JP2015524418A - 血管内皮細胞への髄膜炎菌の線毛媒介接着の受容体としてのｃｄ１４７ - Google Patents

Abstract

本発明は、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染を予防又は治療するための、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤の使用に関係する。本発明はまた、かかる阻害剤と、例えば髄膜炎菌による感染を予防又は治療するために使用されるものなどの抗菌化合物との併用にも関する。本発明はまた、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染の予防及び／又は治療のための方法、並びにＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤のスクリーニングのための方法にも関する。

Description

本発明は、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染を予防又は治療するための、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤の使用に関係する。本発明はまた、かかる阻害剤と、例えば髄膜炎菌による感染を予防又は治療するために使用されるものなどの抗菌化合物との併用にも関する。本発明はまた、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染の予防及び／又は治療のための方法、並びにＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤のスクリーニングのための方法にも関する。

髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス（N. meningitidis）、Ｎｍ）（流行性髄膜炎と敗血症の原因）は、ヒト鼻咽頭の片利共生グラム陰性菌である。血流侵入後、毒性莢膜性細菌は、脳内皮細胞に接着し、そして、宿主細胞の先端面で増殖して、最初の細菌付着部位にマイクロコロニを形成し、次に、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、髄膜にコロニーを形成する（Nassif et al., 2002, Trends Microbiol, 10:227-232）。

髄膜炎菌による感染の主たる臨床像は髄膜炎である。逆説的に、ナイセリア・メニンギティディスはヒト鼻咽頭のよく見られる無症候性コロニー形成菌であって、そして、感染のごく一部だけが持続性菌血症に進行する。菌血症患者の大部分では、血流中のＮ．メニンギティディスの存在が、無症候型を維持する。しかしながら、血液相中に、細菌は、脳内皮細胞と相互作用して、そして、髄膜を浸潤して髄膜炎の原因となる。そしてそれは、患者の７０％における髄膜炎菌播種の第一の臨床合併症である。菌血症患者の３０％において、血流中の髄膜炎菌の存在は、場合によっては電撃性紫斑病を伴った敗血症の臨床的症状につながる。後者の場合では、細菌は血液脳関門を通過する；しかしながら、臨床像の最先端には髄膜炎症状は存在しない。

Ｎｍの発生と蔓延の可能性は、外膜成分（莢膜多糖とリポオリゴ糖［エンドトキシン］）の発現に関連するが、周辺及び脳血管細胞と密に相互作用するＮｍの傾向はＩＶ型線毛の発現に左右される。細菌細胞表面から伸びているこれらの長いフィラメント様構造は、驚くほど多面的な機能を呈するが、それには、毒性莢膜性髄膜炎菌の細胞への付着、及び内皮細胞表面における細菌コロニーの固定化に貢献し、それに続く、内皮障壁を通り抜ける移行を促進する宿主シグナリング事象の始動が含まれる。ＩＶ型線毛は、ヘテロマルチマーピリンサブユニットで構成され、そしてそれは、複雑な機構によって螺旋状の繊維に組まれている。それらには、毛形成に必要とされる主要なピリンであるＰｉｌＥと、構造的にＰｉｌＥに類似する他の少量のピリン（例えばＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ又はＣｏｍｐなど）が含まれ、そして、線毛の接着やシグナリング機能を調節している。ＩＶ型線毛の接着特性はまた、例えばＰｉｌＣ１対立遺伝子などの線毛機構の成分によっても調節され、遺伝学的アプローチを使用した、宿主細胞受容体との直接的な相互作用にかかわる分子決定因子を同定することを難しくしている。結果として、複雑な線毛構造の正確な粘着性成分は未決定のままである。しかしながら、髄膜炎菌ＩＶ型線毛がシグナリング事象を引き起こすのに宿主Ｇタンパク質結合β２アドレナリン作動受容体が必須の内皮受容体であることが、最近同定された（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160; Lecuyer et al., 2011, Infect Immun, 80:175-186）。そのうえ、ヒト脳内皮細胞株の細胞表面のＮｍコロニーが、細菌に面している原形質膜の内部表面へのβａｒｒの移行を促進することが、同定された。コロニー下で移行されるβａｒｒは、Ｎｍによって誘発されるシグナリング事象のための足場プラットフォームとしての役割を果たす。細胞株で発現されたＧＰＣＲの中で、β２アドレノ受容体（β２ＡＲ）だけがコロニー下の皮質性プラークの形成、及び細胞単層の細菌横断において寛容な役割を果たす。これらの観察は、ＢＢＢのヒト脳内皮細胞への安定した接着とその後の通過を促進するために、Ｎｍによるβ２アドレナリン作動性／βアレスチンシグナリング経路の必要性を明らかにしている。より詳しく述べると、β２ＡＲ、特にβ２ＡＲのＮ末端と、例えばＰｉｌＥ又はＰｉｌＶなどのＩＶ型線毛関連タンパク質との相互作用は、Ｎ．メニンギティディスを開放し、ＢＢＢを横断できるようにするプロセスを開始することが示されている。

しかしながら、β２アドレナリン作動受容体を失った内皮細胞でもまだ細菌の接着を支援しており、ＩＶ型線毛がまだ知られていない受容体として別の物質との相互作用によって髄膜炎菌の初期付着を促進していることが示唆される。

従って、内皮細胞への髄膜炎菌の初期付着を妨げることで、血流による脳脊髄膜播種、すなわち、髄膜炎菌による菌血症及び／又は髄膜炎菌による感染を予防し、その結果、細菌性髄膜炎及び／又は電撃性紫斑病を予防する。

発明者らは、内皮細胞への髄膜炎菌の初期接着が、髄膜炎菌の表面に存在しているＩＶ型線毛関連タンパク質と宿主内皮細胞の表面に存在しているＣＤ１４７との相互作用によって媒介されており、かかる相互作用が妨げ、その結果、髄膜炎菌による菌血症を阻害し、そして結果的に髄膜炎菌による感染を阻害できることを見出した。

これにより、本発明は、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染を予防又は治療するために使用するＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤に関する。前記阻害剤は、好ましくは（ｉ）ＣＤ１４７阻害剤及び／又は（ｉｉ）ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤である。好ましくは、前記相互作用は直接的な相互作用である。

ある実施形態において、前記阻害剤は、ＣＤ１４７受容体と相互作用することができ、その結果、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害するポリペプチドであるＣＤ１４７阻害剤を含む。

ある実施形態において、このポリペプチドは、好ましくはＣＤ１４７の細胞外部分に直接向けられた、そして、この相互作用、特に結合によって、前記抗体がＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害するか、又はＩＶ型線毛関連タンパク質のＣＤ１４７への付着を妨げるか若しくは無効にする、抗ＣＤ１４７抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、前記抗ＣＤ１４７抗体は、ＭＥＭ‐Ｍ６／６抗体である。

別の実施形態において、ポリペプチドは、ＣＤ１４７受容体に結合でき、そして、細菌と競合でき、その結果、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体の間で相互作用を阻害するか、又はＣＤ１４７へのＩＶ型線毛関連タンパク質の付着を予防するか、若しくは無効にするＩＶ型線毛関連タンパク質断片であってもよい。

別の実施形態において、前記阻害剤は、核酸、好ましくはＣＤ１４７発現をサイレンシングするｄｓＲＮＡであるＣＤ１４７阻害剤を含む。前記ＣＤ１４７阻害剤は、ＣＤ１４７の発現をサイレンシングするｓｉＲＮＡ又はいくつかのｓｉＲＮＡ、好ましくは配列番号１、２、３、４又は５の配列のうちの少なくとも１種類のｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。

別の実施形態において、前記阻害剤は、ＩＶ型線毛関連タンパク質と相互作用することができ、その結果、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害するポリペプチドであるＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤を含む。

ある実施形態において、このポリペプチドは、好ましくはＣＤ１４７受容体への結合部位に対して向けられた、抗ＩＶ型線毛関連タンパク質抗体又は抗体フラグメントであり、この相互作用、特に結合によって、前記抗体は、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体の間の相互作用を阻害するか、又はＩＶ型線毛関連タンパク質のＣＤ１４７への付着を予防するか、若しくは無効にする。

別の実施形態において、このポリペプチドは、ＣＤ１４７ポリペプチド、好ましくはＩＶ型線毛関連タンパク質に結合することができるＣＤ１４７アミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドであり、前記抗体又はポリペプチドは、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害する。

ある実施形態において、前記ＣＤ１４７ポリペプチドは、ＣＤ１４７の細胞外ドメインの可溶形又はその断片を含むか又はそれらから成り、前記可溶形又は断片は、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との間の相互作用を阻害する。ＣＤ１４７の細胞外ドメインの可溶形は、配列番号６の配列又はその断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤、及び医薬的に許容され得るビヒクル、希釈剤又は担体を含む医薬組成物もまた、提供する。

ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤と、さらに少なくとも１種類の抗菌化合物を含む医薬組成物もまた、提供する。前記組成物は、医薬的に許容され得るビヒクル、希釈剤又は担体を含んでいる。特徴によると、その組成物は、ヒトを含めた哺乳動物への同時、別々、又は連続した投与のためのものである。好ましくは、前記少なくとも１種類の抗菌化合物は、（ｉ）髄膜炎菌ワクチン抗原、又は（ｉｉ）少なくとも２種類の髄膜炎菌ワクチン抗原を含む融合タンパク質である。前記髄膜炎菌ワクチン抗原は、髄膜炎菌のＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨｂｐ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＮａｄＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰ、又はその断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

髄膜炎菌の内皮細胞への接着を予防する方法における、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤の使用を、さらに提供する。この方法は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）又は試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において使用され得る。

それを必要としている個体（哺乳動物、好ましくはヒト）に、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤、又は本明細書中に開示した及び提供した組成物の治療上有効な量を投与することを含む、髄膜炎菌による菌血症及び／又は髄膜炎菌による感染を予防又は治療する方法もまた、提供する。

髄膜炎菌による菌血症及び／又は髄膜炎菌による感染を予防又は治療するための薬剤の製造のための、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤の使用もまた、提供する。

ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用の阻害剤のスクリーニング方法もまた、提供し、前記方法は、以下の：
ａ）ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片、及びＣＤ１４７受容体又はその断片を含む媒質を準備し、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片及びＣＤ１４７受容体又はその断片は、特異的に一緒に相互作用して、結合対を形成でき、
ｂ）候補化合物を、前記媒質と接触させ、
ｃ）前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との間の相互作用の阻害を計測する、
から成るステップを含む。

本発明は、以下の図面と実施例を参照することにより、ここでより詳細に説明される。本明細書中に引用したすべての文献及び特許文献を、参照により本明細書中に援用する。

Ｎ．メニンギティディス受容体候補としてのＣＤ１４７の同定。ＴＰＡ処理はＢＢ１９細胞へのＮｍの接着を引き起こす：細胞を、アクチノマイシンＤの不存在下（−）若しくは存在下（１μｇ／ｍｌ）で、処理しない（白色）か又はＴＰＡで処理した（１０ｎｇ／ｍｌ、黒色）。野性型髄膜炎菌（ＷＴ）の接着を処理の４８時間後に計測した。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＞＿３；^***Ｐ＜０．０００１；二元配置分散分析。

Ｎ．メニンギティディス受容体候補としてのＣＤ１４７の同定。ＴＰＡ処理はＢＢ１９細胞へのＮｍの接着を引き起こす：細胞を、処理しない（白色）か又はＴＰＡで処理した（１０ｎｇ／ｍｌ、黒色）。野性型髄膜炎菌（ＷＴ）又は細菌の突然変異株ｄｐｉｌＥ、ｄｐｉｌＣ１若しくはｄｐｉｌＣ２の接着を、処理の４８時間後に計測した。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＞＿３；^***Ｐ＜０．０００１；二元配置分散分析。

β２アドレナリン作動受容体連関シグナリング事象とは無関係に細菌接着部位においてＣＤ１４７が蓄積した。イソプロテレノール誘発β２‐アドレナリン作動受容体エンドサイトーシスはＩＶ型線毛誘導シグナリング事象を阻害したが、細菌接着部位においてＣＤ１４７蓄積に影響しなかった。１０ｌａＭのイソプロテレノールでの細胞の前処理によりＮｍ接着部位におけるＥｚｒｉｎ、Ａｃｔｉｎ、ＣＤ４４又はＣＤ１４７動員の定量化。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^***Ｐ＜０．００１；^**Ｐ＜０．０１；ＮＳ Ｐ＞０．０５；二元配置分散分析。

ＣＤ１４７ノックダウンは、対照ｓｉＲＮＡ（ＣＴＬ）に対して、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３ｓへのＮｍの接着を低減させた。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４；^**Ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。

外因性ＣＤ１４７の発現は、ＣＤ１４７ノックダウンｈＢＭＥＣ細胞への細菌接着を回復させた。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^**Ｐ＝０．００２５；一元配置分散分析。

ＣＤ１４７ノックダウンは、剪断応力下でのｈＢＭＥＣ細胞へのＮｍの初期接着を低減した。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^**Ｐ＜０．０１。一元配置分散分析。

ＩＣＡＭ‐１‐ＦｃではなくＣＤ１４７‐Ｆｃ（両方とも５μｇ／ｍｌ）が、ｈＢＭＥＣ細胞へのＮｍの接着を低減した。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^**Ｐ＜０．０１）。一元配置分散分析。

