BR122021020419B1 - Vetor de vírus adeno-associado (aav) que compreende uma proteína de capsídeo vp1, composições farmacêuticas compreendendo o mesmo, e seus usos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um vetor de vírus adeno-associado (AAV) aprimorado que compreende uma proteína de capsídeo VP1 compreendendo uma ou mais substituições de lisina, em que o dito vetor compreende, adicionalmente, um minigene que compreende repetições de terminal invertidas de AAV e uma sequência de ácidos nucleicos heterólogos ligados de modo operativo a sequências reguladoras que direcionam a expressão de um produto da sequência de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula hospedeira, em que a dita substituição de lisina é eficaz para inibir ubiquitinação da dita proteína de capsídeo, aumentando, desse modo, a transdução do dito vetor de AAV em uma célula alvo. Refere-se ainda a composições farmacêuticas e métodos aprimorados para terapia genética mediada por AAV.

Description

[0001] Este pedido reivindica prioridade aos Pedidos Provisórios n°s US 61/635.273 e 61/794.995 depositados em 18 de abril de 2012 e 15 de março de 2013, respectivamente, sendo que os conteúdos inteiros de cada um são incorporados no presente documento a título de referência como se apresentados na íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Este pedido refere-se aos campos de terapia genética e biologia molecular. Mais especificamente, esta invenção fornece vetores virais adeno-associados que compreendem variantes de capsídeo de proteína que melhoram a eficácia de transdução de vetores de AAV que compreendem transgenes terapeuticamente benéficos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Diversas publicações e documentos de patente são citados ao longo de todo o relatório descritivo a fim de descrever o estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Cada uma dessas citações é incorporada no presente documento a título de referência como se apresentada na íntegra.

[0004] O vírus adeno-associado (AAV) é um vírus não envelopado, com defeito de replicação e pequeno (20 nm). Muitos sorotipos de AAV distintos foram caracterizados em primatas humanos e não humanos. O genoma de AAV é compreendido de DNA de fita única com repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 pb em ambas as extremidades. Há dois quadros de leitura abertos (ORFs), rep e cap. Embora os produtos de rep sejam essenciais para a replicação de AAV, 3 proteínas de capsídeo (VP1, VP2 e VP3) são expressas a partir do gene de cap. VP1, VP2 e VP3 reúnem-se a uma razão de 1:1:10 para formar um capsídeo icosahedral (Xie Q et al, 2002). Durante a produção de vetor de AAV recombinante (rAAV), um cassete de expressão flanqueado por ITRs é empacotado no capsídeo de AAV. Os genes exigidos para a replicação de AAV não são incluídos no cassete. O AAV recombinante é considerado o mais seguro e um dos vetores virais mais amplamente usados para a transferência de gene in vivo. Os vetores podem infectar as células de múltiplos tipos de tecido que fornecem expressão de transgene forte e persistente. Os mesmos são também não patogênicos e têm um perfil de imunogenicidade baixo (High KA, 2011).

[0005] Um dos objetivos imediatos para testes de terapia genética é otimizar vetores para maximizar a transdução de tecido minimizando ao mesmo tempo a dose de vetor. Mediante a entrada na célula, as proteínas de capsídeo de AAV são submetidas à degradação mediada por proteassoma. A fosforilação de resíduos de tirosina expostos à superfície do capsídeo de AAV representa uma das primeiras etapas que leva à degradação do vírus por meio da trajetória de ubiquitina- proteassoma (Zhong L et al, 2007). A maior parte da proteólise regulada na célula ocorre através dessa trajetória. A ubiquitina é uma proteína pequena (~8,5 kDa) que pode ser encontrada em todas as células eucarióticas. A ubiquitina é ligada à cadeia lateral dos aminoácidos de uma proteína de substrato. Após as proteínas ubiquitina adicionais serem fixadas ao substrato por meio da ubiquitina inicialmente ligada, uma cadeia de poliubiquitina é formada e o substrato é marcado para a degradação (Thrower JS et al 2000, Peng J et al 2003, Bedford L et al 2011). Foi mostrado que a mutação dos resíduos de tirosina expostos à superfície leva a um aumento na eficácia de transdução de vetores de AAV2 (Zhong L et al, 2008). Mais recentemente, diversos gru- pos mostraram que a estratégia é eficaz com outros sorotipos de AAV em diversos tecidos, incluindo o sorotipo de AAV 6 e 8.

[0006] Claramente, uma necessidade existe na técnica para com posições e métodos que melhoram a transdução de AAV que carrega transgenes clinicamente importantes em pacientes em necessidade dos mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] De acordo com a presente invenção, as variantes de AAV inovadores são fornecidas que exibem eficácia de transdução aumentada em comparação aos sorotipos de AAV (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV8, AAV-rh74), que não têm as modificações reveladas no presente documento. Tais vetores melhorados são úteis para a trans- dução de uma variedade de tecidos, incluindo fígado, músculo, cérebro e retina.

[0008] Em uma modalidade, um vetor de vírus adeno-associado (AAV) que compreende uma proteína de capsídeo VP1 alterada é fornecido, sendo que a proteína de capsídeo alterada compreende substituições de resíduo de lisina, reduzindo desse modo a ubiquiti- nação do capsídeo e aumentando a eficácia de transdução de AAV variante em tecidos e células alvo. Em uma modalidade, o vetor compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo, (por exemplo, um minigene que compreende repetições terminais invertidas de AAV e uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga) ligado operativamente a sequências reguladoras que direcionam a expressão de um produto da sequência de ácidos nucleicos heteróloga em uma célula hospedeira. Em uma modalidade preferencial, o vetor de AAV compreende uma ou mais substituições de lisina em VP1 conforme forne-cido nas tabelas estabelecidas no presente documento. Em outra modalidade, o vetor de AAV é do sorotipo AAV8 e contém uma alteração fornecida na Tabela 3.

[0009] Em uma modalidade preferencial, os vetores de AAV da in venção que compreende as proteínas de capsídeo variantes são úteis para a expressão de peptídeos terapêuticos ou ácidos nucleicos terapêuticos. Tais peptídeos incluem, sem limitação, uma molécula de RNAi antiviral, Fator VIII, Fator IX ou um fragmento funcional dos mesmos. Os produtos de expressão adicionais incluem, por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, imunoglobulinas quiméricas, anticorpos humanizados ou anticorpos de cadeia única. Em um aspecto, o produto de expressão é um RNAi que é útil para inibir a replicação e infecção de HCV. Em outra modalidade, o produto de expressão é um ácido nucleico antissenso útil para modular descendentemente uma célula alva de interesse.

[00010] Em outra modalidade da invenção, uma composição farmacêutica que compreende os vetores de AAV variantes da invenção em um carreador biologicamente compatível é fornecida. Também são abrangidas pela presente invenção as culturas celulares que compreendem os vetores revelados no presente documento.

[00011] A invenção também abrange um método para entregar um transgene para uma célula em um indivíduo, sendo que o dito método compreende a etapa de contatar a célula com um vetor de AAV conforme revelado no presente documento, em que o dito vetor de AAV compreende o transgene, em que a presença da substituição de lisina na sequência de capsídeo VP1 no dito vector é associada à ubiquiti- nação reduzida e eficácia de transdução aumentada.

[00012] Em um aspecto final, a invenção fornece variantes virais de proteção que são ineficazes na infecção de células, mas são eficazes para bloquear a neutralização de anticorpo de variantes virais que carregam transgenes benéficos devido às similaridades estruturais das duas variantes virais. As variantes de capsídeo exemplificativos para esse propósito incluem, por exemplo, K38R, K143R, K510R e K709R. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00013] Figura 1: Lisinas na superfície de AAV1, AAV2 e AAV8: os números PDB de sorotipos de AAV usados aqui são conforme segue: AAV1: 3NG9, AAV2: 1LP3 e AAV8: 2QA0. As setas representam os respectivos resíduos de Lisina. (A) Há 11 Lisinas na superfície de VP3 de AAV1. As cores de resíduo são conforme segue: K258 vermelho, K459 azul, K491 amarelo, K493 magenta, K508 ciano, K528 salmão escuro, K533 verde claro, K545 azul claro (ardósia), K567 salmão escuro, K666 ciano claro, K707 cinza. (B) Há 10 Lisinas na superfície de VP3 de AAV2. As cores de resíduo são conforme segue: K258 vermelho, K490 amarelo, K507 ciano, K527 salmão escuro, K532 verde claro, K544 azul claro (ardósia), K549 amarelo claro, K556 magenta claro, K665 ciano claro, K706 cinza (C) Há 8 Lisinas na superfície de VP3 de AAV8. As cores de resíduo são conforme segue: K259 vermelho, K333 verde, K510 ciano, K530 salmão escuro, K547 azul claro (ardósia), K569 salmão escuro, K668 ciano claro, K709 cinza. Note que K528 e K567 de AAV1 e K530 e K569 de AAV8 estão lado a lado na estrutura e mostrados com a mesma cor.

