co-fator necessário para a produção do metabólito.
[0060] Em particular, o meio mineral de cultura para E. coli poderá assim ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad Sci. EUA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou meio tal como um foi definido por Schaefer e al. (1999, Anal Biochem. 270: 88-96), e mais particularmente o meio de cultura mínimo descrito abaixo:
o pH do meio é ajustado a 7,4 com a soda.* solução de oligoelemento: Ácido cítrico a 4g/L, Mn S04 a 3g/L, Na CI a 1 g/L, Co CI2 a 0,1 g/L, Zn SO4 a 0,10 g/L, Cu SO4 a 10mg/L, H3 BO3 a 10mg/L, Na Mo 04 a 10mg/L.
[0061] De maneira análoga, o meio mineral de cultura para C. glutamicum poderá assim ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl e al., 1989, Appl. Microbiol.Biotechnol. 32: 205-210) a um meio tal como definido por Riedel e al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).
[0062] A fermentação é realizada de preferência em anaerobiose e quemostaticamente ou seja, alimentada continuamente, a uma taxa de diluição fixa, com o dito meio de cultura mínimo que contém uma concentração em fonte de carbono fixa e sendo desgaseificada ao nitrogênio.
[0063] A concentração em fonte de carbono do meio de alimentação da fermentação é aumentada apenas quando um regime permanente limitado pela concentração em fonte de carbono residual é atingido e estável durante vários dias.
[0064] O modo de cultura quemostático é o modo de cultura preferencial pois é o que favorece a melhoria dos desempenhos de crescimento e de produção em 1,2- propanodiol da cepa modificada e conduzida a isolar os microorganismos evoluídos.
[0065] Por atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada, entende-se de acordo com a invenção, o conjunto das atividades enzimáticas melhoradas implicadas na via de conversão do DHAP em 1,2-propanodiol. A atividade enzimática melhorada no microorganismo evoluído consiste em um aumento da quantidade de 1,2-propanodiol pelo microorganismo evoluído em relação às quantidades produzidas pelo microorganismo inicial correspondente, em condições de cultura idênticas.
[0066] Por atividade «acetona sintase» melhorada, entende-se de acordo com a invenção, o conjunto das atividades enzimáticas melhoradas implicadas na via de conversão do acetato e o acetil-coA em acetona. A atividade enzimática evoluída no microorganismo evoluído de segunda geração consiste em um aumento da quantidade de acetona produzida pelo microorganismo evoluído de segunda geração em relação ao microorganismo evoluído transformado correspondente, nas condições de cultura idênticas.
[0067] A invenção refere-se também ao isolamento e a caracterização dos genes evoluídos nas cepas evoluídas obtidas pelo processo de acordo com a invenção, e as proteínas evoluídas codificadas pelos ditos genes evoluídos. Estes genes evoluídos podem ser introduzidos e em um organisma coifa sob o controle de elementos de regulação apropriados para a sua expressão no dito organismo a fim de permitir a produção da proteína evoluída correspondente.
[0068] A melhoria de desempenhos dos microorganismos modificados, em particular da cepa E. coli MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ao longo da cultura em chemostat, sugere que estas condições de cultura permitem selecionar um complexo piruvato desidrogenase endógena funcional em condições anaerobioses, condições de grandes produções de NADH. Com efeito, sabe-se que o complexo piruvato desidrogenase que catalisa a transformação do piruvato em acetil-CoA liberando-se do NADH é funcional apenas aeróbico, enquanto que quando se está em condição de anaerobiose é o piruvato formato Liase que é funcional e catalisa a transformação do piruvato em acetil-CoA e formato (Snoep J. L., de Graef M. R., Westphal A. H., de Kok A. Teixeira de Mattos o M. J. and Neijssel O. M. (1993)). Ora uma das modificações efetuadas, na cepa modificada de E. coli construída para a produção de 1,2-propanodiol, para produzir o NADH por decarboxilação do piruvato, é a deleção dos genes pfltA e pflB codificando para a atividade piruvato formato Liase. A única possibilidade para a célula modificada é metabolizar o piruvato em acetil-CoA pelo complexo piruvato desidrogenase produzindo-se um NADH. O complexo piruvato desidrogenase da cepa modificada evoluída foi caracterizado e é menos sensível ao NADH do que o complexo piruvato desidrogenase da cepa selvagem.
[0069] A presente invenção conduz à seleção de um complexo piruvato desidrogenase funcional em anaerobiose que permite produzir dois NADH por oxidação do gliceraldeído-3-Fosfato em acetato, NADH que podem ser reoxidados apenas pela via de redução do hidroxiacetona-fosfato em 1,2-propanodiol. A seleção de um complexo enzimático pouco sensível ao NADH favorece a velocidade de produção do 1,2-propanodiol.
[0070] A presente invenção conduzida vantajosamente a seleção de mutações do gene Ipd (cuja sequência selvagem é conhecida hppt//genolist.pasteur.fr/Colibri) codificando para a lipoamida desidrogenase do complexo piruvato desidrogenase. Em particular, a presença de uma mutação pontual que provoca a substituição da alanina 55 por uma valina foi identificada. Esta enzima é conhecida para ser responsável pela inibição do complexo piruvato desidrogenase pelo NADH. Esta enzima modificada é igualmente parte da presente invenção.
[0071] A presente invenção permite melhor os desempenhos dos microorganismos modificados, em particular da cepa E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB igualmente, por evolução, ao longo da cultura anaeróbica quemostática, enzimas endógenos implicadas na via de conversão do DHAP em 1,2-propanodiol. A evolução destas enzimas tem por consequência um aumento da taxa de crescimento e a concentração final em 1,2-propanodiol.
[0072] De maneira preferencial de acordo com invenção, a cepa evoluída não compreende a evolução do gene gldA. De acordo com um modo particular, a cepa de evolução compreende uma deleção do gene gldA.
[0073] Descrição das figuras
[0074] Figura 1: esquema do metabolismo da cepa modificada E. coli para a produção de 1,2-propanodiol e de acetona de acordo com a invenção
[0075] Legenda:
[0076] LDH: lactato desidrogenase
[0077] ADH: aldeído-álcool desidrogenase
[0078] PFL: piruvato formato Liase
[0079] PDHc: complexo piruvato desidrogenase
[0080] Figura 2: Evolução da cepa E. coli MG1655 11 tpiA, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB em cultura quemostática sobre glicose: concentração de glicose (figura 2A) e outros produtos (figura 2B).
[0081] Figura 3: comparação da atividade enzimática do complexo piruvato desidrogenase da cepa selvagem e a cepa evoluída de acordo com a invenção, em função de concentrações crescentes em NADH.
[0082] Os exemplos de realização abaixo permitem ilustrar a invenção, sem buscar limitar seu alcance.
[0083] Exemplo 1: construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA :: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB capaz de produzir unicamente o 1,2-propanodiol e o acetato por fermentação da glicose:
[0084] a) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA:: cm:
[0085] A inativação do gene tpiA é realizada inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol ao mesmo tempo, deletando-se a maior parte do gene em causa. A técnica utilizada é descrita por Datsenko, K.A. ; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products. Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645.
