BR122017002991B1 - Composições imunogênicas aquosas para múltiplos sorogrupos meningocócicos - Google Patents

Abstract

Sacarídeos capsulares conjugados dos sorogrupos meningocócicos C, W135 e Y são seguros e imunogênicos em humanos, quando combinados em uma dose única. Esse efeito é retido quando é adicionado um sacarídeo capsular conjugado do sorogrupo A. Esses antígenos conjugados podem ser combinados estavelmente em uma dose única aquosa, sem a necessidade de liofilização. Pode ser obtida uma ampla proteção contra infecção pelo sorogrupo B com o uso de um pequeno número de antígenos definidos de polipeptídeo. Esses antígenos de polipeptídeo podem ser combinados com os antígenos de sacarídeo, sem perda da eficácia protetora para qualquer um dos cinco sorogrupos. A eficácia é retida mesmo se for adicionado um conjugado de Hib. A eficácia de um conjugado do sorogrupo W135 é aumentada pela adição de antígenos protéicos derivados de uma cepa do sorogrupo B. A adição de um conjugado de Hib aos conjugados meningocócicos aumenta a atividade global contra o sorogrupo W135 de meningococo.

Description

[001] Todos os documentos aqui citados são incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] Essa invenção se relaciona à imunização contra meningite bacteriana e, particularmente, à imunização combinada contra meningite bacteriana causada por múltiplos patógenos.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[003] N. meningitidis é um patógeno humano não móvel, Gram- negativo, que coloniza a faringe e causa meningite (e, ocasionalmente, septicemia na ausência de meningite). Causa doença tanto endêmica quanto epidêmica. Após a introdução da vacina de conjugado contra Haemophilus influenzae do tipo B (Hib), N. meningitidis é a principal causa de meningite bacteriana nos EUA. Um terceiro patógeno responsável por meningite bacteriana é Streptococcus pneumoniae, mas uma vacina eficaz (PrevNarTM [1]) é agora disponível. Como a vacina para Hib, a vacina pneumocócica se baseia em conjugados de antígenos sacarídicos capsulares.

[004] Com base no polissacarídeo capsular do organismo, foram identificados vários sorogrupos de N. meningitidis, incluindo A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y e Z. O sorogrupo A é patógeno mais frequentemente implicado na doença endêmica na África subsaariana. Os sorogrupos B e C são responsáveis pela grande maioria dos casos nos Estados Unidos e na maioria dos países desenvolvidos. Os sorogrupos W135 e Y são responsáveis pelo resto dos casos no EUA e nos paises desenvolvidos. Embora o polissacarídeo capsular seja um imunógeno protetor eficaz, cada sorogrupo exige um antígeno sacarídico separado, e essa abordagem é inadequada para a imunização contra o sorogrupo B. Dessa forma, o recente sucesso com vacinas conjugadas de sacarídeos contra o sorogrupo C (MenjugateTM [2], MeningitecTM e NeisVac-CTM) não teve nenhum impacto na doença causada pelos sorogrupos A, B, W135 ou Y; pelo contrário, essas vacinas apresentam uma pressão seletiva em direção à emergência desses sorogrupos como as principais causas de doença meningocócica.

[005] Uma vacina tetravalente injetável de polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, Y e W135 é conhecida há muitos anos [3,4] e é licenciada para uso humano. Os polissacarídeos nessa vacina são não- conjugados e estão presentes em uma proporção de peso de 1:1:1:1 [5], com 50 μg de cada polissacarídeo purificado. Embora seja eficaz em adolescentes e adultos, ela induz uma resposta imune pobre e uma curta duração de proteção e não pode ser usada em bebês (por exemplo, referência 6). Além disso, as vacinas apresentam a desvantagem de necessitar de reconstituição a partir das formas liofilizadas no momento do uso.

[006] Para o sorogrupo B, uma vacina mostrou-se decepcionante. Foram testadas vacinas baseadas em vesículas da membrana externa (por exemplo, referência 7), mas a proteção é tipicamente restrita à cepa usada para fabricar a vacina.

[007] Dessa forma, permanece a necessidade de uma vacina que proteja contra os sorogrupos meningocócicos A, C, W135 e Y em crianças, e também uma que não necessite de reconstituição antes de ser administrada. Além disso, permanece a necessidade de uma vacina que proteja amplamente contra o sorogrupo B.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

[008] A invenção preenche todas essas necessidades e se baseia em oito achados separados. Primeiro, os inventores verificaram que sacarídeos capsulares conjugados de sorogrupos meningocócicos C, W135 e Y são seguros e imunogênicos em humanos quando combinados em uma dose única. Segundo, eles verificaram que esse efeito é mantido quando é adicionado um sacarídeo capsular conjugado do sorogrupo A. Terceiro, verificaram que esses antígenos conjugados podem ser combinados de forma estável em uma única dose aquosa, sem necessidade de liofilização. Quarto, verificaram que pode ser obtida uma ampla proteção contra infecção pelo sorogrupo B usando um pequeno número de antígenos polipeptídicos definidos. Quinto, constataram que esses antígenos polipeptídicos podem ser combinados com os antígenos sacarídicos sem perda de eficácia protetora para qualquer um dos cinco sorogrupos. Sexto, verificaram que a eficácia é mantida mesmo se for adicionado um conjugado de Hib. Sétimo, verificaram que a eficácia de um conjugado do sorogrupo W135 é intensificada pela adição de antígenos protéicos derivados de uma cepa do sorogrupo B. Finalmente, constataram que a adição de um conjugado de Hib aos conjugados meningocócicos aumenta a atividade global contra sorogrupo W135 de meningococo.

[009] Dessa forma, a invenção fornece uma composição imunogênica aquosa a qual, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta imune bactericida contra sorogrupos B, C, W135 e Y de N. meningitidis, em que a composição compreende: (i) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo C; (ii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo W135; (iii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo Y; e (iv) um ou mais antígenos polipeptídicos do sorogrupo B. A composição aquosa também pode induzir uma resposta imune bactericida contra sorogrupo A de N. meningitidis e pode, desse modo, compreender ainda: (v) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo A.

[0010] A invenção também fornece uma composição imunogênica aquosa a qual, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta imune que é (a) bactericida pelo menos contra o sorogrupo W135 de N. meningitidis e (b) protetora contra a doença por H. influenzae do tipo b, em que a composição compreende: (i) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo W135; (ii) um antígeno sacarídico capsular conjugado de H. influenzae do tipo b. A composição pode ainda incluir conjugados de antígenos sacarídicos capsulares dos sorogrupos C e Y e, opcionalmente, A. Ela pode ainda incluir antígenos polipeptídicos do sorogrupo B de N. meningitidis.

[0011] Antígenos sacarídicos preferidos são oligossacarídeos.

[0012] Sorogrupos C, W135 e Y

[0013] Técnicas para a preparação de polissacarídeos capsulares de meningococos são conhecidas há muitos anos e tipicamente envolvem um processo que compreende as etapas de precipitação do polissacarídeo (por exemplo, usando um detergente catiônico), fracionamento com etanol, extração com fenol gelado (para a remoção de proteína) e ultracentrifugação (para a remoção de LPS) (por exemplo, veja a referência 8).

[0014] Um processo mais preferido [9] envolve a precipitação do polissacarídeo seguida por solubilização do polissacarídeo precipitado usando um álcool inferior. A precipitação pode ser obtida usando um detergente catiônico como sais de tetrabutilamônio e cetiltrimetilamônio (por exemplo, os sais de brometo), ou brometo de hexadimetrina e sais de miristiltrimetilamônio. Brometo de cetiltrimetilamônio (‘CTAB’) é particularmente preferido [10]. A solubilização do material precipitado pode ser obtida usando um álcool inferior como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2- ol, dióis etc., mas etanol é particularmente adequado para solubilizar complexos CTAB-polissacarídeo. Etanol pode ser adicionado ao polissacarídeo precipitado para gerar uma concentração final de etanol (com base no conteúdo total de etanol e água) entre 50% e 95%.

[0015] Após re-solubilização, o polissacarídeo pode ser adicionalmente tratado para a remoção de contaminantes. Isso é particularmente importante em situações nas quais mesmo a mínima contaminação não é aceitável (por exemplo, para a produção de vacina humana). Isto tipicamente envolverá uma ou mais etapas de filtração, por exemplo, pode ser usada filtração profunda, filtração através de carvão ativado, filtração por tamanho e/ou ultrafiltração.

[0016] Uma vez filtrado para a remoção de contaminante, o polissacarídeo pode ser precipitado para tratamento e/ou processamento adicional. Isto pode ser convenientemente obtido por troca de cátions (por exemplo, pela adição de sais de cálcio ou sódio).

[0017] Após purificação, os sacarídeos capsulares são conjugados às proteínas transportadoras como descrito abaixo.

[0018] Métodos adicionais e alternativos para purificação e conjugação de sacarídeos meningocócicos são revelados nas referências 11 e 12.

[0019] Como alternativa à purificação, os sacarídeos capsulares da presente invenção podem ser obtidos por síntese total ou parcial, por exemplo, a síntese de Hib é revelada na referência 13 e a síntese de MenA na referência 14.

[0020] O sacarídeo pode ser quimicamente modificado, por exemplo, pode ser O-acetilado ou des-O-acetilado. Qualquer uma dessas des-O-acetilação ou hiper-acetilação pode ocorrer em posições específicas no sacarídeo. Por exemplo, a maioria das cepas do sorogrupo C tem grupos O-acetil na posição C-7 e/ou C-8 dos resíduos de ácido siálico, mas cerca de 15% de isolados clínicos são desprovidos desses grupos O-acetil [15,16]. A acetilação parece não afetar a eficácia protetora (por exemplo, diferentemente do produto MenjugateTM, o produto NeisVac-CTM usa um sacarídeo des-O-acetilado, mas ambas as vacinas são eficazes). O sacarídeo do sorogrupo W135 é um polímero de unidades de ácido siálico- dissacarídeo de galactose. O sacarídeo do sorogrupo Y é similar ao sacarídeo do sorogrupo W135, exceto que a unidade de dissacarídeo de repetição inclui glicose em vez de galactose. Da mesma forma que os sacarídeos do sorogrupo C, os sacarídeos de MenW135 e MenY têm O- acetilação variável, mas nas posições 7 e 9 de ácido siálico [17]. Qualquer modificação química como esta preferivelmente ocorre antes da conjugação, mas pode alternativa ou adicionalmente ocorrer durante a conjugação.

[0021] Sacarídeos de sorogrupos diferentes são, de preferência, purificados separadamente, e podem então ser combinados, tanto antes quanto após a conjugação.

[0022] Sorogrupo A

[0023] Composições da invenção podem incluir um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo A. O sacarídeo pode ser purificado e conjugado da mesma forma usada para os sorogrupos C, W135 e Y (veja acima), embora ele seja estruturalmente diferente - enquanto as cápsulas dos sorogrupos C, W135 e Y se baseiem em torno de ácido siálico (ácido N-acetil-neuramínico, NeuAc), a cápsula do sorogrupo A se baseia em N-acetil-manosamina, que é o precursor natural do ácido siálico. O sacarídeo do sorogrupo A é particularmente suscetível à hidrólise, e sua instabilidade em meios aquosos significa que (a) a imunogenicidade de vacinas líquidas contra o sorogrupo A diminui ao longo do tempo, e (b) o controle de qualidade é mais difícil, em função da liberação de produtos da hidrólise de sacarídeo na vacina.

[0024] O sacarídeo capsular nativo de MenA é um homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato ligado (α1^6), com O-acetilação parcial em C3 e C4. A ligação glicosídica principal é uma ligação 1-6 fosfodiéster que envolve o grupo hemiacetal de C1 e o grupo álcool de C6 da D-manosamina. O comprimento médio da cadeia é de 93 monômeros. Ele tem a seguinte fórmula:

[0025] Os inventores prepararam um antígeno sacarídico modificado que retém a atividade imunogênica do sacarídeo nativo do sorogrupo A, mas que é bem mais estável na água. Grupos hidroxila anexados aos carbonos 3 e 4 das unidades de monossacarídeo são substituídos por um grupo de bloqueio (referência 18).

[0026] O número de unidades de monossacarídeo que possuem grupos de bloqueio no lugar de hidroxilas pode variar. Por exemplo, todas ou substancialmente todas as unidades de monossacarídeo podem ter grupos de bloqueio. Alternativamente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das unidades de monossacarídeo podem ter grupos de bloqueio. Pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 unidades de monossacarídeo podem ter grupos de bloqueio.

[0027] Da mesma forma, o número de grupos de bloqueio em uma unidade de monossacarídeo pode variar. Por exemplo, o número de grupos de bloqueio em uma unidade de monossacarídeo em particular pode ser 1 ou 2.

[0028] A unidade de monossacarídeo terminal pode ter ou não um grupo de bloqueio em vez de sua hidroxila nativa. Prefere-se reter um grupo hidroxila anomérico livre em uma unidade de monossacarídeo terminal a fim de fornecer um apoio para reações adicionais (por exemplo, conjugação). Grupos hidroxila anoméricos podem ser convertidos em grupos amino (-NH2 ou NH-E, em que E é um grupo de proteção de nitrogênio) por aminação redutora (usando, por exemplo, NaBH3CN/NH4Cl) e podem então ser regenerados após outros grupos hidroxilas terem sido convertidos em grupos de bloqueio.

