BRPI0300660B1 - method for quantifying mitochondrial cytochrome c release and kit for detecting mitochondrial cytochrome c release - Google Patents

Abstract

"método para quantificar liberação mitocondrial de citocromo c, composição para detectar liberação mitocondrial de citocromo c, kit para detectar liberação mitocondrial de citocromo c, uso de composição para liberação mitocondrial de citocromo c". é descrito método para quantificar a liberação mitocondrial de citocromo c durante a morte celular comportando permeabilização seletiva da membrana plasmática e imunodetecção de citocromo c. a invenção reporta-se, ainda, à composição para detectar liberação mitocondrial de citocromo c, kit para detectar liberação mitocondrial de citocromo c, bem como uso de composição para liberação mitocondrial de citocromo c."Method to quantify mitochondrial cytochrome c release, composition to detect mitochondrial cytochrome c release, kit to detect mitochondrial cytochrome c release, use of cytochrome c mitochondrial release composition". A method for quantifying cytochrome c mitochondrial release during cell death is described by selective plasma membrane permeabilization and cytochrome c immunodetection. The invention further relates to the composition for detecting cytochrome c mitochondrial release, kit for detecting cytochrome c mitochondrial release, as well as the use of the mitochondrial cytochrome c release composition.

Description

"MÉTODO PARA QUANTIFICAR LIBERACAO MITOCONDRIAL DE CITOCROMO C e KIT PARA DETECTAR LIBERACAO MITOCONDRIAL DE CITOCROMO C" h presente invenção se refere a um método para quantificar a liberação mitocondrial de citocromo c durante a morte celular comportando perrr.eabilizacão seletiva da membrana plasmática e imunodetecção de citocromo c. 0 citocromo c apoproteico e um componente da cadeia respiratória mitocondrial localizado na face externa da membrana mitocondrial. interna, que e liberado da mi tocondria para o citosol depois do desencadearaento do processo de apoptose em diferentes tipos de células como resposta a uma diversidade de agressões sofridas pelas mesmas. Uma vez liberado o citocromo c, conjuntamente com fatores citosolicos, ativa uma cascata de proteases, denominadas caspases, que promovem a morte da célula. Na medida que a liberação mitocondrial do citocromo c ccnstitui-se em uma etapa critica no processo de apoptose, sua quantificação pode ser utilizada para caracterizar este tipo de norte ce1ular."METHOD FOR QUANTIFYING CITROCHROME C MITCHONDRIAL RELEASE AND KIT FOR DETECTING CITROCHROME C MITCHONDRIAL RELEASE" This invention relates to a method for quantifying mitochondrial release of cytochrome c during cell death by selectively immunodeficient membrane-permeation. cytochrome c. Cytochrome c apoprotein is a component of the mitochondrial respiratory chain located on the outer surface of the mitochondrial membrane. which is released from the myocardium to cytosol after the apoptosis process is triggered in different cell types in response to a variety of aggressions suffered by them. Once released cytochrome c, together with cytosolic factors, activates a cascade of proteases, called caspases, which promote cell death. As mitochondrial release of cytochrome is a critical step in the apoptosis process, its quantification can be used to characterize this type of cell north.