抗ＣＤ１４７ ＭＥＭ‐Ｍ６／６［１０μｇ／ｍｌ］は、ｈＢＭＥＣ細胞へのＮｍの接着を強力に阻害したが、他の抗体［１０μｇ／ｍｌ］は、ほとんど（ＭＥＭ‐Ｍ６／１）又はまったく（抗ＩＣＡＭ‐１、１１Ｃ８１）接着に影響を及ぼさなかった。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^***Ｐ＜０．００１；^**Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析。

Ｎｍは、ＩＣＡＭ‐１‐Ｆｃではなく、固定化されたＣＤ１４７‐Ｆｃに直接接着する。陰性：固定されたタンパク質なし。バー：１視野あたりの平均。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３；^***Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析。

固定化されたＣＤ１４７‐Ｆｃへの野生型（ＷＴ）、ｄｐｉｌＥ、ｄｐｉｌＣ１又はｄｐｉｌＣ２髄膜炎菌の接着。バー：１視野あたりの平均。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４；^***Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析。

精製したＭＢＰ‐ＰｉｌＥ及びＭＢＰ‐ＰｉｌＶキメラは、ＣＤ１４７‐Ｆｃと直接相互作用したが、その一方、ＭＢＰ‐ＰｉｌＸ、ＭＢＰ‐ＣｏｍＰ、及びＭＢＰは相互作用しなかった。トップ：示したＭＢＰ‐Ｐｉｌｉｎｓを担持するブドウ球菌（staphylococci）と共沈したＣＤ１４７‐Ｆｃ。最下位：結合ＣＤ１４７‐Ｆｃの定量化。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４；^***Ｐ＜０．００１；^**Ｐ＜０．０１；一元配置分散分析。

可溶性ＭＢＰ‐ＰｉｌＥ及びＭＢＰ‐ＰｉｌＶは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への細菌接着を強力に阻害したが、その一方で、ＭＢＰ‐ＰｉｌＸ、ＭＢＰ‐ＣｏｍＰ、及びＭＢＰは影響を受けなかった。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４；^***Ｐ＜０．００１；^**Ｐ＜０．０１；一元配置分散分析。

細菌の突然変異株ΔｐｉｌＥ及びΔｐｉｌＶは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に接着しなかった。平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４；^***Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析。

ＷＴの接着の％として表した、接着蛍光髄膜炎菌／１００μｍ２切片の定量化。平均±ｓ．ｅ．ｍ ｎ＝３、３人の異なったドナーからの脳切片、^***Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析。

ＣＤ１４７との線毛相互作用を必要とするＮ．メニンギティディスによる新しいヒト脳切片への現場感染。抗体の不存在下における蛍光と相対的な、総蛍光／１００μｍ２の平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４、３人の異なったドナーからの脳切片、^*Ｐ＜０．０５；一元配置分散分析。

ナイセリア・メニンギティディスの線毛は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト皮膚異種移植片を標的化するのに必要である（腹腔内経路、１０⁶ＣＦＵ、１群あたり３匹のマウス）。

ＳＣＩＤマウスにおける菌血症に対するヒト皮膚異種移植片の影響（静脈内経路、１０⁵ＣＦＵ、１群あたり３匹のマウス）。

ナイセリア・メニンギティディスを感染させたＳＣＩＤマウスの生存率（静脈内経路、１０⁵ＣＦＵ、１群あたり３匹のマウス）。

定義
「髄膜炎菌による菌血症」は、あらゆる臨床的症状のない、宿主の血液中の生存髄膜炎菌の一時的な通過を意味する。

「髄膜炎菌による感染」は、臨床的症状を伴った、宿主における生存髄膜炎菌の持続的な存在を意味する。

「髄膜炎菌」は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｍ）細菌、好ましくは血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５のＮｍを意味する。

「ＩＶ型線毛関連タンパク質」は、細菌の線毛の表面に存在しているタンパク質を意味する。例えば、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質は、ＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、又はＣｏｍＰタンパク質であり得る。前記ＩＶ型線毛関連タンパク質は、好ましくはＰｉｌＥ又はＰｉｌＶタンパク質であり、より好ましくはいずれかの髄膜炎菌血清型、例えば、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５の髄膜炎菌由来のＰｉｌＥ又はＰｉｌＶタンパク質である。

Ｂａｓｉｇｉｎ（ＢＳＧ）又は細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）とも呼ばれる「ＣＤ１４７」は、Ｎ末端細胞外部分に２つの重度にグリコシル化されたＣ２型免疫グロブリン様領域を含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態において、ＣＤ１４７は：
ａ）配列番号７（ＮＣＢＩ参照配列NP_001719.2、２０１２年２月２６日のアップデート）の配列、
ｂ）配列番号８（ＮＣＢＩ参照配列NP_940991.1、２０１２年２月２６日のアップデート）の配列、
ｃ）配列番号９（ＮＣＢＩ参照配列NM_001728.2、２０１２年２月２６日のアップデート）の核酸によってコードされた配列、
ｄ）配列番号１０（ＮＣＢＩ参照配列NM_198589.1、２０１２年２月２６日のアップデート）の核酸によってコードされた配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一の配列、
から含むか又はそれらから成る。

「ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との間の相互作用」は、髄膜炎菌の表面に存在しているＩＶ型線毛関連タンパク質と、例えば宿主の末梢又は脳内皮細胞などの内皮細胞の表面に存在しているＣＤ１４７との間の直接的な相互作用を意味する。実際には、発明者らは、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との間の直接的な相互作用が髄膜炎菌の内皮細胞への接着を可能にし、その結果、髄膜炎菌が、例えば脳血管や末梢血管などの血管に感染することを可能にすることを見出した。

「阻害剤」は、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用を低減するか又は無効にできる作用物質を意味する。前記阻害剤は、ＣＤ１４７の発現を低減できても、無効にできてもよい。本発明によると、前記阻害剤は（ｉ）ＣＤ１４７阻害剤、及び／又は（ｉｉ）ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤である。

好ましくは、前記阻害剤は、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用を少なくとも１０、２０、３０、４０％、好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、そして最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％低減できるか又は無効にできる。

本明細書中のポリペプチド及び核酸への言及には、本明細書中に開示したアミノ酸配列及び核酸配列、並びに前記配列の変異型が含まれる。

変異タンパク質は、スプライス変異体、対立遺伝子及びアイソフォームなどの自然発生変異体であってもよく、又はそれらは遺伝子組み換え手段で作製されてもよい。アミノ酸配列における変異は、タンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす、タンパク質をコードする核酸配列への１若しくは複数のコドンの置換、欠失又は挿入によって導入されてもよい。任意に、変異は、タンパク質におけるその他のアミノ酸による１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるアミノ酸の置換によるものである。さらに又はあるいは、変異は、タンパク質内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるアミノ酸の付加又は欠失によるものであってもよい。

変異核酸配列は、中程度又は高いストリンジェンシー条件下で配列番号１〜５、９、１０の配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含んでいる。ストリンジェント条件又は高いストリンジェンシー条件は：（１）洗浄するために低イオン強度と高熱、例えば５０℃にて０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）４２℃にてハイブリダイゼーション中に、例えばホルムアミド、例えば７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いたｐＨ６．５の、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニールピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤を用いる；又は（３）４２℃にて０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、そして、５５℃にて５０％のホルムアミド中での洗浄と、それに続く５５℃にてＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄を伴った、４２℃にて５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いる、ものによって決定され得る。

中程度のストリンジェント条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されているように特定でき、そして、前記のものより低いストリンジェントの洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及びＳＤＳの％）の使用が含まれる。中程度のストリンジェント条件に関する例は：２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性断片化サケ***ＤＮＡを含む溶液中、３７℃にて一晩のインキュベーションと、それに続く、約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でのフィルタの洗浄である。

本明細書中に開示されたタンパク質及び変異タンパク質の断片もまた、本発明に包含される。そのような断片は、Ｎ末端又はＣ末端が切り詰めらていても、例えば完全長タンパク質と比較したときに、内部の残基を欠失していてもよい。好ましくは、前記断片は、長さが少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれより長いアミノ酸である。

本明細書中に開示された核酸配列及び変異型の断片もまた、本発明に包含される。そのような断片は、３’又は５’末端が切り詰められていても、又は例えば完全長核酸配列と比較したときに、内部の塩基を欠失していてもよい。好ましくは、前記断片は、長さが少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれより長い塩基である。

変異タンパク質としては、先に本明細書中で記載した変異型核酸配列によってコードされたタンパク質を挙げることもできる。変異タンパク質としてはまた、本明細書中に開示したポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を挙げることもできる。好ましくは、変異タンパク質は、本明細書中に開示した完全長ポリペプチド配列又はポリペプチド配列の断片に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性は、配列を整列させ、そして、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要であれば、ギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一である変異体配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして規定され、どのような保存的置換も配列同一性の一部とは見なさなかった。配列同一性は、変異体配列の完全長、参照配列の完全長、又はその両方にわたって決定され得る。

変異核酸配列としては、本明細書中に開示した核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有するタンパク質を挙げることもできる。好ましくは、変異タンパク質は、本明細書中に開示した完全長核酸配列又は核酸配列の断片に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の核酸配列同一性を有する。核酸配列同一性は、配列を整列させ、そして、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要であれば、ギャップを導入した後の、参照配列中の核酸残基と同一である変異体配列中の核酸残基のパーセンテージとして規定され、どのような保存的置換も配列同一性の一部とは見なさなかった。配列同一性は、変異体配列の完全長、参照配列の完全長、又はその両方にわたって決定され得る。

参照ペプチドに対して「実質的に相同」のペプチドは、１若しくは複数の保存的置換によって参照配列から誘導され得る。好ましくは、これらの相同ペプチドは、環化を妨げないように、システイン残基を２つ含んでいない。１若しくは複数のアミノ酸残基が、生物学的に類似した残基によって置換されるか、又は８０％超のアミノ酸が同一である、若しくは約９０％超、好ましくは約９５％超が類似しているとき（機能上同一）、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。

本発明の照会アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドによれば、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、対象ポリペプチド配列が照会アミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり最大で５つのアミノ酸変化を含んでもよいことを除いて、照会配列と同一であることが意図されている。言い換えれば、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基のうちの最大５％（１００分の５）が、別のアミノ酸によって挿入、欠失、又は置換されてもよい。

本願との関連において、同一性のパーセンテージは、全体的な整列を使用することで計算される（すなわち、２つの配列はそれらの全長にわたって比較される）。２以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、≪ｎｅｅｄｌｅ≫プログラム（それらの全長を考慮するとき、２つの配列の（ギャップを含めた）最適な整列を見つけるために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈの全体的な整列アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用する）が例えば使用されてもよい。例えば、ｎｅｅｄｌｅプログラムは、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイトで入手可能である。本発明による同一性のパーセンテージは、１０．０の「ＧａｐＯｐｅｎ」パラメーター、０．５の「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメーター、及びＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを用いたＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ（全体的）プログラムを使用して、好ましくは計算される。

参照配列に対して「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の」アミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列と比較して、例えば欠失、挿入及び／又は置換などの突然変異を含んでいてもよい。置換の場合には、参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列とは別の種由来の相同性配列に相当してもよい。

アミノ酸置換は、保存的であっても、非保存的であってもよい。好ましくは、置換は保存的置換であって、そしてそこでは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換されている。好ましくは、置換は、以下の表にみられるような保存的置換に該当している。

「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合サイトを含む分子を意味する。従って、抗体の用語は、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、二重特異性抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、ラクダ科動物の抗体、及び抗体フラグメントも包含する。自然抗体において、２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに結合し、それぞれの重鎖はジスルフィド結合により１つの軽鎖と結合している。ラムダ（ｌ）とカッパ（ｋ）の２つの軽鎖のタイプがある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖のクラス（イソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ。それぞれの鎖は、異なる配列ドメインを含む。軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインを含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、これらをまとめてＣＨという）の４つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖結合、分泌、胎盤移動、補体結合及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合等の重要な生物学的特性を与える。Ｆｖ断片は、イムノグロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部からなる。抗体の特異性は、抗体結合サイトと抗原決定基との間の構造的相補性に帰する。抗体結合サイトは、高度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から主になる残基で構成されている。時々、非高度可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、全ドメイン構造及び結合サイトに影響する。相補性決定領域又はＣＤＲｓは、ネイティブイムノグロブリン結合サイトの自然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を定義するアミノ酸配列を意味する。イムノグロブリンの軽鎖は、Ｌ‐ＣＤＲ１、Ｌ‐ＣＤＲ２、Ｌ‐ＣＤＲ３である３つのＣＤＲを有し、イムノグロブリンの重鎖は、Ｈ‐ＣＤＲ１、Ｈ‐ＣＤＲ２、Ｈ‐ＣＤＲ３である３つのＣＤＲを有する。従って、抗原結合サイトは、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれのＣＤＲのセットを含む６つのＣＤＲを有する。

フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に配置されたアミノ酸配列、すなわち、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）によって規定されるように、単一種の異なった免疫グロブリンの間で比較的保存された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域のそれらの部分を意味する。本明細書中に使用される場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％又はそれを上回る、特に９０％、９５％、又は１００％）のフレームワーク領域である。

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、単一アミノ酸組成物から成る抗体分子を指し、そしてそれは、特異的抗原に対して向けられ、且つ、Ｂ細胞又はハイブリドーマの単一クローンによって産生され得る。モノクローナル抗体はまた、遺伝子組み換えであってもよい、すなわち、タンパク質工学によって作製されていてもよい。

「キメラ抗体」という用語は、ヒト以外の動物由来の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインと関連して含む改変抗体を指す。ヒト以外の動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は類似したものなどのあらゆる動物が使用され得る。キメラ抗体はまた、少なくとも２つの異なった抗原に対して特異性を有する多特異的抗体を意味することもできる。