[00014] Figura 2: Diversos resíduos de Lisina do capsídeo de AAV8 foram mutados para Arginina. O sangue dos animais foi coletado 8 semanas após a injeção de vírus por meio da veia da cauda. Os níveis hF.IX são detectados por ELISA (A) Os resíduos que são previstos para serem ubiquitinados pelo software com níveis de confiança alto e médio foram mutados para arginina. 2,5 x 1010 partículas de vírus por camundongo foram injetadas por meio da veia da cauda (B,C). Os resíduos que são previstos com confiança baixa para serem ubiquitina- dos pelo software foram mutados para arginina. 2,5 x 109 partículas de vírus por camundongo foram injetadas por meio da veia da cauda. (B) mutações de capsídeo K569R e K668R (C) O efeito das mutações de capsídeo K38R, K143R, K259R, K510R, K547R é comparado ao efeito da mutação K530R.

[00015] Figura 3: Combinação das mutações de capsídeo K a R (A) A combinação das mutações K137R, K33R e K530R é ainda maior do que o tipo selvagem, mas não estatisticamente diferente da K530R. (B) A mutação K709R afeta negativamente a transdução de AAV8, A adição da mutação K709R ao mutante K(137/333/530)R também diminui a transdução do vírus. C) A combinação de múltiplas Lisinas a mutações de argininas não aumenta a taxa de transdução. (D) A combinação de três lisinas a resíduos de arginina com quatro ou seis tirosi- nas a resíduos de fenilalanina diminui a taxa de transdução.

[00016] Figura 4: Transdução de AAV1 (A) Morte CTL de hepatóci- tos HHL5-B7 transduzidos com mutantes de lisina de AAV-1 em três diferentes MOIs 5K, 50K e 500K. O peptídeo (IPQYGYLTL para AAV1; VPQYGYLTL para AAV2) foi usado como um controle positivo. A liberação de LDH correlaciona-se com a morte celular. (B) O número total de células positivas GFP e a expressão de GFP foram comparados dentre diferentes construtos a 50K e 500K MOIs.

[00017] Figura 5: transdução de AAV2: A) Os mutantes K137R, K527R ou K532R de AAV2 foram comparados ao WT AAV2 em termos da taxa de transdução de linhagem celular HHL5. As células foram transfectadas a 10K, 50K, 100K e 500K MOIs e verificadas 24 horas após para a expressão de GFP. B) Um gráfico que mostra a citotoxici- dade conforme medida pela liberação de LDL das variantes testadas.

[00018] Figura 6: Ensaio CTL no qual as células de hepatócito alvo foram transduzidas com o vetor de AAV-2 a concentrações crescentes e, então, incubadas com células efetoras compatíveis com HLA. Os vetores de AAV codificaram o capsídeo de AAV-2 do tipo selvagem ou mutações de lisina única conforme indicado. Os efetores foram derivados de PBMC expandido in vitro contra o epítopo de Classe I de MHC de AAV-2 VPQYGYLTL e a razão entre efetor e alvo foi 10:1. Os resultados são expressos como porcentagem de atividade CTL (% de cito- toxicidade em comparação às células tratadas com 10% de SDS como um controle de citotoxicidade máxima após a subtração de fundo) em relação ao vetor do tipo selvagem.

[00019] Figura 7: dados de RH74: Níveis de expressão de transgene F.IX humano em plasma medidos por um ELISA específico para F.IX humano. A) Definição de TMR=K(137/333/530)R, Definição de HMF= Y(253/275/447/703/707/733)F. B) Definição de HMR: K(137/259/333/530/552/569)R, Definição de 195/202: G195A+ L199V+ S201P+ G202N. Embora HMR+195/202, HMR+195/202+K(38)R, HMR+195/202+K(51)R, HMR+195/202+K(61)R e HMR+195/202+K(77)R tenham produzido uma produção de hFIX maior mediante a injeção a camundongos, a injeção de HMR+195/202+K(122/123)R ou HMR+195/202+K(142/413)R não produziu qualquer hFIX detectável de modo algum. C): O mutante RHM13_1 produziu níveis de hFIX similares em comparação a Rh74 WT enquanto que os níveis de hFIX derivados de camundongos tratados com RHM17_1 foram pouco acima dos níveis de fundo. D) O mutante RHM14_2 produziu níveis de hFIX similares em comparação a Rh74 WT; o desempenho de RHM15_1 foi entre este de AAV8 e AAVrh74 WT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00020] Em concordância com a presente invenção, foi revelado que a mutação dos resíduos de lisina em capsídeos de AAV para resíduos de arginina aumenta a eficácia de transdução de AAV. Os experimentos iniciais mostraram que uma única substituição de um resíduo de lisina previsto para ser um alvo para a ubiquitinação resultou em níveis maiores de expressão do transgene IX de fator humano (FIX) em camundongos em comparação aos animais que recebem vetores de AAV não modificados. Os mutantes de lisina de AAV descritos no presente documento poderiam ser usados com vantagem para gerar vetores que alvejam o fígado, CNS, músculo e outros órgãos com efi- cácia maior em comparação aos capsídeos de AAV do tipo selvagem. Consequentemente, esta revelação pode ser usada para desenvolver terapias para tratar hemofilia A, B, doença de Huntington e virtualmente qualquer outra doença que exige níveis de transdução aumentados de transgenes desejáveis em um tecido alvo de interesse.

[00021] As definições a seguir são fornecidas para facilitar um entendimento da presente invenção.

I. DEFINIÇÕES:

[00022] "Terapia genética" é a inserção de genes em células e/ou tecidos de um indivíduo para tratar uma doença, comumente doenças hereditárias em que um alelo mutante defeituoso é substituído ou suplementado com um alelo funcional.

[00023] "Vírus adeno-associados", da família parvovírus, são vírus pequenos com um genoma de DNA de fita única. Esses vírus podem inserir material genético em um sítio específico no cromossoma 19 e são preferenciais porque os mesmos não são associados a uma doença patogênica em humanos.

[00024] Um peptídeo ou proteína "terapêutica" é um peptídeo ou proteína que pode aliviar ou reduzir os sintomas que resultam de uma ausência ou defeito em uma proteína em uma célula ou indivíduo. Alternativamente, um peptídeo ou proteína "terapêutica" é um que confere de outra maneira um benefício a um indivíduo, por exemplo, efeitos anticâncer. Os peptídeos e proteínas terapêuticos incluem, porém sem limitação, CFTR (proteína reguladora de transmembrana de fibrose cística), distrofina (incluindo o produto de proteína de minigenes de distrofina, consulte, por exemplo, Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130), utrofina (Tinsley et al., (1996) Nature 384:349), fatores de coagulação (Fator XIII, Fator IX, Fator X, etc.), anticorpos monoclonais (Lewis et al., 2002), eritropoietina, o receptor de LDL, lipoproteína lipase, ornitina transcarbamilase, β-globina, α-globina, espectrina, α- antitripsina, adenosina deaminase, hipoxantina guanina fosforibosil transferase, β-glucocerebrosidase, esfingomielinase, hexosaminidase lisossômica, cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, hormônios, fatores de crescimento (por exemplo, fatores de crescimento do tipo insulina 1 e 2, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de nervo, fator neurotró- fico -3 e -4, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento derivado da glia, fator de crescimento de transformação α e β e similares), citocinas (por exemplo, α-interferon, β-interferon, interferon-Y, interleucina-2, interleucina-4, interleucina 12, fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófagos, linfotoxina), produtos de gene suicida (por exemplo, timidina quinase do vírus herpes simplex, citosina deaminase, toxina da difteria, citocromo P450, deoxicitidina quinase e fator de necrose tumoral), proteínas que conferem resistência a um fármaco usado na terapia contra o câncer, produtos de gene supressor de tumor (por exemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, VHL, APC e similares) e qualquer outro peptídeo ou proteína que tenha um efeito terapêutico em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00025] Os peptídeos ou proteínas terapêuticos exemplificativos adicionais incluem aqueles que podem ser usados no tratamento de uma condição de doença incluindo, porém sem limitação, fibrose cística (e outras doenças do pulmão), hemofilia A, hemofilia B, talassemia, anemia e outros distúrbios sanguíneos, AIDS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotró- fica, epilepsia e outros distúrbios neurológicos, câncer, diabetes melli- tus, distrofias musculares (por exemplo, Duchenne, Becker), doença de Gaucher, doença de Hurler, deficiência de adenosina desaminase, doenças de armazenamento de glicogênio e outros defeitos metabólicos, doenças degenerativas da retina (e outras doenças do olho) e doenças de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração).