[0029] Grupos de bloqueio para a substituição de grupos hidroxila podem ser diretamente acessíveis por meio de uma reação de derivação do grupo hidroxila, ou seja, por substituição do átomo de hidrogênio do grupo hidroxila por outro grupo. Derivados adequados de grupos hidroxila que atuam como grupos de bloqueio são, por exemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, ésteres, éteres (por exemplo, silil éteres ou alquil éteres) e acetais. Alguns exemplos específicos destes grupos de bloqueio são alil, Aloc, benzil, BOM, t-butil, tritil, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP etc. Outros grupos de bloqueio que não são diretamente acessíveis e que substituem completamente o grupo hidroxila incluem C1-12 alquil, C3-12 alquil, C512 aril, C5-12 aril-C1-6 alquil, NR1R2 (R1 e R2 são definidos no parágrafo seguinte), H, F, Cl, Br, CO2H, CO2(C1-6 alquil), CN, CF3, CCl3 etc.

[0030] Grupos de bloqueio preferidos têm a fórmula: -O-X-Y ou -OR3 em que: X é C(O), S(O) ou SO2; Y é C1-12 alquil, C1-12 alcoxi, C3-12 cicloalquil, C5-12 aril ou C5-12 aril-C1-6 alquil, cada um dos quais pode opcionalmente ser substituído por 1, 2 ou 3 grupos selecionados independentemente de F, Cl, Br, CO2H, CO2(C1-6 alquil), CN, CF3 ou CCl3; ou Y é NR1R2; R1 e R2 são selecionados independentemente de H, C1-12 alquil, C3-12 cicloalquil, C5-12 aril, C5-12 aril-C1-6 alquil; ou R1 e R2 podem ser unidos para formar um grupo heterocíclico saturado C3-12; R3 é C1-12 alquil ou C3-12 cicloalquil, cada um dos quais pode opcionalmente ser substituído por 1, 2 ou 3 grupos selecionados independentemente de F, Cl, Br, CO2(C1-6 alquil), CN, CF3 ou CCl3; ou R3 é C5-12 aril ou C5-12 aril-C1-6 alquil, cada um dos quais pode opcionalmente ser substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos selecionados de F, Cl, Br, CO2H, CO2(C1-6 alquil), CN, CF3 ou CCl3. Quando R3 for C1-12 alquil ou C3-12 cicloalquil, ele é tipicamente substituído por 1, 2 ou 3 grupos como definido acima. Quando R1 e R2 estiverem unidos para formar um grupo heterocíclico saturado C3-12, significa que R1 e R2, junto com o átomo de nitrogênio, formam um grupo heterocíclico saturado contendo qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). O grupo heterocíclico pode conter 1 ou 2 heteroátomos (como, por exemplo, N, O ou S) diferentes do átomo de nitrogênio. Exemplos de grupos heterocíclicos saturados C3-12 são pirrolidinil, piperidinil, morfolinil, piperazinil, imidazolidinil, azetidinil e aziridinil.

[0031] Grupos de bloqueio -O-X-Y e -OR3 podem ser preparados a partir de grupos -OH por procedimentos padronizados de derivação como, por exemplo, reação do grupo hidroxila com um haleto de acila, haleto de alquila, haleto de sulfonila etc. Dessa forma, o átomo de oxigênio em -O-X-Y é preferivelmente o átomo de oxigênio do grupo hidroxila, enquanto o grupo -X-Y em -O-X-Y preferivelmente substitui o átomo de hidrogênio do grupo hidroxila.

[0032] Alternativamente, os grupos de bloqueio podem ser acessíveis por meio de uma reação de substituição como, por exemplo, uma substituição do tipo Mitsonobu. Esses e outros métodos de preparação de grupos de bloqueio a partir de grupos hidroxila são bem conhecidos.

[0033] Mais preferivelmente, o grupo de bloqueio é - OC(O)CF3 [19] ou um grupo carbamato -OC(O)NR1R2, em que R1 e R2 são selecionados independentemente de C1-6 alquil. Mais preferivelmente, R1 e R2 são ambos metil, ou seja, o grupo de bloqueio é -OC(O)NMe2. Grupos de bloqueio carbamato têm um efeito estabilizador sobre a ligação glicosídica e podem ser preparados sob condições leves.

[0034] Sacarídeos de MenA modificados preferidos contêm n unidades de monossacarídeo, em que pelo menos h% das unidades de monossacarídeo não têm grupos -OH em ambas as posições 3 e 4. O valor de h é 24 ou mais (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100) e é preferivelmente 50 ou mais. Os grupos -OH ausentes são preferivelmente grupos de bloqueio, como definidos acima.

[0035] Outros sacarídeos de MenA modificados preferidos compreendem unidades de monossacarídeo, em que pelo menos s das unidades de monossacarídeo não têm -OH na posição 3 e não têm -OH na posição 4. O valor de s é pelo menos 1 (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Os grupos -OH ausentes são preferivelmente grupos de bloqueio, como definido, acima.

[0036] Sacarídeos de MenA modificados adequados para uso com a invenção têm a fórmula:

em que n é um número inteiro de 1 a 100 (preferivelmente um número inteiro de 5 a 25, mais preferivelmente 15-25); T tem a fórmula (A) ou (B):

cada grupo Z é selecionado independentemente de OH ou um grupo de bloqueio como definido acima; e cada Q grupo é selecionado independentemente de OH ou um grupo de bloqueio como definido acima; Y é selecionado de OH ou um grupo de bloqueio como definido acima; E é H ou um grupo de proteção de nitrogênio; e em que mais do que cerca de 7% (por exemplo, 8%, 9%, 10% ou mais) dos grupos Q são grupos de bloqueio.

[0037] Cada um dos n+2 grupos Z pode ser o mesmo ou diferente entre eles. Da mesma forma, cada um dos n+2 grupos Q podem ser os mesmos ou diferentes entre eles. Todos os grupos Z podem ser OH. Alternativamente, pelo menos 10%, 20, 30%, 40%, 50% ou 60% dos grupos Z podem ser OAc. Preferivelmente, cerca de 70% dos grupos Z são OAc, com o restante dos grupos Z sendo OH ou grupos de bloqueio, como definidos acima. Pelo menos cerca de 7% dos grupos Q são grupos de bloqueio. Preferivelmente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou até mesmo 100% dos grupos Q são grupos de bloqueio.

[0038] Grupos de bloqueio preferidos são grupos que retiram elétrons. Sem querer se fixar a uma teoria, acredita-se que ligações glicosídicas sejam instáveis à hidrólise em função da ajuda de um ataque nucleofílico intramolecular de um grupo hidroxila do sacarídeo sobre a ligação glicosídica (ou seja, por formação de um intermediário cíclico). Quanto maior a força nucleofílica do grupo hidroxila, maior a tendência ao ataque nucleofílico intramolecular. Um grupo de bloqueio que retira elétrons tem o efeito de deslocar o par único de oxigênio diminuindo, desse modo, a força nucleofílica do oxigênio e diminuindo a tendência ao ataque nucleofílico intramolecular.

[0039] Para a proteção contra o sorogrupo A, portanto, as composições aquosas podem incluir um sacarídeo modificado de MenA como definido acima.

[0040] Composições preferidas da invenção podem ser estocadas por 28 dias a 37°C e, após esse período, menos de f% da quantidade total inicial de sacarídeo conjugado de MenA estará não conjugada, em que f é 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou menos.

Conjugação covalente

[0041] Sacarídeos capsulares nas composições da invenção serão normalmente conjugados à proteína transportadora(s). Em geral, a conjugação aumenta a imunogenicidade de sacarídeos, uma vez que os converte de antígenos T-independentes a antígenos T-dependentes permitindo, desse modo, a iniciação para memória imunológica. A conjugação é particularmente útil para vacinas pediátricas e é uma técnica bem conhecida (por exemplo, revisada nas referências 20 a 29).

[0042] Proteínas transportadoras preferidas são toxinas ou toxóides bacterianos como, por exemplo, toxóide diftérico ou toxóide tetânico, ou a toxina diftérica mutante CRM197 [30-32]. Outras proteínas transportadoras adequadas incluem a proteína da membrana externa de N. meningitidis [33], peptídeos sintéticos [34,35], proteínas de choque térmico [36,37], proteínas de pertussis [38,39], citocinas [40], linfocinas [40], hormônios [40], fatores de crescimento [40], proteínas artificiais compreendendo múltiplos epitopos de célula T CD4+ humana de vários antígenos derivados de patógenos [41] como, por exemplo, proteína N19 [42], proteína D de H. influenzae [43,44], pneumolisina [45], proteína pneumocócica de superfície PspA [46], proteínas de captação de ferro [47], toxina A ou B de C. difficile [48], toxinas bacterianas mutantes (por exemplo, toxina colérica ‘CT’ ou toxina termolábil de E. coli, ‘LT’) como, por exemplo, uma CT com uma substituição em Glu-29 [49] etc. Transportadores preferidos são toxóide diftérico, toxóide tetânico, proteína D de H. influenzae e, particularmente, CRM197.

[0043] Dentro de uma composição da invenção, é possível usar mais de uma proteína transportadora, por exemplo, para reduzir o risco de supressão do transportador. Dessa forma, diferentes proteínas transportadoras podem ser usadas para diferentes sorogrupos, por exemplo, sacarídeos do sorogrupo A podem ser conjugados a CRM197, enquanto sacarídeos do sorogrupo C podem ser conjugados ao toxóide tetânico. Também é possível usar mais de uma proteína transportadora para um antígeno sacarídico em particular, por exemplo, sacarídeos do sorogrupo A podem estar em dois grupos, com alguns conjugados a CRM197 e outros conjugados ao toxóide tetânico. No entanto, em geral prefere-se usar a mesma proteína transportadora para todos os sorogrupos, com CRM197 sendo a escolha preferida.

[0044] Uma única proteína transportadora pode carregar mais de um antígeno sacarídico [50]. Por exemplo, uma única proteína transportadora pode ter a ela conjugados sacarídeos de sorogrupos A e C. Para alcançar esse objetivo, os sacarídeos podem ser misturados antes da reação de conjugação. Em geral, no entanto, prefere-se ter conjugados separados para cada sorogrupo.

[0045] Conjugados com uma proporção de sacarídeo:proteína (p/p) entre 1:5 (ou seja, proteína em excesso) e 5:1 (ou seja, sacarídeo em excesso) são preferidos. Proporções entre 1:2 e 5:1 são preferidas, e proporções entre 1:1,25 e 1:2,5 são mais preferidas. Proteína transportadora em excesso pode ser preferida para MenA e MenC.

[0046] Conjugados podem ser usados junto com proteína transportadora livre [51]. Quando certa proteína transportadora estiver presente tanto na forma livre quanto na conjugada em uma composição da invenção, a forma não conjugada preferivelmente não é mais do que 5% da quantidade total da proteína transportadora na composição como um todo e, mais preferivelmente, está presente em menos do que 2% por peso.

[0047] Pode ser usada qualquer reação de conjugação adequada, com qualquer vinculador adequado, quando necessário.

[0048] O sacarídeo será tipicamente ativado ou funcionalizado antes da conjugação. A ativação pode envolver, por exemplo, reagentes de cianilação como CDAP (por exemplo, tetrafluorborato de 1-ciano-4- dimetilamino piridínio [52, 53 etc.]). Outras técnicas adequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; (veja também a introdução à referência 27).

[0049] Podem ser feitas ligações por meio de um grupo vinculador usando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 54 e 55. Um tipo de ligação envolve a aminação redutora do polissacarídeo, acoplando o grupo amino resultante com uma extremidade de um grupo vinculador de ácido adiposo, e depois acoplando uma proteína à outra extremidade do grupo vinculador de ácido adiposo [25,56,57]. Outros vinculadores incluem B-propionamido [58], nitrofenil-etilamina [59], haletos de haloacila [60], ligações glicosídicas [61], ácido 6-aminocapróico [62], ADH [63], porções C4 a C12 [64] etc. Como alternativa ao uso de um vinculador, pode ser usada ligação direta. Ligações diretas com uma proteína podem compreender oxidação dos polissacarídeos seguida por aminação redutora com a proteína, como descrito, por exemplo, nas referências 65 e 66.

[0050] Um processo que envolve a introdução de grupos amino no sacarídeo (por exemplo, por substituição dos grupos =O terminais com - NH2) seguida por derivatização com um diéster adiposo (por exemplo, diéster de ácido adiposo N-hidroxisuccinimido) e a reação com proteína transportadora é preferida. Outra reação preferida utiliza ativação de CDAP com uma proteína transportadora D, por exemplo, para MenA ou MenC.

[0051] Após conjugação, os sacarídeos livres e conjugados podem ser separados. Há muitos métodos adequados, incluindo cromatografia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração etc. (veja também as referências 67 e 68 etc.).

[0052] Quando a composição da invenção incluir um oligossacarídeo conjugado, prefere-se que a preparação do oligossacarídeo preceda a conjugação.

[0053] Após conjugação, os métodos da invenção podem incluir uma etapa de medida do nível de proteína transportadora não conjugada. Uma forma de efetuar essa medida envolve eletroforese capilar [69] (por exemplo, solução livre) ou cromatografia eletrocinética micelar [70].

[0054] Após conjugação, os métodos da invenção podem incluir a etapa de medida do nível de sacarídeo não conjugado. Uma forma de realizar essa medida envolve HPAEC-PAD [67].

[0055] Após conjugação, os métodos da invenção podem incluir uma etapa de separação do sacarídeo conjugado do sacarídeo não conjugado. Uma forma de separar esses sacarídeos é o uso de um método que precipite seletivamente um componente. A precipitação seletiva de sacarídeo conjugado é preferida, para deixar sacarídeo não conjugado em solução, por exemplo, por um tratamento do desoxicolato [67].

[0056] Após conjugação, os métodos da invenção podem incluir uma etapa de medida do tamanho molecular e/ou da massa molar de um conjugado. Em particular, podem ser medidas as distribuições. Uma forma de executar essas medidas envolve cromatografia por exclusão de tamanho com detecção por fotometria de dispersão luminosa multiângulo e refratometria diferencial (SEC-MALS/RI) [71].