「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンのものと比較して、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、異なった特異性のドナー免疫グロブリンからのＣＤＲを含むように改変された抗体を指す。好ましい実施形態において、マウスＣＤＲは、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域に繋ぎ合わせられる。

「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部、好ましくは完全な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、抗体フラグメントから形成されたＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体及び多特異的抗体が挙げられる。

「Ｆａｂ」という用語は、分子量が約５００００であり、抗原結合活性を有し、プロテアーゼであるパパインを用いてＩｇＧを処理することにより得られる断片のうちＨ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖の全体とが互いにジスルフィド結合により結合した抗体断片を意味する。

「Ｆ（ａｂ’）２」は、分子量が約１０００００であり、抗原結合活性を有し、プロテアーゼであるペプシンを用いてＩｇＧを処理することにより得られる断片のうちヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに長い抗体断片を意味する。

「Ｆａｂ’」という用語は、分子量が約５００００であり、抗原結合活性を有し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる抗体断片を意味する。

一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーにより結合されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から、通常、発現される共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントとしては、好ましくは遺伝子組み換ええ技術を使用することによって、適当な立体構造で保持されているＣＤＲが挙げられる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価抗体断片及び多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖｓの結合により自発的に形成可能であり、又は二価ｓｃ（Ｆｖ）２等のペプチドリンカーによる一価ｓｃＦｖｓの結合により生じ得る。

「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合サイトを有する低分子抗体断片であり、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ‐ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片を意味する。同一鎖における２つのドメイン間でペアにさせるには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインが他方の鎖の相補的なドメインとペアにすることができ、２つの抗原結合サイトが生成される。

「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ‐ＲＮＡ又はＲＮＡ‐ＤＮＡ又はＲＮＡ‐ＰＮＡ（タンパク質核酸；Egholm et al., 1993, Nature 365, 566）相互作用により標的ＲＮＡに結合し、そして、標的ＲＮＡの活性を変化させる（総説に関して、Stein and Cheng, 1993, Science 261, 1004, and Woolf et al., U.S. Pat. No. 5,849,902を参照）非酵素的核酸分子を意味する。一般的に、アンチセンス分子は、そのアンチセンス分子の一つの連続した配列に沿って標的配列に対して相補的である。しかし、特定の実施形態において、アンチセンス分子は、基質分子がループ又はヘアピンを形成するように基質に結合することができ、及び／又はアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループ又はヘアピンを形成するように結合することができる。これにより、アンチセンス分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを上回る非隣接基質配列と相補的であり得るか、又はアンチセンス分子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ上回る非隣接配列部分は、標的配列と相補的であり得るか、あるいはその両方である（例えばCrooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45を参照）。加えて、アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ‐ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的化し、その結果、二本鎖の状態の標的ＲＮＡを消化するＲＮＡｓｅ Ｈを活性化するために使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１若しくは複数のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含むことができ、そしてそれは、ＲＮＡｓｅ Ｈが標的ＲＮＡを開裂するのを活性化することができる。

導入によって、アンチセンス核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路と一般的に呼ばれている細胞経路に入る。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングとも呼ばれる、ＲＮＡの選択的細胞内分解を指す。ＲＮＡｉとしてはまた、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）による翻訳抑制も挙げられる。ＲＮＡｉは、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｓ）若しくはｓｉＲＮＡｓの導入によって、又は１若しくは複数の標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、例えばプラスミド又は導入遺伝子からの、ｓｉＲＮＡｓの細胞内での産生によって開始される。あるいは、ＲＮＡｉは、細胞で自然に生じて、外来性ＲＮＡ、例えばウイルスＲＮＡを除去している。天然のＲＮＡｉは、分解機構を他の同族のＲＮＡ配列に向ける前駆体ｄｓＲＮＡのダイサー定方向断片化を介して続く。

いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸は、長い二本鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び／又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。

本明細書中で使用される場合、「長い二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、ゲノム若しくは合成起源の又はベクターの発現由来の、改変されたか又は改変されていない、オリゴリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチド、及びその断片又は一部を指し、そしてそれは、部分的に若しくは完全に二本鎖であってもよく、且つ、平滑末端であっても、５’ 又は３’オーバーハングであってもよく、そして、それ自体で畳み込んで二本鎖の領域をもたらしている単一のオリゴリボヌクレオチドを含むヘアピン形態があってもよい。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１５０ｂｐ〜３０００ｂｐに及ぶサイズ、好ましくは２５０ｂｐ〜２０００ｂｐに及ぶ、より好ましくは３００ｂｐ〜１０００ｂｐに及ぶサイズを有する。いくつかの実施形態において、前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００ｂｐのサイズを有する。いくつかの実施形態において、前記ｄｓＲＮＡは、多くて３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００ｂｐのサイズしか有していない。

「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、着目の遺伝子に標的化されたヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ分子の２つの領域の間の相補的対合によって形成された構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である遺伝子に標的化されている。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡｓの二本鎖の長さは、１５ヌクレオチドから５０ヌクレオチドに及び、好ましくは２０ヌクレオチドから３５ヌクレオチドに及び、さらにより好ましくは２１ヌクレオチドから２９ヌクレオチドに及ぶ。いくつかの実施形態において、二本鎖は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドの長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、二本鎖は、長くても４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチドの長さのものであり得る。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であってもよい。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成している２つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループは長さが異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造はまた、３又は５つのオーバーハング部分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、０、１、２、３、４、又は５ヌクレオチドの長さの３’又は５’オーバーハングである。

細胞及び生物体内へのアンチセンス核酸の注入及びトランスフェクションは、デリバリーの主要な方法である。しかしながら、発現ベクターはまた、一過性で又は安定して形質移入された哺乳動物細胞における継続的なアンチセンス核酸の発現のために使用され得る（例えばBrummelkamp et al., 2002, Science, 296:550-553; Paddison et al., 2002, Genes & Dev, 16:948-958を参照）。

アンチセンス核酸は、化学的に合成されても、又は例えばCaruthers et al., 1992, Methods in Enzymology, 211:3-19; International PCT Publication No. WO 99/54459; Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng, 61:33-45; and U.S. Pat. No. 6,001,311に記載されているような当該技術分野で知られているプロトコールを使用した一本鎖ＤＮＡ発現ベクター又は同等物の使用によって発現されてもよい。制限されることのない例において、小規模合成が、３９４Applied Biosystems, Inc.のシンセサイザによっておこなわれる。あるいは、本発明のアンチセンス核酸分子は、別々に合成され、そして、例えば、連結反応（International PCT publication No. WO 93/23569; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem, 8:204）によって合成後に一つに繋ぎ合わせられ得る。

本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも１０、２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、そして、最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％ＣＤ１４７の発現を減少させことが可能であり得る。

「髄膜炎菌ワクチン抗原」とは、Ｎ．メニンギティディスに対して免疫応答を惹起することができ、且つ、ワクチン又は免疫原性化合物としての使用に好適である髄膜炎菌抗原を意味している。

「免疫原性化合物」とは、個体に投与されたときに、免疫応答を引き起こすか又は免疫調節する（すなわち、免疫抑制するか若しくは免疫刺激する）、あるいは個体に投与されたときに、抗体産生を引き起こす化合物を意味している。

本明細書中で使用される場合、「ワクチン」とは、免疫応答を免疫調節するために投与される本明細書中に記載の免疫原性化合物などの化合物を指し、そして特にその作用物質により、病気から個体を保護するか又は治療する。ワクチンは、すなわち、疾病進行を低減するか若しくは止めるために、疾患発生後の個体に投与するための、治癒的な（治療的な）ワクチンであっても、及び／又は最初の（及び／又は再帰的）感染を予防するために、疾患発生前の個体に投与するための予防（予備的）ワクチンであってもよい。

「対象」、「個体」又は「宿主」という用語は、互換的に使用され、そして、例えばヒト又はヒト以外の哺乳動物であってもよい。好ましくは、対象は、男性、女性、又は小児である。

ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤
本発明は、髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染を予防又は治療するために使用するＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用の阻害剤に関し、前記阻害剤は、以下：
（ｉ）ＣＤ１４７阻害剤、及び／又は
（ｉｉ）ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤、
である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ１４７阻害剤は、抗ＣＤ１４７抗体又はアンチセンス核酸であって、前記抗体は、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害し、そして、前記アンチセンス核酸は、ＣＤ１４７受容体発現をサイレンシングする。

一実施形態において、前記アンチセンス核酸は、配列番号７若しくは８の配列のＣＤ１４７、又は配列番号９若しくは１０の核酸によってコードされた配列のＣＤ１４７の発現を阻害するか、又は低減することができる配列を含んでいても、それらから成っていてもよい。前記アンチセンス核酸は、ＣＤ１４７をコードする核酸、例えば配列番号９若しくは１０の配列の核酸に相補的な配列を含んでいても、それらから成っていてもよい。好ましくは、前記アンチセンス核酸は、ｓｉＲＮＡ、特に配列番号１、２、３、４又は５の配列のうちの少なくとも１種類のｓｉＲＮＡを含んでいても、それらから成っていてもよい。一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜５から成る群から選択される少なくとも２、３、４又は５個のｓｉＲＮＡを含むか、又はそれらから成る。一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜５から成る群から選択される多くても５、４、３、又は２個のｓｉＲＮＡを含むか、又はそれらから成る。一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、配列配列番号２、３、４及び５のうちの４個のｓｉＲＮＡを含むか、又はそれらから成る。

好ましくは、前記抗ＣＤ１４７受容体抗体は、ＩＶ型関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を予防又は阻害することができ、それにより、内皮細胞への髄膜炎菌の接着を予防又は阻害し、その結果、髄膜炎菌の菌血症及び／又は感染をであると予防又は阻害する。好ましくは、前記抗ＣＤ１４７抗体は、ＩＶ型線毛関連タンパク質へのＣＤ１４７の結合部位に対して向けられた抗体である。好ましくは、前記抗ＣＤ１４７抗体は、ＣＤ１４７又はその断片のＣ末端領域に対して向けられる。より好ましくは、前記抗ＣＤ１４７抗体は、ＣＤ１４７のエクトドメイン又はその断片に向けられる。従って、前記抗ＣＤ１４７は、配列番号７の配列の第１６〜３２１アミノ酸又はその断片、又はその又は配列番号８の配列の第１６〜２０５アミノ酸又はその断片に向けられる。好ましくは、前記抗ＣＤ１４７抗体は、ＣＤ１４７の前記エクトドメインの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個の隣接アミノ酸から成る断片に向けられる。より好ましくは、前記抗ＣＤ１４７は、配列番号７の配列の第２２１〜３１５アミノ酸又は配列番号８の配列の第１０５〜１９９アミノ酸から成る断片、すなわち、ＣＤ１４７の膜近位免疫グロブリンドメイン（Ｉｇ様Ｖ型領域）に向けられている。より好ましくは、前記抗ＣＤ１４７抗体は、抗ＣＤ１４７抗体ＭＥＭ‐Ｍ６／６（Ａｂｃａｍ（登録商標））である。

さらに別の実施形態において、ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤は、抗ＩＶ型線毛関連タンパク質抗体である。好ましくは、前記抗ＩＶ型線毛関連タンパク質抗体は、ＣＤ１４７受容体又はその断片へのＩＶ型線毛関連タンパク質の結合部位に対して向けられた抗体である。さらに好ましくは、前記抗ＩＶ型線毛関連タンパク質抗体は、ＣＤ１４７受容体又はその断片に対するＰｉｌＥ及び／又はへのＰｉｌＶタンパク質の結合部位への抗体に向けられた。

さらに別の実施形態において、ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤は、以下の：
‐ＩＶ型線毛関連タンパク質の免疫原性断片、又は
‐ＩＶ型線毛関連タンパク質の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の免疫原性断片を含むか又はそれらから成る融合タンパク質、
であり、前記免疫原性断片又は前記融合タンパク質が、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を妨げる抗体を伴う免疫応答を惹起することができる。好ましくは、前記免疫原性断片は、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの免疫原性断片である。その結果、前記融合タンパク質は、例えば（ｉ）ＰｉｌＥの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の免疫原性断片、（ｉｉ）ＰｉｌＶの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の免疫原性断片、（ｉｉｉ）ＰｉｌＥの１個の免疫原性断片及びＰｉｌＶの１個の免疫原性断片、（ｉｖ）ＰｉｌＥの２個の免疫原性断片及びＰｉｌＶの２個の免疫原性断片、（ｖ）ＰｉｌＥの１個の免疫原性断片及びＰｉｌＶの２個の免疫原性断片などを含んでいても、それらから成っていてもよい。

さらに別の実施形態において、ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤は、ＣＤ１４７ポリペプチドである。好ましくは、前記ＣＤ１４７ポリペプチドは、前記ＩＶ型関連タンパク質と前記ＣＤ１４７受容体との相互作用を予防又は阻害することができ、それにより、内皮細胞への髄膜炎菌の接着を予防又は阻害し、その結果、髄膜炎菌の菌血症及び／又は感染を予防又は阻害する。従って、前記ＣＤ１４７ポリペプチドは、（ｉ）１若しくは数個のアミノ酸で、配列番号７若しくは８の配列の完全なＣＤ１４７、又は配列番号９若しくは１０の核酸によってコードされた配列の完全なＣＤ１４７と異なっている、且つ、（ｉｉ）内皮細胞膜又はその断片に結合することができない、ＣＤ１４７アミノ酸配列であってもよい。