[00026] O termo "promotores" ou "promotor" conforme usado no presente documento pode se referir a uma sequência de DNA que é localizada adjacente a uma sequência de DNA que codifica um produto recombinante. Um promotor é, de preferência, ligado operativamente a uma sequência de DNA adjacente. Um promotor aumenta tipicamente uma quantidade de produto recombinante expresso a partir de uma sequência de DNA em comparação a uma quantidade do produto recombinante expresso quando não existe nenhum promotor. Um promotor de um organismo pode ser utilizado para intensificar a expressão de produto recombinante de uma sequência de DNA que se origina de outro organismo. Por exemplo, um promotor vertebrado pode ser usado para a expressão de GFP de água-viva em vertebrados. Adicionalmente, um elemento promotor pode aumentar uma quantidade de produtos recombinantes expressos para múltiplas sequências de DNA ligadas em tandem. Portanto, um elemento promotor pode inten-sificar a expressão de um ou mais produtos recombinantes. Múltiplos elementos promotores são bem conhecidos por indivíduos versados na técnica.

[00027] Em uma modalidade, a expressão constitutiva de alto nível será desejada. Os exemplos de tais promotores incluem, sem limitação, o promotor/intensificador LTR de vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), o promotor/intensificador precoce imediato de citomegalo- vírus (CMV) (consulte, por exemplo, Boshart et al, Cell, 41:521 a 530 (1985)), o promotor de SV40, o promotor de diidrofolato redutase, o promotor de β-actina citoplásmica e o promotor de fosfoglicerol qui- nase (PGK).

[00028] Em outra modalidade, promotores induzíveis podem ser desejados. Os promotores induzíveis são aqueles que são regulados por compostos supridos exogeneamente, ou em cis ou em trans, incluindo, sem limitação, o promotor de metalotionina (MT) de ovelha indu- zível por zinco; o promotor de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV) induzível por dexametasona (Dex); o sistema de promotor de polimerase T7 (WO 98/10088); o sistema reprimível por tetraciclina (Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:5.547 a 5.551 (1992)); o sistema induzível por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268:1.766 a 1.769 (1995); consulte também Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512 a 518 (1998)); o sistema induzível por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239 a 243 (1997) e Wang et al., Gene Ther., 4:432 a 441 (1997)]; e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2.865 a 2.872 (1997); Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1.028 a 1.032 (1996)). Outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis nesse contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda ou em células de replicação somente.

[00029] Em outra modalidade, o promotor nativo para o transgene ou sequência de ácido nucleico de interesse será usado. O promotor nativo pode ser preferencial quando é desejado que a expressão do transgene ou da sequência de ácido nucleico deve imitar a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene ou outra sequência de ácido nucleico deve ser regulada de modo temporal ou desenvolvida ou de uma maneira específica para tecido ou em resposta a um estímulo transcricional específico. Em uma modalidade adicional, outros elementos de controle de expressão nativos, tais como elementos intensificadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso Kozak podem também ser usados para imitar a expressão nativa.

[00030] Em uma modalidade, o genoma viral recombinante compreende um transgene ligado operativamente a um promotor específico para tecido. Por exemplo, se a expressão em músculo esquelético for desejada, um promotor ativo no músculo pode ser usado. Esses incluem os promotores a partir de genes que codificam α-actina esquelética, cadeia leve de miosina 2A, distrofina, creatina quinase de músculo, assim como promotores de músculo sintéticos com atividades maiores do que os promotores de ocorrência natural. Consulte Li et al., Nat. Biotech., 17:241 a 245 (1999). Os exemplos de promotores que são específicos para tecido são conhecidos para albumina de fígado, Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor de núcleo de vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996); alfa- fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], óssea (osteocalcina, Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997); sialoproteina óssea, Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11 :654- 64 (1996)), linfócitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); cadeia pesada de imunoglobulina; cadeia a de receptor de célula T), neuronal (promotor de específica para neurônio (NSE), Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); gene de cadeia leve de neurofilamento, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 88:5611-5 (1991); o gene vgf específico para neurônio, Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]; dentre outros.

[00031] O termo "intensificadores" ou "intensificador" conforme usado no presente documento pode se referir a uma sequência de DNA que é localizada adjacente à sequência de DNA que codifica um produto recombinante. Os elementos intensificadores são localizados tipicamente a montante de um elemento promotor ou podem ser localizados a jusante ou dentro de uma sequência de codificação de DNA (por exemplo, uma sequência de DNA transcrita ou traduzida em um produto ou produtos recombinantes). Portanto, um elemento intensificador pode ser localizado 100 pares de base, 200 pares de base ou 300 ou mais pares de base a montante ou a jusante de uma sequência de DNA que codifica o produto recombinante. Os elementos intensificado- res podem aumentar uma quantidade de produto recombinante ex- presso a partir de uma sequência de DNA acima da expressão aumentada proporcionada por um elemento promotor. Múltiplos elementos intensificadores estão prontamente disponíveis aos indivíduos versados na técnica.

[00032] "Ácido nucleico" ou uma "molécula de ácido nucleico" conforme usado no presente documento se refere a qualquer molécula de DNA ou RNA, de fita única ou dupla e, se for de fita única, a molécula de sua sequência complementar em forma linear ou circular. Na discussão de moléculas de ácido nucleico, uma sequência ou estrutura de uma molécula de ácido nucleico particular pode ser descrita no presente documento de acordo com a convenção normal de fornecer a sequência na direção 5' a 3'. Em referência aos ácidos nucleicos da invenção, o termo "ácido nucleico isolado" é usado algumas vezes. Esse termo, quando aplicado ao DNA, refere-se a uma molécula de DNA que é separada das sequências com as quais a mesma é imediatamente contígua no genoma de ocorrência natural do organismo no qual a mesma é originada. Por exemplo, um "ácido nucleico isolado" pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou vírus ou integrada no DNA genô- mico de uma célula procariótica ou eucariótica ou um organismo hospedeiro.

[00033] Um "vetor" é um replicon, tal como um plasmídeo, cosmí- deo, bacmídeo, fago ou vírus, ao qual outro elemento ou sequência genética (ou DNA ou RNA) pode ser ligado de modo a ocasionar a re- plicação do elemento ou sequência genética.

[00034] Um "operon de expressão" refere-se a um segmento de ácido nucleico que pode possuir sequências de controle de transcrição e tradução, tais como promotores, intensificadores, sinais de início de tradução (por exemplo, códons de ATG ou AUG), sinais de poliadeni- lação, terminadores e similares e que facilitam a expressão de uma sequência de codificação de polipeptídeo em um organismo ou célula hospedeira.

[00035] Os termos "transformar", "transfectar", "transduzir" devem se referir a qualquer método ou meio pelo qual um ácido nucleico é introduzido em uma célula ou organismo hospedeiro e podem ser usados alternadamente para transmitir o mesmo significado. Tais métodos incluem, porém sem limitação, transfecção, eletroporação, microinje- ção, infecção, fusão por PEG e similares.

[00036] O ácido nucleico introduzido pode ou não ser integrado (co- valentemente ligado) no ácido nucleico da célula ou organismo receptor. Em células bacterianas, de levedura, vegetais e de mamíferos, por exemplo, o ácido nucleico introduzido pode ser mantido como um elemento epissomal ou replicon independente tal como um plasmídeo. Alternativamente, o ácido nucleico introduzido pode se tornar integrado no ácido nucleico da célula ou organismo receptor e ser estavelmente mantido nessa célula ou organismo e passado adicionalmente para ou herdado pelas células ou organismos descendentes da célula ou organismo receptor. Finalmente, o ácido nucleico introduzido pode existir na célula receptora ou organismo hospedeiro somente transientemente.

[00037] O termo "gene de marcador selecionável" se refere a um gene que quando expresso confere um fenótipo selecionável, tal como resistência antibiótica, em uma célula ou planta transformada.

[00038] O termo "operativamente ligado" significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão da sequência de codificação são colocadas na molécula de DNA nas posições apropriadas em relação à sequência de codificação de modo a efetuar a expressão da sequência de codificação. Essa mesma definição é aplicada algumas vezes à disposição de unidades de transcrição e outros elementos de controle de transcrição (por exemplo, intensificadores) em um vector de expressão.

[00039] O termo "oligonucleotídeo" conforme usado no presente documento se refere a sequências, iniciadores e sondas da presente invenção e é definido como uma molécula de ácido nucleico composta de dois ou mais ribo ou desoxirribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato do oligonucleotídeo dependerá de vários fatores e da aplicação particular e uso do oligonucleotídeo.

[00040] A frase "hibridizam especificamente" se refere à associação entre duas moléculas de ácido nucleico de fita única de sequências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas usadas geralmente na técnica (denominadas algumas vezes "substancialmente complementares"). Particularmente, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contida dentro de uma molécula de DNA ou RNA de fita única da invenção, para a exclusão substancial da hibridização do oligonucleotídeo com ácidos nu- cleicos de fita única da sequência não complementar.

[00041] O termo "iniciador" conforme usado no presente documento se refere a um oligonucleotídeo de DNA, ou de fita única ou de fita dupla, ou derivado de um sistema biológico, gerado pela digestão de enzima de restrição ou produzido sinteticamente que, quando colocado no ambiente apropriado, pode atuar funcionalmente como um principiante de síntese de ácido nucleico dependente de modelo. Quando apresentados com um modelo de ácido nucleico apropriado, os precursores de trifosfato de nucleosídeo adequados de ácidos nucleicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como uma temperatura e pH adequados, o iniciador pode ser estendido em seu terminal 3' pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou atividade similar para render um produto de extensão de iniciador. O iniciador pode variar em comprimento dependendo das condições particulares e exigência da aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnóstico, o iniciador de oligonucleotídeo tem tipicamente 15 a 25 ou mais nucleotí- deos de comprimento. O iniciador deve ter uma complementaridade suficiente ao modelo desejado para iniciar a síntese do produto de extensão desejado, isto é, poder emparelhar com a fita de modelo desejada de uma maneira suficiente para fornecer a porção química de hidroxila 3' do iniciador em justaposição apropriada para o uso na iniciação da síntese por uma polimerase ou enzima similar. Não é exigido que a sequência de iniciador represente um complemento exato do modelo desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos não complementar pode ser ligada na extremidade 5' de um iniciador complementar de outra maneira. Alternativamente, as bases não complementares podem ser intercaladas dentro da sequência de iniciador de oligonucleotídeo, desde que a sequência de iniciador tenha complementaridade suficiente com a sequência da fita de modelo desejado para fornecer funcionalmente um complexo de modelo e iniciador para a síntese do produto de extensão.

[00042] A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi descrita nas Patentes nos U.S.4.683.195, 4.800.195 e 4.965.188, as revelações inteiras das quais são incorporadas a título de referência no presente documento.

[00043] O termo "isolado" pode se referir a um composto ou complexo que foi separado suficientemente de outros compostos com os quais o mesmo seria naturalmente associado. "Isolado" não pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos ou materiais ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade fundamental ou ensaios seguintes e que podem estar presentes, por exemplo, devido à purificação incompleta ou a adição de estabilizadores.

[00044] O termo "resposta imunológica" pretende se referir a qualquer resposta a um antígeno ou determinante antigênico pelo sistema imunológico de um indivíduo vertebrado. As respostas imunológicas exemplificativas incluem respostas imunológicas humorais (por exemplo, a produção de anticorpos específicos para antígeno) e respostas imunológicas mediadas por célula (por exemplo, proliferação de linfóci- to), conforme definido no presente documento abaixo.

II. MÉTODOS DE USO E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO DOS VE-TORES VIRAIS ADENOASSOCIADOS VARIANTES DA INVENÇÃO

[00045] Os métodos da presente invenção fornecem um meio para entregar sequências de ácido nucleico heterólogas em uma faixa ampla de células hospedeiras, incluindo tanto células de divisão quanto de não divisão. Os vetores e outros reagentes, métodos e formulações farmacêuticas da presente invenção são adicionalmente úteis em um método para administrar uma proteína ou peptídeo em um indivíduo em necessidade do mesmo, como um método de tratamento ou de outra maneira. Dessa maneira, a proteína ou peptídeo pode ser produzido, desse modo, in vivo no indivíduo. O indivíduo pode estar em necessidade da proteína ou peptídeo porque o indivíduo tem uma deficiência da proteína ou peptídeo ou porque a produção da proteína ou peptídeo no indivíduo pode conferir algum efeito terapêutico, como um método de tratamento ou de outra maneira e conforme explicado adicionalmente abaixo.

[00046] Em geral, a presente invenção pode ser empregada para entregar qualquer ácido nucleico estrangeiro com um efeito biológico para tratar ou melhorar os sintomas associados a qualquer distúrbio relacionado à expressão de gene. Os estados de doença ilustrativos incluem, porém sem limitação: fibrose cística (e outras doenças do pulmão), hemofilia A, hemofilia B, talassemia, anemia e outros distúrbios de coagulação sanguínea, AIDS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, epilepsia e outros distúrbios neurológicos, câncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por exemplo, Duchenne, Becker), doença de Gaucher, doença de Hurler, deficiência de adenosina desaminase, doenças de armaze-namento de glicogênio e outros defeitos metabólicos, doenças degene-rativas da retina (e outras doenças do olho), doenças de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração) e similares.

[00047] Adicionalmente, a presente invenção pode ser empregada para entregar ácidos nucleicos que codificam anticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos que são conhecidos por fornecer efeitos biológicos benéficos para tratar ou melhorar os sintomas associados a canceres, doenças infecciosas e doenças autoimunes tal como artrite reumatoide. Outras sequências podem codificar, por exemplo, citocinas tais como interferon-alfa que podem modular o curso de uma doença.

[00048] A transferência de gene tem um uso potencial substancial no entendimento e fornecimento da terapia para estados de doença. Há várias doenças hereditárias nas quais os genes defeituosos são conhecidos e foram clonados. Em alguns casos, a função desses genes clonados é conhecida. Em geral, os estados de doença acima se situam em duas classes: estados de deficiência, usualmente de enzimas, que são geralmente hereditárias de uma maneira recessiva e estados não balanceados, pelo menos algumas vezes envolvendo proteínas reguladoras ou estruturais, que são hereditárias de uma maneira dominante. Para doenças de estado de deficiência, a transferência de gene poderia ser usada para trazer um gene normal para tecidos afetados para terapia de substituição, assim como para criar modelos animais para a doença com o uso de mutações antissenso. Para estados de doença não balanceados, a transferência de gene poderia ser usada para criar um estado de doença em um sistema de modelo que poderia, então, ser usado em esforços para agir contra o estado de doença. Consequentemente, os métodos da presente invenção permitem o tratamento de doenças genéticas. Conforme usado no presente documento, um estado de doença é tratado remediando-se parcial ou inteiramente a deficiência ou desequilíbrio que causa a doença ou torna a mesma mais grave. O uso da integração específica para sítio das sequências nucleicas para causar mutações ou para corrigir defeitos também é possível.

[00049] Finalmente, a presente invenção encontra uso adicional em métodos de diagnóstico e triagem, através dos quais um gene de interesse é expresso transiente ou estavelmente em um sistema de cultura celular ou, alternativamente, um modelo de animal transgênico.

III. INDIVÍDUOS, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, VACINAS E MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00050] A presente invenção revela o uso em aplicações tanto veterinárias como médicas. Os indivíduos adequados incluem tanto aves como mamíferos, sendo que mamíferos são preferenciais. O termo "ave", conforme usado no presente documento inclui, porém, sem limitação, galinhas, patos, gansos, codornas, perus e faisões. O termo "mamífero", conforme usado no presente documento inclui, porém, sem limitação, humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc.. Indivíduos humanos são a preferência máxima. Os indivíduos humanos incluem indivíduos fetais, neonatais, infantes, jovens e adultos.

[00051] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma partícula de vírus da invenção em um carreador farmaceuticamente aceitável ou outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, carreadores, adjuvantes, diluentes, etc. Para injeção, o carreador será tipicamente um líquido. Para outros métodos de administração, o carreador pode ser ou sólido ou líquido, tal como água livre de pirógeno estéril ou solução salina tamponada por fosfato livre de pirógeno. Para administração por inalação, o carreador será respirável e estará preferencialmente na forma de particulado sólido ou líquido. Como um meio de injeção, é preferen- cial usar água que contém os aditivos usuais para soluções de injeção, tal como agentes estabilizantes, sais ou salina e/ou tampões.

[00052] Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma célula em que um provírus AAV é integrado no genoma em um carreador farmaceutica- mente aceitável ou outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, carreadores, adjuvantes, diluentes, etc..

[00053] Por "farmaceuticamente aceitável", entende-se um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis. Portanto, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em transfecção de uma célula ex vivo ou na administração de uma célula ou partícula viral diretamente a um indivíduo.