[0086] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a substituição do gene tpiA:
[0087] DtpiAr de 100 bases (SEQ ID N° 1):
[0088] atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtt tctaacct gcgtaCATATGMTATCCTCCTTAG
[0089] com:
[0090] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4109007- 4109087) do gene tpiA (sequência 4108320 a 4109087), sequência de referência no sítio http://genolistpasteudr/Colibri/.
[0091] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat/. Acad Sci. USA 97 : 6640-6645)
[0092] DtpiAf de 100 bases (SEQ ID N° 2):
[0093] cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcacc accaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0094] com:
[0095] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4108320- 4108400) do gene tpiA
[0096] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol levada pelo plasmídeo pKD3
[0097] Os oligonucleotídeos DtpiAr e DtpiAf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é então introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) no qual o sistema À Red (Y,β, exo) expresso favorece amplamente recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos cdh e YIIQ.
[0098] cdh (SEQ ID N° 3):
[0099] ggtgatgatagttatcgccg (homóloga a sequência de 4107536 a 4107555)
[0100] YIIQ (SEQ ID N° 4):
[0101] cgtgccatcgacagcagtcc (homóloga a sequência de 4109599 a 4109580)
[0102] O cassete de resistência cloranfenicol é, em seguida, eliminado e depois. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação (Cheperanov P. P. and Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassetes with opção of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158, 9-14). Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente.
[0103] b) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔpIfAB:: cm:
[0104] A inativação dos genes pflA e pflB é realizada inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol ao mesmo tempo deletando-se a maior parte dos genes referidos. A técnica utilizada é descrita por Datsenko, K.A e Wanner, B.L. (2000).
[0105] Dois oligonucleotides são utilizados para realizar a substituição dos genes pflA e pflB:
[0106] DplfB r de 100 bases (SEQ ID N° 5):
[0107] ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgta tcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0108] com:
[0109] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (952235 952315) do gene pflB (sequência 950495 a 952777), sequência de referência no sítio http://genolistpasteur.fr/Colibri/.
[0110] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl Acad Sci. EUA 97: 6640-6645)
[0111] DplfAf de 100 bases (SEQ ID N° 6):
[0112] gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaact caataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
[0113] com:
[0114] uma região (caracteres minúsculas) homóloga a sequência (949470- 949550) situada a montante do gene pflA (sequência de 949563 a 950303)
[0115] uma região (caracteres maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portada pelo plasmídeo pKD3
[0116] Os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) nas qual a enzima Red recombinase expresso permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2.
[0117] pflAB 1 (SEQ ID N° 7):
[0118] agacattaaaaati:1tacgtgcagctacccg (homóloga a sequência de 948462 a 948491)
[0119] pflAB 2 (SEQ ID N° 8):
[0120] gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homólogo a sequência de 953660 a 983689)
[0121] c) construção de uma cepa modificada E. coli MG 1655 ΔtpiA, ΔpIfAB:
[0122] A deleção dos genes pflA e pflb por substituição dos genes por um cassete de resistência ao cloranfenicol na cepa MG1655 ΔtpiA foi realizada pela técnica de transdução com o fago P1. O protocolo é constituído de duas etapas: por um lado, a preparação do Lisado de fago sobre a cepa MG1655 ΔplfAB::cm e por outro lado, transdução da cepa MG1655 ΔtpiA por este Lisado de fago.
[0123] Preparação do Lisado de fago:
[0124] - Semeamento por 100μl de uma cultura a noite da cepa MG 1655 (ΔpIfAB.:cm) de 10 ml LB + Cm 301μg/ml + glicose 0,2% + CaCl2 5 mM
[0125] - Incubação 30 min a 37°C sob agitação
[0126] - adição de 100 μl de Lisado de fago P1 preparado na cepa selvagem MG1655 (cerca de 1.109 fago/ml)
[0127] - Agitação a 37°C durante 3 horas até a lise total das células
[0128] - Adição de 200 μl de clorofórmio e vortex
[0129] - Centrifugação 10 min à 4500g para eliminar os detritos celulares
[0130] - Transferência do sobrenadante em um tubo estéril e adição do 200 μl de clorofórmio
[0131] - Conservação do Lisado a 4°C
[0132] Transdução
[0133] - Centrifugação 10 min à 1500g de 5 ml de uma cultura a noite da cepa MG 1655 (ΔtpiA ) em meio LB
[0134] - Suspensão da pelota celular em 2,5 ml de MgS04 10 mM, CaCI2 5 mM
[0135] - Tubos de controle: 100 μl células
[0136] 1001 μl fagos P1 da cepa MG1655 (ΔpIfAB .:cm)
[0137] - Tubo de ensaio: 100 μl de células + 100 μl de fagos P1 da cepa MG1655 (ΔplfAB.:cm)
[0138] - Incubação 30 min a 30°C sem agitação
[0139] - Adição de 100 μl de citrato de sódio 1 M em cada tubo e depois vortex
[0140] - Adição de 1 ml de LB
[0141] - Incubação 1 hora à 37°C sob agitação
[0142] - Deposição sobre caixas LB + Cm 30 μg/ml após centrifugação 3 min a 7000 vpm dos tubos.
[0143] - Incubação a 37°C até o dia seguinte.
[0144] Verificação da cepa
[0145] Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção da região que contém (pflAB::cm) é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 por um lado, e cdh e YIIQ por outro lado, a fim de verificar igualmente a deleção do gene tpiA na cepa ΔpflAB::cm. A cepa retida é designada MG1655 Δ (pflAB ::cm, ΔtpiA).
[0146] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB.
[0147] d) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔpflAB::cm:b
[0148] como precedentemente a inativação do gene adhE é realizada inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte do gene referido pela técnica descrito por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0149] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0150] DadhE r de 100 bases (SEQ ID N° 9):
[0151] atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatat gccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG
[0152] com:
[0153] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1297263- 1297343) do gene adhE (sequência 1294669 a 1297344), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.frfColibrif).
[0154] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000))
[0155] DadhEf de 100 bases (SEQ ID N° 10):
[0156] caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagc gcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0157] com:
[0158] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1294694- 1294774) do gene adhE
[0159] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0160] Os oligonucleotídeos DadhEr e DadhEf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos ychGf e adhECr.
[0161] ychGf (SEQ ID N° 11):
[0162] ggctcatlgcaccaccatccag (homóloga a sequência de 1294357 a 1294378)
[0163] adhECr (SEQ ID N° 12):
[0164] gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homóloga a sequência de 1297772 a 1297749)
[0165] e) construção de uma cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE:
[0166] A deleção do gene adhE na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB é efetuada como precedentemente com ajuda da técnica transdução com ajuda do fago P1 (ver protocolo ao c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔadhE::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiAΔpflAB é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos ychCf e adhECr para verificar a mutação do gene adhE e também com ajuda dos oligonucleotídeos pflAB1 e pflAB2 por um lado, e cdh e YIIQ por outro lado, a fim de verificar igualmente a deleção dos genes fliA e B, e tpiA na cepa ΔadhE::cm.
[0167] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com os mesmos oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é chamada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE.