一部の実施形態において、前記ＣＤ１４７ポリペプチドは、ＣＤ１４７の細胞外ドメイン又はその断片からそのを含んでいても、それらから成っていてもよい。

好ましくは、前記ＣＤ１４７ポリペプチドは：
ａ）配列番号６のアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号６と実質的に相同な、好ましくは配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列、
を含んでいても、それらから成っていてもよい。

例えば、前記断片は、前記ＣＤ１４７ポリペプチドの１０〜１８０個の隣接アミノ酸、好ましくは５０〜１５０個のアミノ酸、さらに好ましくは８０〜１２０個のアミノ酸を含んでいても、それらから成っていてもよい。例えば、前記断片は、前記ＣＤ１４７ポリペプチドの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０個の隣接アミノ酸、及び／又は多くとも前記ＣＤ１４７ポリペプチドの１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０個の隣接アミノ酸を含んでいても、それらから成っていてもよい。

抗菌化合物
いくつかの実施形態において、連続して又は同時に、少なくとも１種類の抗菌化合物と組み合わせて、本発明よる阻害剤を投与するためのものである。

いくつかの実施形態において、本発明よる阻害剤は、連続して又は同時に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び／又は多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２の抗菌化合物と組み合わせて投与するためのものである。

連続投与は、成分が別々の時間又は時点で投与されることを示すが、それにもかかわらず、時間又は時点は重なっていてもよい。同時投与は、成分が同時に投与されることを示す。

抗菌化合物は、細菌の発生及び／又は増殖を阻害又は予防する生体学的成分及び／又は化学的成分であってもよい。好ましくは、前記抗菌化合物は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｍ）、好ましくは血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５のＮｍに対して有効な抗菌化合物である。

抗菌化合物としては、これだけに限定されるものではないが、例えばβ‐ラクタミン系抗生物質などの抗生物質が挙げられる。β‐ラクタミン系抗生物質は、例えば、これだけに限定されるものではないが、（ａ）例えばベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、アモキシシリン、アンピシリン、コアモキシクラブ、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリンなどのペニシリン；（ｂ）例えばセファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、セホテタン、セホキシチン、セフトリアキソン、セフィキシム、セホタキシム、セフタジダイム、セフェピム、セフピロムなどのセファロスポリン；（ｃ）例えばイミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、タゾバクタム、スルバクタムなどのカルバペネム、であってもよい。

好ましくは、前記少なくとも１種類の抗菌化合物は、（ｉ）髄膜炎菌ワクチン抗原、又は（ｉｉ）少なくとも２種類の髄膜炎菌ワクチン抗原を含む融合タンパク質である。

本発明よる髄膜炎菌ワクチン抗原は、当業者に周知である。実際に、髄膜炎菌に対する数種類のワクチンが、商品化されている及び／又は開発中である。

髄膜炎菌ワクチン抗原は、ＭＣＶ‐４（Ｍｅｎａｃｔｒａ（登録商標）又はＭｅｎｖｅｏ（登録商標）という名称で、商品化されている）、ＭＰＳＶ‐４（Ｍｅｎｏｍｕｎｅ（登録商標））、Ｍｅｎｃｅｖａｘ（登録商標）又はＮｍＶａｃ４‐Ａ／Ｃ／Ｙ／Ｗ‐１３５ワクチンの中に含まれる多糖又は複合糖質抗原のうちの少なくとも１種類を含んでいても、それらから成っていてもよい。

髄膜炎菌ワクチン抗原はまた、群Ｂ（ＭｅｎＢ）、Ａ、Ｃ、Ｙ及び／又はＷ１３５髄膜炎菌の莢膜及び／又は外膜小胞（ＯＭＶ）を含んでいても、それらから成っていてもよい。

いくつかの実施形態において、髄膜炎菌ワクチン抗原は、単数若しくは複数のポリペプチドを含むか又はそれらから成る。

そのようなポリペプチド又はポリペプチド抗原のいくつかは、現在、それらのワクチン効力について調査されている。髄膜炎菌ワクチン抗原は、髄膜炎菌の外側表面のタンパク質のいずれでもあってもよい。従って、髄膜炎菌ワクチン抗原は、ＰｉｌＥタンパク質（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６９４６３に記載）、ＰｉｌＶタンパク質（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６９４６３に記載）、ＰｉｌＸタンパク質、ＰｉｌＣタンパク質、ＣｏｍＰタンパク質、髄膜炎菌因子Ｈ結合タンパク質（以前にＧＮＡ１８７０又はＬｐ２０８６と呼ばれたｆＨｂｐ）、主要な免疫優性表面ポーリン（ＰｏｒＡ）、ナイセリアヘパリン結合抗原（以前にＧＮＡ２１３２と呼ばれたＮＨＢＡ）、ナイセリア接着因子Ａ（ＮａｄＡ）、ＭａｆＡ、ナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ）、ヘモグロビン受容体（ＨｍｂＲ）、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂＰＢ）、オートトランスポーターセリンプロテアーゼ（ＡｕｓＰ）又はその断片であってもよい。好ましくは、前記断片は免疫原性断片である。

ＰｉｌＥタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば、髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＰｉｌＥタンパク質は、配列番号１１若しくは配列番号１２の配列、又は配列番号１１若しくは配列番号１２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＰｉｌＶタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば、髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＰｉｌＶタンパク質は、配列番号１３の配列、又は配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＰｉｌＸタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＰｉｌＸタンパク質は、配列番号１４の配列、又は配列番号１４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＰｉｌＣタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＰｉｌＣタンパク質は、配列番号１５の配列、又は配列番号１５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＣｏｍＰタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１６の配列、又は配列番号１６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ｆＨＢＰタンパク質は、サブファミリーＢ／変異型１又はサブファミリーＡ／変異型２のｆＨＢＰポリペプチドであってもよい。例えば、前記ｆＨＢＰポリペプチドは、配列番号１７若しくは配列番号１８の配列、又は配列番号１７若しくは配列番号１８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＰｏｒＡタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＰｏｒＡタンパク質は、配列番号１９の配列、又は配列番号１９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＮＨＢＡタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＮＨＢＡタンパク質は、配列番号２０の配列、又は配列番号２０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＮａｄＡタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＮａｄＡタンパク質は、配列番号２１の配列、又は配列番号２１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＭａｆＡタンパク質は任意の髄膜炎菌の血清型、例えば、髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＭａｆＡタンパク質は、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４の配列、又は配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＮｓｐＡタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＮｓｐＡタンパク質は、配列番号２５の配列、又は配列番号２５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＨｍｂＲタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＨｍｂＲタンパク質は、配列番号２６の配列、又は配列番号２６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＴｂｐＢタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＴｂｐＢタンパク質は、配列番号２７の配列、又は配列番号２７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

ＡｕｓＰタンパク質は、任意の髄膜炎菌の血清型、例えば髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ又はＷ１３５に由来してもよい。例えば、前記ＡｕｓＰタンパク質は、配列番号２８の配列、又は配列番号２８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、又はその免疫原性断片を含んでいても、それらから成っていてもよい。

本発明よる免疫原性断片は、前記髄膜炎菌ワクチン抗原と同じであるか実質的に同じ免疫原性活性がある、本明細書中に記載したような髄膜炎菌ワクチン抗原の隣接部分であってもよい。すなわち、断片は、ＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨＢＰ、ＮａｄＡ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂＰＢ、又はＡｕｓＰを認識する抗体を伴った免疫応答を惹起することができる。好ましくは、断片は、髄膜炎菌による感染を妨げる抗体を伴った免疫応答を惹起することができる。より好ましくは、前記断片は、髄膜炎菌がＢＢＢを通過する又は脳脊髄膜空間に広がるのを防ぐ抗体を伴った免疫応答を惹起することができるＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの免疫原性断片である。さらに好ましくは、前記断片は、ＰｉｌＥ及び／又はＰｉｌＶとβ２ＡＲとの相互作用を阻害する抗体を伴った免疫応答を惹起することができるＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの免疫原性断片である。

一部の実施形態において、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの前記免疫原性断片は、それぞれＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの疎水性ドメインを担持していない。より特に、ＰｉｌＥの前記免疫原性断片は、配列ＦＴＬＩＥＬＭＩＶＩＡＩＶＧＩＬＡＡＶＡＬＰＡＹＱＤＹＴＡＲＡＱＶＳＥＡＩＬＬＡＥＧＱＫＳＡＶＴＥＹＹＬ（配列番号２９）の疎水性ドメインを担持していない。より特に、ＰｉｌＶの前記免疫原性断片は、配列ＦＴＬＬＥＬＭＩＡＶＡＩＬＧＩＬＴＬＩＴＹＰＳＹＫＴＹＩＲＲＶＲＬＳＥＶＲＴＴＬＬＨＮＡＱＴＭＥＲＹＹＲＱ（配列番号３０）の疎水性ドメインを担持していない。

いくつかの実施形態において、ＰｉｌＥの前記免疫原性断片は、以下の：
ａ）配列ＳＡＶＴＥＹＹＬＮＨＧＥＷＰＧＤＮＳＳＡＧＶＡＴＳＡＤＩＫＧＫＹＶＱＳＶＴＶＡＮＧＶＩＴＡＱＭＡＳＳＮＶＮＮＥＩＫＳＫＫＬＳＬＷＡＫＲＱＮＧＳＶＫＷＦＣＧＱＰＶＴＲＴＴＡＴＡＴＤＶＡＡＡＮＧＫＴＤＤＫＩＮＴＫＨＬＰＳＴＣＲＤＤＳＳＡＳ（配列番号３１）、又は
ｂ）配列番号３１の配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５個の連続したアミノ酸から成る断片、又は
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一の配列、
を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、ＰｉｌＶの前記免疫原性断片は、以下の：
ａ）配列ＴＭＥＲＹＹＲＱＫＧＴＦＫＴＹＤＫＮＫＬＫＱＮＫＹＦＮＶＴＬＳＫＶＳＰＤＨＦＴＬＱＡＤＰＮＰＴＴＮＤＧＥＴＣＶＶＴＬＤＧＧＴＩＡＡＳＧＴＮＱＳＣＰＧＦＤ（配列番号３２）、又は
ｂ）配列番号３２の配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個の連続したアミノ酸から成る断片、又は
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、
を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの前記免疫原性断片は、髄膜炎菌のシグナリングに関与するβ２ＡＲに対する認識ドメインを担持している。

より特に、ＰｉｌＥの前記免疫原性断片は、以下の：
ａ）配列ＣＧＱＰＶＴＲＴＴＡＴＡＴＤＶＡＡＡＮＧＫＴＤＤＫＩＮＴＫＨＬＰＳＴＣ（配列番号３３）、又は
ｂ）配列番号３３の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、２５、３０個の連続したアミノ酸から成る断片、又は
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一のである配列、
を含むか又はそれらから成る。

より特に、ＰｉｌＶの前記免疫原性断片は、以下の：
ａ）配列ＧＥＴＣＶＶＴＬＮＤＧＧＴＩＡＡＳＧＴＮＱＳＣＰＧＦＤ（配列番号３４）、又は
ｂ）配列番号３４の配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５個の連続したアミノ酸から成る断片、又は
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である配列、
を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、本明細書中に記載した髄膜炎菌ワクチン抗原を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２含む。

例えば、前記融合タンパク質は、以下の：
‐フレームで髄膜炎菌ＰｉｌＶタンパク質又はその免疫原性断片と融合した髄膜炎菌ＰｉｌＥタンパク質又はその免疫原性断片；又は
‐フレームでＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨＢＰ、ＮａｄＡ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰタンパク質又はその免疫原性断片と融合した髄膜炎菌ＰｉｌＥタンパク質又はその免疫原性断片；又は
フレームでＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨＢＰ、ＮａｄＡ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰタンパク質又はその免疫原性断片と融合した髄膜炎菌ＰｉｌＶタンパク質又はその免疫原性断片；又は
‐フレームで（ｉ）髄膜炎菌ＰｉｌＶタンパク質又はその免疫原性断片、及び（ｉｉ）ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨＢＰ、ＮａｄＡ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰタンパク質又はその免疫原性断片と融合した髄膜炎菌ＰｉｌＥタンパク質又はその免疫原性断片、
を含むか又はそれらから成る。

例えば、前記融合タンパク質は、配列番号１８の配列のｆＨＢＰポリペプチドに融合された配列番号３１の配列のＰｉｌＥの免疫原性断片、又は配列番号１８の配列のｆＨＢＰポリペプチドに融合された配列番号３３の配列のＰｉｌＥの免疫原性断片を含むか又はそれらから成る。その結果、前記融合タンパク質は、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含むか又はそれらから成る。

例えば、前記融合タンパク質は、配列番号１８の配列のｆＨＢＰポリペプチドに融合された配列番号３２の配列のＰｉｌＶの免疫原性断片、又は配列番号１８の配列のｆＨＢＰポリペプチドに融合された配列番号３４の配列のＰｉｌＶの免疫原性断片を含むか又はそれらから成る。その結果、前記融合タンパク質は、配列番号３７又は配列番号３８の配列を含むか又はそれらから成る。

融合タンパク質は、例えば融合タンパク質内に含まれた別の抗原、タンパク質又は断片を連結することを可能にするペプチドリンカー、精製に有用なタグ、リーダー配列、シグナルペプチド、免疫原性を高める１若しくは複数のペプチド断片などの他の残基をさらに含んでもよい。