[00054] A presente invenção fornece adicionalmente um método para entregar um ácido nucleico a uma célula. Para métodos in vitro, o vírus pode ser administrado à célula por métodos de transdução viral padrão, conforme são conhecidos na técnica. Preferencialmente, as partículas de vírus são adicionadas às células na multiplicidade apropriada de infecção de acordo com métodos de transdução padrão apropriados para as células alvo particulares. As titulações de vírus para administração podem variar, dependendo do tipo de célula alvo e do vetor viral particular, e podem ser determinadas por aqueles versados na técnica sem experimentação indevida. Alternativamente, a administração de um vetor de parvovírus da presente invenção pode ser realizada por quaisquer outros meios conhecidos na técnica.

[00055] Vetores virais recombinantes são preferencialmente administrados à célula em uma quantidade biologicamente eficaz. Uma quantidade "biologicamente eficaz" do vetor viral é uma quantidade que é suficiente para resultar em infecção (ou transdução) e expressão da sequência de ácidos nucleicos heterólogos na célula. Se o vírus for administrado a uma célula in vivo (por exemplo, o vírus é administrado a um indivíduo conforme descrito abaixo), uma quantidade "biologicamente eficaz" do vetor viral é uma quantidade que é suficiente para resultar em transdução e expressão da sequência de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula alvo.

[00056] A célula à qual o vetor viral inovador será administrado pode ser de qualquer tipo, incluindo, porém, sem limitação, células neurais (incluindo células dos sistemas nervosos periférico e central, em particular, células cerebrais), células pulmonares, células da retina, células epiteliais (por exemplo, células epiteliais intestinal e respiratória), células musculares, células pancreáticas (incluindo células beta), células hepáticas, células do miocárdio, células ósseas (por exemplo, células-tronco da medula óssea), células-tronco hemato- poiéticas, células do baço, queratinócitos, fibroblastos, células endo- teliais, células da próstata, células germinativas e similares. Alternativamente, a célula pode ser qualquer célula progenitora. Como uma alternativa adicional, a célula pode ser uma célula germinativa (por exemplo, célula germinativa neural, célula germinativa hepática). Além disso, as células podem ser de qualquer espécie de origem, conforme indicado acima.

[00057] Em modalidades particulares da invenção, as células são removidas de um indivíduo, o vetor de parvovírus é introduzido nas mesmas, e as células são então inseridas novamente no indivíduo. Os métodos para remover células do indivíduo para tratamento ex vivo, seguido por introdução de volta no indivíduo, são conhecidos na técnica. Alternativamente, o vetor de rAAV é introduzido em células de outro indivíduo, em células cultivadas, ou em células de qualquer outra fonte adequada, e as células são administras e um indivíduo que precisa das mesmas.

[00058] As células adequadas para terapia genética ex vivo incluem, porém, sem limitação, células hepáticas, células neurais (incluindo células dos sistemas nervosos central e periférico, em particular, células cerebrais), células pancreáticas, células do baço, fibroblastos (por exemplo, fibroblastos da pele), queratinócitos, células endoteliais, células epiteliais, mioblastos, células hematopoiéticas, células do estroma da medula óssea, células progenitoras e células-tronco.

[00059] As dosagens das células pra administração a um indivíduo variarão mediante a idade, condição e espécie do indivíduo, o tipo de célula, o ácido nucleico que é expresso pela célula, o modo de administração e similares. Tipicamente, pelo menos cerca de 102 a cerca de 108, preferencialmente cerca de 103 a cerca de 106 células serão administradas por dose. Preferencialmente, as células serão administradas em uma "quantidade terapeuticamente eficaz".

[00060] Uma quantidade "terapeuticamente eficaz", conforme usado no presente documento, é uma quantidade que é suficiente para aliviar (por exemplo, mitigar, diminuir, reduzir) pelo menos um dos sintomas associados a um estado de doença. Alternativamente determinado, uma quantidade "terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que é suficiente para fornecer algum aprimoramento na condição do indivíduo.

[00061] Um aspecto adicional da invenção é um método para tratar indivíduos in vivo com as partículas virais inovadoras. A administração das partículas de parvovírus da presente invenção a um indivíduo humano ou um animal que precisa da mesma pode ser por qualquer meio conhecido na técnica para administração de vetores virais.

[00062] Os modos exemplificativos de administração incluem administração oral, retal, transmucosal, tópica, transdérmica, inalação, parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular e intra-articular), e similares, assim como injeção direta em tecido ou órgão, alternativamente, injeções intratecal, intramuscular direta, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal ou intraocular. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como suspensões ou soluções líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Alternativamente, pode-se administrar o vírus em um local em vez de maneira sistêmica, por exemplo, em uma formulação de liberação prolongada ou depósito.

[00063] Em modalidades particularmente realizadas da invenção, a sequência de nucleotídeos de interesse é entregue ao fígado do indivíduo. A administração ao fígado pode ser atingida por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, porém, sem limitação, administração intravenosa, administração intraportal, administração intrabiliar, administração intra-arterial e injeção direta no parênquima do fígado.

[00064] Preferencialmente, as células (por exemplo, células hepáticas) são infectadas por um vetor de parvovírus recombinante que codifica um peptídeo ou uma proteína, as células expressam o peptídeo ou a proteína codificada e secretam o mesmo no sistema circulatório em uma quantidade terapeuticamente eficaz (conforme definido acima). Alternativamente, o vetor é entregue e expresso por outra célula ou tecido, incluindo, porém, sem limitação, cérebro, pâncreas, baço e músculo.

[00065] Em outras modalidades preferenciais, as partículas de par- vovírus inovadoras são administradas por via intramuscular, mas preferencialmente por injeção intramuscular ou por administração local (conforme definido acima). Em outras modalidades preferenciais, as partículas de parovírus da presente invenção são administradas aos pulmões.

[00066] O vetor de parovírus revelado no presente documento pode ser administrado aos pulmões de um indivíduo por qualquer meio ade- quado, mas é administrado preferencialmente por administração de uma suspensão em aerossol de partículas respiráveis compreendidas pelos vetores de parovírus inovadores, que o indivíduo inala. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. Aerossóis de partículas líquidas que compreendem os vetores de parovírus inovadores podem ser produzidos por meios adequados, tal como com um nebuliza- dor de aerossol acionado por pressão ou um nebulizador ultrassônico, conforme é conhecido por aqueles versados na técnica. Consulte, por exemplo, a Patente no 4.501.729. Aerossóis de partículas sólidas que compreendem os vetores virais inovadores podem ser similarmente produzidos com qualquer gerador de aerossol de medicamento parti- culado sólido, por técnicas conhecidas no campo farmacêutico.

[00067] As dosagens das partículas de parovírus inovadoras dependerão do modo de administração, da doença ou afecção a ser tratada, da condição do sujeito individual, do vetor viral particular e do gene a ser entregue e podem ser determinadas de uma maneira rotineira. As doses exemplificativas para atingir efeitos terapêuticos são titulações de vírus de pelo menos cerca de 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 ,1016 unidades de transdução ou mais, preferencialmente cerca de 108 a 1013 unidades de transdução, ainda mais preferencialmente 1012 unidades de transdução.

[00068] Em suma, os vetores de parvovírus, reagentes e métodos da presente invenção podem ser usados para direcionar um ácido nu- cleico a células ou que se dividem ou que não se dividem e para expressar estavelmente o ácido nucleico nas mesmas. Usando-se esse sistema de vetor, é agora possível introduzir em células, in vitro ou in vivo, genes que codificam proteínas que afetam fisiologia celular. Os vetores da presente invenção podem ser, portanto, úteis em terapia genética para estados de doença ou para modificação experimental de fisiologia celular.

[00069] O seguinte exemplo é fornecido para ilustrar certas modalidades da invenção. O mesmo não pretende limitar a invenção de qualquer forma.

EXEMPLO I Mutações de Lisina em Arginina afetam a taxa de transdução de AAV e entrega de MHC Identificação de resíduos de lisina a serem alvejados em vetores de AAV1 e AAV8

[00070] Usou-se o software UbPred para prever os sítios de ubiqui- tinação possíveis em proteínas de capsídeo AAV1, AAV2, AAV8 e Rh74 (Radivojac P et al, 2010). O software UbPred está disponível online em http://www.ubpred.org/index.html. A saída da análise é a previsão dos resíduos de lisina importantes para a ubiquitinação dentro da sequência de capsídeos de serotipo de AAV indicados. Consulte a Figura 1 e a Tabela 1. Esses são os seguintes:

[00071] Sequência de Proteína de capsídeo VP1 de AAV1: MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDD- GRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAG- DNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGL- VEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNF- GQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNE- GADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS- SASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQR- LINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFS- DSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMI- PQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEE- VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFS- RGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTW- TGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESA- GASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTD- PATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTD- GHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFIT- QYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTV- DNNGLYTEPRPIGTRYLTRP

Legenda: Identificação Faixa de pontuação Sensibilidade Especificidade Confiança baixa 0,62 < s < 0,69 0,464 0,903 Confiança média 0,69 < s < 0,84 0,346 0,950 Confiança alta 0,84 < s < 1,00 0,197 0,989 Mutantes desejáveis em AAV-1

Sequência de Proteína de capsídeo VP1 de AAV8: MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDD- GRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAG- DNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGL- VEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNF- GQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNE- GADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS- NGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQR- LINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTI- QVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMI- PQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYT- FEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTL- GFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAW- TAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIF- GKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQN- TAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGN- FHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFIT- QYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVN- TEGVYSEPRPIGTRYLTRNL Lisina

Legenda: Identificação Confiança baixa Confiança média Faixa de pontuação 0,62 < s < 0,69 0,69 < s < 0,84 Sensibilidade 0,464 0,346 Especificidade 0,903 0,950 Confiança alta 0,84 < s < 1,00 0,197 0,989

[00072] A tabela 3 anexa ao mesmo fornece o rendimento de vetor obtido com o uso dos diferentes mutantes de capsídeo, incluindo AAV8 da invenção. A tabela também indica se a mutação resultou em eficiências de transdução aumentadas, diminuídas ou compráveis em comparação a vetores do tipo selvagem do mesmo serotipo. Sequência de Proteína de capsídeo VP1 de AAV2: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDS- RGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQL- DSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLE- PLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLN- FGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNE- GADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWAL- PTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFN- RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTT- TIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMV- PQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYT- FEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR- LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSW- TGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIF- GKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNR- QAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTD- GHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFIT- QYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTV- DTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

Legenda: Identificação Confiança baixa Confiança média Confiança alta Faixa de pontuação 0,62 < s 0,69 < s 0,84 < s < 0,69 < 0,84 < 1,00 Sensibilidade Especificidade 0,464 0,346 0,197 0,903 0,950 0,989 Sequência de Proteína de capsídeo VP1 de AAV-Rh74: MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDN- GRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAG- DNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGL- VESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNF- GQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNE- GADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS- NGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQR- LINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTI- QVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMI- PQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYN- FEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGT- QQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSN- FAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMF- GKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADN- LQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGN- FHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFIT- QYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVN- TEGTYSEPRPIGTRYLTRNL Lisina

Legenda: Identificação Faixa de pontuação Sensibilidade Especificidade Confiança baixa 0,62 < s < 0,69 0,464 0,903 Confiança média 0,69 < s < 0,84 0,346 0,950 Confiança alta 0,84 < s < 1,00 0,197 0,989 Mutantes desejáveis em AAV-rh74 (consulte também a Tabela 3)

[00073] Os seguintes conjuntos de iniciadores foram utilizados para criar as variantes de capsídeo contendo lisina da invenção: Iniciadores usados para mutagênese: Iniciadores de AVV1: AAV1 K61R Senso: 5'-CTT CAA CGG ACT CGA CAG GGG GGA GCC-3' Antissenso: 5'-GGC TCC CCC CTG TCG AGT CCG TTG AAG-3' AAV1 K84R Senso: 5'-GCC TAC GAC CAG CAG CTC AGA GCG GGT GAC-3' Antissenso: 5'-GTC ACC CGC TCT GAG CTG CTG GTC GTA GGC-3' AAV1 K137R Senso: 5'-TGG TTG AGG AAG GCG CTA GGA CGG CTC CT-3' Antissenso: 5'-AGG AGC CGT CCT AGC GCC TTC CTC AAC CA-3' AAV1 K143R Senso: 5'-CTA AGA CGG CTC CTG GAA AGA GAC GTC CGG TAG-3' Antissenso: 5'-CTA CCG GAC GTC TCT TTC CAG GAG CCG TCT TAG-3' AAV1 K161R Senso: 5'-CGG GCA TCG GCA GGA CAG GCC AGC A-3' Antissenso: 5'-TGC TGG CCT GTC CTG CCG ATG CCC G-3' AAV1 K459R Senso: 5'-AGT CCG GAA GTG CCC AAA ACA GGG ACT TGC TGT -3' Antissenso: 5'-ACA GCA AGT CCC TGT TTT GGG CAC TTC CGG ACT-3' AAV1 K528R Senso: 5'-GCA CTG CTA TGG CCT CAC ACA GAG ACG ACG AAG-3' Antissenso: 5'-CTT CGT CGT CTC TGT GTG AGG CCA TAG CAG TGC-3' AAV1 K533R Senso: 5'-CAA AGA CGA CGA AGA CAG GTT CTT TCC CAT GAG CG-3' Antissenso: 5'-CGC TCA TGG GAA AGA ACC TGT CTT CGT CGT CTT TG -3' AAV1 K707R Senso: 5'-TGCAGTACACATCCAATTATGCAAGATCTGCCAACG TTG-3' Antissenso: 5'- CAACGTTGGCAGATCTTGCATAATTGGATGTGTACTGCA-3'

[00074] Iniciadores de AVV8: AAV8 K137R Senso: 5'-GGT TGA GGA AGG CGC TAG GAC GGC TCC TGG-3' Antissenso: 5' CCA GGA GCC GTC CTA GCG CCT TCC TCA ACC-3' AAV8 K333R Senso: 5'-GCA GAA TGA AGG CAC CAG GAC CAT CGC CAA TAA CC-3' Antissenso: 5'-GGT TAT TGG CGA TGG TCC TGG TGC CTT CAT TCT GC-3' AAV8 K530R Senso: 5'-GCA TCG CTA TGG CAA CAC ACA GAG ACG ACG AGG-3' Antissenso: 5'-CCT CGT CGT CTC TGT GTG TTG CCA TAG CGA TGC-3' AAV8 K709R Senso: 5'- GTACACCTCCAACTACTACAGATCTACAAGTGTGGACTTTG-3' Antissenso: 5'- CAAAGTCCACACTTGTAGATCTGTAGTAGTTGGAGGTGTAC-3'

[00075] Iniciadores de AVV2: AAV2 K39R Senso: 5'-GCCCGCAGAGCGGCATAGGGACGACAG-3' Antissenso: 5'-CTGTCGTCCCTATGCCGCTCTGCGGGC-3' AAV2 K137R Senso: 5'-CCTGGTTGAGGAACCTGTTAGGACGGCTCCGG-3' Antissenso: 5'-CCGGAGCCGTCCTAACAGGTTCCTCAACCAGG-3' AAV2 K143R Senso: 5'-AGACGGCTCCGGGAAAAAGGAGGCCGGTA-3' Antissenso: 5'-TACCGGCCTCCTTTTTCCCGGAGCCGTCT-3' AAV2 K161R Senso: 5'-CCTCGGGAACCGGAAGGGCGGGCC-3' Antissenso: 5'-GGCCCGCCCTTCCGGTTCCCGAGG-3' AAV2 K490R Senso: 5'-CCGCCAGCAGCGAGTATCAAGGACATCTGCGG-3' Antissenso: 5'-CCGCAGATGTCCTTGATACTCGCTGCTGGCGG-3' AAV2 K527R Senso: 5'-CGGCCATGGCAAGCCACAGGGACGATGAA-3' Antissenso: 5'-TTCATCGTCCCTGTGGCTTGCCATGGCCG-3' AAV2 K532R Senso: 5'-ACAAGGACGATGAAGAAAGGTTTTTTCCTCAGAGCGG-3' Antissenso: 5'- CCGCTCTGAGGAAAAAACCTTTCTTCATCGTCCTTGT-3'

[00076] Iniciadores de AAV-rh74: AAV-rh74 K137R Senso: 5'-CTGGTTGAATCGCCGGTTAGGACGGCTCCTG-3' Antissenso: 5'-GACCAACTTAGCGGCCAATCCTGCCGAGGAC-3' AAV-rh74 K333R Senso: 5'-GCAGAATGAAGGCACCAGGACCATCGCCAATAACC-3' Antissenso: 5'-GGTTATTGGCGATGGTCCTGGTGCCTTCATTCTGC-3' AAV-rh74 K530R Senso: 5'-GTTGCCATGGCTACCCACAGGGACGACGAA-3' Antissenso: 5'-TTCGTCGTCCCTGTGGGTAGCCATGGCAAC-3' AAV-rh74 K552R Senso: 5'-GGAAACAGGGAGCTGGAAGAGACAACGTGGACTAT-3' Antissenso: 5'-ATAGTCCACGTTGTCTCTTCCAGCTCCCTGTTTCC-3' AAV-rh74 K569R Senso: 5'-CTAACCAGCGAGGAAGAAATAAGGACCACCAACCC-3' Antissenso: 5'-GGGTTGGTGGTCCTTATTTCTTCCTCGCTGGTTAG-3' AAV-rh74 K691R Senso: 5'-CGAGTGGGAGCTGCAGAGGGAGAACAGCAA-3' Antissenso: 5'-TTGCTGTTCTCCCTCTGCAGCTCCCACTCG-3' AAV-rh74 K695R Senso: 5'-GCTGCAGAAGGAGAACAGCAGACGCTGGAACC-3' Antissenso: 5'-GGTTCCAGCGTCTGCTGTTCTCCTTCTGCAGC-3' AAV-rh74 K709R Senso: 5'- AGTACACTTCCAACTACTACAGATCTACAAATGTGGACTTTGC-3' Antissenso: 5'- GCAAAGTCCACATTTGTAGATCTGTAGTAGTTGGAAGTGTACT-3'

[00077] A Tabela 5 fornece uma série de vetores de AAV derivados de mutagênese que foram usados para acondicionar cassetes de ex-pressão de transgene de AAV com especificidade para fígado para FIX. A eficiência de acondicionamento foi indistinguível daquela observada com vetores de AAV8 não modificados do tipo selvagem.

[00078] Os mutantes de capsídeo que contêm 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos de lisina alterados em qualquer uma das proteínas de capsídeo descritas no presente documento para aumentar ainda mais a eficiência de transdução também estão dentro do escopo da invenção. Os dados também revelam que certas mutações resultam em variantes que exibiram eficiência de transdução significativamente reduzida. Tais variantes poderiam ser usadas em combinação com variantes que exibem eficiências de transdução aumentadas, para atuar como iscas para neutralizar ou saturar uma resposta imunológica direcionada por anticorpo aos vetores entrantes, possibilitando, desse modo, que vetores que portam os transgenes desejáveis entrem de modo mais eficaz nas células.

[00079] A Figura 1 mostra diagramas esquemáticos da superfície de capsídeo. Os dados apresentados nas Figuras 2A, 2B e 2C demos tram que alterar resíduos de lisina no capsídeo VP1 em AAV8 altera o nível de transgene produzido devido aos níveis de transdução altera-dos. A Figura 3A, 3B e 3C mostra os efeitos de mutações únicas e múltiplas na produção de HF.IX em células transduzidas. A Figura 3D demonstra que mutações por combinação, por exemplo, de três resí-duos de lisina em arginina com quatro ou seis resíduos de tirosina em fenilalanina diminui as taxas de transdução.

Extermínio CTL de Hepatócitos HHL5-B7 com o uso de mutantes de lisina de AAV

[00080] Avaliou-se o extermínio CTL de hepatócitos transduzidos com certos mutantes de lisina de AAV revelados no presente documento. Os seguintes materiais e métodos foram empregados para avaliar o extermínio CTL de hepatócitos transduzidos.

Geração de vetor

[00081] Os vetores de AAV foram produzidos em células HEK-293 com o uso de uma abordagem de tripla transecção conforme descrito previamente (Matsushita, 1998) e purificados com métodos de centri-fugação de gradiente de cloreto de césio (Ayuso, 2010). Os peptídeos de epítopo de AAV foram sintetizados por Genemed Synthesis e res- suspensos a uma concentração de 5 mg/ml em 100% de DMSO.

Expansão in vitro de células T

[00082] PBMCs humanos (Cellular Technology LTD) foram descon-gelados, lavados, contados e ressuspensos a uma concentração de 2 x 106 células/ml em meio de linfócito AIM-V (Gibco) contendo 3% de soro humano (Bioreclamation), 1% de L-glutamina (Gibco) e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). Para cada condição de expansão, 1x106 (500 μl) células foram adicionadas por poço em uma placa de 24 poços (BD Falcon) em um volume de 500 μl. 1x106 (500 μl) adicionais de esplenócitos irrigados autólogos (3.000 rad) foram também adicio-nados a cada poço como células alimentadoras, juntamente com 2,5 μg/ml de β-2-microglobulina humana (Lee Biosolutions) e 10 ng/ml de IL-7 recombinante humana (R&D Systems). As células foram expandi-das na presença de peptídeo de AAV a uma concentração final de 10 μg/ml a 37 °C em 5% de CO2. IL-2 humana (Roche) a uma concentra-ção de 10 ng/ml foi adicionada à cultura celular após as primeiras 24 horas e preenchida normalmente a cada 48 horas posteriormente. As células foram divididas em novos poços conforme necessário e a esti-mulação antigênica (antígeno e células alimentadoras) foi repetida a cada 7 a 10 dias por até 3 ciclos de reestimulação.

ENSAIO DE CTL

[00083] O ensaio de CTL foi realizado conforme descrito previamente (Pien, 2009). Em resumo, a liberação de lactato desidrogenase (LDH) seguida por lise mediada por CTL foi medida com o Ensaio de Citotoxicidade Não radioativo CytoTox 96 (Promega). Quatro mil célu-las alvo hepatócito HHL5 foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano Microtest Primaria (BD Falcon) em DMEM não contendo soro. As células alvo foram transduzidas em um MOI de 5.000, 50.000 e 50.000 de capsídeo de AAV e incubadas por 18 horas a 37 °C e 5% de CO2. Após o tratamento e a incubação, as células alvo plaqueadas foram lavadas uma vez com meios antes da adição de linfócitos T citotóxicos com especificidade para epítopo, ex-pandidas conforme descrito acima. CTLs foram adicionados a uma ra-zão celular entre efetor e célula alvo de 10:1 por 4 horas a 37 °C, 5% de CO2 e LDH foi medido após uma incubação de 30 minutos à tempe-ratura ambiente com leitura de substrato enzimático a 490 nm com o uso de um espectrofotômetro (Spectramax).

Citometria de fluxo

[00084] A expressão de GFP após a transdução de AAV foi medida por citometria de fluxo. Hepatócitos humanos de linhagens celulares HHL5 ou Huh7 foram plaqueados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina (Gibco) e 1% de penicili- na/estreptomicina (Gibco) a uma densidade de 250.000 células/poço em uma placa de 24 poços Primaria Multiwell (BD Falcon). As células foram transduzidas com 5.000, 50.000 ou 5.000.000 MOI de vetor de AAV e incubadas por 18 horas a 37°C e 5% de CO2. Após a incuba-ção, as células foram tripsinizadas, lavadas duas vezes com PBS 2% FBS e fixadas com 2% de paraformaldeído. As amostras foram adqui-ridas em um citômetro de fluxo FACS Canto II com o uso de FACSDi- va® (BD Biosciences) e análise adicional foi realizada com o uso do software Flowjo® (Treestar).

RESULTADOS DE ENSAIO DE CTL

[00085] A fim de testar adicionalmente o efeito das mutações de lisina na transdução viral, utilizou-se um ensaio de citotoxicidade mediado por CTL in vitro previamente desenvolvido em laboratório para testar a funcionalidade de vetores de AAV (Pien et al.). Os resultados de transdução de AAV1 e AAV2 são mostrados nas Figuras 4, 5 e 6. Na Figura 4, todas as mutações de lisina no capsídeo AAV-1 resultaram em uma diminuição em extermínio mediado por CTL de células alvo, sugerindo que as mutações de lisina levaram a processamento e apresentação menos eficiente de antígeno superficial mediante trans- dução. Além disso, o efeito de mutações de lisina parece ser aditivo, com o triplo e quádruplo de mutantes de lisina mostrando a maior di-minuição de extermínio mediado por CTL (Figura 4A, B). As mutações ao capsídeo AAV-2 mostraram um efeito similar. Consulte as Figuras 5 e 6. A Figura 7 mostra os resultados de transdução obtidos quando variantes Rh74 foram testadas.

[00086] Em suma, revelou-se que realizar mutação dos resíduos de lisina em capsídeos de AAV em resíduos de arginina aumenta a eficiência de transdução de AAV. Os experimentos identificaram diversas variantes que mediante transdução resultaram em níveis maiores de expres- são do transgene de fator IX (FIX) humano em camundongos em comparação a animais que receberam vetores de AAV não modificados. REFERÊNCIAS Xie Q, Bu W, Bhatia S, Hare J, Somasundaram T, Azzi A, et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:10.405 a 10.410 High KA, Aubourg P "rAAV human trial experience" Meth-ods Mol Biol. 2011;807:429 a 457. Zhong L, Zhao W, Wu J, Li B, Zolotukhin S, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Srivastava A. "A dual role of EGFR protein tyrosine kinase signaling in ubiquitination of AAV2 capsids and viral second-strand DNA synthesis." Mol Ther. julho de 2007;15(7):1.323 a 1.330. 17 de abril de 2007. Zhong L, Li B, Mah CS, Govindasamy L, Agbandje- McKenna M, Cooper M, Herzog RW, Zolotukhin I, Warrington KH Jr, Weigel-Van Aken KA, Hobbs JA, Zolotukhin S, Muzyczka N, Srivastava A. "Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point muta-tions in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses." Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 3;105(22):7.827 a 7.832. Thrower JS, Hoffman L, Rechsteiner M, e Pickart C M "Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal." EMBO J. 4 de janeiro de 2000; 19(1): 94 a 102. Bedford L, Lowe J, Dick LR, Mayer RJ, Brownell JE. "Ubiq-uitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets" Nat Rev Drug Discov. janeiro de 2011;10(1):29 a 46. Peng, J; Schwartz; Elias; Thoreen; Cheng; Marsischky; Roe- lofs; Finley et al (Aug 2003). "A proteomics approach to understanding protein ubiquitination". Nature biotechnology 21 (8): 921 a 926. Radivojac, P., Vacic, V., Haynes, C., Cocklin, R. R., Mohan, A., Heyen, J. W., Goebl, M. G., e Iakoucheva, L. M. Identification, Analysis and Prediction of Protein Ubiquitination Sites. Proteins: Struc-ture, Function, and Bioinformatics. 78(2):365 a 380. (2010)

[00087] Apesar de certas modalidades preferenciais da presente invenção terem sido descritas e especificamente exemplificadas acima, não se pretende que a invenção seja limitada a tais modalidades. Várias modificações podem ser feitas à mesma sem afastamento do escopo e espírito da presente invenção, conforme apresentado nas seguintes reivindicações. Tabela 1 Comparação das posições de lisina em AAV1, AAV2 e AAV8 e suas previsões de ubiquitinação Cor do Marcador: Verde: baixa confiança; Azul: média confiança; Ver-melho: alta confiança; Preto: não há previsão de ubiquitinação AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDSO AAV8 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQSQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 60 AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERH[2DDSRGLVLPGYKYLGPFNGLD6O AAV-rh74 MAADGYLPDWLED NLSEGIR EWWDLKPGAPKP KANQQ KQDNG RGLVLPGYKYLG PF NGLD 60 AAV1 IJGEPVNAADAAALEHCSAYDQQLUAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV8 EGEPVNAADAAALEHDSAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV2 2GEPVNEADAAW-EHEOAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERL,<EDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV-rh74 ^GEPVNAADAAALEHD^YDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV1 ESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRV 239 AAV8 ESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV240 AAV2 DSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRV239 AAV-rW4 ESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV240 AAV1 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTG-ASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ298 AAV8 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 300 AAV2 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS-SQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 297 AAV-rh74 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPROWQ 300 AAV1 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSA 358 AAV8 RLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGT(2TIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA 380 AAV2 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSA 357 AAV-rh74 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGI{2TIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA36O AAV1 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEE 418 AAV8 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFED420 AAV2 HQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFED417 AAV-rh74 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFÊD420 AAV1 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPUDQYLYYLNRTQNQSGSAQNÇJDLLFSRGSPAGMSVQPKNW 478 AAV8 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNW 480 AAV2 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNW 477 AAV-rh74 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW480 AAV1 LPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGAS|2YNLNGRESIINPGTAMASHÍ3DDED[3FFPMS538 AAV8 LPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMAThyjDDEERFFPSN 540 AAV2 LPGPCYRQQRVSIJTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHJDDEE^FFPQSSS? AAV-rh74 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATH[3DDEERFFPSS 540 AAV1 GVM1FG^SAGASNTALDNVMITDEEE(3ATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHA 598 AAV8 GILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEE^TTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNS6OO AAV2 GVLIFGKQGSESTNVDI^VMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNT 597 AAV-rh74 GVLMFGKQGAGIJDNVDYSSVMLTSEEEI^TTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS 600 AAV1 MGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANP 658 AAV8 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQ1LIKNTPVPADP660 AAV2 QGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANP 657 AAV-i+174 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP 660 AAV1 PAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQWENS|2RWNPEVQYTSNYA2SANVDFTVDNN718 AAV8 PUFNQSy|LNSFITQYSTGQVSVEIEWELQMENS&WNPEIQYTSNYYSsTSVDFAVNTE 720 AAV2 STTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWEL(^ENSERWNPEIQYTSNYN|SSVNVDFTVDTN 717 AAV-rh74 PTTFNQAKLASFlTQYSTGQVSVEIEWELC^EN^RWNPEIQYTSNYYygSTNVDFAVNTE 720 AAV1 GLYTEPRPIGTRYLTRP- 735 AAV8 GVYSEPRPIGTRYLTRNL 738 AAV2 GVYSEPRPIGTRYLTRNL 735 AAV-rh74 GTYSEPRPIGTRYLTRNL 738 Tabela 2

[00088]Ub Pred software (http://ubpred.org/):

[00089] A. Hey Analysi Ub Pred software (http://ubpred.org/): Radivojac P., Vacic, V., Haynes, C., Cocklin, R.R., Mohan, en, J.W., Goebl, M.G., and Iakoucheva, L.M. Identification, s and Prediction of Protein Ubiquitination Sites. Proteins: Struc- ture, Function, and Bioinformatics. 78(2):365-380. (2010). Tabela 3

Definição de TMR = K(137/333/530)R Definição de HMF = Y(253/275/447/703/707/733)F Definição de HMR : K(137/259/333/530/552/569)R Definição de 195/202 : G195A+L199V+S201P+G202N

Claims (16)

1. Vetor de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pe-lo fato de que compreende uma proteína de capsídeo VP1 que com-preende as seguintes substituições de lisina na posição 137, K137R, na posição 333, K333R, e na posição 530, K530R, de uma proteína de capsídeo de AAV-rh74 VP1 (SEQ ID NO: 4), em que o referido vetor compreende ainda um minigene que compreende repetições de termi-nal invertidas de AAV e uma sequência de ácidos nucleicos heterólo- gos ligada de modo operativo a sequências reguladoras que direcio-nam a expressão de um produto da sequência de ácidos nucleicos he- teróloga em uma célula hospedeira, em que a referida substituição de lisina é eficaz para inibir ubiquitinação da referida proteína de capsí- deo, aumentando, desse modo, a transdução do referido vetor de AAV em uma célula alvo, em comparação a um vetor de AAV compreen-dendo a proteína de capsídeo de AAV-rh74 VP1 sem as substituições de lisina.

2. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de ácidos nucleicos heteróloga é um ácido nucleico ou peptídeo terapêutico.

3. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado pelo fato de que o peptídeo terapêutico é um fator de coagula-ção selecionado a partir do grupo que consiste em Fator VIII, Fator IX ou um fragmento funcional dos mesmos.

4. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de ácidos nucleicos heteróloga é uma IgG, uma IgM, uma IgA, uma IgD, uma IgE, uma imunoglobulina quimérica, um anticorpo humanizado ou um anticorpo de cadeia única.

5. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de áci- dos nucleicos heteróloga é uma imunoglobulina quimérica.

6. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, ca-racterizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de ácidos nucleicos heteróloga é um anticorpo de cadeia única.

7. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de ácidos nucleicos heteróloga é um RNA de interferência (RNAi).

8. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 7, caracte-rizado pelo fato de que o referido RNAi é um RNAi antiviral, em que o referido RNAi antiviral é eficaz para inibir a infecção e a replicação de HCV.

9. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 7, caracte-rizado pelo fato de que o referido RNAi é eficaz para inibir a expressão de um gene alvo eucariótico.

10. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de áci-dos nucleicos heteróloga é uma citocina de modificação de doença.

11. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de áci-dos nucleicos heteróloga é um par de nucleases de dedo de zinco.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de AAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um veículo fisiológico compatível para o mesmo.

13. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de áci-dos nucleicos heteróloga é Fator VIII.

14. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o produto de expressão da sequência de áci-dos nucleicos heteróloga é Fator IX.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende os vetores de AAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 13 ou 14, e um veículo fisiológico compatível para o mesmo.

16. Uso do vetor de AAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou da composição farmacêutica, como defi-nida na reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia A ou hemofilia B.

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