[0168] f) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana:
[0169] A inativações do gene IdhA (coordenadas 1439878 a 1440867) na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago é realizado com a cepa E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, IdhA::kana fornecido por Clark D.P. (Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli: micropiology, 143, 187-195.). Transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE é realizado com ajuda do Lisado de fago da cepa E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, IdhA::kana. Os transdutantes são selecionados na kanamicina e a inserção do cassete kanamicina no gene IdhA é verificada com ajuda dos oligonucleotídeos hslJC e IdhAC2.
[0170] hslJC (SEQ ID N° 13):
[0171] gccatcagcaggcttagccg (homólogo a sequência 1439345 a 1439767)
[0172] IdhAC2: (SEQ ID N°14):
[0173] gggtattgtggcatgtttaaccg (homólogo a sequência 1441007 a 1441029)
[0174] A cepa obtida é denominada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana.
[0175] g) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔgloA::cm:
[0176] A inativação do gene gloA é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0177] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0178] GLOAD f de 100 bases (SEQ ID N°15):
[0179] atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgg gcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[0180] com:
[0181] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1725861- 1725941) do gene gloA (sequência 1725861 a 1726268), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/.
[0182] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, KA. and Wanner, B.L. (2000))
[0183] GLOA 0 R (SEQ ID N°16)
[0184] ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccaca aacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0185] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1726188 - 1726268) do gene gloA (1725861 - 1726268)
[0186] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0187] Os oligonucleotídeos GLOADr e GLOADf são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos Nem A C d e Rnt C r.
[0188] NemAQd (SEQ ID N°. 17):
[0189] gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homólogo de 1725331 a 1725361)
[0190] Rnt Cr (SEQ ID N°. 18):
[0191] gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (homólogo à sequência de 1726765 a 1726795)
[0192] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA:
[0193] A inativação do gene gloA na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔgloA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos NemAQd e Rnt Cr para verificar a mutação do gene gloA e também com ajuda dos oligonucleotídeos, pflAB1 e pf1AB2, cdh e YIIQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, a fim de verificar igualmente respectivamente a deleção dos genes pflA e B, tpiA, adhE, e IdhA na cepa ΔgloA::cm.
[0194] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA.
[0195] i) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔaIdA:: cm
[0196] A inativação do gene aIdA é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000).
[0197] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0198] AidA D f de 100 bases (SEQ ID N°19)
[0199] atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggat tg atgtggtaGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0200] com:
[0201] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1486256 - 1486336) do gene aIdA (sequência 1486256 - 1487695), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
[0202] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)).
[0203] aIdAD r de 100 bases (SEQ ID N°20)
[0204] ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgcca ataccgg affiCATATGAATATCCTCCTTAG
[0205] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1487615 - 1487695) do gene aIdA (1486256 a 1487695)
[0206] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3
[0207] Os oligonucleotídeos AIdA D r e aIdAD f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e ainserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos Ydc F Cf e gapCCr.
[0208] YdcF Cf. (SEQ ID N° 21):
[0209] tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homólogo de 1485722 a 1485752)
[0210] gapCCr (SEQ ID N° 22):
[0211] cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homólogo a sequência de 1488195 a 1488225)
[0212] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, Alda.
[0213] A inativação do gene aIdA na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo de c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa. MG1655 ΔaIdA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos Ydc F C f e gapCCr para verificar a mutação do gene aIdA e também com ajuda dos oligonucleotídeos, NemAQd e Rnt Cr, pflAB1 e pf1AB2, cdh e YIlQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, a fim de verificar de mesmo modo, respectivamente a deleção dos genes gloA, pflA e B, tpiA, adhE na cepa ΔaIdA::cm.
[0214] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é denominada MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA.
[0215] g) construção de uma cepa modificada E. Coli MG1655 ΔaldB::cm:
[0216] A inativação do gene aldB é realizada como precedentemente inserindo-se um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0217] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0218] AldB D f de 100 bases (SEQ ID N°23)
[0219] tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccag catcatctt gtGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0220] com:
[0221] uma região (caracteres minúsculos) homóloga à sequência (3752603 - 3752683) do gene aldB (sequência 3752603 a 3754141), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteudr/Colibril)
[0222] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)).
[0223] aldBD r de 100 bases (SEQ ID N°24):
[0224] atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcc cgctatg acaaCATATGAATATCCTCCTTAG
[0225] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (3754061 - 3754141) do gene aldB (3752603 a 3754141)
[0226] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portado pelo plasmídeo pKD3.
[0227] Os oligonucleotídeos AldB D r e aldB D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pkD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pK046) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos aldB Cf e YiaYCr.
[0228] aldB C f (SEQ ID N°. 25):
[0229] catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (homólogo a sequência de 3752057 para 3752095)
[0230] YiaYCr (SEQ ID N°. 26):
[0231] tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homólogo a sequência de 3754644 a 3754674)
[0232] h) construção de uma cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB.
[0233] A inativação do gene aldB na cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada como precedentemente com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 ΔaldB::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada com ajuda deste lisate. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos aldB C f e YiaYCr para verificar a mutação do gene aldB e também com ajuda dos oligonucleotídeos, a NemAQd e Rnt Cr, pflAB1 e pflAB2, cdh e YIIQ, ychCf e adhECr, hslJC e IdhAC2, Ydc F C f e gapCCr, a fim de verificar do mesmo modo, respectivamente a deleção dos genes gloA, pflA e B, tpiA, adhE, aIdA na cepa ΔaldB::cm.
[0234] Como precedentemente, o cassete de resistência ao cloranfenicol é, em seguida, eliminado. O plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP que age ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, então, introduzido nas cepas recombinantes por electroporação. Após uma série de cultura a 42°C, a perda do cassete de resistência ao antibiótico é verificada por uma análise PCR com mesmos os oligonucleotídeos que esses utilizados precedentemente. A cepa obtida é chamada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB.
[0235] Exemplo 2: Cultura e evolução da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB em chemostat:
[0236] Para otimizar a produção de 1,2-propanodiol a partir da glicose pela cepa E. coli MG 16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, uma cultura da cepa quemostática, em um meio de cultura mínimo, suplementado em nitrato de sódio em extrato de levedura, durante várias semanas, é realizada em condição de anaerobiose.
[0237] No início da cultura, a concentração inicial em glicose no bidon de alimentação da cultura é de 20 g/l, a taxa de diluição é de 0,04h-1 e um fluxo de nitrogênio contínuo é mantido para realizar as condições de anaerobiose. A concentração celular e as produções em 1,2-propanodiol e acetato são fracas. Após várias semanas de cultura, o crescimento e as concentrações em produtos aumentam, um regime permanente é atingido caracterizado por uma concentração em glicose residual e concentrações em produtos constantes (figura 2).
[0238] Exemplo 3: Caracterização de um complexo piruvato desidrogenase evoluído pouco sensível ao NADH:
[0239] A evolução do complexo piruvato desidrogenase (PDHc) para um PDHc pouco sensível ao NADH é destacada, ao mesmo tempo, por uma dosagem da atividade da enzima evoluída in vitro, e, por comparação da sequência de um dos genes. (ipd) codificando para a lipoamida desidrogenase do PDHc evoluído com este do gene do PDHc nativo.
[0240] a) dosagem da atividade enzimática do complexo piruvato desidrogenase:
[0241] A dosagem da atividade enzimática do PDHc in vitro da cepa E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é efetuada de acordo com o protocolo descrito por Schwartz e Reed (Schwartz E. R. and Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistry, 6,1434-1439).
