JP6026494B2 - 1,2−プロパンジオールの発酵製造のための基質としてのスクロースの使用 - Google Patents
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これら1,2−プロパンジオールの製造のための化学的方法の欠点に照らすと、生合成を魅力的な選択肢である。微生物による糖からの1,2−プロパンジオールの天然生産に関して2つの経路が同定されている。1つ目の経路では、6−デオキシ糖(例えば、L−ラムノースまたはL−フコース)がジヒドロキシアセトンリン酸および(S)−ラクトアルデヒドに開裂され、さらに(S)−1,2−プロパンジオールへと還元することができる(Badia et al, 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能するものの、デオキシヘキソースのコストが高いために経済上実現可能な方法をもたらし得ない。2つ目の経路は、解糖経路とその後のメチルグリオキサール経路を介した汎用糖(例えば、グルコースまたはキシロース)の代謝である。ジヒドロキシアセトンリン酸はメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元され得る。その後、これら2つの化合物は2回目の還元反応を受け、1,2−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの天然(R)−1,2−プロパンジオール生産株によって用いられている。これらの2つの微生物は、種々の糖類、すなわち、単糖類(六炭糖としてはD−グルコース、D−マンノース、D−ガラクトース、および五炭糖としてはD−キシロースまたはL−アラビノース)または二糖類(ラクトースまたはセロビオース)または混合物から1,2−プロパンジオールを製造するために用いられている(Tran Din and Gottschalk, 1985, Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987, Altaras et al, 2001)。得られた最高性能は力価9g/lであり、グルコースからの収率は0.2g/gであった(Sanchez-Rivera et al, 1987)。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改良は、利用可能な遺伝的手段が不足しているために限られていると思われる。同じ合成経路が大腸菌または他の腸内細菌科でも機能的であり、この微生物におけるD−グルコースまたはD−フルクトースに限定された炭素源を用いた1,2−プロパンジオールの製造に関するいくつかの検討がCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)およびBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によりなされた。嫌気的流加発酵槽で得られた最良の結果は、1,2−プロパンジオールの生産率4.5g/lであり、グルコースからの収率は0.19g/gであった(Altaras and Cameron, 2000)。同じアプローチで得られたものでありながら、より低い力価および収率という結果も特許WO98/37204に記載されているが、違う炭素源、すなわち、ガラクトース、ラクトース、スクロースおよびキシロースを用いたものであり、しなかながらグルコースもまた用いられていた。二糖類(ラクトースおよびスクロース)で得られた力価は極めて低かった(それぞれ6mg/lおよび7mg/l)。特許出願WO2005/073364には、合理的に設計され、進化させた大腸菌株を用い、より良好な製造結果が記載されている。1.8g/lの1,2−プロパンジオール力価が得られ、収率は消費グルコース1g当たり0.35gであった。また、特許WO99/28481には、組換え酵母を用いた1,2−プロパンジオールおよびヒドロキシアセトンの製造が記載されている。
1,2−プロパンジオールを生産する微生物を、スクロースの供給源を含んでなる適切な培地で培養すること、および
生産された1,2−プロパンジオールを回収すること
を含んでなり、該微生物が、1,2−プロパンジオールの生産のための唯一の炭素源としてスクロースを利用することができるものである方法に関する。
その後、フルクトースはフルクトキナーゼによりリン酸化されてフルクトース−6−リン酸となり、グルコースはグルコキナーゼのよりリン酸化されてグルコース−6−リン酸となる。この非PTSスクロース利用系をコードする遺伝子は調節タンパク質により制御可能である。本発明の好ましい態様では、微生物は、大腸菌EC3132由来の遺伝子、すなわち、スクロース:プロトン共輸送系(cscB)、フルクトキナーゼ(cscK)、インベルターゼ(cscA)およびスクロース特異的レプレッサー(cscR)をコードする遺伝子cscBKARを自然発現するか、またはこれらの遺伝子の導入により改変されている。これらの遺伝子は総てを一緒に組み合わせて使用することもできるし、またはこれらの遺伝子の少なくとも1つを含んでなる任意の組合せで使用することもできる。特に、遺伝子cscRは省くことができる。また、他の生物由来の相同遺伝子も使用可能である。
大腸菌株MG1655 lpd*,ΔtpiA、ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA::Cm,ΔgloA、ΔaldA,ΔaldB,Δeddを嫌気性条件下、ケモスタット培養で進化させ、WO2008/116852に記載のように最小培地での増殖に適応させた。この株を進化株大腸菌MG1655 lpd*,ΔtpiA、ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA::Cm,ΔgloA、ΔaldA,ΔaldB,Δeddと呼んだ。
・Schmid et al. (1982)に記載されているものなどのスクロース−PTS系をコードする遺伝子を担持するpUR400
・Jahreis et al. (2002)に記載されているものなどのスクロース透過酵素およびキナーゼ系をコードする遺伝子を担持するpKJL101.1
・進化型大腸菌MG1655 lpd*,ΔtpiA、ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA,ΔgloA、ΔaldA,ΔaldB,Δedd(pUR400)および
・進化型大腸菌MG1655 lpd*,ΔtpiA、ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA,ΔgloA、ΔaldA,ΔaldB,Δedd(pKJL101.1)
と呼んだ。
実施例1に記載されているように得られた株と対照として用いるプラスミドを含まない株を、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、好気性条件下、唯一の炭素源として20g/lグルコースまたはスクロースを含む最小培地MML11PG1_100(上記の組成を参照)中で培養した。炭素源としてのグルコースを対照として用いた。
実施例1に記載されているように得られた株を、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、好気性条件下、炭素源としてサトウキビ果汁(20g/lスクロース当量)を含む最小培地MML11PG1_100中で培養した。
実施例1に記載されているように得られた株を、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、好気性条件下、リン酸塩およびアンモニウム((NH4)2HPO4 2.5g/l)、鉄(クエン酸鉄、H2O 0.1g/l)およびチアミン(0.02g/l)を補給しない、または補給した、希釈サトウキビ果汁(20g/lスクロース当量)を含有する培地中で培養した。
Claims (9)
- 発酵により1,2−プロパンジオールを製造する方法であって、
1,2−プロパンジオールを生産する大腸菌(Escherichia coli)微生物を、スクロースの供給源を含んでなる適切な培地で培養すること、および
生産された1,2−プロパンジオールを回収すること
を含んでなり、前記微生物が、1,2−プロパンジオールの生産のための唯一の炭素源としてスクロースを利用することができるように遺伝的に改変されており、前記遺伝的改変が、PTSスクロース利用系をコードする遺伝子scrKYABRの導入または非PTSスクロース利用系をコードする遺伝子cscBKARの導入である、方法。 - スクロースの供給源が、バイオマスから得られるものである、請求項1に記載の方法。
- バイオマスが植物バイオマスである、請求項2に記載の方法。
- スクロースの供給源が、サトウキビ、テンサイ、サトウモロコシ、サトウカエデ、サトウヤシおよびブルーアガベからなる群から選択される植物から得られるものである、請求項2または3に記載の方法。
- スクロースの供給源が、果汁、濃縮果汁またはシロップ、清澄化果汁、糖蜜または結晶化スクロースの形態である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- スクロース源が、サトウキビまたはテンサイ工業の最終生成物、中間生成物または副生成物である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 適切な培地がスクロースの供給源からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 適切な培地が、スクロースの供給源に加えて、少なくともリン源および/または窒素源を含有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- スクロース源が少なくとも7%のスクロースを含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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