医薬組成物
本発明はまた、本発明による阻害剤と、医薬的な許容され得るビヒクル、希釈剤、又は担体を含む医薬組成物に関する。

好ましくは、前記阻害剤は、以下の：
（ｉ）本明細書中で先に規定している配列番号１、２、３、４、及び５の配列のｓｉＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、多くても５、４、３、２、又は１のｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）本明細書中で先に規定している配列番号２、３、４、及び５の配列のうちの４つのｓｉＲＮＡ、
（ｉｉｉ）本明細書中で先に規定している抗ＣＤ１４７抗体ＭＥＭ‐Ｍ６／６、又は
（ｉｖ）本明細書中で先に規定している配列番号６の配列の変異型ＣＤ１４７、
を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、少なくとも１種類の抗菌化合物をさらに含む。有効成分は、医薬的に許容され得るビヒクル、希釈剤、又は担体を含んでいる同じ組成物に混合されてもよい。それらは、ヒトを含めた哺乳動物に、同時、別々又は連続した投与のために別々に調整されてもよい。前記医薬組成物はまた、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び／又は多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２の抗菌化合物を含んでもよい。

前記少なくとも１種類の抗菌化合物は、先に規定された化合物であってもよい。好ましくは、前記少なくとも１種類の抗菌化合物は、以下の：
（ａ）本明細書中で先に規定している、少なくともＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨＢＰ、ＮａｄＡ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰタンパク質又はその免疫原性断片、又は
（ｂ）本明細書中で先に規定している融合タンパク質、
を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、以下の：
‐阻害剤（ｉ）と抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｉ）と抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｉｉ）と抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｖ）と抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉ）と抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉｉ）と抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉｉｉ）と抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉｖ）と抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉ）と（ｉｉｉ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉ）と（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉ）と（ｉｉｉ）、及び抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉ）と（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ｂ）、
‐阻害剤（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ａ）、
‐阻害剤（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ｂ）、又は
‐阻害剤（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び抗菌化合物（ｂ）、
を含む。

本発明よる医薬組成物は、好適な医薬的な単位剤形の形態で経口的に投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、錠剤、ハード若しくはソフトカプセル、特にハード若しくはソフトゼラチンカプセル、水溶液、懸濁液、リポソーム、及び成形高分子ゲルなどの他の徐放製剤で調製されてもよい。

投与方法と剤形は、所定の治療適用にとって望ましく、且つ、効果的である治療薬又は組成物の特性に密接に関連している。好適な投薬形態としては、これだけに限定されるものではないが、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、及びリンパ管投与、及び有効成分の全身送達のための他の剤形が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、これだけに限定されるものではないが、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏又はイオン導入によって受動的に）；静脈内（ボーラス、点滴）；皮下（点滴、デポー剤）；経粘膜（頬側及び舌下、例えば、口腔内崩壊錠剤、ウェハー、フィルム、及び発泡性配合物）；結膜（点眼剤）；直腸（坐剤、浣腸剤）；又は皮内（ボーラス点滴、デポー剤）を含めた当該技術分野で知られているあらゆる方法で投与され得る。

固形の単位投薬剤形は、通常型のものであり得る。固形形態は、例えば本発明の阻害剤、そして、任意に本発明の抗菌化合物、及び担体、例えば潤滑油、並びに例えばラクトース、スクロース、又はコーンスターチなどの不活性充填剤を含んでいる一般的なゼラチンタイプなどのカプセルである。別の実施形態において、これらの化合物は、例えばラクトース、スクロース又はコーンスターチなどの一般的な錠剤ベースを、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、又はアルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と組み合わせて錠剤化される。

経口液体医薬組成物は、例えば、水性又は油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ又はエリキシル剤の形態であってもよく、あるいは使用前に水又は他の好適なビヒクルによる構成のための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体医薬組成物は、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、又は保存料などの従来の添加剤を含んでもよい。

本発明の医薬組成物はまた、（例えば、注射、例えばボーラス注射又は連続点滴による）非経口投与向けに処方されてもよく、そして、アンプル、充填済みシリンジ、小容積注入容器又は追加の保存料を含んだ複数用量コンテナの形態で単位剤形の状態で提供されてもよい。医薬組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳濁液としてそうした形態をとることができ、そして、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含んでもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリー水による構成のための、無菌固形物の無菌分離によるか、又は溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。

直腸投与に好適であって、その担体が固形物である医薬組成物は、最も好ましくは、単位用量坐剤として提供される。好適な担体としては、ココアバター及び当該技術分野で一般的に使用される他の材料が挙げられ、そして、坐剤は、（単数若しくは複数の）軟化した又は溶融した担体と医薬組成物との混合と、それに続く、鋳型中での冷却と成形によって都合よく形成され得る。

吸入による投与向けに、本発明よる医薬組成物は、インサフレーター、ネブライザ若しくは加圧型パック、又はエアゾールスプレーを提供する他の簡便な手段から都合よく提供される。加圧型パックは、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスなどの好適な噴射剤を含んでもよい。加圧型エーロゾルの場合では、投薬単位は、計量された量を送達するような弁を備えることよって決定され得る。あるいは、吸入又は吹送による投与向けに、本発明の医薬組成物は、乾燥粉末組成物、例えば、医薬組成物と、例えばラクトース又はデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、例えば、カプセル若しくはカートリッジ、又は例えば、そこから粉末が吸入器又は吹送器を用いて投与され得るゼラチンパック又はブリスターパックの単位剤形で提供されてもよい。

鼻腔内投与向けに、本発明の医薬組成物は、例えばプラスチックボトルアトマイザーによるなどして、液状スプレーによって投与されてもよい。これらの定型的な例は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒｇ（イソプロテレノール吸入器‐Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（イソプロテレノール吸入器‐Ｒｉｋｅｒ）である。

アンチセンス核酸投与に関して、本発明の医薬組成物は、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、脂質ベースの担体系内へのカプセル封入を含めた形態で調製されてもよい。本発明での使用に好適な代替的な脂質ベースの担体系に関する制限されることのない例としては、ポリカチオン性ポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号を参照）、シクロデキストリンポリマ核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００８７０２４号を参照）、生分解性ポリ３アミノ酸エステルポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００７１６５４号を参照）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば米国特許出願公開第２００２０１９２２７４号を参照）、アニオン性リポソーム（例えば米国特許出願公開第２００３００２６８３１号を参照）、カチオン性リポソーム（例えば米国特許出願公開第２００３０２２９０４０号を参照）、可逆的マスクリポプレックス（例えば米国特許出願公開第２００３０１８０９５０号を参照）、細胞型特異的リポソーム（例えば米国特許出願公開第２００３０１９８６６４号を参照）、ポリマーマトリックス含有微細粒子（例えば米国特許出願公開第２００４０１４２４７５号を参照）、ｐＨ感応性リポプレックス、（例えば米国特許出願公開第２００２０１９２２７５号を参照）、放出可能親水性ポリマーにより誘導体化された脂質含有リポソーム（例えば米国特許出願公開第２００３００３１７０４号を参照）、脂質封入核酸（例えばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０３／０５７１９０を参照）、脂質カプセル封入核酸（例えば米国特許出願公開第２００３０１２９２２１号を参照）、ポリカチオン性ステロール誘導体核酸複合体（例えば米国特許第６，７５６，０５４号を参照）、他のリポソーム成分（例えば米国特許出願公開第２００３００３５８２９号を参照）、他の微小粒子組成物（例えば米国特許出願公開第２００３０１５７０３０号を参照）、ポリ‐プレキシ（例えばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０３／０６６０６９）、エマルジョン組成物（例えば米国特許第６，７４７，０１４号を参照）、縮合核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０１２３６００号を参照）、他のポリカチオン性核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０１２５２８１号を参照）、ポリビニルエーテル核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４０１５６９０９号を参照）、多環式アミジニウム核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２２０２８９号を参照）、ナノカプセル及びマイクロカプセル組成物（例えばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０２／０９６５５１）、リポソームと乳濁液の安定化混合物（例えば、ＥＰ１３０４１６０）、ポルフィリン核酸複合体（例えば米国特許第６，６２０，８０５号を参照）、脂質核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号を参照）、核酸マイクロエマルジョン（例えば米国特許出願公開第２００５００３７０８６号を参照）、及びカチオン性脂質ベース組成物（例えば米国特許出願公開第２００５０２３４２３２号を参照）が挙げられる。当業者は、本発明の改変ｓｉＲＮＡもまた、裸のｓｉＲＮＡ分子として提供され得ることを理解する。

本発明の医薬組成物はまた、例えば着香料、着色料、又は保存料などの他のアジュバントを含んでもよい。

治療に使用するのに必要である医薬組成物の量は、選択した治療薬によって異なるだけではなく、投与経路、治療される病態の性質、及び患者の年齢や状態によっても異なり、そして、最終的にかかりつけの医師又は臨床医の裁量によることは、さらに理解される。

内皮細胞への髄膜炎菌の接着を予防する方法
本発明よる阻害剤は、内皮細胞への髄膜炎菌の接着を予防又は阻害する方法に使用されてもよい。

前記方法は、試験管内での方法であっても、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）での方法であってもよい。

従って、本発明は、内皮細胞への髄膜炎菌の接着を予防又は阻害するための試験管内又は生体内での方法における、本明細書中に規定される阻害剤の使用を提供する。

いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、本明細書中で先に規定される少なくとも１種類の抗菌化合物と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、本明細書中で先に規定される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び／又は多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２の抗菌化合物と組み合わせて使用される。

前記方法は、例えば前記細胞及び／又は前記髄膜炎菌を前記阻害剤に晒すことを含んでもよい。前記方法が生体内における方法であるとき、その方法は、前記阻害剤をその対象、好ましくはそれを必要としている患者に投与することを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記内皮細胞は、脳の内皮細胞、毛細管内皮細胞、ヒト皮膚内皮細胞及び／又は臍帯静脈内皮細胞であってもよい。

投与と治療方法
本発明はまた、それを必要としている個体における髄膜炎菌の菌血症又は感染を予防又は治療する方法であって、治療上有効な量の本発明による阻害剤又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

「治療」とは、（すなわち、所定の疾患を患っている患者に対する）治癒的な使用を意味し、そして、「予防する」とは、（すなわち、所定の疾患の発症に関する個々の感受性に対する）予備的な使用を意味している。「治療」という用語は、疾患の完治に通じる治療だけではなく、患者の進行を遅らせる及び／又は生存を長引かせる治療も含んでいる。

「有効な量」は、所望の治療又は予防の結果を達成するために、必要な投薬量及び期間にて、有効な量を指す。

本発明の阻害剤の治療上有効な量は、所望の治療結果を引き出すために、例えば個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びにタンパク質の能力などの要因によって変動し得る。治療上有効な量は、阻害剤のあらゆる毒性又は有害な効果も治療的な有益効果より軽い量を包含する。治療上有効な量はまた、利益、例えば臨床上の利益を与えるのに十分な量を包含する。

本発明との関連において、「髄膜炎菌の菌血症又は感染を予防すること」は、宿主の内皮細胞に髄膜炎菌が接着するのを予防することを意味してもよい。

本発明との関連において、「髄膜炎菌の菌血症又は感染を治療すること」は、宿主の内皮細胞に髄膜炎菌が接着するのを覆すか、緩和するか、又は阻害することを意味してもよい。

本発明との関連において、髄膜炎菌による感染は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％軽減され得る。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、連続して又は同時に、先に規定される少なくとも１種類の抗菌化合物と組み合わせて、先に規定される阻害剤の投与を含む。例えば、前記少なくとも別の抗菌化合物は、（ｉ）髄膜炎菌ワクチン抗原、又は（ｉｉ）本明細書中で先に記載したように、少なくとも２つの髄膜炎菌ワクチン抗原を含む融合タンパク質を含む。

別の実施形態において、前記方法は、本発明による医薬組成物の投与を含む。

投与計画は、全身的な投薬計画であってもよい。投与の様式及び剤形は、所定の治療適用において望ましく且つ有効である、治療薬又は組成物の特性と密接に関連している。好適な剤形及び投与経路としては、これだけに限定されるものではないが、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、及びリンパ管投与、及び／又は有効成分の全身送達のための他の剤形及び投与経路が挙げられる。好ましい実施形態において、剤形は、非経口投与のためのものである。

投与計画は、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００日間の期間にわたるものであってもよい。

用量範囲は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の間にあってもよい。より好ましくは、用量範囲は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の間にある。最も好ましくは、用量範囲は、１ｍｇ／ｋｇ／日〜８０ｍｇ／ｋｇ／日の間ある。最も好ましくは、用量範囲は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の間、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日〜４０ｍｇ／ｋｇ／日の間ある。

いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量であってもよい。いくつかの実施形態において、用量は、多くても５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、２５、１５、１０、５、１、０．５、０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量であってもよい。

用量範囲はまた、１０〜１００００ＵＩ／ｋｇ／日の間にあってもよい。より好ましくは、用量範囲は、５０〜５０００ＵＩ／ｋｇ／日の間、又は１００〜１０００ＵＩ／ｋｇ／日の間にある。

いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００ＵＩ／ｋｇ／日の用量であってもよい。いくつかの実施形態において、用量は、多くても１００００、９５００、９０００、８５００、８０００、７５００、７０００、６５００、６０００、５５００、５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００ＵＩ／ｋｇ／日の用量であってもよい。