Os métodos conhecidos para medir a liberação do citocromo c compreendem "Western blot" e microscopia de fluorescência. A técnica de "Western blot" requer o fracionamento e separação da mitocôndria da célula homogeneizada. Depois deste estagio as frações seguem intenso e longo processo, incluindo eletroforese das proteínas através de um gel e deste para uma membrana, incubação da membrana com anticorpos primários e secur.dários para detectar as proteínas . Finaimente o citocromo c e revelado e quantificado para exibir o grau. de morte da célula. Tal procedimento usualmente demanda pelo menos dois dias. Além disso, durante a homogeneização das células, a mitocôndria pode romper e a técnica de "Western » blot" poderia induzir a uma superestimação da liberação do citocromo c. A microscopia de fluorescência é mais rápida e mais fácil do que a técnica citada, mas a análise das células apoptóticas no microscópio pode também ser longa e, mais importante, a amostragem é sempre a principal preocupação quando se usa esta técnica. 0 método descrito segundo a presente invenção diminui drasticamente o tempo despendido para a determinação da liberação mitocondrial do citocromo c, de pelo menos dois dias para um dia, enquanto aumenta a precisão da medida desta proteína e o número de células analisadas durante a apoptose. O resultado é que se consegue efetuar a análise usando qualquer metodologia de fluorescência, quimioluminescência ou colorimetria. 0 método é baseado nas diferenças entre os lipídeos que constituem a membrana plasmática e a membrana mitocondrial. 0 quociente colesterol/fosfolipídeo é muito elevado na membrana plasmática, enquanto as membranas mitocondriais interna e externa possuem baixo quociente por serem muito pobres ou até virtualmente livres de colesterol.Known methods for measuring cytochrome c release include Western blot and fluorescence microscopy. The Western blot technique requires fractionation and separation of mitochondria from the homogenized cell. After this stage the fractions follow intense and long process, including electrophoresis of the proteins through a gel and from this to a membrane, incubation of the membrane with primary and secondary antibodies to detect the proteins. Finish the cytochrome c is revealed and quantified to display the degree. of cell death. Such a procedure usually takes at least two days. In addition, during cell homogenization, mitochondria may rupture and the Western blot technique could induce overestimation of cytochrome c release. Fluorescence microscopy is faster and easier than the aforementioned technique, but analysis of apoptotic cells under the microscope can also be lengthy and, most importantly, sampling is always the main concern when using this technique. The method described according to the present invention dramatically decreases the time taken to determine mitochondrial release of cytochrome c from at least two days to one day, while increasing the measurement accuracy of this protein and the number of cells analyzed during apoptosis. The result is that the analysis can be performed using any fluorescence, chemiluminescence or colorimetry methodology. The method is based on the differences between the lipids that make up the plasma membrane and the mitochondrial membrane. The cholesterol / phospholipid ratio is very high in the plasma membrane, while the inner and outer mitochondrial membranes have a low quotient because they are very poor or even virtually cholesterol free.

Usando baixas concentrações de detergentes específicos de colesterol, tais como digitonina, é possível seletivamente romper a membrana plasmática sem afetar as membranas das organelas intracelulares, como as membranas mitocondriais. A digitonina forma complexos insolúveis com o colesterol, que conduzem à segregação deste e à formação de orifícios de 40-50 A de largura na camada lipídica. A partir do momento em que a membrana plasmática é permeabilizada, é possível remover qualquer componente citosólico capaz de passar através dos orifícios formados pela ação da digitonina, incluindo o citocromo c liberado da mitocôndria das células apoptóticas. Qualquer composto descrito ou ainda a descrever que seletivamente permeabilizaria a membrana plasmática baseado no quociente colesterol/fosfolipídeo está incluído nesta invenção para detectar a liberação do citocromo c. 0 método da presente invenção compreende a permeabilização seletiva da membrana plasmática com baixas concentrações de detergente específico ao colesterol, como digitonina, previamente a uma série de lavagens e à fixação das células. Estas etapas asseguram que o citocromo c liberado seja removido da célula, enquanto a fixação impede a perda desta proteína não liberada durante as etapas seguintes. As células são posteriormente permeabilizadas com um detergente geral, como Triton X-100, Tween 20, Dodecil Sulfato de Sódio ou qualquer outro detergente conhecido ou ainda não conhecido, com a finalidade de permitir a entrada na célula de anticorpos contra citocromo c conjugado com um marcador, como marcador fluorescente, enzima, ou qualquer outro sistema usado para revelação. O imunocomplexo pode também ser revelado indiretamente usando um anticorpo secundário conjugado com um marcador desejável para fluorescência, quimioluminescência ou detecção de cores. Células não-apoptóticas são positivas para citocromo c uma vez que os citocromos c estão retidos dentro da mitocôndria. Neste caso, a análise por citometria de fluxo, detectaria uma população de células com alta fluorescência. Entretanto, nas células apoptóticas, o citocromo c liberado ao citoplasma será na seqüência liberado das células para o meio de lavagem durante o tratamento com digitonina, tornando as células negativas para citocromo c. A fluorescência da população de células apoptóticas detectada pela citometria de fluxo, neste caso, seria em tomo da fluorescência de fundo. A presente invenção comporta um método para quantificar a liberação mitocondrial de citocromo c durante a morte celular compreendendo as etapas de: a) permeabilização seletiva da membrana plasmática; b) imunodetecção de citocromo c.Using low concentrations of cholesterol-specific detergents such as digitonin, it is possible to selectively disrupt the plasma membrane without affecting intracellular organelle membranes such as mitochondrial membranes. Digitonin forms cholesterol insoluble complexes, which lead to its segregation and the formation of 40-50 A wide holes in the lipid layer. Once the plasma membrane is permeabilized, any cytosolic component capable of passing through the holes formed by the action of digitonin, including cytochrome c released from mitochondria of apoptotic cells, can be removed. Any compound described or yet to be described that would selectively permeabilize the plasma membrane based on the cholesterol / phospholipid quotient is included in this invention to detect cytochrome c release. The method of the present invention comprises selective permeabilization of the plasma membrane with low concentrations of cholesterol specific detergent such as digitonin prior to a series of washes and cell fixation. These steps ensure that the released cytochrome c is removed from the cell, while fixation prevents the loss of this unreleased protein during the following steps. The cells are further permeabilized with a general detergent such as Triton X-100, Tween 20, Sodium Dodecyl Sulfate or any other known or unknown detergent to allow antibodies against cytochrome c conjugated to a marker, such as fluorescent marker, enzyme, or any other system used for development. The immunocomplex may also be indirectly disclosed using a secondary antibody conjugated with a desirable marker for fluorescence, chemiluminescence or color detection. Nonapoptotic cells are positive for cytochrome c since cytochrome c is retained within the mitochondria. In this case, flow cytometric analysis would detect a high fluorescence cell population. However, in apoptotic cells, cytochrome c released to the cytoplasm will then be released from the cells into the wash medium during digitonin treatment, making the cells negative for cytochrome c. The fluorescence of the apoptotic cell population detected by flow cytometry in this case would be around background fluorescence. The present invention includes a method for quantifying mitochondrial release of cytochrome c during cell death comprising the steps of: a) selective plasma membrane permeabilization; b) cytochrome immunodetection c.

Vantajosamente no citado método a etapa de permeabilização seletiva da membrana plasmática é seguida pela imunodetecção do citocromo c e analise por técnicas de fluorescência, quimioluminescência e colorimetria. A invenção comporta composição para detectar liberação mitocondrial de citocromo c compreendendo anticorpo primário contra citocromo c, anticorpo secundário conjugado a fluorcromo, digitonina e tampões. A invenção comporta, ainda, kit para detectar a liberação mitocondrial de citocromo c compreendendo anticorpo primário contra citocromo c, anticorpo secundário conjugado a fluorocromo, digitonina e tampões. A invenção comporta, também, o uso de composição para quantificar a liberação mitocondrial de citocromo c durante a morte celular compreendendo anticorpo primário contra citocromo c, anticorpo secundário conjugado a fluorocromo, digitonina e tampões. A seguir apresenta-se a título meramente ilustrativo não limitativo exemplo de método segundo a presente invenção. Células leucêmicas HL60 tratadas com Staurosporina, inibidor da proteína quinase C, foram usadas como modelo para indução de apoptose. Tais células sofrem apoptose, quantificada pela externalização de fosfatidilserina via anexina V-FITC, quando mantidas em meio de cultura por 18 horas. Nenhuma apoptose é observada durante as primeiras 6 horas de exposição à droga muito embora sinais apoptóticos já tenham sido desencadeados no interior das células. As figuras de 1 até 9 mostram os histogramas de fluorescência de células marcadas com anticorpo contra citocromo c analisado por citometria de fluxo. O histograma exibe o decréscimo tempo-dependente da fluorescência das células de HL-60 expostas à Staurosporina como conseqüência da liberação do citocromo c. As células tratadas com Staurosporina por 1 a 6 horas e permeabilizadas com digitonina apresentaram progressivamente menores níveis de fluorescência até próximo da fluorescência de fundo, como mostrado pela média da fluorescência (FM), dentro de cada histograma (Figuras 4 a 9), indicando que depois de 6 horas todo o citocromo c foi liberado da mitocôndria. Controle experimental mostrou células não tratadas permeabilizadas ou não com digitonina (Figura 4 e Figura 3, respectivamente), que exibe níveis similares de alta fluorescência, indicando que baixas concentrações de digitonina usada não liberam uma quantidade significante de citocromo c da mitocôndria. Por outro lado, células não marcadas (Figura 1) ou células marcadas somente com anticorpos secundários (Figura 2) apresentaram fluorescência a níveis de fundo.Advantageously in said method the selective permeabilization step of the plasma membrane is followed by cytochrome c immunodetection and analysis by fluorescence, chemiluminescence and colorimetry techniques. The invention comprises a composition for detecting mitochondrial release of cytochrome c comprising primary antibody against cytochrome c, fluorochrome-conjugated secondary antibody, digitonin and buffers. The invention further comprises a kit for detecting mitochondrial release of cytochrome c comprising primary antibody against cytochrome c, fluorochrome conjugated secondary antibody, digitonin and buffers. The invention also includes the use of a composition for quantifying mitochondrial release of cytochrome c during cell death comprising primary antibody against cytochrome c, fluorochrome conjugated secondary antibody, digitonin and buffers. The following is a non-limiting example of the method according to the present invention. HL60 leukemic cells treated with Staurosporine, protein kinase C inhibitor, were used as a model for apoptosis induction. Such cells undergo apoptosis, quantified by phosphatidylserine externalization via annexin V-FITC, when kept in culture medium for 18 hours. No apoptosis is observed during the first 6 hours of drug exposure although apoptotic signs have already been triggered within the cells. Figures 1 to 9 show the fluorescence histograms of antibody labeled cells against cytochrome c analyzed by flow cytometry. The histogram shows the time-dependent decrease in fluorescence of HL-60 cells exposed to Staurosporine as a consequence of cytochrome c release. Staurosporine-treated cells for 1 to 6 hours and digitonin-permeabilized cells progressively showed lower fluorescence levels to near background fluorescence, as shown by the mean fluorescence (FM) within each histogram (Figures 4 to 9), indicating that after 6 hours all cytochrome c was released from mitochondria. Experimental control showed untreated cells permeabilized or not with digitonin (Figure 4 and Figure 3, respectively), which exhibited similar levels of high fluorescence, indicating that low concentrations of digitonin used did not release a significant amount of mitochondrial cytochrome c. On the other hand, unlabeled cells (Figure 1) or cells labeled with secondary antibodies only (Figure 2) showed background fluorescence.

Nos ensaios efetuados células HL60 foram incubadas, ou não, com Staurosporina 1 uM por 6 horas em meio de RPMI. suplementado com FBS 10%, L-glutamina 2mM, em atmosfera de 5% de C02 a 37°C. A cada hora 106 células foram coletadas e lavadas duas vezes com solução de salina tamponada em fosfato (PBS) e centrifugado a 1000 g durante 5 minutos. As células foram novamente suspensas em lOOul de solução de PBS suplementada com mistura de inibidores de protease a 1% e PMSF lmM. As células foram permeabilizadas por 30 segundos sobre vigorosa agitação com 0,005% de digitonina. Com PBS levou-se o volume a 10 ml, centrifugando-se a 5000 g por 5 minutos, sendo os "pellets" fixados com solução de paraformaldeído 2% durante 20 minutos. Depois de duas lavagens em PBS, em idênticas condições, as células foram lavadas em meio de marcação contendo PBS, 2% soro fetal bovino, 0,5% Triton X-100, 0,2% de azida. sódica e centrifugado a 5000 g por 10 minutos. Os "pellets" foram novamente suspensos no meio contendo 1 ug/ml de anticorpo contra citocromo c (Promega) e incubado por 1 hora a 4°C. O volume foi levado a 10 ml com o meio de marcação e centrifugado a 5000 rpm por 10 minutos. As células foram incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado Alexa488 (Molecular Probes), por 1 hora a 4°C , lavadas nas mesmas condições e analisadas por citometria de fluxo. Os histogramas das figuras 1 a 4, correspondem ao grupo controle: A figura 1 apresenta os resultados da fluorescência de fundo de células HL-60 não tratadas. A figura 2 a fluorescência de fundo para os anticorpos secundários (2o Ab) de células não tratadas. A figura 3, a fluorescência máxima de células não tratadas impermeabilizadas e incubadas com anticorpo primário (Io Ab) e anticorpo secundário. A figura 4 exibe a fluorescência máxima de células não tratadas após a permeabilização das células com digitonina e incubação com ambos anticorpos. As figuras 5 a 9 mostram o decaimento da fluorescência de células HL60 tratadas com . Staurosporina incubadas com ambos anticorpos. A fluorescência média significa o valor médio da fluorescência na região de fluorescência mais elevada.In the assays performed HL60 cells were incubated or not with 1 uM Staurosporine for 6 hours in RPMI medium. supplemented with 10% FBS, 2mM L-glutamine, in a 5% CO2 atmosphere at 37 ° C. Every hour 106 cells were collected and washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and centrifuged at 1000 g for 5 minutes. The cells were resuspended in 100 µl of PBS solution supplemented with 1% protease inhibitor mixture and 1mM PMSF. Cells were permeabilized for 30 seconds under vigorous shaking with 0.005% digitonin. With PBS the volume was brought to 10 ml, centrifuged at 5000 g for 5 minutes and the pellets fixed with 2% paraformaldehyde solution for 20 minutes. After two washes in PBS, under identical conditions, cells were washed in labeling medium containing PBS, 2% fetal bovine serum, 0.5% Triton X-100, 0.2% azide. sodium hydroxide and centrifuged at 5000 g for 10 minutes. The pellets were resuspended in the medium containing 1 µg / ml cytochrome c antibody (Promega) and incubated for 1 hour at 4 ° C. The volume was brought to 10 ml with the labeling medium and centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes. Cells were incubated with Alexa488 conjugated mouse anti-IgG secondary antibody (Molecular Probes) for 1 hour at 4 ° C, washed under the same conditions and analyzed by flow cytometry. The histograms in Figures 1 to 4 correspond to the control group: Figure 1 shows the background fluorescence results of untreated HL-60 cells. Figure 2 is background fluorescence for secondary antibodies (2nd Ab) from untreated cells. Figure 3 shows the maximum fluorescence of untreated cells sealed and incubated with primary antibody (Io Ab) and secondary antibody. Figure 4 shows the maximum fluorescence of untreated cells after permeabilization of the cells with digitonin and incubation with both antibodies. Figures 5 to 9 show the fluorescence decay of HL60 treated cells. Staurosporine incubated with both antibodies. Average fluorescence means the mean fluorescence value in the highest fluorescence region.

REIVINDICAÇÕES

Claims (2)

1. "Método para quantificar a liberação mitocorsdrial de citocromo c durante a morte celular" caracterizado peJ o fato de compreender as etapas de: a) Permeabi1ização seletiva da membrana plasmática sem afetar as membranas das organelas intracelulares pelo emprego de um detergente especifico de coles terol; b) Lavagens e fixação das células; c) Incubação das células com ura anticorpo contra citocromo c conjugado com marcador ou, alternativamente, cora ura anticorpo contra citocromo c e com ura antícorposecundário conjugado com marcador; e d} Iiriunodetecçâo de citocromo c por citometria de fluxo.1. "Method for quantifying mitochorsdrial release of cytochrome c during cell death", characterized by the steps of: a) Selective permeation of the plasma membrane without affecting the intracellular organelle membranes by the use of a specific colol detergent ; b) Washing and fixing of cells; c) Incubation of the cells with a marker-conjugated cytochrome c antibody or, alternatively, with a marker-cytochrome c antibody and a marker-conjugated anti-antibody; and d} cytochrome c detection by flow cytometry. 2)"Método", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de irnunodetecçáo do citocromo c poder ser revelada por fluorescência."Method" according to claim 1, characterized in that the cytochrome immunodetection step can be revealed by fluorescence.