Oligossacarídeos

[0057] Sacarídeos capsulares serão usados geralmente na forma de oligossacarídeos. Estes são convenientemente formados por fragmentação de polissacarídeo capsular purificado (por exemplo, por hidrólise), que normalmente será seguida por purificação dos fragmentos do tamanho desejado.

[0058] A fragmentação de polissacarídeos é realizada preferivelmente para gerar um grau médio final de polimerização (DP) no oligossacarídeo de menos do que 30 (por exemplo, entre 10 e 20, preferivelmente em torno de 10 para o sorogrupo A; entre 15 e 25 para sorogrupos W135 e Y, preferivelmente em torno de 15-20; entre 12 e 22 para o sorogrupo C; etc.). O DP pode ser convenientemente medido por cromatografia de troca iônica ou por ensaios colorimétricos [72].

[0059] Caso seja realizada a hidrólise, o hidrolisado geralmente será dimensionado para remover oligossacarídeos de comprimento curto [73]. Isto pode ser obtido de várias formas como, por exemplo, por ultrafiltração seguida por cromatografia de troca iônica. Oligossacarídeos com um grau de polimerização menor ou igual a cerca de 6 são preferivelmente removidos para o sorogrupo A, e aqueles menores do que cerca de 4 são preferivelmente removidos para os sorogrupos W135 e Y.

[0060] A hidrólise química de sacarídeos geralmente envolve tratamento com ácido ou base sob condições que são padronizadas na técnica. As condições para despolimerização de sacarídeos capsulares em seus monossacarídeos constituintes são conhecidas na técnica. Um método de despolimerização envolve o uso de peróxido de hidrogênio [11]. Peróxido de hidrogênio é adicionado a um sacarídeo (por exemplo, para gerar uma concentração final de H2O2 de 1%) e a mistura é posteriormente incubada (por exemplo, em torno de 55 °C) até ser obtida uma redução do comprimento da cadeia desejada. A redução ao longo do tempo pode ser seguida pela remoção de amostras da mistura e medindo a seguir o tamanho molecular (médio) do sacarídeo na amostra. A despolimerização pode então ser interrompida por resfriamento rápido após ser alcançado o comprimento de cadeia desejado.

Sorogrupo B

[0061] Vacinas contra patógenos como o vírus da hepatite B, difteria e tétano tipicamente contêm um único antígeno protéico (por exemplo, o antígeno de superfície de HBV ou um toxóide tetânico). Em contraste, as vacinas acelulares da coqueluche tipicamente contêm pelo menos três proteínas de B. pertussis e a vacina pneumocócica PrevNarTM contém sete antígenos sacarídicos conjugados separados. Outras vacinas como, por exemplo, as vacinas celulares de pertussis, a vacina do sarampo, a vacina inativada da pólio (IPV) e vacinas meningocócicas de OMV, são, pela sua própria natureza, misturas complexas de um grande número de antígenos. Se a proteção pode ser despertada por um único antígeno, por um pequeno número de antígenos definidos ou por uma mistura complexa de antígenos não definidos, portanto, depende do patógeno em questão.

[0062] Como mencionado acima, uma vacina contra o sorogrupo B do meningococo provou-se insatisfatória. Vacinas baseadas em OMV mostram pouca eficácia. Além disso, o grande número de antígenos não definidos presente em uma OMV, combinado com sua natureza variável, significa que OMVs têm vários problemas de controle de qualidade.

[0063] Os inventores verificaram que pode ser obtida uma proteção ampla contra infecção pelo sorogrupo B e que isto pode ser conseguido com o uso de um pequeno número de antígenos polipeptídicos do sorogrupo B definidos e, dessa forma, as composições da invenção incluem um ou mais antígenos polipeptídicos a fim de que a composição possa induzir uma resposta imune bactericida contra duas ou mais (ou seja, 2 ou 3) linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 do sorogrupo B de N. meningitidis.

[0064] Foram relatadas sequências genômicas para os sorogrupos meningocócicos A [74] e B [75,76], e podem ser selecionados antígenos adequados a partir dos polipeptídeos codificados (por exemplo, as referências 77-82). Antígenos candidatos foram manipulados para melhorar a expressão heteróloga (referências 83 a 85).

[0065] Uma composição preferida inclui uma proteína Tbp e uma proteína Hsf [86]. Hsf é uma proteína autotransportadora [87-89], também conhecida como nhhA [89], GNA0992 [77] ou NMB0992 [75]. Tbp é a proteína de ligação de transferrina [90-93] e engloba tanto TbpA quanto TbpB e as formas de alto e baixo peso molecular de TbpA e TbpB. Tbp engloba as proteínas individuais descritas acima e complexos das proteínas e qualquer outra proteína, ou complexos destas, capazes de ligar transferrina. Embora Tbp possa se referir às formas tanto de alto quanto de baixo peso molecular de TbpA ou TbpB, prefere-se que estejam presentes ambas as formas tanto de alto quanto de baixo peso molecular de TbpA e/ou TbpB. Principalmente, está presente TbpA de alto e de baixo peso molecular.

[0066] Outra composição preferida inclui lipo-oligossacarídeo do sorogrupo B (LOS) [94]. LOS pode ser usado em adição ao(s) polipeptídeo(s) do sorogrupo B ou em seu lugar.

[0067] Outra composição preferida inclui pelo menos um antígeno selecionado de pelo menos duas categorias diferentes de proteína com funções diferentes dentro de Neisseria. Exemplos de tais categorias de proteínas são: adesinas, proteínas autotransportadoras, toxinas, proteínas integrais da membrana externa e proteínas de aquisição de ferro. Esses antígenos podem ser selecionados da forma a seguir, usando a nomenclatura da referência 95: pelo menos uma adesina de Neisseria selecionada do grupo que consiste em FhaB, NspA PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 e NadA; pelo menos uma autotransportadora de Neisseria selecionada do grupo que consiste em Hsf, Hap, IgA protease, AspA, e NadA; pelo menos uma toxina de Neisseria selecionada do grupo que consiste em FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT (NMB1343) e tanto um quanto ambos os LPS do imunotipo L2 e LPS imunotipo L3; pelo menos uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria selecionada do grupo que consiste em TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB e P2086 (XthA); pelo menos uma proteína de Neisseria associada à membrana, preferivelmente proteína da membrana externa, particularmente proteína integral da membrana externa, selecionada do grupo que consiste em PilQ, OMP85, FhaC, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA, HpuB, HimD, HisD, GNA 1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB1124, NMB1162, NMB1220, NMB1313, NMB1953, HtrA e PLDA (OMPLA). Supostamente essas combinações de antígenos de Neisseria produzem um aumento surpreendente da eficácia de uma vacina contra infecção por Neisseria [95].

[0068] Composições particularmente preferidas incluem um ou mais dos seguintes cinco antígenos [96]: (1) uma proteína ‘NadA’, preferivelmente na forma oligomérica (por exemplo, na forma trimérica); (2) uma proteína ‘741’; (3) uma proteína ‘936’; (4) uma proteína ‘953’; e (5) uma proteína ‘287’.

[0069] ‘NadA’ (adesina A de Neisseria) de MenB é revelada como proteína ‘961’ na referência 80 (IDS. DE SEQS. 2.943 e 2.944) e como ‘NMB1994’ na referência 75 (veja também números de acesso no GenBank: 11352904 e 7227256). Um estudo detalhado sobre a proteína pode ser encontrado na referência 97. Quando usada de acordo com a presente invenção, NadA pode assumir várias formas. Formas preferidas de NadA são variantes de truncagem ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 83 a 85. Em particular, NadA sem sua âncora da membrana do terminal C é preferida (por exemplo, deleção dos resíduos 351-405 para a cepa 2996, para gerar ID. DE SEQ. N°:1 deste documento), que algumas vezes é aqui distinguida pelo uso de um ‘C’ sobrescrito, por exemplo, NadA(c). A expressão de NadA sem seu domínio de âncora de membrana em E. coli causa a secreção da proteína no sobrenadante da cultura com remoção concomitante de seu peptídeo-líder de 23mer (por exemplo, para deixar um 327mer para a cepa 2996 [ID. DE SEQ. N°:2 neste documento]). Polipeptídeos sem seus peptídeos-líderes são algumas vezes distinguidos aqui pelo uso de um ‘NL’ sobrescrito, por exemplo, NadA(NL) ou NadA(c)(NL). Polipeptídeos de NadA preferidos têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tenha 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a ID. DE SEQ. N°:2; e/ou (b) compreenda um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos da ID. DE SEQ. N°:1, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) são desprovidos de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou do terminal N da ID. DE SEQ. N°:1 (por exemplo, NadA(c), NadA(NL), NadA(C)(NL)). Outros fragmentos preferidos compreendem um epitopo da ID. DE SEQ. N: 1 e um fragmento particularmente preferido da ID. DE SEQ. N: 1 é a ID. DE SEQ. N: 2. Essas várias sequências incluem variantes de NadA (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes etc.). Várias sequências de NadA são mostradas na Figura 9 da referência 98.

[0070] A proteína ‘741’ de MenB é revelada na referência 80 (IDS. DE SEQS. 2.535 e 2.536) e como ‘NMB1870’ na referência 75 (veja também número de acesso no GenBank GI:7227128). A proteína correspondente no sorogrupo A [74] tem o número de acesso no GenBank 7379322. 741 é naturalmente uma lipoproteína. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 741 pode assumir várias formas. Formas preferidas de 741 são variantes de truncagem ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 83 a 85. Em particular, o terminal N de 741 pode ser deletado até, e incluindo, sua sequência de poli-glicina (ou seja, deleção dos resíduos 1 a 72 para a cepa MC58 [ID. DE SEQ. N°:3 neste documento]), que algumas vezes é aqui distinguida pelo uso de um prefixo ‘ΔG’. Essa deleção pode aumentar a expressão. A deleção também remove o sítio de lipidação de 741. Sequências de 741 preferidas têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tenha 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a ID. DE SEQ. N°:3; e/ou (b) compreenda um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos da ID. DE SEQ. N°:3, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo de 741. Outros fragmentos preferidos são desprovidos de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou do terminal N da ID. DE SEQ. N°:3. Essas sequências incluem variantes de 741 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes etc.). Várias sequências de 741 podem ser encontradas nas IDS. DE SEQS. 1 a 22 da referência 85, nas IDS. DE SEQS. 1 a 23 da referência 99 e nas IDS. DE SEQS. 1-299 da referência 100.

[0071] A proteína ‘936’ do sorogrupo B é revelada na referência 80 (IDS. DE SEQS. 2.883 e 2.884) e como ‘NMB2091’ na referência 75 (veja também o número de acesso no GenBank GI:7227353). O gene correspondente no sorogrupo A [74] tem o número de acesso no GenBank 7379093. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 936 pode assumir várias formas. Formas preferidas de 936 são variantes de truncagem ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 83 a 85. Em particular, o peptídeo-líder do terminal N de 936 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 23 para a cepa MC58, para gerar 936(NL) [ID. DE SEQ. N°:4 neste documento]). Sequências de 936 preferidas têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tenha 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a ID. DE SEQ. N°:4; e/ou (b) compreenda um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos de ID. DE SEQ. N°:4, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreende um epitopo de 936. Outros fragmentos preferidos são desprovidos de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou do terminal N da ID. DE SEQ. N°:4. Essas sequências incluem variantes de 936 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes etc.).

[0072] A proteína ‘953’ do sorogrupo B é revelada na referência 80 (IDS. DE SEQS. 2.917 e 2.918) e como ‘NMB1030’ na referência 75 (veja também número de acesso no GenBank GI:7226269). A proteína correspondente no sorogrupo A [74] tem o número de acesso no GenBank 7380108. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 953 pode assumir várias formas. Formas preferidas de 953 são variantes de truncagem ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 83 a 85. Em particular, o peptídeo-líder do terminal N de 953 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 19 para a cepa MC58, para gerar 953(NL) [ID. DE SEQ. N°:5 neste documento]). Sequências de 953 preferidas têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a ID. DE SEQ. N°:5; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos da ID. DE SEQ. N°:5, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo de 953. Outros fragmentos preferidos são desprovidos de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou do terminal N da ID. DE SEQ. N°:5. Essas sequências incluem variantes de 936 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes etc.). Formas alélicas de 953 podem ser vistas na Figura 19 da referência 82.

[0073] A proteína ‘287’ do sorogrupo B é revelada na referência 80 (IDS. DE SEQS. 3.103 e 3.104), como ‘NMB2132’ na referência 75 e como ‘GNA2132’ na referência 77 (veja também número de acesso no GenBank GI:7227388). A proteína correspondente no sorogrupo A [74] tem o número de acesso no GenBank 7379057. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 287 pode assumir várias formas. Formas preferidas de 287 são variantes de truncagem ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 83 a 85. Em particular, o terminal N de 287 pode ser deletado até, e incluindo, sua sequência de poli-glicina (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 24 para a cepa MC58, para gerar ΔG287 (ID. DE SEQ. N°:6 neste documento). Essa deleção pode aumentar a expressão. Sequências de 287 preferidas têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a ID. DE SEQ. N°:6; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos da ID. DE SEQ. N°:6, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo de 287. Outros fragmentos preferidos são desprovidos de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou do terminal N da ID. DE SEQ. N°:6. Essas sequências incluem variantes de 287 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes etc.). Formas alélicas de 287 podem ser observadas nas Figuras 5 e 15 da referência 82 e no exemplo 13 e na figura 21 da referência 80 (IDS. DE SEQS. 3.179 a 3.184).