[0242] Um volume de 100 ml de cultura celular é retirado do quemostato em frascos previamente desgaseificados e recolocados em uma coifa anaeróbico. As células são centrifugadas 10 minutos a 6000 vpm. A pelota é colocada em suspensão em cerca de 100 ml de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH7.9, 0.5 mM tiamina pirofosfato, e depois centrifugados novamente, 10 minutos a 6000 vpm. A lavagem é efetuada uma segunda vez nas mesmas condições.A pelota celular é colocada em suspensão em 800 μl de tampão.A suspensão celular é desintegrada por meio de um aparelho com ultra-sons em 4 ciclos de tratamento (30 segundos a 30%), entrecortados por 2 minutos de repouso em gelo.Os detritos celulares são eliminados por centrifugação 5 minutos a 13400 vpm, o sobrenadante é o extrato acelular bruto. Os sais presentes no extrato acelular, suscetíveis de interferir na dosagem enzimática são eliminados por passagem do extrato através de uma coluna PD10 equilibrada com o tampão fosfato de potássio pH 7,9, 0,5mM de tiamina pirofosfato. O extrato é eluído com 3,5ml do mesmo tampão que precedentemente. O eluído recuperado é o extrato acelular bruto.
[0243] A atividade enzimática do estrato acelular bruto é medido inicialmente na ausência de NADH, e depois em segundo momento, na presença de concentrações crescentes de NADH de 0.14 mM a 2.7 mM. Os resultados obtidos são comparados com os apresentadas na literatura para a cepa de E. coli selvagem figura n° 3 (Snoep J. L., de Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii and Escherichia coli: implicações for their activity in vivo, FEMS microbiology letters, 114,279-284).
[0244] Os resultados obtidos indicam que o PDHc da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída é menos sensíveis ao NADH que a cepa selvagem de E. coli. Para um relação [NAD+]/[NADH ] = 33, uma inibição total da atividade do PDHc da cepa selvagem é observada, enquanto que 80% da atividade do PDHc evoluída é medida.
[0245] b) Determinação da sequência do gene Ipd codificando para o lipoamida desidrogenase do complexo do desidrogenase da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0246] O DNA cromossômico da cepa E. Coli*MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é extraídos a partir de 1 ml de uma cultura a noite em LB. Após centrifugação, as células são lavadas com a água estéril e depois explodidas por choque térmico 5 minutos a 94°C. O DNA cromossômico é recuperado no sobrenadante após centrifugação. O gene Ipd (sequência 127912 a 129336) codificando para a lipoamida desidrogenase (E3) do complexo piruvato desidrogenase é amplificado por PCR com ajuda dos dois oligonucleotídeos seguintes:
[0247] AceEf (SEQ ID N° 27)
[0248] cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (homólogo a sequência 127504 a 127532)
[0249] YacH r (SEQ ID N° 28)
[0250] aagttcaggagagccgccc (homólogo a sequência 127513 a 129531)
[0251] Um produto PCR de 2000 de pares de bases correspondente ao gene Ipd é obtido e sequenciado. Os resultados obtidos mostram a presença de uma mutação pontual que provoca a substituição alanina 55 por uma valina.
[0252]
[0253] Exemplo 4: A via de conversão do metil glioxal em 1,2-propanodiol da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída não implica o glicerol desidrogenase:
[0254] A fim de mostrar que a melhora dos desempenhos da cepa modificada E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída não é ligada a uma evolução do glicerol desidrogenase codificada pelo gene gldA, uma cepa E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída no qual o gene gIdA foi deletado foi construído.
[0255] a) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔgIdA::cm:
[0256] A inativação do gene gldA é realizada como indicado no exemplo 1 inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, em que se deleta a maior parte dos genes ditos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0257] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0258] gldA D f de 100 bases (SEQ ID N° 29)
[0259] gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctga tctggcgt cgcgGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0260] com:
[0261] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4135512 a 4135592) do gene gldA sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).
[0262] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000)
[0263] gldA 0 r de 100 bases (SEQ ID N°30):
[0264] atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaa tacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG
[0265] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (4136535-- 4136615) do gene gldA (4135512 à 4136615)
[0266] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3.
[0267] Os oligonucleotídeos gldA D r e gldA D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG 1655 (pKD46) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos YijF D e TalCr.
[0268] YijF D (SEQ ID N° 31):
[0269] gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (homóloga a sequência de 4135140 a 4135174)
[0270] TalCr (SEQ ID N° 32):
[0271] cacgcatattccccattgccgggg (homóloga a sequência de 4137216 a 4137239)
[0272] Um produto PCR de 2100 pb é obtido para o gene selvagem como para o gene deletado e substituído pelo gene de resistência ao cloranfenicol. Também, os produtos PCR obtidos são digeridos e depois pela enzima de restrição Sall. Dois fragmentos de cerca de 1000 pb é obtido para o produto PCR selvagem enquanto que o produto PCR que contém o gene de resistência ao cloranfenicol não é digerido.
[0273] b) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída.
[0274] A inativação do gene gldA na cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída foi realizada como no exemplo 1 com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo em c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 galdA::cm, e a transdução da cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA foi realizada com ajuda deste lisate. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos YijF D e TalCr para verificar a mutação do gene gldA.
[0275] c) Cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0276] As duas cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída são cultivadas com pH não regulado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio em extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/1 em condição anaerobiose durante 10 dias. O perfil de produtos de fermentação obtido mostra que a deleção do gene gldA não acarreta uma diminuição da produção de 1.2 propanodiol (tabela 1).
[0277] Tabela 1: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0278] Exemplo 5: Melhora do rendimento de conversão da glicose em 1.2 propanodiol por deleção do gene edd codificando para o 6-fosfo-gluconato desidratase na cepa ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA::cm evoluída:
[0279] a) construção de uma cepa modificada MG 1655 Δedd::cm:
[0280] A inativação do gene edd é realizada como indicado no exemplo 1 inserindo um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol, ao mesmo tempo, deletando- se a maior parte dos genes referidos pela técnica descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
[0281] Dois oligonucleotídeos são utilizados para realizar a deleção:
[0282] edd D f de 100 bases (SEQ ID N° 33)
[0283] ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattca cgtcctgt tcGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG
[0284] com:
[0285] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1930817 a 4) do gene edd (sequência 1930817 a 1932628), sequência de referência no sítio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
[0286] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pkD3 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L.(2000)
[0287] edd D r de 100 bases (SEQ ID N°34):
[0288] atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatct cgcccggatCATATGAATATCCTTAG
[0289] uma região (caracteres minúsculos) homóloga a sequência (1932548 - 1932628) do gene edd (sequência 1930817 a 1932628).