スクリーニング方法
本発明はまた、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用の阻害剤をスクリーニングするための方法に関し、前記方法は、以下の：
ａ）ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片、及びＣＤ１４７受容体又はその断片を含む媒質を準備し、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片及びＣＤ１４７受容体又はその断片は、特異的に一緒に相互作用して、結合対を形成でき、
ｂ）候補化合物を、前記媒質と接触させ、
ｃ）前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との間の相互作用の阻害を計測する、
から成るステップを含む。

好ましくは、ステップｂ）は、ステップａ）の媒質に候補化合物を追加することによっておこなわれる。

相互作用を阻害する化合物が選択される。この選択は、ステップｃ）における測定が前記相互作用の有意な阻害を実証した場合に、おこなわれ得る。

いくつかの実施形態において、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質は、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶタンパク質、又はＣＤ１４７受容体と相互作用することができるその断片を含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、前記ＣＤ１４７受容体の断片は、ＣＤ１４７のエクトドメイン、又はＣＤ１４７の膜近位の免疫グロブリンドメイン、又は配列番号６の配列のＣＤ１４７の細胞外ドメインを含むか又はそれらから成る。

いくつかの実施形態において、本発明よる方法は、ステップｃ）において、相互作用の阻害の計測が、免疫学的アッセイによって（特にＥＬＩＳＡ又は免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）によって）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）によって、又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によっておこなわれることを特徴とする。

好ましくは、本発明による方法は、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術に基づいている。Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）は、着目の２種類の分子がコーティングされた、ドナー（Ｄ、光増感剤）及びアクセプター（Ａ、化学発光物質）マイクロビーズを互いに結合できるようにすることに基づいている。Ｄビーズのレーザ励起は、雰囲気酸素が光増感剤によって一重項状態に変換される原因となる。一重項酸素分子種は、Ａビーズ上の化学発光物質を順番に活性化する。活性化によって、化学発光物質は、マイクロプレートリーダーの光検出機構によって検出される光を放射する。Ａ及びＤビーズが近接（＜２００ｎｍ）するときにシグナルが生じ、これにより２つのビーズ上に捕捉されているパートナーの間の相互作用が報告される（Taouji et al., 2009, Curr Genomics, 10(2):93）。

従って、ある実施形態において、ステップａ）にて、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片をアクセプタービーズに結合させ、且つ、前記ＣＤ１４７受容体又はその断片をドナービーズに結合させる。別の実施形態において、ステップａ）にて、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片をドナービーズに結合させ、且つ、前記ＣＤ１４７受容体又はその断片をアクセプタービーズに結合させる。前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片、及び前記ＣＤ１４７又はその断片は、前記ビーズに直接結合させても、間接的に結合させてもよい。

ステップａ）は、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質と前記ＣＤ１４７受容体との間の相互作用を可能にする条件下でおこなわれる。従って、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質と前記ＣＤ１４７受容体との結合は、ドナー粒子とアクセプター粒子を互いから２００ｎｍ未満の距離させる結果となり、それにより、ドナー分子とアクセプター分子の間のエネルギー移動をもたらす。

いくつかの実施形態において、ドナービーズはフタロシアニンを含んでいて、アクセプタービーズはルブレンを含んでいる。ドナービーズは、６８０ｎｍのレーザ励起を受け、雰囲気酸素から一重項状態の酸素への転換を引き起こす。一重項状態の酸素は、アクセプタービーズ上の化学発光物質、すなわち、ルブレンと反応する。エネルギー移動時に、活性化されたルブレンは、マイクロプレートリーダーの受光素子によって検出される５２０〜６２０ｎｍの光を放射する。その発光は、例えば、Perkin‐Elmer製のＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルプレートリーダーなどのマイクロウェルプレートリーダーの受光素子を用いて計測できる。

いくつかの実施形態において、ドナー及びアクセプタービーズは、フルオロフォアに結合され、そして、蛍光へのエネルギー移動量は、励起のときに第一のドナーフルオロフォアによって第二のアクセプターフルオロフォアに向かって放射される。アクセプターフルオロフォアは、これにより活性化され、そして、第二の蛍光を放射する。第二のアクセプターフルオロフォアの蛍光は、例えば、蛍光分光光度計によって計測できる。

エネルギー移動がステップａ）において検出される場合、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との間で相互作用があると考えられる。

候補化合物としては、これだけに限定されるものではないが、ペプチド、小分子、抗体、アプタマー、及び例えばアンチセンス核酸などの核酸が挙げられる。

ステップｃ）における、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との間の相互作用の阻害の計測は、発光又は蛍光を計測することによっておこなわれてもよい。ステップｃ）における発光又は蛍光のレベルが、ステップａ）における発光又は蛍光のレベルより低い場合、候補化合物が前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との相互作用の阻害剤であることを示している。

配列表の簡単な説明
配列番号１〜５は、ＣＤ１４７に対するｓｉＲＮＡの配列を示す。

配列番号６は、ＣＤ１４７の細胞外ドメインの配列を示す。

配列番号７は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７１９．２で参照されるＣＤ１４７のアミノ酸配列を示す。

配列番号８は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿９４０９９１．１で参照されるＣＤ１４７のアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７２８．２で参照されるＣＤ１４７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿１９８５８９．１で参照されるＣＤ１４７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１及び１２は、ＰｉｌＥのアミノ酸配列を示す。

配列番号１３は、ＰｉｌＶのアミノ酸配列を示す。

配列番号１４は、ＰｉｌＸのアミノ酸配列を示す。

配列番号１５は、ＰｉｌＣのアミノ酸配列を示す。

配列番号１６は、ＣｏｍＰのアミノ酸配列を示す。

配列番号１７及び１８は、ｆＨＢＰのアミノ酸配列を示す。

配列番号１９は、ＰｏｒＡのアミノ酸配列を示す。

配列番号２０は、ＮＨＢＡのアミノ酸配列を示す。

配列番号２１は、ＮａｄＡのアミノ酸配列を示す。

配列番号２２〜２４は、ＭａｆＡのアミノ酸配列を示す。

配列番号２５は、ＮｓｐＡのアミノ酸配列を示す。

配列番号２６は、ＨｍｂＲのアミノ酸配列を示す。

配列番号２７は、ＴｂｐＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号２８は、ＡｕｓＰのアミノ酸配列を示す。

配列番号２９は、ＰｉｌＥの疎水性ドメインの配列を示す。

配列番号３０は、ＰｉｌＶの疎水性ドメインの配列を示す。

配列番号３１及び３３は、ＰｉｌＥの免疫原性断片の配列を示す。

配列番号３２及び３４は、ＰｉｌＶの免疫原性断片の配列を示す。

配列番号３５及び３６は、ＰｉｌＥとｆＨＢＰポリペプチドの間の融合タンパク質の配列を示す。

配列番号３７及び３８は、ＰｉｌＶとｆＨＢＰポリペプチドの間の融合タンパク質の配列を示す。

配列番号３９は、対照ｓｉＲＮＡの配列を示す。

材料と方法
小型化抽出に適合させた一連の遺伝子発現解析（ＳＡＤＥ）
ＴＰＡでの処理の１６時間後に、２×１０⁷個の無処理のＢＢ１９細胞又はＴＰＡ処理したＢＢ１９細胞から抽出した２００μｇのＲＮＡを、ＳＡＤＥの基質として使用した。ＳＡＤＥスクリーンを、Virlon et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96:15286-15291に記載のとおり実施した。簡単に言えば、全ＲＮＡを細胞から抽出し、ポリアデニル化ＲＮＡをオリゴｄＴカラムにより選択し、そして、タグ付与したｃＤＮＡをポリＡＲＮＡから合成した。ＤＮＡタグのコンカテマを配列決定し、２つのライブラリにおいて示差的に表された配列決定タグの数を測定し、そして、モンテカルロ統計解析を使用して分析した。

抗体と試薬
抗ｈＣＤ１４７抗体をAbD Serotecから購入し、抗ｈＣＤ４４ ｍＡｂをImmunotechから購入し、抗ｈＩＣＡＭ‐１をR&D Systemsから購入し、抗ＧＦＡＰ及び抗ビメンチンをSigma Aldrichから購入した。

エズリンに対して作製されたポリクローナル抗血清を、P.Mangeat（CNRS UMR5539、Montpelier France）から入手した。ＰｉｌＥ（２０Ｄ９）に対して作製されたｍＡｂ及び髄膜炎菌２Ｃ４．３菌株に対して作製されたポリクローナル抗血清を、先に記載した（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160）。免疫蛍光法標識、色素免疫組織化学、及び免疫ブロッティングに使用する二次抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratoriesからのものであった。可溶性キメラＣＤ１４７‐Ｆｃ及びＩＣＡＭ‐１‐Ｆｃ分子を、R&D Systemsから購入した。ＤＡＰＩ、ローダミン‐ファロイジン、ＴＰＡ、アクチノマイシンＤ、イソプロテレノール、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質及びニトロブルーテトラゾリウム／ＢＣＩＰホスファターゼアルカリ基質を、Sigma Aldrichから購入した。

細胞培養、トランスフェクション及び感染
ＢＢ１９、パピローマウィルスによって形質転換されたヒト脳内皮細胞株は、Dr JA. Nelson（Oregon Health and Science University, Beaverton, USA）によって親切なことに提供された（Prudhomme et al., 1996, Int J Parasitol, 26:647-655）。細菌接着を引き起こすために、ＢＢ１９を、ＴＰＡ（１０ｎｇ／ｍｌ、１０分間）で処理し、洗浄し、そして、処理の４８時間後に髄膜炎菌の接着を計測した。指示されたＴＰＡ処理の２時間後に、転写阻害剤アクチノマイシンＤを加え（１μｇ／ｍｌ、４時間）、細胞を洗浄し、そして、接着を４２時間後に計測した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３及びｈＢＭＥＣ細胞株を、先に記載したとおり形質移入し、そして、感染させた（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160; Doulet et al., 2006, J Cell Biol, 173-627-637）。ヒトＣＤ１４７をコードするプラスミドは、Dr Bukrinskyによって親切なことに提供され、ＹＦＰに融合されたβ２アドレナリン作動受容体をコードするプラスミド（ｐ２ＡＲ‐ＹＦＰ）を、先に記載した（Angers et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97:3684-3689）。ＣＤ１４７、ＣＤ４４及びＩＣＡＭ‐１の発現をサイレンシングするために、４つのｓｉＲＮＡ二本鎖のプール（Dharmacon製のＯＮ‐ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ）を使用した。ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon）を対照として使用した。トランスフェクションの２日後に、ノックダウンの効率をＦＡＣＳ分析によって算定し、そして、細胞を並行して感染させた。示したｈＢＭＥＣ細胞をＣＤ１４７の３’非翻訳領域を標的化するｓｉＲＮＡ３’ＧＣＵＧＵＣＵＧＧＵＵＧＣＧＣＣＡＵＵＵＵ５’（配列番号１）又は対照ｓｉＲＮＡ３’ＡＵＧＵＡＵＵＧＧＣＣＵＧＵＡＵＡＧ５’（配列番号３９）（Eurogentech）で形質移入し、そして、４０時間後に、細胞を再び、模擬形質移入する（‐）か、又はＣＤ１４７のコード領域がｃＤＮＡで形質移入した。８時間後に、ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ１４７の表面発現を定量化し、そして、細胞を、Ｎｍ８０１３クローン１２、クラスＩ ＳＢピリンを発現する莢膜性Ｏｐａ‐、Ｏｐｃ血清型Ｃ臨床分離株に並行して感染させた。

この菌株の変異体ＡｐｉｌＣ１、ＡｐｉｌＣ２、ＡｐｉｌＥ、ＡｐｉｌＶ、ＡｐｉｌＸ、ＡｃｏｍＰ、及びＧＦＰを発現する野性型Ｎｍを送達し、そして、先に記載したように培養した（Nassif et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA, 91:3769-3773; Mikaty et al., 2009, PloS Pathog, 5:e1000314; Helaine et al., 2005, Mol Microbiol, 55:65-77; Mairey et al., 2006, J Exp Med, 203:1939-1950）。

接着アッセイ
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３、ｈＢＭＥＣ、及びＢＢ１９への髄膜炎菌接着を、先に記載したとおり、静電気及び剪断応力条件下の両方でアッセイした（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160; Mairey et al., 2006, J Exp Med, 203:1939-1950; Lambotin et al., 2005, J Cell Sci, 118:3805-3816）。指示された髄膜炎菌を、５μｇ／ｍｌの可溶性組み換え組み換えヒトＣＤ１４７‐ＦｃとＩＣＡＭ‐１‐Ｆｃキメラと共にプレインキュベートしたとき（ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合され、そして、ジスルフィド連結ホモダイマーとして作製されたＣＤ１４７又はＩＣＡＭ‐１のＩｇドメインを含む）、ｈＢＭＥＣｓとの相互作用の前に、追加の２μｇ／ｍｌの可溶性タンパク質を伴う。髄膜炎菌接着を、静止状態において、感染の３０分後に定量化した。抗体の抑制効果に対処するために、ｈＢＭＥＣｓをＩＢＩＤＩチャンバーで培養し、１０μｇ／ｍｌの抗体標的化ＩＣＡＭ‐１（１１Ｃ８１）又はＣＤ１４７（ＭＥＭ‐Ｍ６／１とＭＥＭ‐Ｍ６／６）で１時間前処理し、倒立顕微鏡下で層状流（０．０４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ²）を示した。ＧＦＰ発現性細菌を、気流下のチャンバー内下で導入した。２０分後に、接着細菌の数を測定した。固定したタンパク質における接着アッセイのために、組み換えヒトＣＤ１４７‐Ｆｃ及びＩＣＡＭ１‐Ｆｃキメラを、Steffen et al., 2008, Curr Biol, 18:926-931に記載の技術の改変を使用してガラススライド上に固定した。簡単に言えば、スライドを０．１％のＰｏｌｙ‐Ｌ樹脂でコーティングし、ＰＢＳで洗浄し、グルタルアルデヒド（０．５％）で架橋し、洗浄し、アッセイバッファー（３％のＢＳＡ及びＰＢＳ）中で２時間、抗Ｆｃと共にインキュベートし、アッセイバッファーで洗浄し、２μｇ／ｍｌのキメラタンパク質を用いて４℃にて一晩インキュベートした。ＯＤ₆₀₀ ０．０５の髄膜炎菌懸濁液での感染前に、スライドを洗浄した。細菌とのインキュベーション後に、スライドを３回洗浄し、そして、固定した。細菌にラベルし、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００顕微鏡を用して６３×油浸レンズを使用して視覚化した。１視野あたりの接着細菌の数を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して３０分間定量化した。