[0074] Antígenos de MenB preferidos compreendem uma sequência de aminoácidos encontrada em uma das cepas 2996, MC58, 95N477 e 394/98. A proteína 287 é preferivelmente da cepa 2996 ou, mais preferivelmente, da cepa 394/98. A proteína 741 é preferivelmente do sorogrupo B cepas MC58, 2996, 394/98 ou 95N477, ou do sorogrupo C cepa 90/18311. A cepa MC58 é mais preferida. As proteínas 936, 953 e NadA são preferivelmente da cepa 2996. Quando uma composição incluir um antígeno protéico em particular (por exemplo, 741 ou 287), a composição pode incluir aquele antígeno em mais de uma forma variante, por exemplo, da mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Essas proteínas podem ser incluídas como tandem ou como proteínas separadas.

[0075] Em algumas modalidades, no entanto, a composição da invenção inclui a mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Verificou-se que essa abordagem é eficaz para a proteína 741. Essa proteína é um antígeno extremamente eficaz para despertar respostas de anticorpos antimeningocócicos e é expressa em todos os sorogrupos meningocócicos. A análise filogenética mostra que a proteína se divide em dois grupos, e que um destes se subdivide novamente para gerar três variantes no total [101] e, embora o soro desenvolvido contra certa variante seja bactericida dentro do mesmo grupo variante, ele não é ativo contra cepas que expressam uma das outras duas variantes, ou seja, há uma proteção cruzada intravariante, mas não uma proteção cruzada intervariantes [99,101]. Para uma eficácia de cepa cruzada, portanto, prefere-se que uma composição inclua mais de uma variante da proteína 741. Uma sequência exemplar de cada variante é dada na IDS. DE SEQS. Nos.: 10, 11 e 12 neste documento, começando com um resíduo de cisteína do terminal N ao qual o lipídeo será anexado de forma covalente na forma nativa da lipoproteína. Prefere-se, portanto, que a composição inclua pelo menos dois de: (l) uma primeira proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos a% de identidade de sequência para a ID. DE SEQ. N°:10 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste em um fragmento de pelo menos x aminoácidos contíguos da ID. DE SEQ. N°:10; (2) uma segunda proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos b% de identidade de sequência para a ID. DE SEQ. N°:11 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste em um fragmento de pelo menos y aminoácidos contíguos da ID. DE SEQ. N°:11; e (3) uma terceira proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos c% de identidade de sequência para a ID. DE SEQ. N°:12 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste em um fragmento de pelo menos z aminoácidos contíguos da ID. DE SEQ. N°:12. O valor de a é pelo menos 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, ou mais. O valor de b é pelo menos 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, ou mais. O valor de c é pelo menos 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, ou mais. Os valores de a, b e c não estão intrinsecamente relacionados entre eles. O valor de x é pelo menos 7, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. O valor de y é pelo menos 7, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. O valor de z é pelo menos 7 por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Os valores de x, y e z não estão intrinsecamente relacionados entre eles. Prefere-se que uma certa sequência de aminoácidos de 741 não caia em mais de uma das categorias (1), (2) e (3). Uma certa sequência de 741 cairá, desse modo, somente dentro de uma das categorias (1), (2) e (3). Assim, prefere-se que: a proteína (l) tenha menos de i% de identidade de sequência para a proteína (2); a proteína (1) tenha menos de j% de identidade de sequência para a proteína (3); e proteína (2) tenha menos de k% de identidade de sequência para proteína (3). O valor de i é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 etc.) e é no máximo a. O valor de j é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 etc.) e é no máximo b. O valor de k é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 etc.) e é no máximo c. Os valores de i, j e k não estão intrinsecamente relacionados entre eles.

[0076] Composições da invenção incluem um pequeno número (por exemplo, menos de t antígenos, em que t é 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3) de antígenos purificados do sorogrupo B. Prefere-se particularmente que a composição não inclua misturas complexas ou indefinidas de antígenos, por exemplo, prefere-se não incluir vesículas da membrana externa na composição. Os antígenos são expressos preferivelmente de forma recombinante em um hospedeiro heterólogo e depois purificados. Para uma composição incluindo t antígenos de MenB, pode haver t polipeptídeos separados, mas, para reduzir ainda mais a complexidade, prefere-se que pelo menos dois dos antígenos sejam expressos como uma cadeia única de polipeptídeo (uma proteína “híbrida” [referências 83 a 85]), ou seja, de forma que os t antígenos formem menos do que t polipeptídeos. Proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: primeira, uma proteína que possa ser instável ou expressa com deficiência por ela mesma pode ser ajudada pela adição de um parceiro híbrido adequado que supere o problema; segunda, a fabricação comercial é simplificada, uma vez apenas uma expressão e purificação precisam ser empregadas a fim de produzir duas proteínas separadamente úteis. Uma proteína híbrida incluída em uma composição da invenção pode compreender dois ou mais (ou seja, 2, 3, 4 ou 5) dos cinco antígenos listados acima. Híbridos que consistem em dois dos cinco antígenos são preferidos.

[0077] Dentro da combinação de cinco antígenos básicos (NadA, 741, 953, 936 e 287), um antígeno pode estar presente em mais de uma proteína híbrida e/ou como uma proteína não híbrida. Prefere-se, no entanto, que um antígeno esteja presente, seja como um híbrido ou como um não híbrido, mas não como ambos, embora possa ser útil incluir a proteína 741 tanto como um antígeno híbrido quanto como um não híbrido (preferivelmente lipoproteína), particularmente quando for usada mais de uma variante de 741.

[0078] Proteínas híbridas podem ser representadas pela fórmula NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, em que: X é uma sequência de aminoácidos de um dos cinco antígenos básicos; L é uma sequência de aminoácidos vinculadora opcional; A é uma sequência de aminoácidos do terminal N opcional; B é uma sequência aminoácidos do terminal C opcional; e n é 2, 3, 4 ou 5.

[0079] Principalmente, n é 2. Híbridos de dois antígenos para uso na invenção compreendem: NadA e 741; NadA e 936; NadA e 953; NadA e 287; 741 e 936; 741 e 953; 741 e 287; 936 e 953; 936 e 287; 953 e 287. Duas proteínas preferidas são: X1 é uma 936 e X2 é uma 741; X1 é uma 287 e X2 é uma 953.

[0080] Se uma porção -X- tiver uma sequência de peptídeo- líder na sua forma selvagem, esta pode ser incluída ou omitida na proteína híbrida. Em algumas modalidades, os peptídeos-líderes serão deletados, exceto aquele da porção -X- localizada no terminal N da proteína híbrida, ou seja, o peptídeo-líder de X1 será mantido, mas os peptídeos-líderes de X2 ... Xn serão omitidos. Isso equivale a deletar todos os peptídeos-líderes e usar o peptídeo-líder de X1 como porção -A-.

[0081] Para cada n exemplos de [-X-L-], a sequência de aminoácidos vinculadora -L- pode estar presente ou ausente. Por exemplo, quando n = 2, o híbrido pode ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2- COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH etc. Sequências de aminoácidos vinculadoras -L- serão tipicamente curtas (por exemplo, 20 aminoácidos ou menos, ou seja, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos compreendem sequências peptídicas curtas que facilitam a clonagem, vinculadores de poli-glicina (ou seja, que compreendem Glyn, em que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) e etiquetas de histidina (ou seja, Hisn, em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outras sequências de aminoácidos vinculadoras adequadas serão evidentes para aqueles com habilidade na técnica. Um vinculador útil é GSGGGG (ID. DE SEQ. N: 9), com o dipeptídeo Gly-Ser sendo formado a partir de um sítio de restrição BamHI ajudando, desse modo, a clonagem e a manipulação, e o tetrapeptídeo (Gly)4 sendo um vinculador poli-glicina típico. Se Xn+1 for uma proteína ΔG e Ln for um vinculador de glicina, isso pode ser equivalente a Xn+1 não sendo uma proteína ΔG e Ln estando ausente.

[0082] -A- é uma sequência aminoácidos do terminal N opcional. Esta será tipicamente curta (por exemplo, 40 ou aminoácidos ou menos, ou seja, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos incluem sequências-líderes para o direcionamento do tráfego de proteína, ou sequências peptídicas curtas que facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, etiquetas de histidina, ou seja, Hisn, em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outras sequências de aminoácidos do terminal N adicionais serão evidentes para aqueles com habilidade na técnica. Caso X1 seja desprovida de sua própria metionina do terminal N, - A- é preferivelmente um oligopeptídeo (por exemplo, com l, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) que fornecem uma metionina do terminal N.

[0083] -B- é uma sequência de aminoácidos do terminal C opcional. Será tipicamente curta (por exemplo, 40 aminoácidos ou menos, ou seja, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos incluem sequências para o direcionamento do tráfego de proteína, sequências peptídicas curtas que facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, que compreendem etiquetas de histidina, ou seja, Hisn, em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), ou sequências que aumentam a estabilidade da proteína. Outras sequências de aminoácidos do terminal C adequadas serão evidentes para aqueles com habilidade na técnica.

[0084] Duas proteínas híbridas da invenção particularmente preferidas são as seguintes:

[0085] Essas duas proteínas podem ser usadas em combinação com NadA (particularmente com a ID. DE SEQ. N°:2). Dessa forma, uma composição preferida de antígenos de MenB para uso com a invenção inclui um primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ID. DE SEQ. N°:2, um segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ID. DE SEQ. N°:7 e um terceiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°:8. Este é um grupo de antígenos de MenB preferido para uso com a invenção.

[0086] Como mencionado acima, composições da invenção podem induzir uma resposta sérica bactericida de anticorpos que seja eficaz contra duas ou três das linhagens hipervirulentas de MenB, A4, ET-5 e linhagem 3. Elas podem adicionalmente induzir respostas bactericidas de anticorpos contra uma ou mais das linhagens hipervirulentas do subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-l ou complexo de ET-37, e contra outras linhagens, por exemplo, linhagens hiperinvasivas. Essas respostas de anticorpos são medidas convenientemente em camundongos e são um indicador-padrão da eficácia da vacina (por exemplo, veja a observação final 14 da referência 77). A atividade sérica bactericida (SBA) mede a morte bacteriana mediada por complemento, e pode ser testada usando complemento humano ou de filhote de coelho. Os padrões da OMS (Organização Mundial de Saúde) exigem que uma vacina induza um aumento de pelo menos 4 vezes na SBA em mais de 90% dos receptores.

[0087] A composição não precisa induzir anticorpos bactericidas contra cada e contra todas as cepas de MenB dentro dessas linhagens hipervirulentas; em vez disso, para certo grupo de quatro ou mais cepas de meningococo do sorogrupo B dentro de uma linhagem hipervirulenta em particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) dos grupos. Grupos preferidos de cepas incluirão cepas isoladas em pelo menos quatro dos seguintes países: Grã Bretanha, Austrália, Canadá, Noruega, Itália, Estados Unidos, Nova Zelândia, Holanda, Brasil e Cuba. O soro preferivelmente tem uma titulação bactericida de pelo menos 1.024 (por exemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou maior, preferivelmente pelo menos 214), ou seja, o soro é capaz de matar pelo menos 50% das bactérias de teste de uma cepa em particular quando diluído 1/1.024, como descrito na referência 77.

[0088] Composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes cepas de meningococo do sorogrupo B: (i) do grupo A4, cepa 961-5945 (B:2b:P1.21,16) e/ou cepa G2136 (B:-); (ii) do complexo ET-5, cepa MC58 (B:15:P1.7,16b) e/ou cepa 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) da linhagem 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) e/ou cepa BZ198 (B:NT:-). Composições mais preferidas podem induzir respostas bactericidas contra cepas 961-5945, 44/76 e 394/98. As cepas 961-5945 e G2136 são ambas cepas de referência MLST de Neisseria (ids. 638 e 1.002 na referência 102). A cepa MC58 é amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a cepa sequenciada na referência 75. A cepa 44/76 foi amplamente usada e caracterizada (por exemplo, referência 103) e é uma das cepas de referência MLST de Neisseria (id. 237 na referência 102; linha 32 da Tabela 2 na referência 104). A cepa 394/98 foi isolada originalmente na Nova Zelândia em 1998 e há vários estudos publicados usando essa cepa (por exemplo, as referências 105 e 106). A cepa BZ198 é outra cepa MLST de referência [id. 409 na referência 102; linha 41 da Tabela 2 na referência 104]. A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra a cepa LNP17592 do sorogrupo W135 (W135:2a:P1.5,2), do complexo ET-37. Esta é uma cepa de Haji isolada na França em 2000.

[0089] Outros antígenos polipeptídicos de MenB que podem ser incluídos em composições da invenção incluem aqueles que compreendem uma das seguintes sequências de aminoácidos: ID. DE SEQ. N°:650 da referência 78; ID. DE SEQ. N°:878 da referência 78; ID. DE SEQ. N°:884 da referência 78; ID. DE SEQ. N°:4 da referência 79; ID. DE SEQ. N°:598 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:818 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:864 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:866 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:1.196 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:1.272 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:1.274 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:1.640 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:1.788 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.288 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.466 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.554 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.576 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.606 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.608 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.616 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.668 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.780 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.932 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.958 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.970 da referência 80; ID. DE SEQ. N°:2.988 da referência 80, ou um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos na qual: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para as referidas sequências; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos das referidas sequências, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreender um epitopo da sequência relevante. Mais de um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais) desses polipeptídeos pode ser incluído.