[0290] uma região (caracteres maiúsculos) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol portada pelo plasmídeo pkD3
[0291] Os oligonucleotídeos edd D r e edd D f são utilizados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pkD3. O produto PCR obtido é, então, introduzido por electroporação na cepa MG1655 (pK046) na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao antibiótico são, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos eda d e zwf r:
[0292] Eda d (SEQ ID N°. 35):
[0293] CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC (homóloga a sequência de 1930439 a 1930462)
[0294] Zwf r (SEQ ID N°. 36):
[0295] GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (homóloga a sequência de 1932968 a 1932996)
[0296] b) construção de uma cepa modificada MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída:
[0297] A inativação do gene edd na cepa MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, Δald::cm evoluída foi realizada como no exemplo 1 com ajuda da técnica do fago P1 (ver protocolo c). O Lisado de fago P1 é efetuado na cepa MG1655 Δedd::cm, e a transdução da cepa MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB é realizada com ajuda deste Lisado. Os transdutantes resistentes ao cloranfenicol são controlados com ajuda dos oligonucleotídeos eda d e zwf r para verificar a mutação do gene edd.
[0298] c) Cultura das cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0299] As duas cepas modificadas E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída são cultivadas com pH não regulado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio e extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/l em condição de anaerobiose durante 10 dias. O perfil de produtos de fermentação obtido mostra que a deleção do gene edd acarreta um aumento do rendimento de conversão da glicose em 1,2-propanodiol de 0,13 g/g a 0,35 g/g (tabela 2). A deleção do gene edd na cepa E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída permite, então, melhorar os desempenhos da cepa.
[0300] Tabela 2: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB evoluída:
[0301] Exemplo 6: Construção de uma cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) capaz de produzir o 1,2-propanodiol et a acetona:
[0302] O plasmídeo denominado pSOS95T é um vetor recíproco de expressão para E. coli/C. acetobutylicum que leva o operon acetona de Clostridum acetobutylicum constituído de quatro genes adc, ctfAB, thl codificando respectivamente para acetoacetato carboxilase, a coenzima A transferase e a tiolase sob a dependência do promotor tiolase. Estas três enzimas catalisam a transformação do acetil-CoA e o acetato em acetona e dióxido de carbono. O plasmídeo pSOS95T foi obtido por inserção no plasmídeo pSOS95 (Gene bank número de acessão AY187686) do gene thl de C. acetobutylicum codificando para a tiolase, no sítio BamH1 situado entre o promotor tiolase e o gene ctfA. O plasmídeo pSOS95T é introduzido na cepa E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluído por electroporação.
[0303] Células eletrocompetentes da cepa E. coli*MG1655 E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm são preparadas a partir de uma cultura a noite da cepa em LB. Uma cultura de 10 ml LB em erlenmeyer é semeada ao 100o pela cultura à noite e incubada a 37°C. Quando a densidade óptica a 550 nm da cultura atinge um valor compreendido entre 0.4 e 0.6, 1 ml de cultura é centrifugado. As células são lavadas com a água, e depois com uma solução de glicerol a 10%, com de sobrenadantes em 0.05 ml de uma solução de glicerol a 10%. As células são electroporadas imediatamente (25 μF, 200 Q, 2.5KV) (Gene pulsar, Biorad) com 5 μl da preparação plasmídica pSOS95T (Qiagen, Hilden germany). Após 1 hora de expressão fenotípica em meio SOC. (Sambrook J., Fristch E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, N.Y.) a 37°C, os transformantes são selecionados em meio de gelose com carbenicilina 100 μg/ml a 37°C.
[0304] Os transformantes são recolocados em cultura líquida na presença de carbenicilina durante uma noite para realizar uma extração de DNA plasmídica (Qiagen, Hilden Germany) a fim de controlar a presença do plasmídeo pSOS95T e de verificar por digestão enzimática que lhe é correto.
[0305] Exemplo 7: Cultura da cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída capaz de produzir o 1,2-propanodiol e a acetona:
[0306] A cepa modificada E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída é cultivada com pH não controlado em um meio de cultura mínimo suplementado em nitrato de sódio e extrato de levedura com uma concentração inicial em glicose de 20g/l em condição anaerobiose (tabela 3). A dosagem dos produtos de fermentação mostra que a cepa E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) evoluída produz uma mistura de 1,2-propanodiol, de acetato e de acetona.
[0307] Quadro 3: Comparação das concentrações em substrato e produtos de fermentação após 10 dias de cultura das cepas modificadas E. Coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm (pSOS95T) e E. coli*MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, IdhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd::cm evoluída:
[0308] Altaras N. E. and Cameron D. (1999) Metabolic engineering of a 1,2 - propanediol pathway in Escherichia coli: Appl. Env. Microb., 65, 1180-1185.
[0309] Altaras N. E. and Cameron D. C. (2000)Enhanced production of ( R ) 1,2- propanediol by metabolically engineered Escherichia coli: Biotechnol. Prog. 16, 940- 946
[0310] Altaras NE, Etzel MR and Cameron DC. (2001) Conversion of sugars to 1,2-propanediol by Thermoanaerobacterium thermosaccharoyiticum HG-8 : Biotechnol Prog. 17,52-56
[0311] Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The IdhA gene encoding the fermentative lactato dehydrogenase of Escherichia coli: microbiology, 143, 187- 195.
[0312] Cameron D. C., Altaras N. E., Hoffman M. L. and Shaw A. J. (1998) Metabolic engineering of propanediol pathways: Biotechnol. Prog., 14, 116125.
[0313] Cameron D. C., Shaw A. J. and Altaras N. E. (1998) Microbial production of 1,2-propanediol from sugar WO 98/37204
[0314] Cameron D. C., Shaw A. J. and Altaras N. E. (2000) Microbial production of 1,2-propanediol from sugar US 6 087 140
[0315] Cameron D. C., Shaw A. J. and Altaras N. E. (2001) Microbial production of 1,2-propanediol from sugar US 6 303 352
[0316] Carrier T A and Keasling J. D. (1999) Library of sinthetic 5' secondary structures to manipulate mRNA stability in Escherichia coli, Biotechnol.prog., 15, 58- 64
[0317] Cheperanov P. P. and Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158,9-14
[0318] Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad Scl USA 97 : 6640-6645
[0319] Sam brook J., Fristch E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, N.I.
[0320] Schwartz E. R. and Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistri, 6,14341439
[0321] Snoep J. L., De Graef M. R., Westfal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo, FEMS microbiologi letters, 114, 279284)).
[0322] Tran Din K. and Gottschalk G. (1985) Formação of D(-)-1,2-propanediol and D(- )-Iactate from glucose by Clostridium sfenoides under fosfate limitation: Arch Microbiol142, 87-92.
Claims (8)
1. Processo de preparação de uma cepa de Escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples caracterizado pelo fato de compreender: - a cultura sob pressão de seleção, a pressão de seleção compreendendo aplicar taxas aumentadas de diluição de tal forma que conserva no meio de cultura apenas aqueles micro-organismos que exibem uma taxa de crescimento igual a ou maior do que taxa de diluição imposta em um meio de cultura adequado que compreende uma fonte de carbono simples, de uma cepa bacteriana inicial compreendendo uma deleção dos genes tpiA, pflAB, adhE, ldhA, gloA, aldA e aldB, a fim de fazer evoluir, na cepa inicial, um ou mais genes implicados na via de biosíntese do DHAP em metilglioxal e depois em 1,2-propanodiol para os genes evoluídos que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada, e depois - seleciona-se e isola-se a ou as cepas de E. coli evoluídas que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial compreende adicionalmente uma deleção do gene edd.