ＭＢＰ‐Ｐｉｌｉｎ組み換えタンパク質の発現、精製及び固定
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合した完全長タンパク質の第１〜２８アミノ酸残基のコード領域を欠いているＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、及びＣｏｍｐの断片を、Ｅ．コリ（E. Coli）内で生じさせ、アミロース樹脂（New England Biolabs）により精製し、そして、以前記載したように、ＩｇＧのＦｃドメインに特異的な受容体を発現するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＡＴＣＣ２５９２３）上に固定した（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160）。コートした細菌を、１μｇの組み換えヒトＣＤ１４７‐Ｆｃキメラと共に氷上で３０分間インキュベートした。３回の洗浄後に、細菌を、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで溶菌し、そして、共沈したＣＤ１４７‐Ｆｃタンパク質の量をイムノブロット分析で算定した。結合したＣＤ１４７‐Ｆｃを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。指示されたときには、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ＯＤ₆₀₀ ０．０５の髄膜炎菌懸濁液を用いた感染の１５分前に、１０μｇ／ｍｌのＭＢＰピリンで３０分間前処理した。細菌とのインキュベーション後に、細胞を３回洗浄し、そして、接着細菌の数を、先に記載したように測定した。

共焦免疫蛍光顕微鏡検査
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３、ＢＢ１９又はｈＢＭＥＣを、ｐｅｒｍａｎｏｘカバーガラス上又はトランスウェルフィルタ上に集密状態になるまで培養した。指示された処理及び／又は感染後に、細胞を固定し、そして、先に記載のとおりラベルした（Lambotin et al., 2005, J Cell Sci, 118:3805-3816; Hoffmann et al., 2001, J Cell Biol, 155:133-143）。画像収集と分析を、ＤＭＩ６０００顕微鏡（Leica、６３×）で実施した。一連の光学的断面を、共焦回転盤顕微鏡（Leica、６３×）を用いて得た。３Ｄ再構成を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用して得、そして、定量化ヒストグラムをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を有すると使用することでを得た。細菌コロニー下におけるタンパク質動員の定量分析を、指示された着目のタンパク質に関して陽性のコロニーの割合として測定した。１枚のカバーガラスにつき、少なくとも５０個のコロニーを観察した。各実験を二連又は三連で少なくとも３回繰り返した。

ヒト脳組織の感染
新鮮なヒト脳切片を、原因不明の病院外急死で法医学部に回された（神経病理学者によって確認される）巨視的及び組織学的に健常な脳の前頭葉標本から得た（The Institutional Review Boards of the Poincare Hospital, Versailles-Saint Quentin University and the French “Agence de la Biomedecine”の同意書ML1094, PFS 10-008, ClinicalTrials.gov NCT00320099）。

液体窒素中で冷やしたイソペンタンを用いて脳組織を凍らせた後、軟髄膜、脳回及び下部白質を含んでいる、厚さ７μｍの切片を、ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）ｐｌｕｓ顕微鏡用スライド上に固定し、そして、−８０℃にて保存する。解凍した切片を、ＰＢＳ中で５分間再水和性し、そして、０．１％のＢＳＡを含んでいる媒質と共に１時間インキュベートし、その後、細菌の懸濁液（１５０μｌの０．１％のＢＳＡ含有媒質中に２・１０⁷個の細菌）を用いて３７℃にて１時間感染させた。次に、切片を、緩やかに水平方向に５回洗浄し、室温にて１０分間、ＲＡＦ４％中で固定した。指示されたときには、切片を、ＣＤ１４７又はＩＣＡＭ‐１を標的化した１０μｇ／ｍｌの抗体で１時間処理し、次いで、３回洗浄し、その後、細菌に感染させた。接着髄膜炎菌を、色素免疫組織化学と免疫蛍光分析で検出した。色素免疫組織化学をおこなうために、組織の再水和後に、切片を、指示された一次抗体と共に一晩インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次ロバ抗マウス抗体とアルカリホスファターゼロバ抗ウサギ抗体を使用して明らかにした。ＤＡＢ（茶色）及びニトロブルーテトラゾリウム／ＢＣＩＰ（青色）を色素体として使用した。

免疫蛍光分析のために、脳切片を、指示された一次抗体と共に、０．１％のＰＢＳ／ＢＳＡ中で２時間インキュベートした。アレクシア結合ファロイジン及びＤＡＰＩ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、１時間アレクシア複合化二次抗体に加えた。追加の洗浄後に、カバーガラスをｇｌｙｃｅｒｇｅｌ（Dako）中に封入した。サンプル全体を、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ２．０（Hamamatsu）を使用してスキャンし、そしてそれを、光学顕微鏡検査、エピ蛍光（Zeiss Axiovert、４０×）及び共焦（回転盤Leica、６３×）顕微鏡を使用してさらに分析した。マーカーの特異性を、一次抗体を同じ濃度のアイソタイプ対照Ｉｇに置換した切片を調べることによって、及び同じドナーからの非感染組織の免疫染色によって系統的に確認した。１ｍｍ²の表面積に接着した、蛍光ラベルした細菌の定量分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用することで実施した。結果を、２つの独立した実験から、１００μ²あたりの蛍光の平均として示す。３Ｄ再構成を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用した屈曲共焦スタックにより実施した。

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）技術を、ＭＢＰ‐ピリン組み換え融合タンパク質と、ＣＤ１４７‐Ｆｃ‐Ｈｉｓ又は対照としてのＡＬＣＡＭ‐１‐Ｆｃ‐Ｈｉｓとの相互作用を計測するのに使用した。結合反応を、２０μｌ（総反応容量）で白色３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（PerkinElmer, Whalham, MA, USA）を使用することで実施した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）試薬（抗ＭＢＰでコートしたアクセプタービーズ及びニッケルキレートでコートしたドナービーズ）をPerkinElmerから入手した。ＣＤ１４７‐Ｆｃ‐Ｈｉｓ（又はＡＬＣＡＭ‐１‐Ｆｃ‐Ｈｉｓ）とＰｉｌｉｎ‐ＭＢＰを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＮａＣｌ中で調製した。ドナービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を、ＣＤ１４７‐Ｈｉｓ（０、１００又は５００ｎＭ）と一緒に室温で４５分間インキュベートした。並行して、アクセプタービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を、室温でＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）反応バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中、２０℃にて１時間、Ｐｉｌｉｎ‐ＭＢＰ（０、５０又は５００ｎＭ）と一緒にインキュベートした。そして、１０μｌのそれぞれの相互作用パートナーをプレートに加え、暗所且つ室温にて２時間又は一晩インキュベートさせた。抗体競合アッセイをおこなうために、５μｌのＭＥＭ‐Ｍ‐６／６抗体（様々な濃度）を、Ｐｉｌｉｎ‐ＭＢＰアクセプタービーズに加え、その後、ＣＤ１４７Ｆｃ‐Ｈｉｓ‐Ｄｏｎｏｒビーズと共に室温にて３０分間インキュベートした。光シグナルを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（PerkinElmer）を使用することによって検出した。

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ビーズにかかわるすべての操作を、柔らかい照明の下で実施した。

結果と考察
ＮｍのＩＶ型線毛の初期接着に関与する候補受容体を同定するために、Ｎｍ接着をわずかにしか許容しない形質転換ヒト脳内皮細胞株、ＢＢ１９における機能的受容体の誘導発現を利用した。ホルボールエステル１２‐Ｏ‐テトラデカノイルホルボール‐１３‐アセタート（ＴＰＡ）でのＢＢ１９細胞の処理は、血清型Ｃの有線毛莢膜性臨床分離株、Ｎｍ８０１３クローン１２の接着を強化した（図１）。この効果は、転写阻害剤のアクチノマイシンＤによる処理で阻害された（図１）。さらに、野性株と粘着性の線毛を担持している細菌性ｐｉｌＣ２欠失突然変異株だけが、ＴＰＡの処理した細胞に接着し、無線毛ｐｉｌＥ及び非接着性ｐｉｌＣ１変異株とは顕著に異なり、それらは接着しなかった（図２）。これらのデータは、髄膜炎菌ＩＶ型線毛の推定上の接着受容体の転写制御について浮き彫りにした。１０４７８の遺伝子（方法を参照）の示差的且つ定量的な大規模解析を使用して、２１１の上方制御及び１９４の下方制御された遺伝子を、未処理の細胞と比較して、ＴＰＡで処理したＢＢ１９細胞で同定した。上方制御された遺伝子では、ＣＤ１４７を含めて６つが膜結合タンパク質をコードし、血液脳関門（ＢＢＢ）の周知のマーカーが、脳内皮細胞上で高度に濃縮されていて、そしてそこにＮｍが優先的に接着している。ＣＤ１４７は、２つのグリコシル化Ｉｇ様ドメインを有する、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、様々な生理学的及び病理学的プロセスにかかわっている。ＢＢ１９細胞のＴＰＡ処理がＣＤ１４７の発現を上方制御したことを確認した。さらに、ＴＰＡで処理した細胞へのＮｍの接着は、ＣＤ１４７の大規模な動員を細菌接着部位に誘導した。これにより、ＣＤ１４７は、ＩＶ型線毛媒介Ｎｍ接着の魅力的な受容体候補であるように思われた。

内皮細胞へのＮｍの接着におけるＣＤ１４７の役割を調査するために、モデルとして２つの細胞株を使用した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３は、脳毛細血管から得られた完全に差別化されたヒト脳内皮細胞株であって、それはＢＢＢの主要な表現型特性を概括しており、そして、ｈＢＭＥＣは、骨髄毛細管から単離されたヒト内皮細胞株である。予想されるように、ＣＤ１４７は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の有極単分子層の細胞‐細胞間結合で主に濃縮され、そして、ＣＤ１４７の主要部分は管腔表面に存在していた。Ｎｍに感染した細胞では、ＣＤ１４７は髄膜炎菌接着部位に蓄積し、そして、β２アドレナリン作動受容体が同時局在していた。重要なことに、ＣＤ１４７は、初期細菌接着を媒介する推定受容体に予想されるように、β２アドレナリン作動受容体発現と関連する結合シグナリング事象に関係なく動員された（図３）。

ＣＤ１４７が髄膜炎菌接着に必要であるかどうか証明するために、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３、及びｈＢＭＥＣ細胞を、対照ｓｉＲＮＡに対してＣＤ１４７の表面発現の６０〜７０％をノックダウンするＣＤ１４７特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で形質移入した。

ＣＤ１４７がノックダウンされた細胞への細菌接着は、大幅に低減した（図４及び５）。この効果は、外因性ＣＤ１４７の再発現によって回復した（図５）。重要なことには、ＣＤ１４７の喪失もまた、流動状態下で細菌接着に影響を及ぼし、初期接着事象の定量的測定法において（図６）、ＣＤ１４７が髄膜炎菌のヒト内皮細胞への初期接着を促進するのに不可欠であることが示唆された。対照的に、（ＩＶ型媒介シグナリング事象によって細菌接着部位で２つの接着分子が動員された）ＣＤ４４又はＩＣＡＭ‐１発現の類似した喪失は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３又はｈＢＭＥＣ細胞のどちらかの髄膜炎菌接着にも影響せず、そのため、ヒト内皮細胞への髄膜炎菌接着に対するＣＤ１４７喪失の特異的効果を支持した。

内皮細胞へのＮｍ接着におけるＣＤ１４７の役割をさらに確認するために、ＣＤ１４７の細胞外ドメインの遺伝子組み換え可溶形（ＣＤ１４７‐Ｆｃ）を、特に膜結合型受容体と競合するように使用した。ＣＤ１４７‐Ｆｃの添加は、無処理細胞又は対照可溶性ＩＣＡＭ‐１‐Ｆｃで処理した細胞と比較して、ｈＢＭＥＣ細胞への細菌接着を５０％低減した（図７）。独立しているアプローチは、それぞれＣＤ１４７のＮ末端とＣ末端Ｉｇドメインに結合する、２つのＣＤ１４７‐特異的抗体、ＭＥＭ‐Ｍ６／１及びＭＥＭ‐Ｍ６／６の使用による。興味深いことに、感染前にｈＢＭＥＣに加えられると、ＭＥＭ‐Ｍ６／６は、抗ＩＣＡＭ‐１対照抗体（１１Ｃ８１）であらかじめ処理した細胞と比較して、流動状態下で７５％Ｎｍの初期接着を阻害したが、その一方で、ＭＥＭ‐Ｍ６／１は初期接着を２０％低減しただけである（図８）。重要なことには、ＭＥＭ‐Ｍ６／１とＭＥＭ‐Ｍ６／６は共に、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞で発現されたＣＤ１４７を同様に標識した。しかしながら、ＭＥＭ‐Ｍ６／１だけが、細菌接着部位に蓄積したＣＤ１４７分子を効率的にラベルし、ＭＥＭ‐Ｍ６／６と髄膜炎菌がＣＤ１４７において同じ結合モチーフで競合していることが示唆された。全体的に見て、我々のデータは、ＣＤ１４７がヒト内皮細胞へのＮｍの初期付着のための重大な内皮受容体であることを示している。

次に、我々は、Ｎｍがガラス支持体上に固定した精製ＣＤ１４７‐Ｆｃ分子上に直接接着することがあるかどうか調べた。意外なことに、ＣＤ１４７‐Ｆｃに接着する髄膜炎菌の数は、ＩＣＡＭＦｃ又は固定したタンパク質が存在しない対照条件（陰性）に接着する細菌の数に比べて、４〜５倍高かった（図９）。この直接的な相互作用における髄膜炎菌ＩＶ型線毛の役割と一致して、野性型及びｐｉｌＣ２突然変異株は、固定したＣＤ１４７‐Ｆｃに接着し、ｐｉｌＥ及びｐｉｌＣ１変異株とは対照的であった（図１０）。線毛成分中に（単数若しくは複数の）ＣＤ１４７「リガンド」を同定するために、我々は、可溶性ＣＤ１４７‐Ｆｃ分子と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として作製して、ブドウ球菌上に固定した精製組み換えピリンとの相互作用を評価した（Coureuil et al., 2010, Cell, 143:1149-1160に記載のとおり）（図１１）。興味深いことに、精製ＰｉｌＥは、ＣＤ１４７‐Ｆｃ分子と相互作用した。類似した相互作用は、少数のピリンであるＰｉｌＶによっても観察されたが、少数のピリンであるＰｉｌＸ又はＣｏｍＰでは有意な相互作用は検出されなかった。それぞれのピリンに関して、内皮細胞への髄膜炎菌接着に対する相対的な寄与をさらに分析するために、野生型ＮｍによるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の感染を、精製ピリンの存在下で実施し、膜受容体への結合に関するそれらの競合能力を評価した（図１２）。意外なことに、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶの添加は、それぞれ６０％及び５０％細菌接着を低減したが、それに対し、ＰｉｌＸ又はＣｏｍＰタンパク質の添加は効果がなかった（図１２）。一貫して、ｐｉｌＥ変異体と異なって線毛が残っているｐｉｌＶ欠失突然変異株は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への細菌接着を無効にした（図１３）。要するに、これらの結果は、内皮細胞への髄膜炎菌の初期接着におけるＰｉｌＥ及びＰｉｌＶと、ＣＤ１４７との間の選択的相互作用の重要な役割を指摘している。

ヒトでのＮｍ感染におけるこの知見の関連性を評価するために、生きた病原性髄膜炎菌が正常ヒト脳の前頭側標本から得られた新鮮な脳切片上に接着する能力を調査した。意外なことに、細菌は、主に（Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔内の）軟髄膜と皮質領域の脳血管との密な結合を樹立した。重要なことに、この局所化は、ピリンＰｉｌＥ及びＰｉｌＶの両方の発現に依存した、細菌性髄膜炎における神経病理学的観察を大いに連想させる。実際に、ｐｉｌＥ又はｐｉｌＶ欠失突然変異株は、野性型Ｎｍと比較して、同じドナーからの脳切片にわずかにしか接着しなかった（図１４）。野性型細菌は、ＣＤ１４７を発現する内皮細胞で裏打ちされた脳脊髄膜及び皮質の脳血管の腔側上にコロニーを形成した。加えて、細菌コロニーは、ＣＤ１４７＋軟膜細胞と関連しても見られたが、ＣＤ１４７を発現しない膠細胞でもニューロン細胞でも見られず、新鮮なヒト脳組織への細菌の接着がＣＤ１４７発現と密接に関連していることを実証した。最終的に、Ｎｍによる感染の前に、脳切片をＭＥＭ‐Ｍ６／６で前処理することで、脳におけるコロニー形成は大幅に低減したが、ＭＥＭ‐Ｍ６／１及び１１Ｃ８１抗体は効力がなかった（図１５）。これらの結果は、培養内皮細胞を使用した我々のデータに合致し、ＣＤ１４７のＣ末端領域が、脳血管の現場における感染に不可欠であることが確認された。

全体的に見て、この試験は、ＣＤ１４７が、線毛成分のＰｉｌＥ及びＰｉｌＶと直接相互作用することによって、脳及び末梢ヒト内皮細胞へのＮｍの初期接着に不可欠な受容体であることを実証している。重要なことに、それは、微生物リガンドと脳受容体の間の特異的相互作用に依存した、病原性髄膜炎菌による脳血管の選択的な標的化に関してｉｎ ｓｉｔｕにおける最初の実証を提供している。Ｎｍによる組織のコロニー化の病態生理学的カスケードにおけるその重要な位置のため、ＣＤ１４７は、脳及び末梢の毛細血管の髄膜炎菌血液感染性感染を阻害する主要な薬理学的標的となる。髄膜炎菌による感染の動物モデルの不足が、髄膜炎菌発症機序の理解の妨げとなった。Ｎ．メニンギティディスは、ヒト起源の細胞とだけ相互作用し、そして、ヒト細胞にだけ接着するので、そのため、動物モデルを使用した、髄膜炎菌発症機序における髄膜炎菌の細胞相互作用の役割の試験が妨げられた。

ヒト皮膚を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを使用したモデルを準備した。以前の報告では、移植後４〜６週間、ヒト皮膚移植片が、微小血管も含めて正常な皮膚の特徴を維持したことが示されていた（Yan et al., 1993, J Clin Invest, 91: 986; Gilet et al., 2009, J Invest Dermatol, 129: 879）。簡単に言えば、形成外科手術中に取り出した正常ヒト成熟皮膚を、ＳＣＩＤマウスの背部に移植した。１カ月後に、マウスに莢膜性有線毛髄膜炎菌を腹腔内又は静脈内注射によって感染させる。病理組織学的試験では、Ｎ．メニンギティディスが異種移植片の排出管を特異的に標的とし（しかし、正常マウス皮膚のそれはでない）、内皮に接着し、そして、血管の管腔内の閉塞コロニーを形成することが判明した。図１６は、ヒト皮膚を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、細胞と相互作用することができる有線毛莢膜性細菌が、ヒト皮膚と相互作用することができない無線毛莢膜性細菌に比べて、ヒト皮膚により多数存在することを明確に示している。これは、組織学的検査によって確認された。実際に、無線毛細菌は、生体内において移植片のヒト内皮細胞に接着することができなかった。これらのデータは、細菌が生体内においてヒト細胞と相互作用するのに線毛形成が必要であることを実証している。

高レベルの菌血症は、髄膜炎菌の発症機序の最重点であるように考えられている。この菌血症の確立を可能にすることが知られている病原性因子は、莢膜、リポオリゴ糖、Ｈ因子結合タンパク質及び鉄キレート系である。これらの病原性因子が、細胞外液中で細菌が生き残ることを可能にしている。ＳＣＩＤマウスモデルを使用して、我々は、細菌が血管内で相互作用し、及び増殖する能力もまた、菌血症の成立に関与しているという仮説を試験した。図１７が示しているように、有線毛細菌が移植ヒト皮膚マウスに注射されるとき、類似した細菌が非移植マウスに注射されたときに比べて、菌血症がはるかに高度に維持されるので、これにより、細菌とヒト皮膚との相互作用が菌血症の確立を可能にすることが示唆される。Ｖ型線毛の役割は、（内皮細胞に接着することができない）無線毛髄膜炎菌の注射が、有線毛細菌で観察されることと異なって、血流からその細菌を一掃する事実によって確認された。髄膜炎菌の発症機序におけるこの相互作用の役割を確認するために、注射した移植マウス又は注射した非移植マウスの間の有線毛髄膜炎菌の病原力を比較した。図１８に示すとおり、３匹の移植マウスのうち２匹が死亡した一方で、すべての非移植マウスが生き残った。

要するに、これらのデータは、髄膜炎菌による菌血症の確立には、莢膜性、リポオリゴ糖、Ｈ因子結合タンパク質及び鉄キレート系だけでなく、細菌と内皮細胞との相互作用を促進する線毛も必要であることを実証している。加えて、内皮細胞とのこの相互作用は、髄膜炎菌の発症機序には不可欠である（図１８）。これらのデータは、この相互作用を阻害するとで髄膜炎菌による感染が予防され、髄膜炎菌細胞の相互作用を低減することを目的とするワクチンが、髄膜炎菌による感染を予防するのに効果的であることを示唆している。

最後に、ピリンとＣＤ１４７エクトドメインとの相互作用を計測することを可能にするＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ試験を開発した。ＣＤ１４７‐Ｆｃと、（量の少ない他のピリンＰｉｌＸやＣｏｍｐとではなく）ＰｉｌＥ及びＰｉｌＶの両方との間の用量依存性相互作用は、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術を使用することにより検出されたが、ＰｉｌＥ又はＰｉｌＶと、対照タンパク質との間で相互作用は検出されなかった。予想されるように、精製ＭＢＰ‐ＰｉｌＥ‐ＳＡ及びＭＢＰ‐ＰｉｌＥ‐ＳＢキメラは、ＣＤ１４７‐Ｆｃと同じように相互作用した。さらに、ＣＤ１４７とＰｉｌＥとの相互作用は、ＣＤ１４７のＩｇ近位ドメインに対して向けられたＭＥＭ‐Ｍ６／６抗体の添加によって首尾よく阻害できる。これらの結果は、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ試験がＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７との相互作用の阻害剤の高性能スクリーニングに使用できることを示唆している。

Claims (15)

1. 髄膜炎菌による菌血症及び／又は感染を予防又は治療するための使用に向けたＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用の阻害剤であって、以下の：
   （ｉ）ＣＤ１４７阻害剤、及び／又は
   （ｉｉ）ＩＶ型線毛関連タンパク質結合阻害剤、
   である前記阻害剤。
2. 前記ＣＤ１４７阻害剤が、抗ＣＤ１４７抗体又はアンチセンス核酸であって、前記抗体が、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害し、且つ、前記アンチセンス核酸がＣＤ１４７受容体発現をサイレンシングする、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
3. 前記ＩＶ型線毛関連タンパク質阻害剤が、抗ＩＶ型線毛関連タンパク質抗体又はＣＤ１４７ポリペプチド若しくはその断片であり、前記抗体又は前記ＣＤ１４７ポリペプチド若しくはその断片が、ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用を阻害する、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
4. 前記ＣＤ１４７阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、好ましくは配列番号１、２、３、４又は５の配列のうちの少なくとも１種類のｓｉＲＮＡを含む、請求項２に記載の使用のための阻害剤。
5. 前記ＣＤ１４７ポリペプチドが、ＣＤ１４７の細胞外ドメインの可溶形又はその断片を含むか又はそれらから成る、請求項３に記載の使用のための阻害剤。
6. 前記ＣＤ１４７の細胞外ドメインの可溶形が、配列番号６の配列を含むか又はそれらから成る、請求項５に記載の使用のための阻害剤。
7. 前記抗ＣＤ１４７抗体が、ＭＥＭ‐Ｍ６／６抗体である、請求項２に記載の使用のための阻害剤。
8. 少なくとも１種類の抗菌化合物と組み合わせた、連続投与又は同時投与のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
9. 前記少なくとも１種類の抗菌化合物が：
   （ｉ）髄膜炎菌ワクチン抗原、又は
   （ｉｉ）少なくとも２種類の髄膜炎菌ワクチン抗原を含む融合タンパク質、
   である、請求項８に記載の使用のための阻害剤。
10. 前記髄膜炎菌ワクチン抗原が、髄膜炎菌ＰｉｌＥ、ＰｉｌＶ、ＰｉｌＸ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＰ、ｆＨｂｐ、ＰｏｒＡ、ＮＨＢＡ、ＮａｄＡ、ＭａｆＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＴｂｐＢ、ＡｕｓＰ、又はその断片から成る、請求項９に記載の使用のための阻害剤。
11. 前記阻害剤が、医薬的に許容され得る組成物に処方される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
12. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の阻害剤、及び医薬的に許容され得るビヒクル、希釈剤又は担体を含む医薬組成物。
13. 対象、好ましくはヒトへの同時、別々、又は連続した投与のための、少なくとも１種類の抗菌化合物、好ましくは：
    （ｉ）髄膜炎菌ワクチン抗原、又は
    （ｉｉ）少なくとも２種類の髄膜炎菌ワクチン抗原を含む融合タンパク質、
    をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 内皮細胞への髄膜炎菌の接着を妨げる試験管内での方法における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の阻害剤の使用。
15. ＩＶ型線毛関連タンパク質とＣＤ１４７受容体との相互作用の阻害剤のスクリーニング方法であって、以下の：
    ａ）ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片、及びＣＤ１４７受容体又はその断片を含む媒質を準備し、ここで、前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片及びＣＤ１４７受容体又はその断片は、特異的に一緒に相互作用して、結合対を形成することができ、
    ｂ）候補化合物を前記媒質に追加し、
    ｃ）前記ＩＶ型線毛関連タンパク質又はその断片と、前記ＣＤ１４７受容体又はその断片との間の相互作用の阻害を計測する、
    から成るステップを含む前記方法。

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