Componentes antigênicos adicionais

[0090] Antígenos que não sejam de meningococo ou de Neisseria, preferivelmente aqueles que não diminuem a resposta imune contra os componentes meningocócicos, também podem ser incluídos nas composições da invenção. A Ref. 107, por exemplo, revela combinações de oligossacarídeos dos sorogrupos B e C de N. meningitidis junto com o sacarídeo Hib. Antígenos não meningocócicos particularmente preferidos incluem: - um antígeno diftérico como, por exemplo, um toxóide diftérico (por exemplo, capítulo 3 da referência 108). - um antígeno tetânico como, por exemplo, um toxóide tetânico (por exemplo, capítulo 4 da referência 108). - holotoxina de pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinógenos 2 e 3 (por exemplo, as referências 109 e 110). - antígeno celular de pertussis. - um antígeno do vírus da hepatite A como, por exemplo, vírus inativado (por exemplo, 111, 112). - um antígeno do vírus da hepatite B, tais como os antígenos de superfície e/ou centrais (por exemplo, 112,113), com antígeno de superfície preferivelmente sendo adsorvido sobre um fosfato de alumínio [114]. - antígeno(s) da pólio (por exemplo, 115, 116) como, por exemplo, IPV.

[0091] A mistura pode compreender um ou mais destes antígenos adicionais, que podem ser detoxicados, quando necessário (por exemplo, detoxicação da toxina de pertussis por meios químicos e/ou genéticos).

[0092] Quando um antígeno diftérico for incluído na mistura, prefere-se incluir também antígeno tetânico e antígenos de pertussis. Similarmente, quando um antígeno tetânico for incluído, prefere-se também incluir antígenos diftéricos e de pertussis. Similarmente, quando for incluído um antígeno de pertussis, prefere-se também incluir antígenos diftéricos e tetânicos.

[0093] Antígenos na mistura estarão tipicamente presentes em uma concentração de pelo menos 1 μg/ml cada. Em geral, a concentração de certo antígeno será suficiente para despertar uma resposta imune contra aquele antígeno. Prefere-se que a eficácia protetora de antígenos sacarídicos individuais não seja removida ao combiná-los, embora a imunogenicidade real (por exemplo, titulações de ELISA) possa ser reduzida.

[0094] Como alternativa ao uso de antígenos protéicos na mistura, pode ser usado ácido nucléico que codifica o antígeno. Componentes protéicos da mistura podem, desse modo, ser substituídos por ácido nucléico (preferivelmente DNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo) que codifica a proteína. Similarmente, composições da invenção podem compreender proteínas que simulam antígenos sacarídicos por exemplo, mimotopos [117] ou anticorpos anti-idiótipo. Estes podem substituir componentes sacarídicos individuais ou podem suplementá-los. Como exemplo, a vacina pode compreender um peptídeo que simula o polissacarídeo capsular do MenC [118] ou do MenA [119] no lugar do próprio sacarídeo.

[0095] Dois antígenos não meningocócicos preferidos para inclusão nas composições da invenção são aqueles que protegem contra H. influenzae tipo B (Hib) e contra Streptococcus pneumoniae.

Haemophilus influenzae tipo B (Hib)

[0096] Quando uma composição incluir um antígeno de H. influenzae tipo B, ele tipicamente será um antígeno sacarídico capsular de Hib. Antígenos sacarídicos de H. influenzae b são bem conhecidos.

[0097] De forma vantajosa, o sacarídeo de Hib é conjugado de forma covalente a uma proteína transportadora a fim de aumentar sua imunogenicidade, especialmente em crianças. A preparação de polissacarídeos conjugados em geral, e do polissacarídeo capsular de Hib em particular, é bem documentada (por exemplo, referências 21-29 etc.).

[0098] A invenção pode usar qualquer conjugado de Hib adequado. Proteínas transportadoras adequadas são descritas acima, e transportadores preferidos para sacarídeos de Hib são CRM197 (‘HbOC’), toxóide tetânico (‘PRP-T’) e o complexo da membrana externa de N. meningitidis (‘PRP-OMP’).

[0099] A porção de sacarídeo do conjugado pode ser um polissacarídeo (por exemplo, fosfato de polirribosilribitol de comprimento total (PRP)), mas prefere-se hidrolisar os polissacarídeos para formar oligossacarídeos (por exemplo, PM de ~1 a ~5 kDa).

[00100] Um conjugado preferido compreende um oligossacarídeo de Hib ligado de forma covalente a CRM197 por meio de um vinculador ácido adiposo [120, 121]. O toxóide tetânico também é um transportador preferido.

[00101] A administração do antígeno de Hib preferivelmente resulta em uma concentração de anticorpo anti-PRP de > 0,15 μg/ml e, mais preferivelmente, > 1 μg/ml.

[00102] Quando uma composição incluir um antígeno sacarídico de Hib, prefere-se que ela também não inclua um adjuvante de hidróxido de alumínio. Caso uma composição inclua um adjuvante de fosfato de alumínio, o antígeno de Hib pode então ser adsorvido ao adjuvante [122] ou pode ser não adsorvido [123]. A prevenção da adsorção pode ser obtida selecionando-se o pH correto durante a mistura antígeno/adjuvante, um adjuvante com um ponto apropriado de carga zero, e uma ordem de mistura adequada para os vários antígenos diferentes em uma composição [124].

[00103] Composições da invenção podem compreender mais de um antígeno de Hib. Antígenos de Hib podem ser liofilizados, por exemplo, para reconstituição por composições meningocócicas da invenção.

Streptococcus pneumoniae

[00104] Quando uma composição incluir um antígeno de S. pneumoniae, será tipicamente um antígeno sacarídico capsular que é preferivelmente conjugado a uma proteína transportadora (por exemplo, as referências 125 a 127). Prefere-se incluir sacarídeos de mais de um sorotipo de S. pneumoniae. Por exemplo, misturas de polissacarídeos de 23 sorotipos diferentes são amplamente usadas, bem como vacinas conjugadas com polissacarídeos de 5 a 11 sorotipos diferentes [128]. Por exemplo, PrevNarTM [1] contém antígenos de sete sorotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) com cada sacarídeo conjugado individualmente a CRM197 por aminação redutora, com 2 μg de cada sacarídeo por dose de 0,5 ml (4 μg do sorotipo 6B) e com conjugados adsorvidos em um adjuvante de fosfato de alumínio. Composições da invenção preferivelmente incluem pelo menos os sorotipos 6B, 14, 19F e 23F. Conjugados podem ser adsorvidos em um fosfato de alumínio.

[00105] Como alternativa ao uso de antígenos sacarídicos de pneumococo, a composição pode incluir um ou mais antígenos polipeptídicos. São disponíveis sequências genômicas para várias cepas de pneumococo [129,130] e podem ser submetidas à vacinologia reversa [131-134] para identificar antígenos polipeptídicos adequados [135,136]. Por exemplo, uma composição pode incluir um ou mais dos seguintes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 e Sp130, como definido na referência 137. Uma composição pode incluir mais de um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13 ou 14) destes antígenos.

[00106] Em algumas modalidades, a composição pode incluir tanto antígenos sacarídicos quanto polipeptídicos de pneumococo. Estes podem ser usados em uma mistura única ou o antígeno sacarídico pneumocócico pode ser conjugado a uma proteína pneumocócica. Proteínas transportadoras adequadas para tais modalidades incluem os antígenos listados no parágrafo anterior [137].

[00107] Antígenos pneumocócicos podem ser liofilizados, por exemplo, junto com o antígeno de Hib.

Composições farmacêuticas

[00108] A composição da invenção compreenderá tipicamente, além dos componentes acima mencionados, um ou mais “veículos farmaceuticamente aceitáveis”, que incluem qualquer veículo que por si próprio não induza a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, sacarose [138], trehalose [139], lactose e agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomos). Tais veículos são bem conhecidos por aqueles com habilidade na técnica. As vacinas também podem conter diluentes, tais como água, soro fisiológico, glicerol etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsificantes, substâncias para o tamponamento do pH, e outros, podem estar presentes. Soro fisiológico estéril, livre de pirogênio, tamponado com fosfato, é um veículo típico. Uma discussão detalhada sobre excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência 140.

[00109] Composições da invenção estão em forma aquosa, ou seja, soluções ou suspensões. Uma formulação líquida desse tipo permite que as composições sejam administradas diretamente a partir de sua forma embalada, sem a necessidade de reconstituição em um meio aquoso e são, portanto, ideais para injeção. As composições podem ser apresentadas em frascos ou podem ser apresentadas em seringas preenchidas prontas para uso. As seringas podem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa incluirá uma dose única da composição, enquanto um frasco pode incluir uma dose única ou múltiplas doses.

[00110] As composições líquidas da invenção também são adequadas para a reconstituição de outras vacinas a partir de uma forma liofilizada, por exemplo, para reconstituir antígenos Hib ou DTP liofilizados. Quando uma composição da invenção for utilizada para uma reconstituição extemporânea como esta, a invenção fornece um kit, que pode compreender dois frascos ou pode compreender uma seringa preenchida pronta para uso e um frasco, com o conteúdo da seringa sendo usado para reativar o conteúdo do frasco, antes da injeção.

[00111] As composições da invenção podem ser embaladas em forma de dose unitária ou em forma de dose múltiplas. Para formas de doses múltiplas, preferem-se os frascos às seringas preenchidas prontas para uso. Volumes eficazes de dosagem podem ser estabelecidos rotineiramente, mas uma dose da composição humana típica para injeção tem um volume de 0,5 ml.

[00112] O pH da composição é preferivelmente entre 6 e 8, preferivelmente cerca de 7. O pH estável pode ser mantido pelo uso de um tampão. Caso uma composição compreenda um sal de hidróxido de alumínio, prefere-se usar um tampão de histidina [141]. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogênio. As composições da invenção podem ser isotônicas em relação aos humanos.

[00113] Composições da invenção são imunogênicas e são, mais preferivelmente, composições de vacina. Vacinas de acordo com a invenção podem tanto ser profiláticas (ou seja, para evitar a infecção) quanto terapêuticas (ou seja, para tratar a infecção), mas serão tipicamente profiláticas. Composições imunogênicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno(s), além de qualquer outro componente, como necessário. Por “quantidade imunologicamente eficaz”, entende-se a administração daquela quantidade a um indivíduo, tanto em uma dose única quanto como parte de uma série, que é eficaz para tratamento ou prevenção. Essa quantidade varia, dependendo da saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, da idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata etc.), da capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do tratamento médico da situação médica e de outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade cairá em uma gama relativamente ampla que pode ser determinada através de experimentos de rotina.

[00114] Dentro de cada dose, a quantidade de um antígeno sacarídico individual estará geralmente entre 1-50 μg (medida como massa de sacarídeo), por exemplo, cerca de 1 μg, cerca de 2.5 μg, cerca de 4 μg, cerca de 5 μg ou cerca de 10 μg.

[00115] Cada sacarídeo pode estar presente substancialmente na mesma quantidade por dose. No entanto, a proporção (p/p) de sacarídeo de MenY:sacarídeo de MenW135 pode ser maior do que 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou maior) e/ou a proporção (p/p) de sacarídeo de MenY:sacarídeo de MenC pode ser menor do que 1 (por exemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, ou menor).

[00116] Proporções preferidas (p/p) para sacarídeos de sorogrupos A:C:W135:Y são: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; e 2:2:2:1. Proporções preferidas (p/p) para sacarídeos de sorogrupos C:W135:Y são: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; e 2:1:1. Prefere-se usar uma massa substancialmente igual de cada sacarídeo.

[00117] Composições da invenção preferidas compreendem menos do que 50 μg de sacarídeo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem < 40 μg de sacarídeo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem < 30 μg de sacarídeo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem < 25 μg de sacarídeo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem < 20 μg de sacarídeo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem < 10 μg de sacarídeo meningocócico por dose mas, idealmente, as composições da invenção compreendem pelo menos 10 μg no total de sacarídeo meningocócico por dose.

[00118] As composições da invenção podem incluir um antimicrobiano, particularmente quando embaladas no formato de doses múltiplas.

[00119] As composições da invenção podem compreender um detergente, por exemplo, um Tween (polissorbato) como, por exemplo, Tween 80. Detergentes estão geralmente presentes em níveis baixos, por exemplo, < 0,01%.

[00120] As composições da invenção podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para dar tonicidade. A concentração de 10 ± 2 mg/ml de NaCl é típica.

[00121] As composições da invenção incluirão geralmente um tampão. Um tampão fosfato é típico.

[00122] As composições da invenção serão geralmente administradas juntamente com outros agentes imunorreguladores. Em particular, as composições normalmente incluirão um ou mais adjuvantes. Tais adjuvantes incluem, sem limitação:

A. Composições contendo mineral

[00123] Composições contendo mineral adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais, tais como hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos etc. (por exemplo, consulte os capítulos 8 e 9 da referência 142) ou misturas de compostos minerais diferentes, com os compostos assumindo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalino, amorfo etc.) e preferindo-se adsorção. As composições contendo mineral também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [143].

B. Emulsões Oleosas

[00124] Composições de emulsão oleosa adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões esqualeno-água como, por exemplo, MF59 (Capítulo 10 da referência 142; veja também a referência 144) (Esqualeno 5%, Tween 80 0,5% e Span 85 0,5%, formulados em partículas submícron usando um microfluidificador). O adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA) também podem ser usados.

C. Formulações de saponina (capítulo 22 da referência 142)

[00125] Também podem ser usadas formulações de saponina como adjuvantes na invenção. Saponinas são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontradas na casca, folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. Saponina da casca da árvore de Quillaia saponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvante. Saponina também pode ser obtida comercialmente de Smilax ornata (salsaparrilha), Gypsophilla paniculata (“mosquitinho”) e Saponaria officianalis (saponária das boticas). Formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, como QS21, além de formulações lipídicas, como ISCOMs. QS21 é comercializado como StimulonTM.

[00126] Composições de saponina têm sido purificadas usando HPLC e RP-HPLC. Foram identificadas frações específicas purificadas usando essas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, uma saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na referência 145. Formulações de saponina também podem compreender um esterol como, por exemplo, colesterol [146].

[00127] Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas exclusivas chamadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da referência 142]. ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo, como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos nas referências 146-148. Opcionalmente, os ISCOMS podem não conter detergente adicional [149].

[00128] Uma revisão sobre o desenvolvimento de adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada nas referências 150 e 151.

D. Virossomos e partículas tipo vírus

[00129] Virossomos e partículas tipo vírus (VLPs) também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Essas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus, opcionalmente combinadas ou formuladas com um fosfolipídeo. São geralmente não patogênicos, não replicantes e em geral não contêm nada do genoma viral nativo. As proteínas virais podem ser produzidas de forma recombinante ou isoladas de vírus inteiros. Essas proteínas virais adequadas para uso em virossomos ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus influenza (tais como HA ou NA), vírus da Hepatite B (por exemplo, proteínas centrais ou do capsídeo), vírus da Hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavírus, vírus da Febre Aftosa, Retrovírus, vírus Norwalk, vírus do papiloma humano, HIV, RNA-fagos, Qβ-fago (como, por exemplo, proteínas de revestimento), GA-fago, fr-fago, AP205 fago, e Ty (por exemplo, Ty proteína p1 do retrotransposon). VLPs são discutidos com mais detalhes nas referências 152-157. Virossomos são ainda discutidos com mais detalhes, por exemplo, na referência 158.

E. Derivados bacterianos ou microbianos

[00130] Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos, tais como derivados atóxicos de lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS), derivados de Lipídeo A, oligonucleotídeos imunoestimulantes e toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxicados destes.

[00131] Derivados atóxicos de LPS incluem monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de 3 monofosforil lipídeo A des-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma de “partícula pequena” preferida de 3 monofosforil lipídeo A Des-O-acilado é revelada na referência 159. Tais “partículas pequenas” de 3dMPL são pequenas o suficiente para serem filtradas de forma estéril através de uma membrana de 0,22 μm [159]. Outros derivados atóxicos de LPS incluem miméticos de monofosforil lipídeo A, tais como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por exemplo, RC-529 [160,161].

[00132] Derivados de Lipídeo A incluem derivados de lipídeo A de Escherichia coli como, por exemplo, OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, nas referências 162 e 163.

[00133] Oligonucleotídeos imunoestimulantes adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem sequências de nucleotídeos contendo um motivo CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a uma guanosina). RNAs de filamento duplo e oligonucleotídeos contendo sequências palindrômicas ou poli(dG) também mostraram ser imunoestimulantes.

[00134] Os CpGs podem incluir modificações/análogos de nucleotídeos, tais como modificações de fosforotioato e podem ser de filamento duplo ou de filamento único. As referências 164, 165 e 166 revelam substituições análogas possíveis, por exemplo, substituição de guanosina por 2’-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é discutido com mais detalhes nas referências 167172.

[00135] A sequência de CpG pode ser dirigida a TLR9 como, por exemplo, o motivo GTCGTT ou TTCGTT [173]. A sequência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imune de Th1, como um CpG-A ODN, ou pode ser mais específica para a indução de uma resposta de célula B como, por exemplo, um CpG-B ODN. CpG-A e CpG- B ODNs são discutidos nas referências 174-176. Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN.

[00136] Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de forma que a extremidade 5’ esteja accessível para o reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas às suas extremidades 3’ para formar “imunômeros”. Veja, por exemplo, as referências 173 e 177-179.

[00137] Toxinas bacterianas de ribosilação de ADP e derivados detoxicados destas podem ser usados como adjuvantes na invenção. Preferivelmente, a proteína é derivada de E. coli (enterotoxina termolábil de E. coli “LT”), cólera (“CT”) ou pertussis (“PT”). O uso de toxinas de ribosilação de ADP detoxicadas como adjuvantes mucosos é descrito na referência 180 e como adjuvantes parenterais na referência 181. A toxina ou toxóide está preferivelmente na forma de uma holotoxina, compreendendo subunidades tanto A quanto B. Preferivelmente, a subunidade A contém uma mutação detoxicante; preferivelmente, a subunidade B não é mutada. Preferivelmente, o adjuvante é um mutante LT detoxicado como, por exemplo, LT-K63, LT-R72 e LT-G192. O uso de toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxicados destas, particularmente LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrada nas referências 182-189. A referência numérica para substituições de aminoácidos é baseada preferivelmente nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas de ribosilação de ADP estabelecidos na referência 190, especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade.

F. Imunomoduladores humanos

[00138] Imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [191] etc.) [192], interferons (por exemplo, interferon-Y), fator estimulante de colônia de macrófago e fator de necrose tumoral.

G. Bioadesivos e Mucoadesivos

[00139] Bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurônico esterificado [193] ou mucoadesivos, tais como derivados entrecruzados de poli(ácido acrílico), polivinil álcool, polivinil pirrolidona, polissacarídeos e carboximetilcelulose. Quitosana e derivados desta também podem ser usados como adjuvantes na invenção [194].

H. Micropartículas

[00140] Micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Micropartículas (ou seja, uma partícula de ~100 nm a ~150 μm de diâmetro, mais preferivelmente ~200 nm a ~30 μm de diâmetro, e principalmente ~500 nm a 10 μm de diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e atóxicos (por exemplo, um poli(α-hidroxi ácido), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida) são preferidos, tratados opcionalmente para terem uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiônico, como CTAB). I. Lipossomos (Capítulos 13 e 14 da referência 142)

[00141] Exemplos de formulações de lipossomo adequadas para uso como adjuvantes são descritos nas referências 195-197.

J. Formulações de éter de polioxietileno e de éster de polioxietileno

[00142] Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [198]. Tais formulações ainda incluem tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol [199], além de tensoativos de éteres ou éster de polioxietileno alquil em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional como, por exemplo, um octoxinol [200]. Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxietileno-8-esteoril, éter de polioxietileno-4-lauril, éter de polioxietileno-35-lauril e éter de polioxietileno-23-lauril.

K. Polifosfazeno (PCPP)

[00143] Formulações de PCPP são descritas, por exemplo, nas referências 201 e 202.

L. Muramil peptídeos

[00144] Exemplos de muramil peptídeos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).

M. Compostos de Imidazoquinolona

[00145] Exemplos de compostos de imidazoquinolona adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem Imiquamod e seus homólogos (por exemplo, “Resiquimod 3M”), descritos com mais detalhes nas referências 203 e 204.

[00146] A invenção ainda pode compreender combinações de aspectos de um ou mais dos adjuvantes acima identificados. Por exemplo, as seguintes composições de adjuvantes podem ser usadas na invenção: (1) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água [205]; (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) [206]; (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol; (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) [207]; (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo-em- água [208]; (6) SAF, contendo esqualeno 10%, Tween 80TM 0,4%, polímero em bloco de plurônico L121 5% e thr-MDP, sejam microfluidificadas em uma emulsão submícron ou turbilhonadas para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior. (7) O sistema adjuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) contendo esqualeno 2%, Tween 80 0,2% e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforilípideo A (MPL), dimicolato de trehalose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DetoxTM); e (8) um ou mais sais minerais (como, por exemplo, sal de alumínio) + um derivado atóxico de LPS (como, por exemplo, 3dMPL).

[00147] Outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes são reveladas no capítulo 7 da referência 142.

[00148] O uso de adjuvantes de sal de alumínio é particularmente preferido, e os antígenos são geralmente adsorvidos a estes sais. Os conjugados de MenC MenjugateTM e NeisVacTM utilizam um adjuvante de hidróxido, enquanto MeningitecTM usa um fosfato. É possível adsorver nas composições da invenção alguns antígenos a um hidróxido de alumínio, mas tendo outros antígenos em associação com um fosfato de alumínio. Em geral, no entanto, prefere-se usar apenas um único sal, por exemplo, um hidróxido ou um fosfato, mas não ambos. Hidróxido de alumínio é preferivelmente evitado como adjuvante, particularmente se a composição incluir um antígeno Hib. Composições que não contêm hidróxido de alumínio são, portanto, preferidas. Em vez disso, podem ser usados fosfatos de alumínio, e um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com uma proporção molar PO4/Al entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6 mg de Al3+/ml. A adsorção com uma dose baixa de fosfato de alumínio pode ser usada, por exemplo, entre 50 e 100 μg de Al3+ por conjugado por dose. Quando for usado fosfato de alumínio e se desejar não adsorver um antígeno ao adjuvante, isso é favorecido incluindo-se íons fosfato livres em solução (por exemplo, pelo uso de um tampão fosfato).

[00149] Nem todos os conjugados precisam ser adsorvidos, ou seja, alguns ou todos podem estar livres em solução.

[00150] Fosfato de cálcio é outro adjuvante preferido.

Métodos de tratamento

[00151] A invenção também fornece um método para despertar uma resposta de anticorpo em um mamífero, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica da invenção ao mamífero.

[00152] A invenção fornece um método para despertar uma resposta imune em um mamífero que compreende a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. A resposta imune é preferivelmente protetora e preferivelmente envolve anticorpos. O método pode despertar uma resposta de reforço.

[00153] O mamífero é preferivelmente um humano. Quando a vacina for para uso profilático, o humano é preferivelmente uma criança (por exemplo, uma criança pequena ou um bebê) ou um adolescente; quando a vacina for para uso terapêutico, o humano é preferivelmente um adulto. Uma vacina destinada às crianças também pode ser administrada aos adultos, por exemplo, para avaliar segurança, dosagem, imunogenicidade etc.

[00154] A invenção também fornece uma composição da invenção para uso como um medicamento. O medicamento é preferivelmente capaz de despertar uma resposta imune em um mamífero (ou seja, é uma composição imunogênica) e é mais preferivelmente uma vacina.

[00155] A invenção também fornece o uso de (i) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo C; (ii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo W135; (iii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo Y; (iv) um ou mais antígenos polipeptídicos do sorogrupo B; e, opcionalmente, (v) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo A, na fabricação de um medicamento para despertar uma resposta imune em um mamífero.

[00156] Estes usos e métodos são preferivelmente para a prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por uma Neisseria (por exemplo, meningite, septicemia, bacteremia, gonorréia etc.). A prevenção e/ou tratamento de meningite bacteriana e/ou meningocócica é preferida.

[00157] Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção por Neisseria após administração da composição da invenção. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento das respostas imunes contra os cinco antígenos básicos após administração da composição. A imunogenicidade de composições da invenção pode ser determinada administrando-as a indivíduos de teste (por exemplo, crianças 12-16 meses de idade ou modelos animais [209]) e depois determinando-se parâmetros padronizados, incluindo anticorpos séricos bactericidas (SBA) e titulações de ELISA (GMT) de IgG anticápsula total e de alta avidez. Estas respostas imunes serão determinadas geralmente em torno de 4 semanas após administração da composição, e comparadas como os valores obtidos antes da administração da composição. Um aumento de SBA de pelo menos 4 ou 8 vezes é preferido. Quando for administrada mais de uma dose da composição, pode ser feita mais de uma determinação pós- administração.

[00158] Composições preferidas da invenção podem conferir uma titulação de anticorpos em um paciente que seja superior ao critério para a soroproteção para cada componente antigênico para uma percentagem aceitável de indivíduos humanos. Antígenos com uma titulação associada de anticorpos acima da qual um hospedeiro é considerado como sendo soro-convertido contra o antígeno são bem conhecidos, e tais titulações são publicadas por organizações como a OMS. Preferivelmente, mais de 80% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos são soro-convertidos, mais preferivelmente mais de 90%, ainda mais preferivelmente, mais de 93% e principalmente 96100%.

[00159] As composições da invenção serão, em geral, administradas diretamente a um paciente. A liberação direta pode ser obtida por injeção parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular ou ao espaço intersticial de um tecido) ou por administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar ou outra administração mucosa. Prefere-se a administração intramuscular na coxa ou na região superior do braço. A injeção pode ser feita através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas uma injeção sem agulha pode, alternativamente, ser usada. Uma dose intramuscular típica é de 0,5 ml.

[00160] A invenção pode ser usada para despertar imunidade sistêmica e/ou mucosa.

[00161] A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas. Podem ser usadas doses múltiplas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. Um esquema de dose primária pode ser seguido por um esquema de dose de reforço. O momento adequado entre doses primárias (por exemplo, entre 4-16 semanas) e entre as doses primária e de reforço pode ser determinado rotineiramente.

[00162] Infecções por Neisseria afetam várias áreas do corpo e, desse modo, as composições da invenção podem ser preparadas em diversas formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, tanto como soluções quanto como suspensões líquidas. A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, auricular ou ocular, por exemplo, como spray, gotas, gel ou pó (por exemplo, referências 210 e 211). Foi relatado o sucesso da administração nasal de sacarídeos pneumocócicos [212,213], polipeptídeos pneumocócicos [214], sacarídeos de Hib [215], sacarídeos de MenC [216] e de misturas de sacarídeo conjugado de Hib e MenC [217].

Estabilidade de estocagem

[00163] As composições da invenção oferecem estabilidade aumentada, particularmente para o componente sacarídico do sorogrupo A. A invenção fornece um processo para a preparação de uma composição de vacina, compreendendo as etapas de: (1) mistura de (i) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo C, (ii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo W135, (iii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo Y e (iv) um ou mais antígenos polipeptídicos do sorogrupo B; (2) estocagem da composição que resulta da etapa (1) por pelo menos 1 semana; (3) preparação de uma seringa contendo a composição estocada da etapa (2), pronta para injeção a um paciente; e, opcionalmente (4) injeção da composição no paciente.

[00164] A Etapa (1) também pode envolver a mistura de (v) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo A. Também pode envolver a mistura de (vi) um antígeno conjugado de Hib. Pode também envolver a mistura de (vii) um antígeno pneumocócico. A Etapa (2) envolve preferivelmente pelo menos 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas ou mais de estocagem. A etapa de estocagem (2) pode ser ou não abaixo da temperatura ambiente (por exemplo, a 10 ± 10 °C).

[00165] A invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição de vacina, compreendendo as etapas de: (1) mistura de (i) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo C, (ii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo VW135, (iii) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo Y e (iv) um ou mais antígenos polipeptídicos do sorogrupo B; e (2) extração de um volume de dose unitária dos antígenos misturados; e (c) embalagem da dose unitária extraída em um recipiente selado hermeticamente.

[00166] A Etapa (1) também pode envolver a mistura de (v) um antígeno sacarídico capsular conjugado do sorogrupo A. Também pode envolver a mistura de (vi) um antígeno conjugado de Hib. Pode também envolver a mistura de (vii) um antígeno pneumocócico. O recipiente selado hermeticamente pode ser um frasco ou uma seringa.

[00167] A invenção fornece um recipiente selado hermeticamente, contendo uma composição da invenção.

Geral

[00168] O termo “que compreende” significa “que inclui”, bem como “que consiste”, por exemplo, uma composição “que compreende” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir alguma coisa adicional, por exemplo, X + Y.

[00169] O termo “cerca de”, em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x ± 10%.

[00170] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que seja “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra “substancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

[00171] As referências a uma percentagem de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos significa que, quando alinhadas, aquela percentagem de aminoácidos é a mesma quando se compara as duas sequências. Esse alinhamento e o percentual de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinados usando programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos na seção 7.7.18 da referência 218. Um alinhamento preferido é determinado pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisa de lacunas afins com uma penalidade de lacuna aberta de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2, matriz BLOSUM de 62. O Algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é explicado na referência 219.

[00172] O termo “alquil” se refere aos grupos alquil tanto na forma linear quanto ramificada. O alquil grupo pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados de -O-, -NH- ou -S-. O grupo alquil também pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 ligações duplas e/ou triplas. No entanto, o termo “alquil” normalmente se refere aos grupos alquil sem interrupções de heteroátomos ou interrupções de ligações duplas ou triplas. Quando for feita referência a C1-12 alquil, significa que o grupo alquil pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 12 (por exemplo, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). Similarmente, quando for feita referência a C1-6 alquil, significa que o grupo alquil pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 6 (por exemplo, C1, C2, C3, C4, C5, C6).

[00173] O termo “cicloalquil” inclui grupos cicloalquil, policicloalquil e cicloalquenil, além de combinações destes com grupos alquil como, por exemplo, grupos cicloalquilalquil. O grupo cicloalquil pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados de -O-, - NH- ou -S-. No entanto, o termo “cicloalquil” normalmente se refere aos grupos cicloalquil sem interrupções de heteroátomo. Exemplos de grupos cicloalquil incluem grupos ciclopentil, ciclohexil, ciclohexenil, ciclohexilmetil e adamantil. Quando for feita referência a C3-12 cicloalquil, significa que o grupo cicloalquil pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

[00174] O termo “aril” se refere a um grupo aromático, como fenil ou naftil. Quando for feita referência a C5-12 aril, significa que o grupo aril pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 5 e 12 (por exemplo, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

[00175] O termo “C5-12 aril-C1-6 alquil” se refere aos grupos como benzil, feniletil e naftilmetil.

[00176] Grupos de proteção de nitrogênio incluem grupos silil (tais como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acil (tais como as ftalimidas, trifluoracetamidas, metoxicarbonil, etoxicarbonil, t- butoxicarbonil (Boc), benziloxicarbonil (Z ou CbZ), 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxi carbonil, 2,2,2- tricloroetoxicarbonil (Troc)), derivados de sulfonil (como, por exemplo, β- trimetilsililetanossulfonil (SES)), derivados de sulfenil, C1-12 alquil, benzil, benzidril, tritil, 9-fenilfluorenil etc. Um grupo de proteção de nitrogênio preferido é Fmoc.

[00177] Sequências incluídas para facilitar a clonagem ou purificação etc., não contribuem necessariamente para a invenção e podem ser omitidas ou removidas.

[00178] Será observado que podem existir anéis de açúcar na forma aberta e fechada e que, embora as formas fechadas sejam mostradas em fórmulas estruturais neste documento, formas abertas também são englobadas pela invenção.

[00179] Polipeptídeos da invenção podem ser preparados por vários meios (por exemplo, expressão recombinante, purificação a partir de cultura de células, síntese química (pelo menos em parte) etc.) e em várias formas (por exemplo, nativa, fusões, não glicosilados, lipidados etc.). Eles são preparados preferivelmente na forma substancialmente pura (ou seja, substancialmente livres de outras proteínas de N. meningitidis ou da célula hospedeira). Embora a expressão do polipeptídeo possa ocorrer em Neisseria, prefere-se um hospedeiro heterólogo. O hospedeiro heterólogo pode ser procariótico (por exemplo, uma bactéria) ou eucariótico. É preferivelmente E. coli, mas outros hospedeiros adequados incluem Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por exemplo, M. tuberculosis), levedura etc.

[00180] Ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser preparado de muitas formas (por exemplo, por síntese química (pelo menos em parte), a partir de bibliotecas genômicas ou de cDNA, a partir do próprio organismo etc.) e pode assumir várias formas (por exemplo, de filamento único, de filamento duplo, vetores, sondas etc.). Eles são preparados preferivelmente na forma substancialmente pura (ou seja, substancialmente livres de outros ácidos nucléicos de N. meningitidis ou da célula hospedeira). O termo “ácido nucléico” inclui DNA e RNA e também seus análogos, como aqueles contendo estruturas centrais modificadas (por exemplo, fosforotioatos etc.) e também ácidos nucléicos peptídicos (PNA) etc. A invenção inclui ácidos nucléicos que compreendem sequências complementares àquelas acima descritas (por exemplo, para fins anti-senso ou de sondagem).

[00181] Após o sorogrupo, a classificação meningocócica inclui sorotipo, soro-subtipo e então imunotipo e a nomenclatura padronizada lista sorogrupo, sorotipo, soro-subtipo e imunotipo, cada um separado por uma vírgula, por exemplo, B:4:P1.15:L3,7,9. Dentro do sorogrupo B, algumas linhagens frequentemente produzem doença (hiperinvasivas), algumas linhagens causam formas mais graves de doença do que outras (hipervirulentas) e outras raramente causam qualquer doença. São reconhecidas sete linhagens hipervirulentas, especificamente os subgrupos I, III e IV-1, complexo ET-5, complexo ET-37, agrupamento A4 e linhagem 3. Estas foram definidas por eletroforese de enzima multilócus (MLEE), mas a tipagem de sequência multilócus (MLST) também foi usada para classificar meningococos [referência 104].

MODOS PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Proteína híbrida ΔG287-953

[00182] DNAs que codificam a proteína 287 do sorogrupo meningocócico B, cepa 394/98 e a proteína 953 do sorogrupo meningocócico B, cepa 2996, foram digeridos e ligados, junto com uma sequência vinculadora curta, para gerar um plasmídeo que codifica a sequência de aminoácidos ID. DE SEQ. N: 7. O plasmídeo foi transfectado em E. coli e as bactérias cresceram para expressar a proteína. Após crescimento adequado, as bactérias foram colhidas e a proteína foi purificada. Da cultura, as bactérias foram centrifugadas e o pélete foi homogeneizado na presença de tampão de acetato 50 mM (pH 5) com uma proporção de volume de pélete:tampão de 1:8. A lise foi realizada usando um homogeneizador de alta pressão (AVESTIN, 4 ciclos a 96,52 MPa). Após a lise, foi adicionada uréia em uma concentração final de 5 M, seguida por agitação por 1 hora a temperatura ambiente. O pH foi reduzido de 6 para 5 usando tampão de acetato 200 mM (pH 4) + uréia 5 M. A mistura foi centrifugada a 16.800 g por 60 minutos a 2-8 °C. O sobrenadante foi coletado e filtrado por SARTOBRAN P (0,45-0,22 μm SARTORIUS). A proteína no sobrenadante filtrado era estável por pelo menos 30 dias a -20 °C e por pelo menos 15 dias a 2-8 °C.

[00183] A proteína foi posteriormente purificada em uma coluna de troca catiônica (SPFF, Amersham Biosciences) com eluição usando NaCl 350 mM + acetato 50 mM + uréia 5 M pH 5,00. A maioria das impurezas estava presente no material que fluiu. Uma lavagem de pré- eluição usando uma concentração baixa de NaCl (180 mM) eliminou com vantagem duas proteínas contaminantes de E. coli.

[00184] O material eluído foi ajustado até o pH 8 (usando TRIS/HCl 200 mM + uréia 5 M, pH 9) e posteriormente purificado em uma coluna Q Sepharose HP (Amersham) com eluição usando NaCl 150 mM + TRIS/HCl 20 mM, pH 8,00, em uréia 5 M. Novamente, uma lavagem de pré-eluição com sal reduzido (90 mM) foi útil para a eliminação das impurezas.

[00185] O material filtrado eluído da coluna Q HP foi diluído 1:2 usando PBS pH 7,00 (NaCl 150 mM + fosfato de potássio 10 mM, pH 7,00) e então diafiltrado contra 10 volumes de PBS pH 7,00 por ultrafiltração tangencial. Ao final da diafiltração, o material foi concentrado 1,6 vezes a cerca de 1,2 mg/ml de proteínas totais. Usando uma membrana com valor de corte de 30.000 Da (membrana de celulose regenerada de 50 cm2, Millipore PLCTK 30), foi possível dialisar o material com um rendimento de cerca de 90%.

Proteína híbrida 936-ΔG741

[00186] DNAs que codificam a proteína 936 do sorogrupo meningocócico B, cepa 2996, e a proteína 741 do sorogrupo meningocócico B, cepa MC58, foram digeridos e ligados, junto com uma sequência vinculadora curta, para gerar um plasmídeo que codifica a sequência de aminoácidos ID. DE SEQ. N: 8. O plasmídeo foi transfectado em E. coli e as bactérias cresceram para expressar a proteína. A proteína recombinante não foi secretada, mas permaneceu solúvel dentro das bactérias.

[00187] Após crescimento adequado, as bactérias foram centrifugadas para gerar uma pasta úmida e tratadas da seguinte forma: - homogeneização por um sistema de alta pressão na presença de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,00. - centrifugação e clarificação por filtração ortogonal. - cromatografia em coluna catiônica (“SP Sepharose Fast Flow”), com eluição por NaCl 150 mM em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,00. - cromatografia em coluna aniônica (“Q Sepharose XL”) com coleta através do fluxo. - cromatografia em coluna hidrofóbica (“Phenil Sepharose 6 Fast Flow High Sub”) com eluição por fosfato de sódio 20 mM, pH 7,00. - diafiltração contra PBS pH 7,4 com um valor de corte de 10 Kd. - filtração estéril final e estocagem a -20 °C.

[00188] A proteína no material final era estável por pelo menos 3 meses, tanto a -20 °C quanto a 2-8 °C.

Proteína NadA(NL)(C)

[00189] O DNA que codifica a proteína NadA do sorogrupo meningocócico B, cepa 2996, foi digerido para remover a sequência que codifica seu terminal C, para gerar um plasmídeo que codifica a sequência de aminoácidos ID. DE SEQ. N: 1. O plasmídeo foi transfectado em E. coli e as bactérias cresceram para expressar a proteína. A proteína recombinante foi secretada no meio de cultura, e o peptídeo-líder estava ausente na proteína secretada (ID. DE SEQ. N: 2). O sobrenadante foi tratado da seguinte forma: - concentração 7 X e diafiltração contra tampão TRIS/HCl 20 mM pH 7,6 por UF de fluxo cruzado (valor de corte de 30 Kd). - cromatografia em coluna aniônica (“Q Sepharose XL”), com eluição por NaCl 400 mM em TRIS/HCl 20 mM pH 7,6. - etapa de cromatografia em coluna hidrofóbica (“Phenil Sepharose 6 Fast Flow High Sub”), com eluição por NaCl 50 mM em TRIS/HCl pH 7,6. - cromatografia em coluna de cerâmica de hidroxiapatita (“HA Macro. Prep”) com eluição por fosfato de sódio 200 mM pH 7,4. - diafiltração (valor de corte de 30 Kd) contra PBS pH 7,4. - filtração estéril final e estocagem a -20 °C.

[00190] A proteína no material final era estável por pelo menos 6 meses, tanto a -20 °C quanto a 2-8 °C.

[00191] A proteína NadA é suscetível à degradação, e formas truncadas de NadA podem ser detectadas por imunotransferência enzimática ou por espectrometria de massa (por exemplo, por MALDI- TOF), indicando uma perda de PM de até 10 kDa. Os produtos da degradação podem ser separados da NadA nativa por filtração em gel (por exemplo, usando coluna TSK 300SWXL, pré-coluna TSKSWXL, TOSOHAAS). Tal filtração gera três picos: (i) um primeiro pico com tempo de retenção de 12,637 min e PM aparente de 885,036 Da; (ii) tempo de retenção de 13,871 min e PM aparente de 530,388 Da; (iii) tempo de retenção de 13,871 min e PM aparente de 530,388 Da. A análise de dispersão luminosa dos três picos revela os valores reais do PM de (i) 208500 Da, (ii) 98460 Da, (iii) 78760 Da. Dessa forma, o primeiro pico contém agregados de NadA e o terceiro pico contém produtos de degradação.

[00192] Uma vez que o peso molecular previsto de NadA(NL)(C) é 34,113 Da, o pico (ii) contém uma proteína trimérica, que é o antígeno desejado.

Combinações Antigênicas

[00193] Camundongos foram imunizados com uma composição que compreende as três proteínas e, para fins de comparação, as três proteínas também foram testadas isoladamente. Foram usados dez camundongos por grupo. A mistura foi capaz de induzir altas titulações bactericidas contra várias cepas:

[00194] “-” indica que essa cepa não contém gene de NadA

[00195] Olhando individualmente os camundongos, a mistura tripla induziu titulações bactericidas elevadas e consistentes contra as três cepas do sorogrupo B das quais os antígenos individuais são derivados:

Combinação e comparação com OMVs

[00196] Em experimentos adicionais, os antígenos (20 μg de cada antígeno por dose) foram administrados em combinação com 10 μg de OMVs preparadas da cepa H44/76 (Noruega) ou da cepa 394/98 (Nova Zelândia). Controles positivos foram o SEAM-3 mAb anti-capsular para o sorogrupo B ou conjugados CRM197-sacarídeos capsulares para outras cepas. A mistura quase sempre gerou melhores titulações do que OMVs simples, e a adição da mistura às OMVs quase sempre aumentou significativamente a eficácia das OMVs. Em muitos casos, a mistura de antígenos equivaleu ou excedeu a resposta observada com o controle positivo.

Testes com linhagem hipervirulenta

[00197] Os seguintes antígenos foram testados contra diversas cepas do sorogrupo B de várias linhagens hipervirulentas: (a) NadA(NL)(C) (b) ΔG287-953 (c) 936-ΔG741 (d) uma mistura de (a), (b) e (c) (e) OMVs preparadas a partir da cepa H44/76 (Noruega) (f) OMVs preparadas a partir da cepa 394/98 (Nova Zelândia) (g) Uma mistura de ΔG287 e (e) (h) Uma mistura de (d) e (e) (i) Uma mistura de (d) e (f) SEAM-3 foi usado como controle positivo.

[00198] Os resultados foram como mostrado a seguir, expressos como a percentagem de cepas na linhagem hipervirulenta indicada, na qual a titulação bactericida sérica excedia 1.024:

[00199] Contra cepas de referência específicas, as titulações bactericidas foram da seguinte forma:

[00200] Portanto, as composições (d), (h) e (i) induzem respostas bactericidas de anticorpos contra uma ampla variedade de cepas de meningococo do sorogrupo B dentro das linhagens hipervirulentas A4, ET- 5 e linhagem 3. As titulações usando as composições (h) e (i) foram geralmente maiores do que com (d), mas a cobertura das cepas dentro das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 não foi melhor.

[00201] A cobertura de cepas não tipadas também foi elevada com as composições (d), (h) e (i).

Combinação com conjugados meningocócicos e/ou Hib

[00202] A composição tripla de MenB é combinada com uma mistura de oligossacarídeos conjugados para sorogrupos C, W135 e Y, para gerar uma vacina contendo os seguintes antígenos:

[00203] É preparada uma vacina similar, incluindo conjugado de MenA (10 μg de sacarídeo + 12,5-33 μg de CRM197) e/ou um conjugado de HbOC Hib (10 μg de sacarídeo + 2-5 μg de CRM197).

[00204] Em uma série de testes, conjugados dos sorogrupos C, W135 e Y foram combinados, com cada conjugado presente a 40 μg/ml (medido como sacarídeo). Para estocagem antes do uso com antígenos de MenB, os conjugados combinados foram liofilizados [-45 °C por 3 horas, - 35 °C por 20 horas a vácuo de 6,66 Pa, 30°C por 10 horas a 6,66 Pa, 30°C por 9 horas a 16,66 Pa] na presença de 15 mg de sacarose, tampão fosfato 10 mM (pH 7,2). O volume final antes da liofilização era de 0,3 ml. Após ressuspensão em 0,6 ml de solução aquosa, portanto, os sacarídeos estavam presentes a 12 μg por sorogrupo. A liofilização foi usada apenas por conveniência, e nem a eficácia nem a estabilidade durante a estocagem normal do produto final necessita de liofilização.

[00205] Foi preparado um segundo lote de material da mesma forma, mas incluindo também o conjugado do sorogrupo A na mesma dosagem de sacarídeo usada para os sorogrupos C, W135 e Y.

[00206] Foi preparado um terceiro lote de material da mesma forma (sorogrupos A, C, W135 e Y), mas incluindo também um conjugado Hib-CRM197 na mesma dosagem de sacarídeo usada para os meningococos.

[00207] Para comparação, foram preparadas preparações liofilizadas dos conjugados do sorogrupo A e C. O material de MenA foi liofilizado com 15 mg de sacarose para gerar uma dose de 12 μg de sacarídeo após reconstituição, como descrito acima. O material de MenC foi liofilizado com 9 mg de manitol para gerar uma dose de 12 μg de sacarídeo após reconstituição.

[00208] Esses materiais foram combinados com 600 μl da mistura do sorogrupo (d) (ou, como controle, ou seja, grupos 2 e 3, em uma composição idêntica, mas desprovida dos antígenos), para gerar oito composições:

* A quantidade mostrada é de sacarídeo.

[00209] Essas composições foram administradas por via intraperitoneal em um volume de 200 μl a camundongos CD/1 (8 por grupo) nos dias 0, 21 e 35, com uma coleta de sangue final no 49° dia. Os soros do 49° dia foram testados em ensaios de SBA contra diversas cepas meningocócicas nos sorogrupos A, B, C, W 135 e Y. Os resultados foram:

[00210] Dessa forma, os antígenos meningocócicos protéicos permanecem eficazes mesmo após a adição dos antígenos meningocócicos conjugados e dos antígenos sacarídicos de Hib. Similarmente, os conjugados meningocócicos retêm eficácia mesmo após a adição dos antígenos protéicos. Na verdade, os dados sugerem que a adição dos antígenos protéicos aos conjugados aumenta a eficácia anti-MenW135 (compare os grupos 2 e 7). Além disso, há um nível de reatividade cruzada, em particular para o sorogrupo Y, uma vez que os antígenos protéicos isoladamente dão uma boa titulação anti-MenY [cf. referência 220], assim como o fazem os dos grupos 4 e 5.

[00211] Os dados também indicam que a adição de um conjugado de Hib aos conjugados meningocócicos (compare os grupos 2 e 3) aumenta a atividade anti-W135.

Uso de sacarídeo modificado de MenA

[00212] O polissacarídeo capsular foi purificado de MenA e foi hidrolisado para gerar oligossacarídeo de MenA. O polissacarídeo (2 g) foi hidrolisado a 50 °C em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,75, em uma concentração de polissacarídeo de 10 mg/ml por cerca de 4 horas [73]. Após hidrólise, a solução foi seca por evaporação rotatória.

[00213] O oligossacarídeo foi ativado usando o seguinte esquema de reação:

[00214] O oligossacarídeo foi dissolvido em DMSO para gerar uma concentração de sacarídeo de 10 mg/ml. De acordo com uma proporção molar de oligossacarídeo:CDI sendo 1:20, 21,262 g de CDI foram então adicionados e a mistura da reação agitada por 16 horas a temperatura ambiente. O composto MenA-CDI resultante foi purificado por precipitação seletiva em uma mistura 80:20 (v/v) de acetona:DMSO, seguida por centrifugação. A eficácia da reação de ativação foi calculada para ser cerca de 67,9% pela determinação da proporção de imidazol livre em relação ao imidazol ligado.

[00215] Na segunda etapa da reação, o oligossacarídeo MenA- CDI foi solubilizado em DMSO em uma concentração de sacarídeo de cerca de 10 mg/ml. De acordo com uma proporção molar de MenA- unidade CDI:DMA sendo 1:100, 36,288 g de hidrocloreto de dimetilamina 99% (ou seja, R1 e R2 = Me) foram adicionados e a mistura da reação agitada por 16 horas a temperatura ambiente. O produto da reação foi seco por congelamento e re-solubilizado em 10 mg/ml de solução aquosa.

[00216] Para a remoção do reagente de baixo peso molecular da reação (am particular, da dimetilamina (DMA)) da preparação de oligossacarídeo, foi realizada uma etapa de diálise através de uma membrana PMCO de 3,5 kDa (Spectra/PorTM). Foram feitas quatro etapas de diálise: (i) 16 horas contra 2 l de cloreto de sódio 1 M (fator de diálise 1:20), (ii) 16 horas contra 2 l de cloreto de sódio 0,5 M (fator de diálise 1:20), (iii) e (iv) 16 horas contra 2 l de WFI (fator de diálise 1:20). Para melhorar a purificação, também foi efetuada uma etapa de diafiltração através de uma membrana PMCO de 1 kDa (CentriconTM).

[00217] O produto MenA-CDI-DMA purificado foi tamponado em pH 6,5 em L-histidina 25 mM (FlukaTM).

[00218] Para a preparação dos conjugados do sacarídeo modificado de MenA (MenA-CDI-DMA), o processo geral foi o seguinte: - hidrólise do polissacarídeo para gerar fragmentos de oligossacarídeo - dimensionamento dos fragmentos de oligossacarídeo - aminação redutora dos grupos aldeído do terminal nos oligossacarídeos dimensionados - proteção dos grupos -NH2 do terminal por grupo Fmoc, antes da reação de CDI - desproteção intrínseca de grupos -NH2 durante a reação - ativação de DMA dos grupos -NH2 do terminal por SIDEA (ácido adiposo de N-hidroxisuccinimida) - adesão covalente à proteína CRM197

[00219] O conjugado de oligossacarídeo de MenA modificado foi bem mais resistente à hidrólise do que seu equivalente natural em temperaturas elevadas. Após 28 dias a 37 °C, por exemplo, a percentagem de sacarídeo liberado é de 6,4% para o oligossacarídeo modificado vs. 23,5% para o antígeno natural. Além disso, as titulações induzidas pelos oligossacarídeos modificados não são significativamente mais baixas do que as obtidas usando as estruturas nativas de açúcar.

[00220] O conjugado de MenA modificado é combinado com conjugados de MenC, MenW135 e MenY como um substituto para o conjugado de oligossacarídeo não modificado. Essa mistura tetravalente é misturada com os três polipeptídeos de MenB para gerar uma vacina eficaz contra os sorogrupos A, B, C, W135 e Y de N. meningitidis em uma dose única. Combinações pneumocócicas

[00221] As três proteínas de MenB combinadas são misturadas com conjugados sacarídicos pneumocócicos para gerar uma concentração final de 2 μg/dose de cada um dos sorotipos pneumocócicos (duplo para o sorotipo 6B). A vacina reconstituída, dessa forma, contém os seguintes antígenos:

[00224] Será compreendido que a invenção foi descrita apenas como forma de exemplo e que podem ser feitas modificações mantendo-se dentro do escopo e do espírito da invenção.

[00225] REFERÊNCIAS (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência) [1] Darkes e Plosker (2002) Paediatr. Drugs 4:609-630. [2] Jones (2001) Curr. Opin. Investig. Drugs 2:47-49. [3] Armand e cols. (1982) J Biol. Stand 10:335-339. [4] Cadoz e cols. (1985) Vaccine 3:340-342. [5] Baklaic e cols. (1983) Infect. Immun. 42:599-604. [6] MPMR (1997) 46(RR-5) 1-10. [7] Bjune e cols. (1991) Lancet 338(8775):1.093-96. [8] Frash (1990) p.123-145 de Advances in Biotechnological Processes vol. 13 (eds. Mizrahi e Van Wezel). [9] WO03/007985. [10] Inzana (1987) Infect. Immun. 55:1.573-1.579. [11] WO02/058737. [12] Pedido de patente da Grã-Bretanha GB-0408978.5. [ref. do advogado: P037501GB]. [13] Kandil e cols. (1997) Glycoconj. J. 14:13-17. [14] Berkin e cols. (2002) Chemistry 8:4424-4433. [15] Glode e cols. (1979) J. Infect. Dis. 139:52-56. [16] WO94/05325; Patente U.S. 5.425.946. 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Claims (12)

1. Composição imunogênica aquosa que, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta imune bactericida contra sorogrupos B, C, W135 e Y de N. meningitidis, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um antígeno de sacarídeo capsular conjugado do sorogrupo C; (ii) um antígeno de sacarídeo capsular conjugado do sorogrupo W135; (iii) um antígeno de sacarídeo capsular do sorogrupo Y conjugado; (iv) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2; (v) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7; e (vi) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; e um ou mais dos antígenos de sacarídeo capsular do sorogrupo C, W135 e Y é O-acetilado.

2. Composição, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: (v) um antígeno de sacarídeo capsular conjugado do sorogrupo A.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular do sorogrupo A é modificado de forma que pelo menos 20% de suas unidades de monossacarídeo não tenham -OH na posição 3 e nem na posição 4.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a composição pode ser estocada por 28 dias a 37°C e, após aquele período, menos do que 20% da quantidade total inicial de sacarídeo conjugado de MenA estarão não conjugados.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos conjugados são oligossacarídeos.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos são conjugados a uma proteína transportadora selecionada a partir de: toxóide diftérico, toxóide tetânico, proteína D de H. influenzae, e CRM197.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno de sacarídeo que protege contra H. influenzae tipo B (Hib).

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno que protege contra Streptococcus pneumoniae.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende um adjuvante de fosfato de alumínio.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é embalada em um recipiente selado hermeticamente.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o recipiente é um frasco ou uma seringa.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é usada como um medicamento.