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa evoluída compreende adicionalmente pelo menos um gene que codifica um complexo piruvato desidrogenase endógeno, compreendendo uma mutação pontual em que a alanina 55 é substituída por valina, tal que referido complexo piruvato desidrogenase é pouco sensível à inibição pelo NADH.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que se introduz na cepa evoluída um ou vários genes heterólogos que codificam uma ou várias enzimas implicadas na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona, os referidos genes sendo selecionados dentre adc, ctfA e B, e thl de Clostridium acetobutylicum.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cepa evoluída modificada obtida conforme a reivindicação 4 é: - cultivada sob pressão de seleção, a referida pressão de seleção compreendendo aplicar taxas aumentadas de diluição de tal forma que conserva no meio de cultura apenas aqueles micro-organismos que exibem uma taxa de crescimento igual a ou maior do que taxa de diluição imposta em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono simples, a fim de fazer evoluir, na cepa evoluída modificada, um ou mais genes implicados na conversão do acetil-CoA e do acetato em acetona para uma atividade «acetona sintase» melhorada, e depois - os micro-organismos evoluídos de segunda geração que têm uma atividade «1,2-propanodiol sintase» melhorada e uma atividade «acetona sintase» melhorada são então selecionados e isolados.
6. Processo de preparação de 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que cultiva-se uma cepa evoluída conforme definida na reivindicação 5, em um meio de cultura adequado contendo uma fonte simples de carbono, e depois recupera-se o 1,2-propanodiol produzido.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que 1,2-propanodiol e acetona são recuperados.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o 1,2-propanodiol e/ou a acetona são purificados.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0400214 | 2004-01-12 | ||
| FR0400214A FR2864967B1 (fr) | 2004-01-12 | 2004-01-12 | Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol |
| PCT/FR2005/000070 WO2005073364A2 (fr) | 2004-01-12 | 2005-01-12 | Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0506790A BRPI0506790A (pt) | 2007-05-22 |
| BRPI0506790B1 true BRPI0506790B1 (pt) | 2020-12-22 |
Family
ID=34684930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0506790-1A BRPI0506790B1 (pt) | 2004-01-12 | 2005-01-12 | processo de preparação de uma cepa de escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples e processo de preparação de 1,2-propanodiol |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8252579B2 (pt) |
| EP (2) | EP1704230B1 (pt) |
| JP (1) | JP4613177B2 (pt) |
| KR (1) | KR101229525B1 (pt) |
| CN (1) | CN1910278B (pt) |
| AT (1) | ATE440135T1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0506790B1 (pt) |
| CA (1) | CA2547695C (pt) |
| DE (1) | DE602005016073D1 (pt) |
| DK (1) | DK1704230T3 (pt) |
| ES (1) | ES2329914T3 (pt) |
| FR (1) | FR2864967B1 (pt) |
| PL (1) | PL1704230T3 (pt) |
| PT (1) | PT1704230E (pt) |
| RU (1) | RU2407793C2 (pt) |
| SI (1) | SI1704230T1 (pt) |
| WO (1) | WO2005073364A2 (pt) |
| ZA (1) | ZA200605440B (pt) |
Families Citing this family (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2007282161A1 (en) | 2006-05-01 | 2008-02-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Ethanol production in non-recombinant hosts |
| JP2010508013A (ja) * | 2006-10-31 | 2010-03-18 | メタボリック エクスプローラー | グリセロールから１，３−プロパンジオールを高収量で生物学的に製造する方法 |
| AU2007332241A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Biofuelchem Co., Ltd. | Enhanced butanol producing microorganisms and method for preparing butanol using the same |
| WO2008080124A2 (en) * | 2006-12-21 | 2008-07-03 | Gevo, Inc. | Butanol production by metabolically engineered yeast |
| WO2008091627A2 (en) * | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| CA2677309A1 (en) * | 2007-02-08 | 2008-07-14 | Biofuelchem Co., Ltd. | Method for preparing butanol through butyryl-coa as an intermediate using yeast |
| PL389665A1 (pl) | 2007-02-09 | 2010-07-05 | The Regents of the University of CaliforniaThe Regents of the University of California | Wytwarzanie biopaliwa przez rekombinowane mikroorganizmy |
| LT2821494T (lt) | 2007-03-16 | 2017-04-25 | Genomatica, Inc. | 1,4-butandiolio ir jo pirmtakų biosintezės būdai ir kompozicijos |
| KR101631719B1 (ko) * | 2007-03-20 | 2016-06-24 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크. | 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법 |
| CN101641446A (zh) | 2007-03-23 | 2010-02-03 | 代谢探索者公司 | 通过进化和理性设计的组合获得的用于产生1，2-丙二醇的新微生物 |
| US20100279369A1 (en) * | 2007-03-23 | 2010-11-04 | Metabolic Explorer | Metabolically engineered microorganism useful for the production of acetol |
| CA2688450C (en) | 2007-03-23 | 2016-10-25 | Metabolic Explorer | Microorganisms and methods for production of 1,2-propanediol and acetol |
| JP2010521190A (ja) * | 2007-03-23 | 2010-06-24 | メタボリック エクスプローラー | １，２−プロパンジオールの製造に有用な、代謝的に操作された微生物 |
| EP2010644A1 (en) * | 2007-03-23 | 2009-01-07 | Metabolic Explorer | New micro-organisms for the production of acetol obtained by a combination of evolution and rational design. |
| WO2008124523A1 (en) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | The Regents Of The University Of California | Butanol production by recombinant microorganisms |
| US7947483B2 (en) * | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| WO2009045637A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-04-09 | Genomatica, Inc. | Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid |
| JP2011500031A (ja) * | 2007-10-12 | 2011-01-06 | ザ レジェンツ オブ ザ ユニヴァースティ オブ カリフォルニア | イソプロパノールを生産するように操作された微生物 |
| CN101918539A (zh) | 2007-12-17 | 2010-12-15 | 阿姆斯特丹大学 | 包含发酵基因卡盒的自养生物进行光驱动的co2还原生成有机化合物以用作燃料或用作工业半成品 |
| JP2011509691A (ja) | 2008-01-22 | 2011-03-31 | ジェノマティカ， インコーポレイテッド | 合成ガスまたは他のガス状炭素源およびメタノールを利用するための方法および生物体 |
| EP2225127B1 (en) * | 2008-02-21 | 2013-04-03 | Takata AG | Airbag module for a motor vehicle |
| EP2262901B1 (en) | 2008-03-05 | 2018-11-21 | Genomatica, Inc. | Primary alcohol producing organisms |
| WO2009115114A1 (en) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Metabolic Explorer | Polypeptide having glyoxylase iii activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof |
| CN102066551B (zh) | 2008-03-27 | 2013-10-09 | 基因组股份公司 | 用于产生己二酸和其他化合物的微生物 |
| JP2011519561A (ja) * | 2008-05-01 | 2011-07-14 | ジェノマティカ， インコーポレイテッド | メタクリル酸の産生のための微生物 |
| EP2304039B1 (en) * | 2008-06-17 | 2019-08-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate |
| US20100021978A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid |
| EP2313489B1 (en) * | 2008-07-28 | 2015-04-29 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research and Information Network AG | Production method |
| WO2010022763A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 2-hydroxy-isobutyrate |
| WO2010030711A2 (en) | 2008-09-10 | 2010-03-18 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol |
| US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
| ES2401155T3 (es) | 2008-10-03 | 2013-04-17 | Metabolic Explorer | Procedimiento para la purificación de un alcohol a partir de un caldo de fermentación que utiliza un evaporador de película descendente, de película renovada, de película fina o de recorrido corto |
| DK2346999T3 (da) * | 2008-11-07 | 2013-09-30 | Metabolic Explorer Sa | Anvendelse af saccharose som substrat til fermenteringsproduktion af 1,2-propandiol |
| WO2010057022A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of methyl ethyl ketone and 2-butanol |
| CN102395671B (zh) * | 2008-12-03 | 2014-06-25 | 韩国生命工学研究院 | 用于制造1，3-丙二醇的丙三醇氧化途径中阻隔的突变体 |
| AU2009327490A1 (en) * | 2008-12-16 | 2011-07-28 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products |
| KR101827230B1 (ko) | 2008-12-31 | 2018-02-07 | 메타볼릭 익스플로러 | 디올의 제조 방법 |
| US8338148B2 (en) | 2009-03-12 | 2012-12-25 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Method of producing 1,3-propanediol using recombinant Klebsiella strain in which glycerol oxidative pathway has been blocked |
| JP2012522515A (ja) | 2009-04-02 | 2012-09-27 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | コハク酸生産経路の工学処理 |
| US9017983B2 (en) * | 2009-04-30 | 2015-04-28 | Genomatica, Inc. | Organisms for the production of 1,3-butanediol |
| JP2012525156A (ja) | 2009-04-30 | 2012-10-22 | ゲノマチカ， インク． | イソプロパノール、ｎ−ブタノール、及びイソブタノールの産生のための微生物 |
| JP5773990B2 (ja) | 2009-05-07 | 2015-09-02 | ゲノマチカ， インク． | アジペート、ヘキサメチレンジアミン、及び６−アミノカプロン酸の生合成のための微生物及び方法 |
| WO2010132845A1 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Genomatica, Inc. | Organisms for the production of cyclohexanone |
| CA2764368C (en) * | 2009-06-04 | 2017-08-01 | Genomatica, Inc. | Process of separating components of a fermentation broth |
| CN107384846B (zh) | 2009-06-04 | 2021-08-10 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法 |
| EP2440669A4 (en) * | 2009-06-10 | 2013-08-28 | Genomatica Inc | MICROOGANISMS AND PROCEDURES FOR THE CARBON EFFECTIVE BIOSYNTHESIS MEK AND 2-BUTANOL |
| EP2267126A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Metabolic Explorer | Process for the stable gene interruption in clostridia |
| US8969053B2 (en) | 2009-07-30 | 2015-03-03 | Metabolic Explorer | Mutant YqhD enzyme for the production of a biochemical by fermentation |
| JP5913099B2 (ja) | 2009-07-30 | 2016-04-27 | メタボリック エクスプローラー | 発酵による生化学物質生産のための変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓ） |
| EP2459720B1 (en) | 2009-07-30 | 2016-04-27 | Metabolic Explorer | Mutant glycerol dehydrogenase (glydh) for the production of a biochemical by fermentation |
| WO2011017560A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Genomatica, Inc. | Semi-synthetic terephthalic acid via microorganisms that produce muconic acid |
| US9957530B2 (en) * | 2009-08-21 | 2018-05-01 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Production of propanols, alcohols, and polyols in consolidated bioprocessing organisms |
| JP2013504326A (ja) | 2009-09-09 | 2013-02-07 | ジェノマティカ・インコーポレイテッド | イソプロパノールならびに第一級アルコール、ジオールおよび酸の共生成のための微生物ならびに方法 |
| CN105441374A (zh) * | 2009-10-13 | 2016-03-30 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 |
| KR20180014240A (ko) | 2009-10-23 | 2018-02-07 | 게노마티카 인코포레이티드 | 아닐린의 제조를 위한 미생물 |
| WO2011066076A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| WO2011071682A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol |
| MX2012008738A (es) * | 2010-01-29 | 2012-08-31 | Genomatica Inc | Microorganismos y metodos para la biosintesis de p-toluato y tereftalato. |
| US8048661B2 (en) * | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| US8637286B2 (en) * | 2010-02-23 | 2014-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| US9023636B2 (en) | 2010-04-30 | 2015-05-05 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene |
| WO2011140171A2 (en) | 2010-05-05 | 2011-11-10 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of butadiene |
| US8911978B2 (en) | 2010-07-02 | 2014-12-16 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of hydroxy acids |
| TWI500768B (zh) | 2010-07-05 | 2015-09-21 | Metabolic Explorer Sa | 由蔗糖製備１，３－丙二醇之方法 |
| MX2013001071A (es) | 2010-07-26 | 2013-06-28 | Genomatica Inc | Microorganismos y metodos para la biosintesis de aromaticos, 2, 4-pentadienoato y 1, 3-butadieno. |
| CN103391957B (zh) | 2011-02-22 | 2016-01-20 | 东丽株式会社 | 二醇组合物及聚酯 |
| EP2532751A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-12 | Metabolic Explorer | Use of inducible promoters in the fermentative production of 1,2-propanediol |
| WO2012172050A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network Ag | New means and methods for producing propanediol |
| EP2540834A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 1,3-propanediol |
| US9410164B2 (en) | 2011-10-11 | 2016-08-09 | Metabolic Explorer | Biosynthesis pathway for prenol in a recombinant microorganism |
| EP2647718A3 (en) | 2012-04-06 | 2014-12-24 | Metabolic Explorer | Process for producing 5-aminopentanoate empolying a recombinant microorganism |
| WO2013184602A2 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds |
| EP2708598A1 (en) * | 2012-09-14 | 2014-03-19 | Basf Se | Serinol production in glycerol catabolism deficient escherichia coli strains |
| WO2014049382A2 (en) | 2012-09-26 | 2014-04-03 | Metabolic Explorer | Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism |
| CN103589756B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-12-02 | 中国科学院微生物研究所 | 利用l-乳酸生物合成s-1,2-丙二醇的方法 |
| US10689671B2 (en) | 2014-05-12 | 2020-06-23 | Metabolic Explorer | Microorganism and method for the production of 1.2-propanediol based on NADPH dependent acetol reductase and improved NADPH supply |
| JP6026494B2 (ja) * | 2014-12-05 | 2016-11-16 | メタボリック エクスプローラー | １，２−プロパンジオールの発酵製造のための基質としてのスクロースの使用 |
| EP3050970B1 (en) | 2015-01-28 | 2019-09-18 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for optimized production of 1,4-butanediol |
| WO2016162712A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate |
| CN107771214B (zh) | 2015-04-07 | 2022-01-18 | 代谢探索者公司 | 用于具有增加的2,4-二羟基丁酸外排物的优化的2,4-二羟基丁酸产生的修饰的微生物 |
| EP3328997B1 (en) | 2015-07-27 | 2020-12-23 | Institut National Des Sciences Appliquees | New polypeptide having ferredoxin-nadp+ reductase activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof |
| BR112018002048A2 (pt) | 2015-08-07 | 2018-09-18 | Evonik Degussa Gmbh | ?micro-organismo geneticamente modificado e método para a produção fermentativa de metionina? |
| WO2017042602A1 (en) | 2015-09-10 | 2017-03-16 | Metabolic Explorer | New lactaldehyde reductases for the production of 1,2-propanediol |
| WO2017068385A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Metabolic Explorer | Microorganism modified for the assimilation of levulinic acid |
| US11034985B2 (en) | 2015-11-27 | 2021-06-15 | Evonik Operations Gmbh | Method for producing L-methionine |
| WO2017211883A1 (en) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Danmarks Tekniske Universitet | Bacterial cells with improved tolerance to polyols |
| US10961499B2 (en) * | 2016-07-08 | 2021-03-30 | Metabolic Explorer | Method for the fermentative production of molecules of interest by microorganisms comprising genes coding sugar phosphotransferase system (PTS) |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| EP3342873A1 (en) | 2016-12-29 | 2018-07-04 | Metabolic Explorer | Conversion of methylglyoxal into hydroxyacetone using enzymes and applications thereof |
| EP3470512A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Metabolic Explorer | Mutant phosphoserine aminotransferase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate |
| EP3707267A1 (en) * | 2017-11-09 | 2020-09-16 | Braskem S.A. | Process for the recovery of ketones and glycols from fermentation |
| CN115261292B (zh) * | 2021-04-29 | 2023-06-09 | 中国科学院上海高等研究院 | 改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法 |
| CN115125263B (zh) * | 2022-05-31 | 2024-01-23 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 解除pts依赖碳源对相关启动子阻遏的方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6087140A (en) * | 1997-02-19 | 2000-07-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial production of 1,2-propanediol from sugar |
| DK1204755T3 (da) * | 1999-08-18 | 2006-12-11 | Du Pont | Proces til biologisk produktion af 1,3-propandiol |
-
2004
- 2004-01-12 FR FR0400214A patent/FR2864967B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-12 BR BRPI0506790-1A patent/BRPI0506790B1/pt active IP Right Grant
- 2005-01-12 DE DE602005016073T patent/DE602005016073D1/de active Active
- 2005-01-12 CA CA2547695A patent/CA2547695C/fr active Active
- 2005-01-12 JP JP2006548349A patent/JP4613177B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-01-12 AT AT05717405T patent/ATE440135T1/de active
- 2005-01-12 ES ES05717405T patent/ES2329914T3/es active Active
- 2005-01-12 KR KR1020067014050A patent/KR101229525B1/ko active IP Right Grant
- 2005-01-12 SI SI200530761T patent/SI1704230T1/sl unknown
- 2005-01-12 CN CN2005800023110A patent/CN1910278B/zh active Active
- 2005-01-12 EP EP05717405A patent/EP1704230B1/fr active Active
- 2005-01-12 PL PL05717405T patent/PL1704230T3/pl unknown
- 2005-01-12 US US10/585,040 patent/US8252579B2/en active Active
- 2005-01-12 DK DK05717405T patent/DK1704230T3/da active
- 2005-01-12 WO PCT/FR2005/000070 patent/WO2005073364A2/fr active Application Filing
- 2005-01-12 EP EP20090167750 patent/EP2192180A1/fr not_active Ceased
- 2005-01-12 PT PT05717405T patent/PT1704230E/pt unknown
- 2005-01-12 RU RU2006129295/10A patent/RU2407793C2/ru active
-
2006
- 2006-06-30 ZA ZA200605440A patent/ZA200605440B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1910278B (zh) | 2010-05-26 |
| CN1910278A (zh) | 2007-02-07 |
| WO2005073364A3 (fr) | 2005-09-29 |
| ZA200605440B (en) | 2007-04-25 |
| ATE440135T1 (de) | 2009-09-15 |
| RU2407793C2 (ru) | 2010-12-27 |
| CA2547695A1 (fr) | 2005-08-11 |
| CA2547695C (fr) | 2015-03-10 |
| RU2006129295A (ru) | 2008-02-20 |
| US20070072279A1 (en) | 2007-03-29 |
| FR2864967B1 (fr) | 2006-05-19 |
| EP1704230B1 (fr) | 2009-08-19 |
| DK1704230T3 (da) | 2009-11-02 |
| JP2007517517A (ja) | 2007-07-05 |
| FR2864967A1 (fr) | 2005-07-15 |
| EP1704230A2 (fr) | 2006-09-27 |
| PL1704230T3 (pl) | 2010-01-29 |
| KR20060123490A (ko) | 2006-12-01 |
| PT1704230E (pt) | 2009-10-14 |
| SI1704230T1 (sl) | 2009-12-31 |
| DE602005016073D1 (de) | 2009-10-01 |
| US8252579B2 (en) | 2012-08-28 |
| ES2329914T3 (es) | 2009-12-02 |
| KR101229525B1 (ko) | 2013-02-04 |
| WO2005073364A2 (fr) | 2005-08-11 |
| JP4613177B2 (ja) | 2011-01-12 |
| BRPI0506790A (pt) | 2007-05-22 |
| EP2192180A1 (fr) | 2010-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0506790B1 (pt) | processo de preparação de uma cepa de escherichia coli evoluída para a produção de 1,2-propanodiol por metabolismo de uma fonte de carbono simples e processo de preparação de 1,2-propanodiol | |
| US8298807B2 (en) | Micro-organisms for the production of 1,2-propanediol obtained by a combination of evolution and rational design | |
| KR101734793B1 (ko) | 1,2-프로판디올 및 아세톨의 제조를 위한 미생물 및 방법 | |
| ES2691206T3 (es) | Producción de ácido glicólico mediante fermentación a partir de recursos renovables | |
| US20100261239A1 (en) | Metabolically engineered microorganism useful for the production of 1,2-propanediol | |
| TW201005094A (en) | Polypeptide having glyoxalase III activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof | |
| EP2532751A1 (en) | Use of inducible promoters in the fermentative production of 1,2-propanediol | |
| BR112016026164B1 (pt) | Novo microrganismo e método para a produção de 1,2-propanodiol com base em acetol redutase dependente de nadph e suprimento de nadph aprimorado | |
| US20110262980A1 (en) | Micro-organisms for the production of acetol obtained by a combination of evolution and rational design | |
| ES2741823T3 (es) | Cepas de Clostridium acetobutylicum incapaces de producir hidrógeno y útiles para la producción continua de productos químicos y combustibles | |
| BR112019013349A2 (pt) | conversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmasconversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmas | |
| ES2866823T3 (es) | Nuevo polipéptido que presenta una actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, polinucleótido que codifica el mismo y utilizaciones del mismo | |
| MXPA06007929A (en) | Advanced microorganism for producing 1,2-propanediol | |
| BR102018004985A2 (pt) | Microrganismo transgênico de linhagem de escherichia coli recombinante para produção de l-metionina | |
| BR112021015626B1 (pt) | Microorganismo recombinante superexpressando uma enzima tendo atividade d-ribose-5-fosfato aldolase, método de produção do mesmo e método de produção de um ou mais produtos selecionados de monoetilenoglicol e ácido glicólico | |
| KR20190078965A (ko) | 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO POR NAO SE ENQUADRAR NO ART. 229-C DA LPI. |
|
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 22/12/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |