BR112021000727A2 - Composições anti-cd112r e métodos - Google Patents

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Bianka Prinz
Nadthakarn Boland
Kevin Schutz
John Bukowski
Jennifer Symonds
James Mohan
Marisella Panduro Sicheva
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Surface Oncology, Inc.
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Abstract

“composições anti-cd112r e métodos”. a invenção fornece composições de anticorpo anti-cd112r e seu uso no tratamento de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES ANTI-CD112R E MÉTODOS”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório nº U.S. 62/701.065, depositado em 20 de julho de 2018, e do Pedido Pro- visório nº U.S. 62/844.958, depositado em 8 de maio de 2019, cujos conteúdos estão incorporados ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] Anticorpos anti-CD112R são fornecidos, bem como seu uso na intensificação, aumento e sustentação de uma resposta imune anti- tumoral, tratamento de câncer e intensificação das interações de CD226 com CD112.
ANTECEDENTES
[003] Tanto o braço inato quanto o adaptativo do sistema imunoló- gico utilizam células imunes altamente especializadas para patrulhar o corpo, em busca de sinais de malignidade. A imunidade inata fornece a primeira linha de defesa e uma resposta rápida usando mecanismos, tais como barreiras e peptídeos destrutivos, que não são específicos e estão naturalmente presentes. As células exterminadoras naturais (NK) são um tipo de linfócito que faz parte do sistema imunológico inato e podem reconhecer e destruir células infectadas por vírus e células tu- morais usando granzimas armazenadas em seu citoplasma.
[004] A imunidade adaptativa se desenvolve ao longo do tempo em resposta ao antígeno e fornece imunidade duradoura. Linfócitos ci- totóxicos (CTLs), também conhecidos como células T CD8+ são parte da resposta imune adaptativa, pois reconhecem antígenos derivados de vírus e tumor apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs). Os CTLs são ativados pela interação com uma APC, tal como uma célula dendrítica ou macrófago. A APC apresenta os antígenos tu- morais no contexto das moléculas de MHC para o receptor de célula T (TCR) na superfície de células T. Durante esta interação cognata, a APC fornece um sinal coestimulador que leva à ativação de células T, proli- feração de células T e redução ou eliminação de células que expressam o antígeno por meio de mecanismos citotóxicos.
[005] A administração de imunoterapia anti-CD112R fornece uma oportunidade para aumentar, intensificar e sustentar as respostas imu- nes. CD112R é um receptor inibitório expresso principalmente por célu- las T e células NK e compete pela ligação de CD112 com o receptor de ativação CD226. A interação de CD112 com CD112R tem maior afini- dade do que com CD226 e, assim, regula efetivamente a ativação celu- lar mediada por CD226. Anticorpos anti-CD112R que bloqueiam a inte- ração com CD112 limitam a sinalização inibitória diretamente a jusante de CD112R, enquanto simultaneamente promovem uma maior ativação de células imunes aumentando as interações de CD226 com CD112. Em estudos in vitro, os anticorpos anti-CD112R mostraram aumentar a proliferação, ativação e citotoxicidade de células imunes efetoras.
[006] A expressão de mRNA de CD112R é detectada em vários tecidos de câncer e com base na análise preditiva usando o conjunto de dados TCGA (The Cancer Genome Atlas). Sua expressão é mais forte em tumores que são enriquecidos por células T e NK. Além de ser ex- presso em células mieloides, a expressão do ligante de CD112R, CD112, é rotineiramente elevada em células tumorais de diferentes ori- gens celulares. Dadas estas circunstâncias, o envolvimento de CD112R em células imunes que se infiltram no tumor tem um forte potencial para regular negativamente as respostas imunes locais dentro do microam- biente tumoral.
[007] O tratamento terapêutico com anticorpos anti-CD112R for- nece, assim, uma oportunidade de diminuir a sinalização inibitória que ocorre putativamente quando células imunes que expressam CD112R envolvem CD112 em células tumorais e/ou células mieloides dentro do microambiente tumoral e tem o potencial de intensificar, aumentar e sus- tentar respostas imunes antitumorais.
SUMÁRIO
[008] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD112R iso- lado é fornecido. Tal anticorpo anti-CD112R isolado se liga ao CD112R humano, em que o referido anticorpo bloqueia a interação de ligação entre CD112 humano e CD112R humano e não bloqueia a interação de ligação entre CD112 de camundongo e CD112R de camundongo, em que o anticorpo é opcionalmente totalmente humano ou humanizado.
[009] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um anti- corpo isolado que compreende: (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3; (d) LCDR1 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 4; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e (f) LCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 103; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 202; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 203; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 204; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 301; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 303; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 305; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 401; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 402; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 403; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 404; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 405; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 406; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 501; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 502; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 503; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 504; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 505; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 506; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 601; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 602; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 603; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 604; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 605; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 606; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 701; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 702; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 703; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 704; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 705; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 706; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 801; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 802; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 803; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 804; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 805; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 806; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 901; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 902; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 903; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 904; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 905; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 906; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 1003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006; ou (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 2003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2004; 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[010] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma re- gião variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18;
ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 312, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 318; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 412, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 418; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 512, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 518; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 612, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618;
ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 718; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 812, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 818; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 912, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 918; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1018; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2018; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 3018; ou a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4018.
[011] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende seis CDRs (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3) conforme descrito no presente documento e as sequências de VH e/ou VL que são pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à sequência de aminoácidos de VH e/ou VL descritas no presente documento. Em algumas modalidades, as sequências de VH e/ou VL não são 100% idênticas a uma sequência de aminoácidos descrita no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 descritas no presente documento e a variação de sequência dentro das sequências de VH e/ou VL que está fora das sequências de CDR. Em tais modalidades, a variação de sequência das sequências de VH e/ou VL está dentro de uma ou mais regiões de fra- mework de VH e/ou VL.
[012] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende sequên- cias de VH e/ou VL que são pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas a uma sequência de ami- noácidos descrita no presente documento. Em algumas modalidades, as sequências de VH e/ou VL não são 100% idênticas a um aminoácido descrito no presente documento. Em tais modalidades, a variação de sequência das sequências de VH e/ou VL está dentro e/ou fora das se- quências de CDR, a menos que especificado de outra forma.
[013] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma re- gião variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 312, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 318; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 412, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 418; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 512, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 518; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 612, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 718; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 812, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 818; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 912, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 918; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1018; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2018; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3018; ou a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4018.
[014] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos anti- CD112R que ativam as células NK. Em algumas modalidades, são for- necidos anticorpos anti-CD112R que regulam crescentemente CD137 em células NK. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R que ativam células NK e/ou regulam crescentemente CD137 em células NK são anticorpos de qualquer um dos anticorpos descritos na Tabela de Sequências, tais como, por exemplo, os anticorpos 32, 33, 34, 35 e
36. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R que ativam as células NK e/ou regulam crescentemente CD137 em células NK com- preendem as seis CDRs dos anticorpos 32, 33, 34, 35 e 36, respectiva- mente (consultar a Tabela de Sequências).
[015] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo mono- clonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humani- zado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo completa- mente humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado dentre Fab, Fab’, Fv, scFv ou (Fab’)2. Em al- gumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de comprimento com- pleto. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, a divulga- ção fornece uma composição que compreende um anticorpo divulgado no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[016] Em algumas modalidades, o anticorpo aumenta a desgranu- lação de células NK, aumenta a ativação de células NK, aumenta a ati- vação das células NK intratumorais quando apresentadas em combina- ção com um anticorpo anti-TIGIT, inibe o crescimento tumoral in vivo e/ou previne o enxerto tumoral mediante teste repetido com tumor. Em algumas destas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana, e o anticorpo aumenta a desgranulação de células NK, aumenta a ativação de células NK, au- menta a ativação de células NK intratumorais quando apresentadas em combinação com um anticorpo anti-TIGIT, inibe crescimento tumoral in vivo e/ou previne o enxerto tumoral mediante teste repetido com tumor em relação a um anticorpo de outro modo idêntico que compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG humana de um isotipo dife- rente.
[017] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar, aumentar e/ou sustentar uma resposta imunoimune antitumoral num indivíduo que compreende administrar o anticorpo ou a composição descrita no presente documento a um indivíduo com um tumor.
[018] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para tratar câncer num indivíduo que compreende administrar o anti- corpo ou a composição descrita no presente documento a um indivíduo com câncer. Em algumas modalidades, o câncer é carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer pituitário, câncer esofágico, astrocitoma, sarcoma de tecido mole, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo câncer de pulmão de células não pequenas de células escamosas), adenocarci- noma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer color- retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, carcinoma de célula renal, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, câncer de cérebro, câncer endometrial, câncer de testículo, colangiocarcinoma, carcinoma de vesícula biliar, câncer gástrico, melanoma, ou vários tipos de câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de células esca- mosas da cabeça e pescoço).
[019] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar as interações de CD226 com CD112 num indivíduo que compreende administrar o anticorpo ou a composição descrita no pre- sente documento a um indivíduo.
[020] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar a ativação de células T CD8 num indivíduo que com- preende administrar o anticorpo ou a composição descrita no presente documento a um indivíduo que necessita de ativação de células T CD8.
[021] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar a produção gama de interferon de células T CD8 num indivíduo que compreende administrar o anticorpo ou a composição descrita no presente documento a um indivíduo que necessita de pro- dução gama de interferon de células T CD8.
[022] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar a ativação de células NK num indivíduo que compre- ende administrar o anticorpo ou a composição descrita no presente do- cumento a um indivíduo que necessita de ativação de células NK.
[023] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para intensificar a citotoxicidade mediada por células NK num indivíduo que compreende administrar o anticorpo ou a composição descrita no presente documento a um indivíduo que necessita de aumento de cito- toxicidade mediada por célula NK.
[024] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem ainda administrar uma segunda terapia. Em algumas modalidades, a segunda terapia é radioterapia, cirurgia ou ad- ministração de um segundo agente. Em algumas modalidades, a se- gunda terapia é um segundo agente. Em algumas destas modalidades, o segundo agente é um antagonista de PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 ou
TIM-3. Em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista de TIGIT ou CD96. Em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista de PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4 ou CD155. Em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista de CD47, CD39 ou IL-27. Em algumas modalidades, o segundo agente é um agonista de STING.
[025] Em algumas modalidades, a divulgação fornece o uso do an- ticorpo ou da composição descrita no presente documento para intensi- ficar e/ou aumentar e/ou sustentar uma imunidade antitumoral e/ou tra- tar câncer e/ou intensificar as interações de CD226 com CD112.
[026] Em algumas modalidades, a divulgação fornece o uso do an- ticorpo ou da composição descrita no presente documento na prepara- ção de um medicamento para intensificar e/ou aumentar e/ou sustentar uma resposta imune antitumoral e/ou tratar câncer e/ou intensificar as interações de CD226 com CD112.
[027] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um ácido nucleico que codifica um anticorpo divulgado no presente documento.
[028] Em algumas modalidades, a divulgação fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica um anti- corpo divulgado no presente documento.
[029] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para produzir um anticorpo divulgado no presente documento que com- preende cultivar a célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica um anticorpo divulgado no presente documento, sendo que a célula hospedeira é cultivada sob condições em que o anticorpo é ex- presso. Em algumas modalidades, o método compreende ainda purifi- car o anticorpo.
[030] As modalidades exemplificativas da divulgação incluem o se- guinte: Modalidade 1. Um anticorpo anti-CD112R isolado que se liga ao
CD112R humano, em que o referido anticorpo bloqueia a interação de ligação entre CD112 humano e CD112R humano e não bloqueia a inte- ração de ligação entre CD112 de camundongo e CD112R de camun- dongo, em que o anticorpo é opcionalmente totalmente humano ou hu- manizado.
Modalidade 2. O anticorpo isolado da modalidade 1, em que o anticorpo isolado compreende: i) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 701; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 702; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 703; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 704; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 705; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 706; ou ii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 1003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006; ou iii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 2003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2006; ou iv) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 3002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 3003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3006; ou v) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 4003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4006; ou vi) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001 com 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos para as posições 4, 5 e/ou 6 da SEQ ID NO: 1001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002 com 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácidos para as posições 1, 3, 5, 6 e/ou 8 da SEQ ID NO: 1002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006. Modalidade 3. O anticorpo isolado da modalidade 1 ou 2, em que o an- ticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: i) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 718; ou ii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1018; ou iii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2018; ou iv) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3018; ou v) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012, e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4018, opcionalmente com a condição de que se qualquer varia- ção de sequência estiver presente nas CDRs, tal variação de sequência está dentro de HCDR1 ou HCDR2 com não mais do que 3 alterações de aminoácidos, tais como não mais do que 2 alterações de aminoáci- dos para as posições 4, 5 e/ou 6 de HCDR1 e não mais do que 5 alte- rações de aminoácidos, tal como não mais do que 2 alterações de ami- noácidos para as posições 1, 3, 5, 6 e/ou 8 de HCDR2, opcionalmente em que a variação não está dentro de HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Modalidade 4. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pe- sada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: i) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 718; ou ii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1018; ou iii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2018; ou iv) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3018; ou v) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012, e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4018. Modalidade 5. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo humano.
Modalidade 6. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou é um fragmento de anticorpo, opcionalmente um Fab, Fab’, Fv, scFv ou (Fab’)2. Modalidade 7. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o anticorpo compreende uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, em que o anticorpo compreende opcionalmente uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana, uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana ou uma região constante de cadeia pe- sada de IgG4 humana mutante, em que a região constante de cadeia pesada de IgG4 humana mutante compreende opcionalmente uma mu-
tação selecionada dentre uma substituição em Ser228, uma substitui- ção em Leu235, uma substituição em Asn297 ou uma combinação das mesmas, em que a numeração está de acordo com a numeração EU, ou uma substituição S228P e uma substituição L235E, em que a nume- ração está de acordo com a numeração EU.
Modalidade 8. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o anticorpo i) aumenta a desgranulação de células NK; e/ou ii) aumenta a ativação de células NK; e/ou iii) aumenta a ativação de células NK intratumorais quando apresenta- das em combinação com um anticorpo anti-TIGIT; e/ou iv) inibe o crescimento tumoral in vivo e/ou v) previne o enxerto tumoral mediante teste repetido com tumor, opcio- nalmente em que o anticorpo é IgG1 ou IgG4. Modalidade 9. Uma composição farmacêutica que compreende o anti- corpo de qualquer uma das modalidades 1 a 8 e um carreador farma- ceuticamente aceitável, em que a composição compreende opcional- mente um agente opsonizante, um agente de esgotamento de célula T reguladora, quimioterapia e/ou um antagonista de PD-1, PD- L1, CTLA- 4, Lag-3 ou TIM-3. Modalidade 10. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades 1 a 8 ou composição farmacêutica da modalidade 9 para uso na inten- sificação, aumento e/ou sustentação de uma resposta imune antitumo- ral num indivíduo, opcionalmente em que a ativação de célula T CD8 é intensificada ou a produção gama de interferon de célula T CD8 é inten- sificada no indivíduo, ou opcionalmente em que a ativação de célula NK é intensificada no indivíduo ou a citotoxicidade mediada por célula NK é intensificada no indivíduo, ou opcionalmente em que as interações de CD226 com CD112 são intensificadas num indivíduo.
Modalidade 11. O anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades
1 a 8 ou composição farmacêutica da modalidade 9 para uso no trata- mento de câncer num indivíduo, em que o câncer é opcionalmente car- cinoma, linfoma, blastoma, sarcoma ou leucemia, ou em que o câncer é opcionalmente câncer de células escamosas, câncer de pulmão de cé- lulas pequenas, câncer pituitário, câncer esofágico, astrocitoma, sar- coma de tecido mole, câncer de pulmão de células não pequenas (in- cluindo câncer de pulmão de células não pequenas de células escamo- sas), adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, cân- cer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, carcinoma de célula renal, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, câncer de cérebro, câncer endometrial, câncer de testículo, colangiocarcinoma, carcinoma de vesícula biliar, câncer gástrico, mela- noma, ou vários tipos de câncer de cabeça e pescoço (incluindo carci- noma de células escamosas da cabeça e pescoço). Modalidade 12. O anticorpo isolado ou composição farmacêutica para uso da modalidade 10 ou 11, em que o uso compreende ainda adminis- trar uma segunda terapia, em que a segunda terapia é, opcionalmente, radioterapia, cirurgia ou administração de um segundo agente, em que o segundo agente é, opcionalmente, um antagonista de PD -1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 ou TIM-3, ou um antagonista de TIGIT ou CD96, ou um antagonista de PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4 e CD155, ou é um an- tagonista de CD47, ou é um antagonista de CD39, ou é um antagonista de IL-27, ou é um agonista de STING, em que o segundo agente é, opcionalmente, um anticorpo antagonista.
Modalidade 13. Um ácido nucleico que codifica o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 8.
Modalidade 14. Uma célula hospedeira que compreende o ácido nu- cleico da modalidade 13. Modalidade 15. Um método para produzir o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 8 que compreende cultivar a célula hospedeira da modalidade 14 sob condições em que o anticorpo é expresso, opcional- mente que compreende ainda purificar o anticorpo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[031] A Figura 1 representa a capacidade de anticorpos anti- CD112R, em comparação com um anticorpo de controle de isotipo IgG1, para se ligarem a células Jurkat geneticamente modificadas para supe- rexpressar CD112R humano. A intensidade de ligação foi avaliada pela intensidade fluorescente média geométrica (gMFI) da identificação de anticorpo Alexa Fluor® 647.
[032] As Figuras 2A e 2B representam a capacidade de anticor- pos anti-CD112R, em comparação com um anticorpo de controle de iso- tipo IgG1, para bloquear a interação de CD112R com CD112 em células Jurkat geneticamente modificadas para superexpressar CD112R hu- mano. Na Figura 2A, as células foram pré-incubadas com controle de isotipo IgG1 ou anticorpo anti-CD112R. Após a lavagem, as células fo- ram manchadas simultaneamente com CD112 humano identificado com his biotinilado e Estreptavidina-PE. A capacidade dos anticorpos anti- CD112R para bloquear a ligação de CD112 a CD112R foi avaliada pela intensidade fluorescente média geométrica (gMFI) da identificação PE e exibida como inibição percentual. A inibição percentual foi calculada como [100 – ((MFI de amostra de teste/MFI Máxima)*100%)]. A Figura 2B mostra a inibição percentual conforme medido por ELISA da intera- ção entre CD112R e CD112 humanos pelos anticorpos anti-CD112R descritos no presente documento.
[033] A Figura 3 mostra citotoxicidade mediada por célula NK hu- mana intensificada contra células REH (linhagem celular de leucemia humana) na presença de anticorpos anti-CD112R em comparação com um anticorpo de isotipo IgG1. As células NK ativadas e as células REH identificadas com violeta cellTrace foram cocultivadas por quatro horas. Após a cocultura, a viabilidade das células REH foi avaliada por man- chamento com 7-AAD. A citotoxicidade (porcentagem em relação ao isotipo) foi calculada como ((morte em porcentagem de teste menos morte em porcentagem de isotipo) dividido pela morte em porcentagem de isotipo) x 100.
[034] A Figura 4 mostra ativação acionada por antígeno intensifi- cada de células T CD8+, conforme medido pela secreção de IFNγ, na presença de anticorpos anti-CD112R, em comparação com um anti- corpo de controle de isotipo IgG1. As células Colo205 foram pulsadas com o peptídeo pp65 e cocultivadas com células T específicas para CMV humanas na presença de anticorpo anti-CD112R ou um controle de isotipo IgG1. Os níveis de IFNγ nos sobrenadantes de células culti- vadas foram medidos por Luminex. As células T CD8+ tratadas com anticorpos anti-CD112R 2 e 5 resultaram em maior secreção de IFNγ do que observado com o controle de isotipo.
[035] A Figura 5 é um gráfico que representa que uma combina- ção de anticorpos anti-CD112R murinos e anti-TIGIT murinos tem efeito terapêutico no modelo de tumor CT-26 singênico de camundongo. Ca- mundongos que portam tumor foram randomizados em quatro grupos e tratados duas vezes por semana por duas semanas, por injeção IP, com 1) anticorpo de controle de isotipo; 2) anticorpo anti-TIGIT; 3) anticorpo anti-CD112R; ou 4) anticorpo anti-TIGIT combinado com anticorpo anti- CD112R. Os volumes médios de tumor para cada grupo de tratamento são representados como uma função de tempo. Os resultados demons- tram que a combinação de anti-CD112R com anti-TIGIT foi eficaz na redução do crescimento do tumor em comparação com os animais tra-
tados com isotipo, enquanto as monoterapias anti-CD112R ou anti-TI- GIT não mostraram nenhuma atividade ou mostraram apenas um efeito modesto na redução do crescimento do tumor.
[036] A Figura 6 é um gráfico que representa a expressão aumen- tada de CD112R em PBMCs após a ativação de anti-CD3. PBMCs hu- manos foram estimulados in vitro com anticorpo anti-CD3, e a expressão de CD112R foi avaliada por citometria de fluxo. A quantificação da liga- ção de anticorpo CD112R foi avaliada pela intensidade fluorescente mé- dia geométrica (gMFI) da identificação de anticorpo Alexa Fluor® 647 para o tipo de célula indicado. CD112R é representado como fold change em relação ao controle negativo (FON, (gMFI de CD112R divi- dida pela gMFI de isotipo)).
[037] A Figura 7 mostra a desgranulação mediada por célula NK intensificada em resposta às células tumorais na presença de anticor- pos CD112R com um isotipo IgG1. Células NK humanas e células Raji.CD112 foram cocultivadas por quatro horas com anticorpo CD107a PE na presença de anticorpos CD112R. Após a cocultura, a desgranu- lação de células NK foi determinada pela frequência de células NK que eram positivas para CD107a.
[038] As Figuras 8A a 8D mostram ativação intensificada de célu- las NK na presença de um anticorpo CD112R com um isotipo IgG1. PBMCs humanas de 2 doadores diferentes e células K562 foram cocul- tivadas por 16 horas na presença de um anticorpo CD112R. Após a co- cultura, a ativação de células NK foi determinada pela frequência de cé- lulas NK que eram positivas para CD137. Os resultados para o doador 1 e doador 2 em dois ensaios independentes são mostrados nas Figuras 8A a 8D, respectivamente.
[039] A Figura 9 mostra a inibição do crescimento tumoral em ca- mundongos tratados com um anticorpo anti-CD112R. A figura mostra um sumário de 3 experimentos, N=44 a 45 por grupo. A análise estatís- tica foi realizada pelo teste de Mann-Whitney no dia 24 após implante.
[040] As Figuras 10A a 10B mostram que o tratamento com anti- corpo anti-CD112R aumenta a sobrevivência geral de camundongos inoculados com tumores CT-26 e protege os camundongos de novo de- safio de tumor. A Figura 10A mostra a frequência de sobrevivência de camundongos após desafio de tumor primário com tratamento anti- CD112R. Os camundongos sobreviventes não exibiram nenhum tumor palpável além do dia 50 da inoculação e foram considerados responde- dores completos. A Figura 10B mostra a inibição do crescimento do tu- mor em camundongos sobreviventes após novo desafio de tumor em comparação com camundongos de controle virgens. A análise estatís- tica foi realizada pelo teste de Mantel-Cox no dia 50 após implante (Fi- gura 10A) e pelo teste de Mann-Whitney no dia 15 após implante (Figura 10B).
[041] A Figura 11 mostra que a eficácia in vivo do bloqueio de CD112R num modelo de tumor de camundongo CT26 depende das cé- lulas NK e das células T CD8. A figura mostra a inibição do crescimento tumoral de camundongos tratados com anti-CD112R simultaneamente depletados de células NK ou células T CD8.
[042] As Figuras 12A e 12B mostram a expressão de CD69 (Fi- gura 12A) e Granzima B (Figura 12B) em células NK intratumorais em modelo de tumor CT-26 após tratamento com um anticorpo anti- CD112R.
[043] As Figuras 13A a 13F mostram medições de volume tumo- ral médio (Figura 13A) e individual (Figuras 13B a E) como uma função de tempo num modelo de tumor CT-26 após a administração de anticor- pos anti-CD112R sozinhos e em combinação com anticorpos anti-PD1. A Figura 13F mostra a sobrevivência sem tumor geral no dia 50 após implantação como uma fração de sobreviventes sem tumor por grupo.
[044] As Figuras 14A a 14F mostram os alinhamentos das se- quências de CDR dos anticorpos descritos no presente documento. As Figuras 14A a 14C mostram as sequências CDR da região variável de cadeia pesada, e as Figuras 14D a 14F mostram as sequências de CDR da região variável de cadeia leve. Em cada uma das Figuras 14A a 14F, a primeira coluna mostra HCDR1 (Figura 14A), HCDR2 (Figura 14B) e HCDR3 (Figura 14C), LCDR1 (Figura 14D), LCDR2 (Figura 14E) e LCDR3 (Figura 14F), em que o número de clone de anticorpo é forne- cido antes de H1 (para HCDR1), H2 (para HCDR2), H3 (para HCDR3), L1 (para LCDR1), L2 (para LCDR2) e L3 (para LCDR3). A segunda co- luna mostra a sequência, a terceira coluna mostra o número de amino- ácidos na sequência, e a última coluna mostra a porcentagem de iden- tidade de cada sequência em relação à sequência do clone de anticorpo progenitor 32. Os clones de membros da família 32, 33, 34, 35 e 36 estão em negrito.
[045] As Figuras 15A a 15H mostram os alinhamentos das se- quências de região de framework dos anticorpos descritos no presente documento. As Figuras 15A a 15D mostram as sequências de região de framework da região variável de cadeia pesada, e as Figuras 15E a 15H mostram as sequências de região de framework da região variável de cadeia leve. Em cada uma das Figuras 15A a 15F, a primeira coluna mostra a cadeia pesada FR1 (Figura 15A), FR2 (Figura 15B), FR3 (Fi- gura 15C), FR4 (Figura 15D) e a cadeia leve FR1 (Figura 15E), FR2 (Figura 15F) e FR3 (Figura 15G) e FR4 (Figura 15H), em que o número de clone de anticorpo é fornecido antes de VH (para HFR1, HFR3, HFR3 e HFR4) e VL (para LFR1, LFR2, LFR3 e LFR4). A segunda coluna mostra a sequência, e a última coluna mostra a porcentagem de identi- dade de cada sequência em relação à sequência do clone de anticorpo progenitor 32. Os clones de membros da família 32, 33, 34, 35 e 36 estão em negrito.
[046] As Figuras 16A e 16B mostram os alinhamentos das se- quências de região variável dos anticorpos descritos no presente docu- mento. A Figura 16A mostra as sequências de região variável de cadeia pesada, e a Figura 16B mostra as sequências de região variável de ca- deia leve. Cada sequência é identificada com seu número de clone cor- respondente. A porcentagem de identidade de cada sequência em rela- ção à sequência do clone de anticorpo 32 é mostrada. Os clones de membros da família 32, 33, 34, 35 e 36 estão em negrito.
[047] A Figura 17 mostra a extensão da ligação de anticorpos anti- CD112R descritos no presente documento e anticorpos anti-CD112R adicionais (anticorpos A, B e C que se ligam a CD112R humano) a cé- lulas que expressam CD112R de camundongo.
[048] A Figura 18 mostra a extensão da ligação de anticorpos anti- CD112R descritos no presente documento e anticorpos anti-CD112R adicionais (anticorpos A, B e C que se ligam a CD112R humano) a CD112R de camundongo solúvel.
[049] A Figura 19 mostra a porcentagem de inibição da interação entre CD11R de camundongo e CD112 de camundongo por anticorpos anti-CD112R descritos no presente documento e anticorpos anti- CD112R adicionais (anticorpos A, B e C que se ligam a CD112R huma- no).
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
[050] Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou” a menos que in- dicado de outro modo. No contexto de uma reivindicação de dependên- cia múltipla, o uso de “ou” refere-se novamente a mais de uma reivindi- cação independente ou dependente anterior na alternativa apenas. Os termos “que compreende”, “incluindo” e “que tem” podem ser usados de forma intercambiável no presente documento.
[051] Os termos “CD112R,” “Contendo Domínio de Imunoglobulina
Relacionado a PVR”, “Receptor CD112”, “Proteína Contendo Domínio de Imunoglobulina Relacionado a Receptor de Poliovírus”, “Contendo Domínio de Imunoglobulina Relacionado a Receptor de Poliovírus”, “Re- ceptor de Nectina-2”, “C7orf15” e “Proteína Transmembranar PVRIG” são todos usados de forma intercambiável e refere-sem a um CD112R humano nativo, a menos que seja especificamente indicado de outra forma (por exemplo, CD112R de camundongo, CD112R de cinomolgo, etc.). O termo inclui CD112R não processado, de comprimento com- pleto, bem como qualquer forma de CD112R que resulte do processa- mento na célula. O termo abrange variantes de ocorrência natural de CD112R humano, por exemplo, variantes de splicing ou variantes aléli- cas. IDs externos para o gene CD112R incluem Entrez Gene: 79037, Ensembl: ENSG00000213413, OMIM: 617012 e UniProtKB: Q6DKI7.
[052] “Afinidade” refere-se à intensidade do total de soma de inte- rações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A não ser que indicado de outro modo, conforme usado no presente documento, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de li- gação intrínseca que reflete uma interação a 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode ser, de modo geral, representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. As modalidades ilustrativas e exemplificativas es- pecíficas para medir afinidade de ligação são descritas a seguir.
[053] Um anticorpo “com maturidade de afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações numa ou mais regiões hipervari- áveis (HVRs), em comparação com um anticorpo progenitor que não possui tais alterações, em que tais alterações resultam opcionalmente num aprimoramento na afinidade do anticorpo para antígeno.
[054] O termo "anticorpo" no presente documento é usado no sen- tido o mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpo, incluindo, porém sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que os mesmos exibam a atividade de ligação a antígeno desejada.
[055] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula dife- rente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anti- corpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; molécu- las de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos mul- tiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[056] O termo "bloquear", no contexto de uma interação entre duas ou mais moléculas, é usado no presente documento para se referir à inibição ou prevenção da referida interação entre as duas ou mais mo- léculas, em que a inibição ou prevenção da referida interação entre as duas ou mais moléculas está completa ou quase completa sob pelo me- nos uma condição. Uma inibição “quase completa” é uma porcentagem de inibição de cerca de 70 a 99,9% e uma inibição “completa” é de 100%. Por exemplo, diz-se que uma molécula "bloqueia" uma interação entre duas ou mais outras moléculas se a mesma inibir completamente ou quase completamente esta interação em certas concentrações de uma maneira dependente de dose.
[057] O termo "câncer" é usado no presente documento para se referir a um grupo de células que exibem níveis anormalmente altos de proliferação e crescimento. Um câncer pode ser benigno (também de- nominado tumor benigno), pré-maligno ou maligno. As células de câncer podem ser células de câncer sólido ou células de câncer leucêmicas. O termo "tumor" é usado no presente documento para se referir a uma célula ou células que compreendem um câncer. O termo "crescimento do tumor" é usado no presente documento para se referir à proliferação ou crescimento por uma célula ou células que compreendem um câncer que leva a um aumento correspondente no tamanho ou na extensão do câncer.
[058] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[059] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio cons- tante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Há cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias des- tas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de , , , e , respectivamente.
[060] A administração “em combinação com” um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concomi- tante) e consecutiva (sequencial) em qualquer ordem.
[061] O termo “agente citotóxico”, conforme usado no presente do- cumento, refere-se a uma substância que inibe ou impede uma função celular e/ou causa morte ou destruição celular. Os agentes citotóxicos incluem, porém sem limitação, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes ou fármacos quimioterápicos (por exemplo, metotre- xato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalação); agentes inibidores de crescimento; enzi- mas e fragmentos das mesmas, tais como enzimas nucleolíticas; anti-
bióticos; toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas en- zimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumor e anticâncer divulgados abaixo.
[062] “Funções efetoras” referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo de anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: liga- ção de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); liga- ção de receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; e regulação decrescente de recepto- res de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.
[063] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosa- gens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado te- rapêutico ou profilático desejado.
[064] O termo "região Fc" no presente documento é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em algumas mo- dalidades, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226, ou a partir de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente (a numeração neste parágrafo está de acordo com o sistema de numeração de EU, também chamado de ín- dice de EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição. Public Health Service, National Ins- titutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
[065] “Framework”, “região de framework” ou “FR” refere-se a re-
síduos de domínio variável diferentes de resíduos de região hipervariá- vel (HVR). O FR de um domínio variável, de modo geral, consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. De modo correspondente, as sequências de HVR e FR, de modo geral, aparecem na seguinte se- quência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[066] Os termos “anticorpo de comprimento completo”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são usados de forma intercambiável para referência a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente si- milar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente documento.
[067] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospe- deira" e "cultura celular hospedeira" são usados de forma intercambiável e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introdu- zido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras in- cluem "transformantes" e "células transformadas" que incluem a célula transformada primária e progênie derivada da mesma sem considerar o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idên- tica em teor de ácido nucleico a uma célula progenitora e pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica que a triada ou selecionada na célula originalmente transfor- mada está incluída no presente documento.
[068] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências de codificação de anticorpo humano. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antígeno não humanos.
[069] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. O domínio variável da cadeia pe- sada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo na- tivo, de modo geral, tem estruturas similares, com cada domínio com- preendendo quatro regiões de framework conservadas (FRs) e três re- giões hipervariáveis (HVRs). (Consultar, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º edição, W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Um domínio VH ou VL único pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação a antígeno. Além disto, os anticorpos que se ligam a um an- tígeno particular podem ser isolados com o uso de um domínio de VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para triar uma biblioteca de domínios de VL ou VH complementares, respectivamente. Consultar, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
[070] Um “framework consenso humano” é um framework que re- presenta os resíduos de aminoácido de ocorrência mais comum numa seleção de sequências de framework de VL ou VH de imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção de sequências de VL ou VH de imu- noglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio vari- ável. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Ka- bat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edi- ção, Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), volumes 1-3. Numa modalidade, para a VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I como em Ka- bat et al., supra. Em algumas modalidades, para a VH, o subgrupo é o subgrupo III como em Kabat et al., supra.
[071] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, conforme usado no presente documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência (“regiões de- terminantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam laços es- truturalmente definidos (“laços hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos de contato com antígeno (“contatos de antígeno”). De modo geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3).
[072] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, porém sem limitação, um agente citotóxico.
[073] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Os mamíferos incluem, porém sem limitação, animais domesticados (por exemplo, va- cas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, seres hu- manos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedo- res (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinadas modalida- des, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[074] Um anticorpo “isolado” é um que foi separado de um compo- nente de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focagem isoe- létrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (por exemplo, HPLC de troca iônica ou de fase reversa). Para análise dos métodos para ava- liação de pureza de anticorpo, consultar, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[075] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado no pre- sente documento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma popu- lação de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticor- pos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes , por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou surgindo durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, sendo que tais variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal que tipicamente in- cluem anticorpos diferentes direcionados contra diferentes determinan-
tes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anti- corpo monoclonal é direcionado contra um único determinante num an- tígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados em conformidade com a presente inven- ção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, porém sem limitação, o método de hibridoma, métodos de DNA recom- binante, métodos de exibição de fago e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todo ou parte dos loci de imunoglobulina hu- mana, em que tais métodos e outros métodos exemplificativos para pro- duzir anticorpos monoclonais são descritos no presente documento.
[076] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conju- gado a uma porção química heteróloga (por exemplo, uma porção quí- mica citotóxica) ou radiomarcador. O anticorpo nu pode estar presente numa formulação farmacêutica.
[077] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobu- lina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, os an- ticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas ca- deias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. A partir da ter- minação N a C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), tam- bém chamada de um domínio pesado variável ou um domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Similarmente, da terminação N a C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de um domínio leve variável ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve cons- tante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seu domínio constante.
[078] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoáci- dos” no que diz respeito a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos numa se- quência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das se- quências e introdução de intervalos, se necessário, para se alcançar a máxima identidade de percentagem de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de se- quência. O alinhamento para propósitos de determinação da porcenta- gem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da habilidade na técnica, por exem- plo, usando um software de computador comercialmente disponível, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar os parâmetros apropri- ados para alinhar as sequências, incluindo quaisquer algoritmos neces- sários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Para os propósitos no pre- sente documento, entretanto, a % de valores de identidade de sequên- cia de aminoácidos é gerada com o uso do programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi escrito por Genentech, Inc., e o código fonte foi preenchido com documentação do usuário no Escritó- rio de Direitos Autorais dos EUA, Washington D.C., 20559, em que é registrado sob o Número de Registro de Direitos Autorais dos EUA TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compi- lado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso num sistema operacional UNIX, incluindo UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[079] Em situações em que ALIGN-2 é usado para comparações de sequência de aminoácidos, a % de identidade de sequência de ami- noácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de ami- noácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada conforme segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácido pontuados como pa- reamentos idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 neste alinhamento do programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será evidente que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de se- quência de aminoácidos de A com B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B com A. A não ser que determinado especificamente de outro modo, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente documento são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior com o uso do programa de computador ALIGN-2.
[080] O termo “formulação farmacêutica” ou "composição farma- cêutica" refere-se a uma preparação que está em tal forma para permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma seja eficaz e que não contém nenhum componente adicional que seja ina- ceitavelmente tóxico a um indivíduo ao qual a formulação seria adminis- trada.
[081] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente numa composição ou formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que é não tóxico a um indivíduo. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, porém sem limitação, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[082] Conforme usado no presente documento, “tratamento” (e va- riações gramaticais do mesmo, tal como “tratar” ou “que trata”) refere- se à intervenção clínica numa tentativa de alterar o curso natural do in- divíduo que é tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, porém sem limitação, prevenir a ocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológi- cas diretas ou indiretas da doença, prevenir a metástase, diminuir a taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas modalidades, os an- ticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para desacelerar a progressão de uma doença.
[083] O termo "vetor", conforme usado no presente documento, re- fere-se a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para pro- pagar outro ácido nucleico ao qual o mesmo está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual o mesmo foi introduzido. Certos vetores têm capacidade para direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados operacional- mente. Tais vetores são denominados no presente documento como “vetor de expressão”. II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS
[084] São fornecidos anticorpos anti-CD112R, composições que compreendem os anticorpos descritos e métodos para seu uso. A. Anticorpos Anti-CD112R Exemplificativos
[085] A Tabela de Sequências abaixo fornece as sequências de certas modalidades dos anticorpos divulgados e reivindicados no pre- sente documento.
[086] Em certas modalidades, são fornecidos anticorpos que se li- gam a CD112R e/ou bloqueiam a ligação de CD112R a CD112 e/ou intensificam a ativação de células T e células NK. Em algumas modali- dades, são fornecidos anticorpos isolados que se ligam a CD112R. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos que bloqueiam a liga- ção de CD112R a CD112. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos que intensificam a ativação de CD226, células T e/ou células NK.
[087] A inibição da ligação entre CD112R e CD112, tal como em células T e NK, pode ser determinada medindo-se a inibição da ligação de células às quais CD112R se liga na presença e ausência do anti- corpo.
[088] São fornecidos no presente documento anticorpos que se li- gam especificamente a CD112R.
[089] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a CD112R hu- mano.
[090] Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a CD112R humano e bloqueiam a interação de CD112R humano a CD112 hu- mano. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a CD112R hu- mano, bloqueiam a interação de CD112R humano a CD112 humano, mas não bloqueiam a interação de CD112R de camundongo a CD112 de camundongo. Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam a CD112R humano, bloqueiam a interação de CD112R humano a CD112 humano, mas não bloqueiam a interação de CD112R de camun- dongo com CD112 de camundongo compreendem os anticorpos 32, 33, 34, 35 e 36.
[091] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma região variável de cadeia pesada ("VH") que compreende CDR1,
CDR2 e/ou CDR3 de VH de qualquer um dos anticorpos CD112R for- necidos no presente documento (isto é, clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36).
[092] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento e uma VL que compreende CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de qualquer um dos an- ticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas moda- lidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36 e uma VL que compreende CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, opcionalmente, em que as CDRs de VH e VL são do mesmo clone de anticorpo.
[093] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos que compreendem o seguinte: (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; ou (b) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 103; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106; ou (c) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 202; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 203; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 204; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206; ou (d) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 301; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 303; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 305; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306; ou (e) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 401; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 402; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 403; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 404; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 405; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 406; ou (f) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 501; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 502; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 503; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 504; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 505; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 506; ou (g) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 601; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 602; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 603; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 604; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 605; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 606; ou (h) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 701; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 702; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 703; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 704; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 705; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 706; ou (i) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 801; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 802; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 803; com ou sem (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 804; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 805; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 806; ou (j) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 901; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 902; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 903; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 904; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 905; e (f) LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 906; ou (k) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 1003; (d) LCDR1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006; ou (l) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 2003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2005; e (f) LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2006; ou (m) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 3003; (d) LCDR1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 3004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3006; ou (n) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4002; (c) HCDR3 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 4003; (d) LCDR1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 4004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4006.
[094] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 de VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que compre- ende CDR1, CDR2 e CDR3 de VL de qualquer um dos clones de anti- corpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36.
[095] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R pode com- preender: (a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 2 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 2; ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 5 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 5; ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 44 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 44; ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 58 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 58; ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 10 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 10; ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 38 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 38; ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1,
CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 15 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 15; ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 35 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 35; ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 47 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 47; ou (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 46 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 46; ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 32 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 32; ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 33 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 33; ou (m) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 34 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 34; ou (n) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do clone de anticorpo número 36 e uma VL que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do clone de anticorpo nú- mero 36.
[096] A Tabela de Sequências abaixo fornece as sequências de região variável da cadeia pesada e leve de certos anticorpos divulgados.
[097] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH de qual- quer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36.
[098] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R compreen- de a VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substi- tuições de aminoácidos fora das regiões determinantes de complemen- taridade (CDRs), tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas fora das CDRs. Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R com- preende a VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão fora das regiões determinantes de comple- mentaridade (CDRs).
[099] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R compreen- de a VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substi- tuições de aminoácidos nas regiões de framework da sequência de VH, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo CD112R compreende a VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão nas regiões de framework da sequência de VH.
[0100] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R compreen- de as CDRs de VH e VL de qualquer um dos anticorpos CD112R des- critos no presente documento, em que cada CDR compreende 0, 1, 2 ou 3 adições, substituições (por exemplo, substituições conservativas) ou deleções de aminoácidos.
[0101] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH que compreende as sequências de aminoácidos das CDRs de VH de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento e compreende uma VH que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à VH de qualquer um dos an- ticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas moda- lidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo me- nos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36. Em certas modalidades, a VH do anticorpo se difere desta das sequências de VH mostradas na Tabela de Sequências devido a 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos nas regiões de framework da sequência de VH, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas. Em certas modalidades, a VH do anticorpo se difere desta das sequên- cias de VH mostradas na Tabela de Sequências devido a 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão nas regiões de framework da sequência de VH.
[0102] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em cer- tas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que con- siste na sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou
36.
[0103] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL de qual- quer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compre- ende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL que compreende as sequências de aminoácidos das CDRs de VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento e compreende uma VL que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em cer- tas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que com- preende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da VL de qual- quer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36. Em certas modalidades, a VL do anticorpo se difere desta das sequências de VL mostradas na Tabela de Sequências devido a 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos nas regiões de framework da sequência de VL, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas. Em certas modalidades, a VL do anticorpo se difere desta das sequências de VL mostradas na Tabela de Sequências de- vido a 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão.
[0104] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que consiste na sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em cer- tas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VL que con- siste na sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou
36.
[0105] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH de qual- quer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento e compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos mesmos anticorpos CD112R fornecidos no pre- sente documento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R com- preende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, opcionalmente, em que a VH e a VL são do mesmo número de clone de anticorpo.
[0106] Em certas modalidades, a VH do anticorpo é esta de qual- quer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de ami- noácidos nas regiões de framework da sequência de VH, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas, e a VL é esta de qualquer um dos mesmos anticorpos da lista acima. Em certas modalidades, no en- tanto, a VH do anticorpo é esta de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36, mas com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições nas regiões de framework da sequência de
VH.
[0107] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH e uma VL que compreendem as sequências de aminoácidos da VH e VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36.
[0108] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH que compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs de VH de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento bem como uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL que compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs de VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no pre- sente documento e também compreende uma VH e uma VL que são, cada uma, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, a VH e a VL do anticorpo se diferem das sequências de VH e VL mostradas na Tabela de Se- quências devido a 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos nas re- giões de framework das sequências, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substitui- ções conservativas, ou tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de rever- são.
[0109] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH e uma VL consistindo na sequência de aminoácidos da VH e VL de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente do- cumento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma VH e uma VL que consistem, cada uma, nas sequências de ami- noácidos da VH e VL de qualquer um dos clones de anticorpo números 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 e 36.
[0110] Um anticorpo CD112R pode compreender:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 2 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 2; ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 5 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 5; ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 44 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 44; ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 58 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 58; ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 10 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 10; ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 38 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 38; ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 15 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 15; ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 35 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 35; ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 47 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 47; (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 46 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 46;
(k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 32 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 32; ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 33 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 33; ou (m) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 34 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 34; ou (n) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 36 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da VL do clone de anticorpo número 36; ou
[0111] Um anticorpo CD112R pode compreender: (a) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 2 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 2 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 2; ou (b) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 5 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 5 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 5; ou (c) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 44 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 44 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 44; ou (d) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 58 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 58 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 58; ou (e) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 10 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 10 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 10; ou (f) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 38 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 38 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 38; ou (g) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 15 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 15 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 15; ou (h) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 35 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 35 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 35; ou (i) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 47 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 47 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 47; ou (j) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 46 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 46 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 46; ou (k) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 32 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 32 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 32; ou
(l) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 33 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 33 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 33; ou (m) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 34 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 34 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 34; ou (n) uma VH que compreende as CDRs de VH da VH do clone de anti- corpo número 36 e uma VL que compreende as CDRs de VL do clone de anticorpo número 36 e as sequências de aminoácidos de VH e VL que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à VH e à VL do clone de anticorpo número 36.
[0112] Em algumas das modalidades acima, a VH e/ou a VL podem se diferir da sequência de cada uma das espécies pela presença de 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas. Em algumas modalidades, a VH pode com- preender 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão.
[0113] Um anticorpo CD112R pode compreender: (a) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 2 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 2; ou
(b) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 5 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 5; ou (c) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 44 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 44; ou (d) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 58 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 58; ou (e) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 10 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 10; ou (f) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 38 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 38; ou (g) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 15 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 15; ou (h) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 35 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 35; ou (i) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 47 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 47; ou (j) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 46 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 46; ou (k) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 32 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 32; ou
(l) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 33 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 33; ou (m) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 34 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 34; ou (n) uma VH que consiste na sequência de aminoácidos da VH do clone de anticorpo número 36 e uma VL que consiste na VL do clone de anti- corpo número 36.
[0114] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende qualquer uma das regiões variáveis e/ou CDRs de região variável 1 a 3 dos anticorpos descritos acima e em outra parte do presente docu- mento, tal como na Tabela de Sequências.
[0115] Em algumas modalidades, o anticorpo CD112R é um anti- corpo IgG, tal como o anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ou uma forma modificada do mesmo, conforme descrito na seção abaixo. Em algumas modalidades, a região constante tem função efetora e, em algumas mo- dalidades, a região constante não é efetora.
[0116] Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma cadeia pesada (HC) que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos CD112R fornecidos no presente documento. Em certas modalidades, um anticorpo CD112R compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de ami- noácidos da cadeia pesada de qualquer um dos clones de anticorpo nú- meros 2, 5, 44, 58, 10, 38, 15, 35, 46, 47, 32, 33, 34 ou 36.
[0117] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R pode com- preender: (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 2 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 2; ou (b) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 5 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 5; ou (c) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 44 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 44; ou (d) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 58 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 58; ou (e) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 10 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 10; ou (f) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 38 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 38; ou (g) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 15 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 15; ou (h) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 35 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 35; ou (i) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 47 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 47; ou (j) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 46 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 46; ou (k) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 32 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 32; ou (l) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 33 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 33; ou (m) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 34 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 34; ou (n) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do clone de anticorpo número 36 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo número 36.
[0118] Um anticorpo CD112R pode compreender: (a) uma cadeia pesada (HC) que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anticorpo número 2 e uma cadeia leve (LC) que compre- ende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 2 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos
99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 2, respectiva- mente; ou (b) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 5 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 5 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 5, respectivamente; ou (c) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 44 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 44 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 44, respectivamente; ou (d) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 58 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 58 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 58, respectivamente; ou (e) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 10 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 10 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 10, respectivamente; ou
(f) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 38 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 38 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 38, respectivamente; ou (g) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 15 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 15 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 15, respectivamente; ou (h) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 35 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 35 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 35, respectivamente; ou (i) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 47 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 47 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 47, respectivamente; ou (j) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 46 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de
LC do clone de anticorpo número 46 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 46, respectivamente; ou (k) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 32 e uma LC que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 32 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 32, respectivamente; ou (l) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 33 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 33 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 33, respectivamente; ou (m) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 34 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 34 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 34, respectivamente; ou (n) uma HC que compreende as CDRs de HC da HC do clone de anti- corpo número 36 e uma cadeia leve (LC) que compreende as CDRs de LC do clone de anticorpo número 36 e as sequências de aminoácidos de HC e LC que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos
92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à HC e à LC do clone de anticorpo número 36, respectivamente.
[0119] Em algumas das modalidades acima, a HC e/ou a LC podem se diferir da sequência de cada uma das espécies pela presença de 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições conservativas. Em algumas das modalidades acima, a HC e/ou a LC podem se diferir da sequência de cada uma das espécies pela presença de 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de reversão.
1. Classe Exemplificativa de Anticorpos com Características Estru- turais e Funcionais Compartilhadas
[0120] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos anti- CD112R. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD112 comparti- lham certas características estruturais e/ou funcionais. Em algumas mo- dalidades, a classe de anticorpos inclui um anticorpo progenitor e vari- antes com maturidade de afinidade do mesmo. Uma classe exemplifica- tiva de anticorpos inclui, porém sem limitação, o clone progenitor 32 e variantes com maturidade de afinidade do mesmo. Em algumas moda- lidades, as variantes com maturidade de afinidade compreendem os an- ticorpos 33, 34, 35 e 36. Em algumas modalidades, as variantes com maturidade de afinidade compreendem anticorpos com substituições conservativas em comparação com os anticorpos 32, 33, 34, 35 e 36. a. Características Estruturais da Classe Exemplificativa de Anticor- pos
[0121] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R com- partilham características estruturais, tais como, por exemplo, aquelas mostradas nas Figuras 14 e 15. Quando uma "classe" ou "membros de uma classe" de anticorpos são descritos no presente documento, deve ser entendido que modalidades que descrevem um único anticorpo anti-
CD112R ou múltiplos anticorpos anti-CD112R são abrangidas/contem- pladas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R compre- endem HCDR3s idênticas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R compreendem LCDR1s idênticas. Em algumas modalida- des, os anticorpos anti-CD112R compreendem LCDR2s idênticas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD112R compreendem LCDR3s idênticas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- CD112R compreendem HCDR3s idênticas e LCDR1s, LCDR2s e/ou LCDR3s idênticas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- CD112R compreendem HCDR3 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 1003, e/ou LCDR1 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004, e/ou LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005, e/ou LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006.
[0122] Em algumas modalidades, cada membro da classe de anti- corpos compreende regiões de framework de cadeia pesada que com- preendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1007, 1008, 1009 e 1010. Em algumas modalidades, cada membro da classe de an- ticorpos compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92% ou pelo menos 93% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012, em que toda e qualquer variação de sequência em relação à SEQ ID NO: 1012 está em HCDR1 e/ou HCDR2. Em algumas moda- lidades, cada membro da classe de anticorpos compreende regiões de framework de cadeia leve que compreendem as sequências de amino- ácidos das SEQ ID NOs: 1013, 1014, 1015 e 1016. Em algumas moda- lidades, cada membro da classe de anticorpos compreende a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1018.
[0123] Os membros desta classe exemplificativa de anticorpos po- dem compreender alguma variação nas sequências de aminoácidos de
HCDR1 e HCDR2. Em algumas modalidades, cada membro da classe de anticorpos compreende HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001 com 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos para as posições 4, 5 e/ou 6 da SEQ ID NO: 1001. Em algumas modalidades, a classe de anticorpos compreende HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001 com 1, 2 ou 3 alterações de ami- noácidos para as posições que variam entre os aminoácidos da SEQ ID NO: 1001, 2001, 3001, 4001 e 701 conforme mostrado na Figura 14. Em algumas modalidades, uma ou mais das 1, 2 ou 3 alterações de amino- ácidos não são substituições conservativas. Em algumas modalidades, uma ou mais das 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos são substituições conservativas. Em certas modalidades, um membro da classe de anti- corpos compreende HCDR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 2001, 3001, 701 ou 4001.
[0124] Em algumas modalidades, cada membro da classe de anti- corpos compreende HCDR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 1002 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002 com 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácidos para as posi- ções 1, 3, 5, 6 e/ou 8 da SEQ ID NO: 1002. Em algumas modalidades, a classe de anticorpos compreende HCDR2 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1002 com 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácidos para as posições que variam entre os aminoácidos da SEQ ID NO: 1002, 2002, 3002, 4002 e 702 conforme mostrado na Fi- gura 14. Em algumas modalidades, uma ou mais das 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácidos não são substituições conservativas. Em al- gumas modalidades, uma ou mais das 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de ami- noácidos são substituições conservativas. Em certas modalidades, um membro da classe de anticorpos compreende HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2002, 3002, 702 ou 4002.
[0125] Em algumas modalidades, cada membro da classe de anti- corpos compreende regiões de framework de cadeia pesada e de ca- deia leve idênticas. b. Características Funcionais da Classe Exemplificativa de Anticor- pos
[0126] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos anti- CD112R, em que os anticorpos compartilham um efeito técnico especial de ligação a CD112R humano, bloqueando a interação de CD112R hu- mano com CD112 e falhando em bloquear a interação de CD112R de camundongo com CD112. Em algumas modalidades, cada membro de uma classe de anticorpos se liga ao CD112R humano e bloqueia a inte- ração de ligação entre o CD112 humano e o CD112R humano. Em al- gumas modalidades, cada membro da classe de anticorpos não blo- queia a interação de ligação entre CD112 de camundongo e CD112R de camundongo. Embora os membros da classe de anticorpos não blo- queiem a interação entre CD112 de camundongo e CD112R de camun- dongo, os membros da classe de anticorpos inibem parcialmente a in- teração de ligação entre CD112 de camundongo e CD112R de camun- dongo ou não inibem a interação de ligação entre CD112 de camun- dongo e CD112R de camundongo. Em algumas tais modalidades, ne- nhum membro da classe de anticorpos inibe a interação entre CD112R de camundongo e CD112 de camundongo em mais de 50%. Em algu- mas modalidades, cada membro da classe de anticorpos exibe pelo me- nos alguma ligação a CD112R de camundongo solúvel. Em algumas modalidades, o anticorpo é completamente humano ou humanizado. Em algumas modalidades, cada membro da classe de anticorpos se liga ao mesmo epítopo em CD112R humano.
2. FRAGMENTOS DE ANTICORPO
[0127] Em determinadas modalidades, um anticorpo fornecido no presente documento é um fragmento de anticorpo. Os exemplos de fra- gmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma análise de certos fragmentos de anticorpo, consultar Hudson et al Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma análise dos fragmentos scFv, consultar, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Mo- noclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer- Verlag, Nova York), páginas 269-315 (1994); consultar também o docu- mento nº WO 93/16185; e as Patentes nº U.S. 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab')2 que compreendem resí- duos de epítopo de ligação a receptor de salvamento e que têm meia- vida in vivo aumentada, consultar a Patente nº U.S. 5.869.046.
[0128] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação a antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consul- tar, por exemplo, o documento nº EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[0129] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo humano de domínio único (Domantis, Inc., Waltham, MA; consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 6.248.516 B1).
[0130] Os fragmentos de anticorpos podem ser feitos através de vá- rias técnicas, incluindo, porém sem limitação, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras re- combinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no pre- sente documento.
3. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[0131] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido no presente documento é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferen- tes. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para CD112R e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas modalida- des, uma das especificidades de ligação é para CD112R e a outra é selecionada independentemente de um (no caso de biespecífico) ou mais (no caso de multiespecífico) dentre PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3, TIM-3, TIGIT, CD96, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, CD155, STING, CD47, CD39 e IL-27. Em determinadas modalidades, os anticorpos bi- específicos podem se ligar a dois epítopos diferentes de CD112R. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agen- tes citotóxicos a células que expressam CD112R. Os anticorpos bies- pecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento com- pleto ou fragmentos de anticorpo.
[0132] As técnicas para a produção de anticorpos multiespecíficos incluem, porém sem limitação, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada da imunoglobulina que têm diferentes es- pecificidades (consultar Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), engenha- ria “knob-in-hole” (consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos modifi- cando-se os efeitos de direcionamento eletrostático para produzir molé- culas heterodiméricas de anticorpo Fc (WO 2009/089004A1); reticu- lando-se dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consultar, por exem- plo, a Patente nº U.S. 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); usando-se zíperes de leucina para produzir anticorpos biespe- cíficos (consultar, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol.148(5):1547-
1553 (1992)); usando-se tecnologia de “diacorpo” para produzir frag- mentos de anticorpos biespecíficos (consultar, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e usando-se dí- meros Fv de cadeia única (sFv) (consultar, por exemplo Gruber et al., J. Immunol.152:5368 (1994)); e preparando-se anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0133] Os anticorpos geneticamente modificados com três ou mais sítios de ligação a antígeno funcionais, incluindo “Anticorpos octupus”, são também incluídos no presente documento (consultar, por exemplo, o documento nº US 2006/0025576A1).
[0134] O anticorpo ou fragmento no presente documento também inclui um "Fanticorpo de Dupla Ação" ou "DAF" que compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a CD112R, bem como outro antí- geno diferente (consultar o documento nº US 2008/0069820, por exem- plo).
4. VARIANTES DE ANTICORPO
[0135] Em certas modalidades, são contempladas variantes de se- quência de aminoácidos dos anticorpos fornecidos no presente docu- mento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de se- quência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas intro- duzindo-se modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combi- nação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características de- sejadas, por exemplo, ligação a antígeno.
5. VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO
[0136] Em certas modalidades, variantes de anticorpo que têm uma ou mais substituições de aminoácidos são fornecidas.
Os sítios de inte- resse para mutagênese substitucional incluem as HVRs e as FRs.
As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 como "substitui- ções exemplificativas". As substituições de aminoácidos podem ser in- troduzidas num anticorpo de interesse, e os produtos triados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação a antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhorados.
TABELA 1 Original Resíduo Exemplificativas Substituições Conservativas Substituições
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades de cadeia lateral comuns:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0137] As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma dentre estas classes por outra classe.
[0138] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alte- rações podem ser realizadas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (consultar, por exemplo, Cho- wdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que co- locam o antígeno em contato com a variante resultante VH ou VL que é testada quanto à afinidade de ligação. A maturação da afinidade através da construção e nova seleção a partir de bibliotecas secundárias foi des- crita, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Bi- ology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em algumas modalidades de maturação da afinidade, diversidade é in- troduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um dentre uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada por oligo- nucleotídeo). Uma biblioteca secundária é, então, criada. A biblioteca é, então, triada para identificar quaisquer variantes de anticorpo com a afi- nidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas por HVR, em que diversos resíduos de HVR (por exemplo4 a 6 resíduos de uma vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação a antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese ou modelagem de var- redura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3, em particular, são frequente- mente alvejadas.
[0139] Em certas modalidades, substituições, inserções ou dele- ções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas, conforme fornecido no presente documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora de resíduos de contato com antígeno nas HVRs. Em certas moda- lidades das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém no máximo uma, duas ou três substituições de aminoácido.
[0140] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser alvejados para mutagênese é chamado “mutagênese por varredura de alanina”, conforme descrito por Cunnin- gham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Neste método, um resí- duo ou grupo de resíduos-alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antí- geno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nas locali- zações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às subs- tituições iniciais. Alternativa ou ainda, uma estrutura de cristal de um complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato en- tre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizi- nhos podem ser alvejados ou eliminados como candidatos para substi- tuição. As variantes podem ser triadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.
[0141] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxil-terminais na faixa de comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intrassequência de resíduos de aminoácido únicos ou múlti- plos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molé- cula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
6. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0142] Em determinadas modalidades, um anticorpo fornecido no presente documento é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicolisado. A adição ou a deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo podem ser convenientemente realizadas al- terando-se a sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos.
[0143] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o carboi- drato ligado ao mesmo pode ser alterado. Os anticorpos produzidos por células de mamífero tipicamente compreendem um oligossacarídeo bi- antenário ramificado que está, de modo geral, ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consultar, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), ga- lactose e ácido siálico, assim como uma fucose fixada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas mo- dalidades, as modificações do oligossacarídeo num anticorpo da inven- ção podem ser realizadas a fim de criar variantes de anticorpo com cer- tas propriedades aprimoradas.
[0144] Em algumas modalidades, são fornecidas variantes do anti- corpo que têm uma estrutura de carboidrato que carece de fucose ligada
(direta ou indiretamente) a uma região Fc.
Por exemplo, a quantidade de fucose em tal anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada calcu- lando-se a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento nº WO 2008/077546, por exemplo.
Asn297 refere-se ao resíduo asparagina localizado em cerca da posição 297 na região Fc (numeração de EU de resíduos da região Fc); entre- tanto, Asn297 pode também estar localizado cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido às variações de sequência menores em anticorpos.
Tais variantes de fucosilação podem ter função de ADCC aprimorada.
Con- sultar, por exemplo, as Publicações de Patente nº US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exem- plos de publicações relacionadas a variantes de anticorpos “desfucosi- ladas” ou “com deficiência de fucose” incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005 / 053742; WO2002 / 031140; Okazaki et al.
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Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.
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Bioeng. 87: 614 (2004). Os exemplos de linhagens celulares com a capacidade para produzir anticorpos desfu- cosilados incluem células CHO Lec13 com deficiência de fucosilação de proteína (Ripka et al.
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Biophys. 249: 533-545 (1986); Pe- dido de Patente nº US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares com knockout, tais como o gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8,
células CHO com knockout (consultar, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al.Biotechnol. Bioeng Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e o documento nº WO2003/085107).
[0145] São, ainda, fornecidas variantes de anticorpo com oligossa- carídeos bisseccionados, por exemplo, em que um oligossacarídeo bi- antenário ligado à região Fc do anticorpo é bisseccionado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aprimorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, no documento nº WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente nº US 6.602.684 (Umana et al.); e documento nº US 2005/0123546 (Umana et al.). São também fornecidas variantes de an- ticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, nos documentos nº WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
7. VARIANTES DE REGIÃO FC
[0146] Em determinadas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácido podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente documento, gerando, assim, uma variante de re- gião Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) numa ou mais posições de aminoácidos.
[0147] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, porém, não todas as funções efetoras, o que torna a mesma um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC.
Por exemplo, ensaios de ligação de receptor Fc (FcR) po- dem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não tenha ligação de FcR (portanto, provavelmente não tem atividade de ADCC), mas retém a capacidade de ligação de FcRn.
As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcRIII apenas, enquanto os monócitos expressam FcRI, FcRII e FcRIII.
A expressão de FcR em células he- matopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Ki- net, Annu.
Rev.
Immunol. 9:457-492 (1991). Os exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente nº U.S. 5.500.362 (consultar, por exemplo, Hellstrom, I. et al.
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Med. 166:1351-1361 (1987). Alternativamente, métodos de ensaios não radi- oativos podem ser usados (consultar, por exemplo, o ensaio de citotoxi- cidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc.
Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo Cyto- Tox 96® (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais en- saios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativa ou ainda, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exem- plo, num modelo animal, tal como este divulgado em Clynes et al.
Proc.
Nat’l Acad.
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USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação a C1q po- dem ser também executados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade de CDC.
Consultar, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos nº WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação de comple- mento, um ensaio de CDC pode ser realizado (consultar, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J.
Immunol.
Métodos 202:163 (1996); Cragg,
M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004). As determinações de ligação a FcRn e eliminação/meia-vida in vivo podem ser também realizadas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Petkova, SB et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
[0148] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais resíduos de região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patentes nº U.S. 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais dentre as po- sições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o assim cha- mado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 em alanina (Patentes no US 7.332.581).
[0149] Certas variantes de anticorpo com ligação aprimorada ou di- minuída a FcRs são descritas. (Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 6.737.056; WO 2004/056312 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
[0150] Em determinadas modalidades, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoá- cidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de EU dos resíduos).
[0151] Em algumas modalidades, alterações são feitas na região Fc que resultam em ligação de C1q alterada (isto é, ou melhorada ou dimi- nuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente nº US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0152] Os anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação apri- morada ao receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos no documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aqueles anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nos mes- mos que aprimoram a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições num ou mais dos resíduos de região Fc: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo de região Fc 434 (por exemplo, Patente nº US
7.371.826).
[0153] Consultar também Duncan e Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente nº U.S. 5.648.260; Patente nº U.S. 5.624.821; e docu- mento nº WO 94/29351 em relação a outros exemplos de variantes de região Fc.
[0154] Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido de acordo com a Tabela de Sequências, em que o isotipo é IgG1 humana. Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido de acordo com a Tabela de Sequências, em que o isotipo é IgG4 humana. Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido de acordo com a Tabela de Se- quências, em que o isotipo é IgG4 humana, em que há uma única mu- tação na serina 228 para prolina (S228P).
8. Variantes de anticorpo geneticamente modificado com cisteína
[0155] Em certas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, “thioMantibodies”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cis- teína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Substituindo-se estes resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são, assim, posicionados em sítios acessí- veis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras porções químicas, tais como porções químicas de fármaco ou porções químicas de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adiante no presente documento. Em certas modalidades, qual- quer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração de EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração de EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos geneticamente modificados com cisteína po- dem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente nº U.S.
7.521.541.
9. DERIVADOS DE ANTICORPO
[0156] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido no presente documento pode ser ainda modificado para conter porções químicas não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e estão pronta- mente disponíveis. As porções químicas adequadas para derivação do anticorpo incluem, porém sem limitação, polímeros solúveis em água. Os exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, porém sem limitação, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno gli- col/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copo- límeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipro- pileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), ál- cool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietile- noglicol pode ter vantagens na fabricação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ra- mificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero for fixado, podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou o tipo de polímeros usa- dos para derivação podem ser determinados com base em considera- ções, incluindo, porém sem limitação, as propriedades ou funções par- ticulares do anticorpo a serem aprimoradas, seja o derivado de anti- corpo usado numa terapia sob condições definidas, etc.
[0157] Em outra modalidade, são fornecidos conjugados de um an- ticorpo e porção química não proteica que podem ser seletivamente aquecidos pela exposição à radiação. Em algumas modalidades, a por- ção química não proteica é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, porém sem limitação, compri- mentos de onda que não prejudicam células normais, mas que aquecem a porção química não proteica a uma temperatura na qual as células próximas à porção química não proteica do anticorpo são exterminadas. B. MÉTODOS RECOMBINANTES
[0158] Anticorpos podem ser produzidos usando métodos e compo- sições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na Patente nº U.S. 4.816.567. Em algumas modalidades, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-CD112R descrito no presente do- cumento. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoá- cidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pe- sadas do anticorpo). Numa modalidade adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem estes ácidos nucleicos são fornecidos. Numa modalidade adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende tal ácido nucleico. Em tal modali- dade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transfor- mada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codi- fica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em al- gumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo,
uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um anticorpo anti-CD112R, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condi- ções adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, recu- perar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[0159] Para a produção recombinante de um anticorpo anti- CD112R, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, con- forme descrito acima, é isolado e inserido num ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicionais numa célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedi- mentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotí- deos que têm a capacidade para se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[0160] As células hospedeiras para a clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos incluem células procarióticas ou eu- carióticas descritas no presente documento. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consultar, por exemplo, as Patentes nº U.S. 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Con- sultar também Charlton, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular bacteriana numa fração solúvel e pode ser ainda purificado.
[0161] Ainda a procariontes, micróbios eucariontes, tais como fun-
gos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou ex- pressão adequados para os vetores codificantes de anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas trajetórias de glicosilação foram "hu- manizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Consultar Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
[0162] As células hospedeiras adequadas para a expressão do an- ticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados in- cluem células vegetais e de insetos. Inúmeras cepas de baculovírus fo- ram identificadas que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[0163] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Consultar, por exemplo, as Patentes nº US
5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descre- vem a tecnologia PLANTIBODIESTM para produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[0164] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exem- plos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a li- nhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linha- gem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano
(HELA); células renais caninas (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens de células de mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linha- gens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpos, consultar, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Mole- cular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003). C. IMUNOCONJUGADOS
[0165] A invenção também fornece imunoconjugados que compre- endem um anticorpo anti-CD112R conjugado no presente documento a um ou mais outros agentes terapêuticos ou isótopos radioativos.
[0166] Em outra modalidade, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente documento conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isó- topos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188SM153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, o mesmo pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou uma identificação de rotação para imaginologia por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imaginologia por ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, car- bono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0167] Os conjugados de um anticorpo podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifun- cional, tal como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ci- clo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis- azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (tal como bis-(p-diazonombenzoil)-etilenodiamina), di-isociana- tos (tal como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ati- vos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imu- notoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta-acético identificado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consultar o documento nº WO94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácido, ligante sensível a pep- tidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); Patente nº US 5.208.020) pode ser usado.
[0168] Os imunoconjugados ou ADCs no presente documento con- templam expressamente, porém sem limitação, tais conjugados prepa- rados com reagentes reticuladores, incluindo, porém sem limitação, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA). D. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0169] Formulações ou composições farmacêuticas de um anti- corpo anti-CD112R conforme descrito no presente documento são pre- paradas misturando-se tal anticorpo que tem o desejado grau de pureza com um ou mais carreadores, diluentes e/ou excipientes farmaceutica- mente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A.
Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
Os carreadores, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são, de modo geral, não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações usadas e incluem, porém sem limitação: água estéril, tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxi- dantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; clo- reto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíli- cos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, gluta- mina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissa- carídeos e outros carboidratos incluindo glicose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trea- lose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo , complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Os carreadores farma- ceuticamente aceitáveis exemplificativos no presente documento in- cluem, ainda, agentes de dispersão de fármaco intersticial, tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.).Certas sHASEGPs exemplificativas e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patente nº US 2005/0260186 e 2006/0104968.Num aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[0170] As formulações de anticorpo liofilizadas exemplificativas são descritas na Patente nº US 6.267.958. As formulações aquosas de an- ticorpos incluem aquelas descritas na Patente nº US 6.171.586 eWO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de his- tidina-acetato.
[0171] A formulação ou composição no presente documento pode também conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência, aquelas com atividades complementares que não afetam adversamente uma à outra. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combina- ção em quantidades que são eficazes para o propósito destinado.
[0172] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcáp- sulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por po- limerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelu- lose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectiva- mente, em sistemas de entrega de medicamento coloidais (por exem- plo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartí- culas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divul- gadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0173] Preparações de liberação prolongada podem ser prepara- das. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contém o anticorpo, sendo que tais matrizes estão na forma de ar- tigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[0174] As formulações ou composições a serem usadas para admi-
nistração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facil- mente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. E. MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[0175] Qualquer um dos anticorpos anti-CD112R fornecidos no pre- sente documento podem ser usados em métodos terapêuticos. Ao longo do documento, quando um "anticorpo" é discutido, também deve ser en- tendido que uma composição que compreende o anticorpo também é abrangida.
[0176] Num aspecto, um anticorpo anti-CD112R para uso como um medicamento é fornecido. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-CD112R para uso na intensificação, aumento e/ou sus- tentação de uma resposta imune antitumoral num indivíduo que tem um tumor. Em algumas modalidades, o tumor é canceroso. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-CD112R para uso no trata- mento de câncer. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD112R para uso na intensificação das interações de CD226 com CD112 é for- necido.
[0177] Num aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um an- ticorpo anti-CD112R na manufatura ou preparação de um medicamento. Em algumas modalidades, o medicamento é para uso na intensificação, aumento e/ou sustentação de uma resposta imune antitumoral num in- divíduo que tem um tumor. Em algumas modalidades, o tumor é cance- roso. Em algumas modalidades, o medicamento é para tratamento de câncer. Em algumas modalidades, o medicamento é para intensificar as interações de CD226 com CD112.
[0178] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para o tra- tamento de doenças e/ou distúrbios em que o bloqueio de CD112R é desejado. Em algumas modalidades, métodos para intensificar, aumen- tar e/ou sustentar uma resposta imune antitumoral num indivíduo que tem um tumor são fornecidos que compreendem administrar um anti- corpo anti-CD112R conforme descrito no presente documento. Em al- gumas modalidades, o tumor é canceroso. Em algumas modalidades, métodos para tratar câncer num indivíduo que tem câncer são forneci- dos que compreendem administrar um anticorpo anti-CD112R conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, métodos para intensificar as interações de CD226 com CD112 num indivíduo, opcionalmente com câncer, são fornecidos que compreendem adminis- trar um anticorpo anti-CD112R conforme descrito no presente docu- mento.
[0179] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para ali- viar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio associado à pro- teína CD112R; ou um anticorpo anti-CD112R ou um medicamento que compreende o anticorpo anti-CD112R para aliviar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio associado à proteína CD112R (tal como qualquer uma das doenças ou distúrbios descritos no presente docu- mento, por exemplo, câncer). Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para reduzir o número de sintomas ou a gravidade de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio associado à proteína CD112R; ou um anticorpo anti-CD112R ou um medicamento que com- preende o anticorpo anti-CD112R para reduzir o número de sintomas ou a gravidade de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio associado à proteína CD112R (tal como qualquer uma das doenças ou distúrbios descritos no presente documento, por exemplo, câncer). Numa modalidade particular, o sintoma de uma doença ou distúrbio as- sociado à proteína CD112R é um tumor, e uma redução é uma redução no tamanho de um tumor, a falha do tumor em crescer ou a eliminação do tumor.
[0180] Os anticorpos descritos no presente documento podem ser usados, por exemplo, para o tratamento de câncer. Em algumas moda- lidades, métodos para tratar câncer são fornecidos que compreendem administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo descrito no presente documento a um indivíduo. Em algumas modalidades, os anticorpos po- dem ativar ou intensificar uma resposta imune no indivíduo, tal como uma resposta imune específica para antígeno. Em algumas modalida- des, os anticorpos podem estimular a atividade de células T. Em algu- mas modalidades, os anticorpos podem inibir o crescimento de pelo me- nos um tumor no indivíduo.
[0181] São fornecidos no presente documento métodos para tratar um indivíduo que tem câncer que compreendem administrar ao indiví- duo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo CD112R descrito no presente documento, de modo que o indivíduo seja tratado. Um anticorpo CD112R pode ser usado sozinho. Alternativamente, um anticorpo CD112R pode ser usado em conjunto com outro agente, con- forme descrito mais abaixo.
[0182] Os cânceres podem ser cânceres com tumores sólidos ou malignidades do sangue (por exemplo, tumores líquidos).
[0183] Os exemplos não limitantes de cânceres para tratamento in- cluem carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pul- mão de células não pequenas escamosas (NSCLC), NSCLC não esca- moso, glioma, câncer gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carci- noma de células claras), câncer de ovário, câncer de fígado, câncer co- lorretal, câncer de endométrio, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarci- noma de próstata refratário a hormônios), câncer de tireoide, neuroblas- toma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cân- cer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer de cabeça e pescoço (ou carci- noma), câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediá- trico, assassino natural nasossinusal, melanoma (por exemplo, mela- noma maligno metastático, tal como melanoma maligno cutâneo ou in- traocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da re- gião anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de Falópio, carci- noma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma primá- rio do SNC, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, câncer cere- bral, glioma do tronco cerebral, adenoma hipofisário, sarcoma de Ka- posi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de cé- lulas T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzidos por amianto, cânceres relacionados a vírus ou cânceres de origem viral (por exemplo, vírus do papiloma humano (tumores relacionados ou ori- ginados de HPV)) e malignidades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de células sanguíneas, isto é, a li- nhagem de células mieloides (que produz granulócitos, eritrócitos, trom- bócitos, macrófagos e mastócitos) ou linhagem de células linfoides (que produz células B, T, NK e plasmáticas), tal como todos os tipos de leu- cemias, linfomas e mielomas, por exemplo, leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielógenas, tais como leucemia aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia mi- eloide crônica (CML), AML indiferenciada (MO), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 ou de variante M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica
(M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico isolado e cloroma; linfomas, tais como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), malignidade hematológica de células B, por exemplo, linfomas de células B, linfomas de células T, infoma linfoplasmocitoide, linfoma monocitoide de células B, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de células grandes ana- plásico (por exemplo, Ki 1+), linfoma/leucemia de células T adulto, lin- foma de células do manto, linfoma de células T angioimunoblástico, lin- foma angiocêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma linfoblástico T precursor, linfoblástico T; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocí- tico verdadeiro, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma pri- mário de efusão, linfoma de células B, linfoma linfoblástico (LBL), tumo- res hematopoiéticos de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de células grande, linfoma linfoblástico precursor B, linfoma de células T cutâneo (CTLC) (também chamado de micose fungoide ou síndrome de Sezary) e linfoma linfoplasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldens- trom; mielomas, tais como mieloma de IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado de mieloma indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múltiplos, leucemia linfo- cítica crônica (LLC), linfoma de células pilosas; tumores hematopoiéti- cos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiosscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tu- mores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossar- coma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de li- nhagem linfoide, por exemplo, tumores de células T e células B, inclu- indo, porém sem limitação, distúrbios de células T, tais como leucemia prolinfocítica T (T-PLL), incluindo do tipo célula pequena e célula cere- briforme; leucemia de linfócitos granulares grandes (LGL) do tipo célula T; linfoma hepatoesplênico a/d T-NHL; linfoma de células T perifé- rico/pós-tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma angio- cêntrico (nasal) de células T; câncer de cabeça ou pescoço, câncer re- nal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quaisquer combinações dos referidos cânceres. Os métodos descritos no presente documento também podem ser usados para o tra- tamento de cânceres metastáticos, cânceres refratários não ressecá- veis (por exemplo, cânceres refratários à imunoterapia anterior, por exemplo, com um anticorpo bloqueador CTLA-4 ou PD-1) e/ou cânceres recorrentes.
[0184] Em certas modalidades, um anticorpo descrito no presente documento é administrado a indivíduos que têm um câncer que exibiu uma resposta inadequada a, ou progrediu em, um tratamento anterior, por exemplo, um tratamento anterior com uma imuno-oncologia ou fár- maco de imunoterapia. Em algumas modalidades, o câncer é refratário ou resistente a um tratamento anterior, intrinsecamente refratário ou re- sistente (por exemplo, refratário a um antagonista de trajetória de PD- 1), ou uma resistência ou estado refratário é adquirido. Por exemplo, um anticorpo descrito no presente documento pode ser administrado a indi- víduos que não respondem ou não respondem suficientemente a uma primeira terapia ou que têm progressão da doença após o tratamento, por exemplo, tratamento com antagonista de trajetória anti-PD-1, sozi- nho ou em combinação com outra terapia (por exemplo, com uma tera- pia de antagonista de trajetória anti-PD-1). Em outras modalidades, um anticorpo descrito no presente documento é administrado a indivíduos que não receberam anteriormente (isto é, foram tratados com) um agente imuno-oncológico, por exemplo, um antagonista de trajetória de PD-1. F. COMBINAÇÕES
[0185] Os anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes numa terapia. Por exemplo, um an- ticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional (por exemplo que compreende ainda a ad- ministração de uma segunda terapia).
[0186] Em algumas modalidades, o alvejamento de uma trajetória inibitória independente adicional ou combinações da mesma tem o po- tencial de levar a uma ativação de células imunes ainda mais intensifi- cada além da monoterapia.
[0187] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional ou segundo agente é um agente quimioterápico, um agente opsonizante, um agente de depleção de células T reguladoras ("Treg"), um antago- nista de um alvo diferente de CD112R ou um agonista de um alvo dife- rente de CD112R. Em certas modalidades, o segundo agente é um agente quimioterápico descrito no presente documento ou qualquer agente quimioterápico conhecido. Em algumas modalidades, o segundo agente é um agente opsonizante, em que o agente opsonizante é um anticorpo diferente de um anticorpo anti-CD112R que tem como alvo as células de tumor ou câncer. Em algumas modalidades, o segundo agente é um agente de depleção de Treg descrito no presente docu- mento ou qualquer agente de depleção de Treg conhecido. Em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista de um alvo diferente de CD112R. Em algumas modalidades, o segundo agente é um ago- nista de um alvo diferente de CD112R.
[0188] Em alguns casos, o segundo agente tem como alvo uma tra-
jetória inibitória independente, tal como, por exemplo, uma trajetória en- volvendo PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 ou TIM-3. Em algumas modali- dades, o segundo agente antagoniza um ou mais dentre PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 e TIM-3. Os antagonistas adequados para uso na terapia de combinação descrita no presente documento incluem, sem limitação, ligantes, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e anticorpos biespecíficos) e agentes multivalentes. Numa modalidade, o antago- nista é uma proteína de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão Fc, tal como AMP-244. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1.
[0189] Um anticorpo anti-PD-1 exemplificativo é nivolumab (BMS- 936558) ou um anticorpo que compreende as CDRs ou regiões variá- veis de um dos anticorpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 e 4A11 des- critos no documento nº WO 2006/121168. Em certas modalidades, um anticorpo anti-PD-l é MK-3475 (Lambrolizumab) descrito no documento nº WO2012/145493; AMP-514 descrito no documento nº WO 2012/145493; ou PDR001. Anticorpos de PD-1 conhecidos adicionais e outros inibidores de PD-1 incluem aqueles descritos nos documentos nº WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, Patentes nº U.S.
7.635.757 e 8.217.149 e Publicação de Patente nº U.S. 2009/0317368. Qualquer um dos anticorpos anti-PD-1 divulgados no documento nº WO2013/173223 também pode ser usado. Um anticorpo anti-PD-1 que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em PD-1, como um destes anticorpos também pode ser usado em tratamentos de com- binação.
[0190] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 útil para a terapia de combinação é BMS-936559 (denominado 12A4 no docu- mento nº WO 2007/005874 e Patente nº US 7.943.743) ou um anticorpo que compreende as CDRs ou regiões variáveis de 3G10, 12A4, 10A5,
5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4, que são descritos na Pu- blicação PCT WO 07/005874 e Patente nº US 7.943.743. Em certa mo- dalidade, um anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (também conhecido como durvalumab e Anti-B7-H1), MPDL3280A (também conhecido como atezolizumab e RG7446), MSB0010718C (também conhecido como avelumab; WO2013/79174) ou rHigM12B7. Qualquer um dos an- ticorpos anti-PD-L1 divulgados nos documentos nº WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/ 145493, nas Patentes nº U.S. 7.635.757 e
8.217.149 e na Publicação nº U.S. 2009/145493 pode também ser usado. Os anticorpos anti-PD-L1 que competem com e/ou se ligam ao mesmo epítopo de qualquer um destes anticorpos também pode ser usados em tratamentos de combinação.
[0191] Em certas modalidades, o anticorpo CD112R da divulgação pode ser usado com um antagonista CTLA-4, por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4. Numa modalidade, um anticorpo anti-CTLA-4 é um anti- corpo selecionado a partir do grupo de: Yervoy® (ipilimumab ou anti- corpo 10D1, descrito na Publicação PCT WO 01/14424), tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675,206), anticorpo monoclonal ou anti- CTLA-4 descrito em qualquer uma das seguintes publicações: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente nº U.S. 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): antibodiestract No. 2505 (anticorpo CP-675206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58: 5301-5304. Qual- quer um dos anticorpos anti-CTLA-4 divulgados no documento nº WO2013/173223 também pode ser usado.
[0192] Em algumas modalidades, um anticorpo CD112R da divul- gação é usado em combinação com um antagonista de LAG-3 (também denominado no presente documento e por outros como LAG3). Os exemplos de anticorpos anti-LAG3 incluem anticorpos que compreen- dem as CDRs ou regiões variáveis dos anticorpos 25F7, 26H10, 25E3,
8B7, 11F2 ou 17E5, que são descritos na Publicação de Patente nº US2011/0150892, WO10/19570 e WO2014/008218. Numa modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 é BMS-986016. Outros anticorpos anti-LAG-3 reconhecidos na técnica que podem ser usados incluem IMP731 e IMP- 321, descritos nos documentos nº US 2011/007023, WO08/132601 e WO09/44273. Os anticorpos anti-LAG-3 que competem com e/ou se li- gam ao mesmo epítopo de qualquer um destes anticorpos também pode ser usados em tratamentos de combinação.
[0193] Em algumas modalidades, o alvejamento de dois ou mais dentre os receptores TIGIT, CD96 e CD112R aumenta simultaneamente a sinalização mediada por CD226 além da monoterapia anti-CD112R. Portanto, em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista de TIGIT e/ou CD96. Os antagonistas adequados para uso na terapia de combinação descrita no presente documento incluem, sem limitação, ligantes, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e anticorpos biespecíficos) e agentes multivalentes.
[0194] Em algumas modalidades, os membros da família de genes PVR são crescentemente regulados em células tumorais e podem exibir propriedades de promoção de tumor intrínsecas. O alvejamento de membros adicionais da família de genes PVR em combinação com an- ticorpos anti-CD112R leva a uma sensibilidade intensificadas a tumores além da monoterapia. Portanto, em algumas modalidades, o segundo agente é selecionado a partir de um ou mais de um antagonista de PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4 e CD155. Os antagonistas adequados para uso na terapia de combinação descrita no presente documento in- cluem, sem limitação, ligantes, anticorpos (por exemplo, anticorpos mo- noclonais e anticorpos biespecíficos) e agentes multivalentes.
[0195] Os agonistas de STING induzem a ativação de células imu- nes inatas, resultando no aumento da iniciação de células T e recruta- mento de células imunes para o microambiente tumoral. O alvejamento de agonistas de STING em combinação com CD112R tem o potencial de levar a um aumento ainda maior no recrutamento e ativação de cé- lulas T e células NK.
[0196] A fagocitose mediada por anticorpo anti-CD47 aumentada pode levar a um aumento na apresentação de antígenos derivados do câncer por macrófagos às células T. O tratamento de combinação com um anticorpo anti-CD47 e um anticorpo anti-CD112R, tal como um anti- corpo anti-CD112R fornecido no presente documento fornece uma oportunidade para intensificar as respostas de células T específicas para antígeno de câncer e é totalmente englobado no presente docu- mento.
[0197] A adenosina, por meio de receptores de adenosina expres- sos nas células imunes, inibe a ativação das células T e células NK. Os anticorpos anti-CD39 inibem a geração de adenosina prevenindo-se a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP). O tratamento de combinação com um anticorpo anti-CD39 e um anticorpo anti-CD112R, tal como um anticorpo anti-CD112R fornecido no presente documento, fornece uma oportunidade para intensificar ainda mais a terapia com CD112R ini- bindo a sinalização celular mediada por adenosina em células imunes.
[0198] As citocinas podem modular com eficácia a ativação de cé- lulas T e células NK. IL-27 é uma citocina imunossupressora que inibe as respostas mediadas por células T e células NK. Os anticorpos anti- IL-27 fornecem uma oportunidade para intensificar a terapia com CD112R limitando-se a sinalização de citocina imunossupressora em células imunes. Assim, o tratamento de combinação com um anticorpo anti-IL-27 e um anticorpo anti-CD112R, tal como um anticorpo anti- CD112R fornecido no presente documento, é fornecido.
[0199] Os anticorpos no presente documento podem também ser fornecidos antes, substancialmente contemporâneos ou após outros modos de tratamento, por exemplo, cirurgia, quimioterapia, radioterapia,
ou a administração de um anticorpo biológico, tal como outro anticorpo terapêutico. Em algumas modalidades, o câncer recorreu ou progrediu após uma terapia selecionada dentre cirurgia, quimioterapia e radiote- rapia ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, um anticorpo CD112R conforme descrito no presente documento pode ser adminis- trado como terapia adjuvante quando há um risco de que micrometás- tases possam estar presentes e/ou a fim de reduzir o risco de uma reci- diva.
[0200] Para o tratamento do câncer, as combinações podem ser ad- ministradas em conjunto com um ou mais agentes anticâncer adicionais, tais como um agente quimioterápico, agente inibidor de crescimento, vacina anticâncer, tal como uma vacina de terapia gênica, agente anti- angiogênese e/ou composição antineoplásica.
[0201] Em algumas modalidades, um fármaco anti-inflamatório pode ser administrado com a combinação, tal como um esteroide ou um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID). Nos casos em que é desejável tornar as células aberrantemente proliferativas quiescentes em conjunto com ou antes do tratamento com anticorpos CD112R des- critos no presente documento, hormônios e esteroides (incluindo análo- gos sintéticos), tais como 17a-Etinilestradiol, Dietilestilbestrol, Testoste- rona, Prednisona, Fluoximesterona, Propionato de Dromostanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, Metil-testosterona, Prednisolona, Triancinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Ami- noglutetimida, Estramustina, Medroxiprogesterona-acetato, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEX®, também podem ser administrados ao indivíduo. Ao usar os métodos ou composições descritos no presente documento, outros agentes usados na modulação do crescimento ou metástase tumoral num ambiente clínico, tais como os antimiméticos, também podem ser administrados conforme desejado.
[0202] Estas terapias de combinação observadas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou composições ou formula- ções ou composições separadas) e a administração separada, em tal caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, si- multaneamente e/ou após a administração do agente e/ou agentes te- rapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, a administração do an- ticorpo anti-CD112R e a administração de um agente terapêutico adici- onal ocorrem com um intervalo de cerca de um mês, ou de cerca de uma, duas ou três semanas, ou de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias uma da outra.
[0203] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo administração parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, intralesional. Infusões parenterais incluem a ad- ministração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exem- plo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, de- pendendo em parte de se a administração é breve ou crônica. Vários cronogramas de dosagem incluindo, porém sem limitação, administra- ções únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos no tempo, adminis- tração em bolus e infusão em pulso são contemplados no presente do- cumento.
[0204] Os anticorpos da invenção podem ser formulados, dosados e administrados de forma consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio parti- cular que é tratado, o mamífero particular que é tratado, a condição clí- nica do sujeito individual, a causa do distúrbio, o sítio de distribuição do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos pelos profissionais da área médica. Conforme usado no presente documento, uma “dose dividida” é a divisão de uma dose unitária única ou uma dose diária total em duas ou mais doses, por exemplo, duas ou mais administrações da dose unitária única. O anti- corpo pode ser administrado como "dose dividida".
[0205] O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes, atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes de- pende da quantidade de anticorpos presente na formulação ou compo- sição, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Os mesmos são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente documento, ou de cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente documento, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empírica/clinica- mente determinada como apropriada. Em algumas modalidades, o an- ticorpo é fornecido numa formulação para liberação imediata, e o outro agente é formulado para liberação prolongada ou vice-versa. G. ARTIGOS DE MANUFATURA
[0206] Em outro aspecto da invenção, um artigo de manufatura con- tendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima é fornecido. O artigo de manufatura compre- ende um recipiente e uma identificação ou bula no ou associada ao re- cipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que é a própria ou combi- nada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosti- car a afecção e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da inven-
ção. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para o trata- mento da afecção de escolha. Além disto, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da inven- ção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adici- onal ou terapêutico de outro modo. O artigo de manufatura nesta moda- lidade da invenção pode compreender ainda uma bula que indica que as composições podem ser usadas para tratar uma afecção específica. Alternativa ou ainda, o artigo de manufatura pode compreender, ainda, um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farma- ceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e so- lução de dextrose. O mesmo pode incluir, ainda, outros materiais dese- jáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tam- pões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0207] Entende-se que qualquer um dos artigos de manufatura acima pode incluir um imunoconjugado da invenção em vez ou além de um anticorpo anti-CD112R. III. EXEMPLOS EXEMPLO 1. GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD112R
[0208] Os antígenos foram biotinilados usando o Kit EZ-Link Sulfo- NHS-Biotinylation da Pierce. Kappa-FITC anti-humano F(ab’)2 de cabra (LC-FITC), ExtrAvidin-PE (EA-PE) e Estreptavidina-AF633 (SA-633) fo- ram obtidos junto à Southern Biotech, Sigma e Molecular Probes, res- pectivamente. Microesferas de Estreptavidina e colunas de separação MACS LC foram adquiridas junto à Miltenyi Biotec. IgG-PE anti-humano de cabra (Human-PE) foi obtido junto à Southern Biotech.
[0209] DESCOBERTA PRIMÁRIA.
[0210] Oito bibliotecas de leveduras sintéticas humanas virgens,
cada uma com diversidade de ~ 109, foram propagadas conforme des- crito anteriormente (consultar, por exemplo, Y.
Xu et al, Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection and analytical tool.
PEDS 26.10, 663-70 (2013); WO2009036379; WO2010105256; e WO2012009568). Para as primeiras duas rodadas de seleção, uma téc- nica de classificação de esferas magnéticas utilizando o sistema Miltenyi MACS foi realizada, conforme descrito anteriormente (consultar, por exemplo, Siegel et al, High efficiency recovery and epitope-specific sor- ting of an scFv yeast display library.
J Immunol Methods 286(1-2), 141- 153 (2004)). Em suma, células de levedura (~1010 células/biblioteca) foram incubadas com 1,5 ml de antígeno de fusão Fc biotinilado 10 nM por 15 min a 30ºC em tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato (PBS)/albumina sérica bovina 0,1% (BSA)). Após a lavagem uma vez com 40 ml de tampão de lavagem gelado, o pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de tampão de lavagem, e Microesferas de Es- treptavidina (500 μl) foram adicionadas à levedura e incubadas por 15 min a 4ºC.
Em seguida, as leveduras foram peletizadas, ressuspensas em 20 ml de tampão de lavagem e carregadas numa coluna Miltenyi LS.
Após os 20 ml terem sido carregados, a coluna foi lavada 3 vezes com 3 ml de tampão de lavagem.
A coluna foi, então, removida do campo magnético, e as leveduras foram eluídas com 5 ml de meio de cresci- mento e, então, cultivadas de um dia para o outro.
Os ciclos de classifi- cação seguintes foram realizados com o uso de citometria de fluxo.
Aproximadamente 2×107 leveduras foram peletizadas, lavadas três ve- zes com tampão de lavagem e incubadas a 30ºC com concentrações decrescentes de antígeno biotinilado (100 a 1 nM) sob condições de equilíbrio ou com um reagente de depleção de poliespecificidade (PSR) para remover anticorpos não específicos da seleção.
Para a depleção de PSR, as bibliotecas foram incubadas com uma diluição de 1:10 de reagente PSR biotinilado conforme descrito anteriormente (consultar, por exemplo, Y. Xu et al, Addressing polyspecificity of antibodies selec- ted from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high- throughput selection and analytical tool. PEDS 26.10, 663-70 (2013)). As leveduras foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem e manchadas com LC-FITC (diluído 1:100) e com os reagentes secun- dários SA-633 (diluído 1:500) ou EAPE (diluído 1:50) por 15 min a 4 ºC. Após a lavagem duas vezes com tampão de lavagem, os péletes celu- lares foram ressuspensos em 0,3 ml de tampão de lavagem e transferi- dos para tubos de classificação tampados com filtro. As seleções que usam pressão de afinidade a fim de selecionar e isolar anticorpos de maior afinidade foram realizadas competindo com antígeno frio (isto é, não identificado).
[0211] A classificação foi realizada usando um classificador FACS ARIA (BD Biosciences) e as portas de classificação foram determinadas para selecionar anticorpos com as características desejadas. As roda- das de seleção foram repetidas até que uma população com todas as características desejadas fosse obtida. Após o ciclo de classificação fi- nal, as leveduras foram colocadas em placas e colônias individuais fo- ram escolhidas para caracterização.
[0212] EMBARALHAMENTO DE LOTE DE CADEIA LEVE.
[0213] O protocolo de diversificação de cadeia leve foi usado du- rante a fase de divulgação primária para descoberta e melhoria adicio- nais do anticorpos.
[0214] Protocolo de diversificação de lote de cadeia leve: cadeias pesadas de uma saída de seleção virgem foram extraídas da levedura por meio de PCR e transformadas numa biblioteca de cadeia leve com uma diversidade de 5 x 106. As seleções foram realizadas com uma ro- dada de MACS e três rodadas de FACS, conforme descrito na desco- berta virgem. Nas diferentes rodadas de FACS, as bibliotecas foram pesquisadas quanto à ligação de PSR e pressão de afinidade por titula- ção de antígeno até 0,5 nM. A classificação foi realizada a fim de obter uma população com as características desejadas.
[0215] OTIMIZAÇÃO DE ANTICORPO
[0216] A otimização de anticorpos foi realizada introduzindo-se di- versidades nas regiões variáveis de cadeia pesada, conforme descrito abaixo.
[0217] Seleção de CDRH1 e CDRH2: A CDRH3 de um único anti- corpo foi recombinada numa biblioteca pré-fabricada com variantes CDRH1 e CDRH2 de uma diversidade de 1 x 10 8 e as seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e três rodadas de FACS, con- forme descrito na descoberta virgem. Nas diferentes rodadas de FACS, as bibliotecas foram pesquisadas quanto à ligação de PSR, reatividade cruzada de camundongo e pressão de afinidade por titulação ou pres- são de afinidade por pré-complexação do antígeno com Fab progenitor ou IgG progenitora para enriquecer ligantes com maior afinidade do que a IgG progenitora. A classificação foi realizada a fim de obter uma po- pulação com as características desejadas.
[0218] PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
[0219] Clones de levedura foram cultivados até saturação e, então, induzidos por 48 horas a 30 ºC com agitação. Após a indução, células de levedura foram peletizadas e os sobrenadantes foram coletados para purificação. IgGs foram purificadas com o uso de uma coluna de Prote- ína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados pela digestão de papaína e purificados através de KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).
[0220] MEDIÇÕES FORTEBIO KD
[0221] As medições de afinidade ForteBio foram realizadas num Octet RED384 em geral conforme anteriormente descrito (consultar, por exemplo, Estep et al, High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs 5(2), 270-278 (2013)). Em suma, as medições de afinidade por ForteBio foram reali- zadas carregando-se IgGs online em sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados offline em tampão de ensaio por 30 min e, então, monitora- dos online por 60 segundos para estabelecimento de linha de base. Os sensores com IgGs carregadas foram expostos a antígeno 100 nM por 3 minutos, e posteriormente, foram transferidos para tampão de ensaio por 3 min para medição de taxa de dissociação. Todas as cinéticas fo- ram analisadas com o uso de modelo de ligação 1:1.
[0222] BLOQUEIO DE LIGANTE/BINAGEM DE EPÍTOPO FORTE-
BIO
[0223] O bloqueio de ligante/binagem de epítopo foi realizado usando um ensaio de bloqueio cruzado em formato de sanduíche pa- drão. IgG ou receptor antialvo de controle foi carregado em sensores AHQ, e sítios de ligação a Fc desocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG1 humano irrelevante (não alvo). Os sensores fo- ram então expostos a antígeno alvo 100 nM seguido por um segundo anticorpo antialvo. A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epítopo não ocupado (não competi- dor), enquanto nenhuma ligação indica bloqueio de epítopo (competidor ou bloqueio de ligante).
[0224] ENSAIO CINÉTICO BIACORE
[0225] Para as medições baseadas em Biacore, o antígeno foi aco- plado covalentemente a um chip C1 de captura de Fc anticamundongo usando um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Bio-Sciences). A associação entre o antígeno e uma titulação de três vezes de cinco pontos do anticorpo começando em 27 nM foi medida por 300 segun- dos. Subsequentemente, a dissociação entre o antígeno e o anticorpo foi medida por 3600 segundos. Os dados cinéticos foram analisados e ajustados globalmente usando um modelo de ligação 1:1.
EXEMPLO 2. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R SE LIGAM A CD112R.
[0226] ENSAIO DE LIGAÇÃO EM CÉLULA
[0227] A capacidade de anticorpos anti-CD112R se ligarem a CD112R expresso nas células foi avaliada. 1 x 105 células Jurkat (linha- gem celular de leucemia de células T aguda, ATCC nº TIB-152) que eram do tipo selvagem ou foram geneticamente modificadas para supe- rexpressar CD112R humano (Jurkat-CD112R OE) foram adicionadas a cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços e manchadas com anticorpos anti-CD112R ou um controle de isotipo IgG1 (0,63 µg/ml) por 1 hora a 4ºC. As células foram lavadas duas vezes com PBS + FCS 2% e ressuspensas com anticorpo IgG Fc anti-humano Alexa Fluor® 647 (Biolegend, número de catálogo 409320) diluído 1:100 em PBS+FCS 2% e incubado a 4ºC por 30 minutos. As células foram subsequente- mente lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS + FCS 2%. Os da- dos celulares foram adquiridos usando um LSRFortessa X-20 (BD Bios- ciences) e analisados com o software FlowJo (Tree Star).
[0228] Os resultados são representados na Figura 1. A quantifica- ção da ligação de anticorpo a células Jurkat-CD112R OE foi avaliada pela intensidade fluorescente média geométrica (gMFI) do sinal Alexa Fluor® 647. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti- CD112R se ligam a células que expressam CD112R. Um sumário da ligação de anticorpo é mostrado na Tabela 2. EXEMPLO 3. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R IMPEDEM CD112 DE SE LIGAR A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD112R
[0229] ENSAIO DE BLOQUEIO EM CÉLULA
[0230] A capacidade de anticorpos anti-CD112R para bloquear a li- gação de CD112 a células que expressam CD112R foi avaliada. 1 x 105 células Jurkat (linhagem celular de leucemia de células T aguda, ATCC nº TIB-152) que foram geneticamente modificadas para superexpressar CD112R humano (Jurkat-CD112R OE) foram adicionadas a cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços e manchadas com diluições seriais de anticorpos anti-CD112R ou um controle de isotipo IgG1 (con- centração mais alta, 10 µg/ml) por 1 hora a 4ºC. As células foram lava- das duas vezes com PBS + FCS 2% e ressuspensas com CD112 hu- mano identificado com his biotinilado (3 µg/ml) (BPS Bioscience, nº71234) e PE Estreptavidina (5 µg/ml) (Biolegend, nº405204) em PBS + FCS 2% e incubadas a 2 horas a 4ºC. As células foram subsequente- mente lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS + FCS 2%. Os da- dos celulares foram adquiridos usando um LSRFortessa X-20 (BD Bios- ciences) e analisados com o software FlowJo (Tree Star).
[0231] Os resultados são representados na Figura 2A e Tabela 2. A quantificação da ligação de CD112 às células foi avaliada pela inten- sidade fluorescente média geométrica (gMFI) do sinal de PE e exibida como inibição percentual. A inibição percentual foi calculada como [100 – ((MFI de amostra de teste/MFI Máxima) * 100%)]. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R inibem a capacidade de CD112 de se ligar a células que expressam CD112R de uma forma de- pendente de dose. Um sumário da ligação e bloqueio de anticorpo é mostrado na Tabela 2.
[0232] A capacidade dos anticorpos anti-CD112R para bloquear CD112R humano também foi avaliada por ELISA. Em suma, placas Nunc Maxisorp de 96 poços foram revestidas com 1 µg/ml de uma pro- teína de fusão CD112R-hIgG4 em PBS de um dia para o outro a 4ºC. As placas foram então lavadas 6X com PBS + Tween-20 0,01% (PBST) e subsequentemente bloqueadas com 200 µl de PBS + BSA 1% por 1,5 hora à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as placas foram lavadas 6X com PBST. Em seguida, 100 µl de anticorpos anti-CD112R em PBS + BSA 1% foram adicionados a uma concentração inicial final de 10 µg/ml, com diluições em série de 4 vezes. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1,5 hora. Em seguida, as placas foram lava- das 6X com PBST e, então, incubadas com 1 µg/ml de proteína Fc CD112 (R&D Systems, número de catálogo 9317-N2-050) que foi bioti- nilada com um kit de biotinilação sulfo-NHS (Thermo Fisher, número de catálogo 21925) em 100 µl de PBS + BSA 1% por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 6x com PBST e subsequen- temente incubadas com estreptavidina-HRP (Biolegend, número de ca- tálogo 405210) diluído em PBS + BSA 1% de acordo com a recomen- dação do fabricante por 1 hora à temperatura ambiente. Após esta incu- bação, as placas foram então lavadas 6X com PBST e desenvolvidas com substrato TMB (Life Technologies, número de catálogo 002023). A reação foi interrompida com um volume igual de solução de interrupção (Life Technologies, número de catálogo SS04). A absorbância a 450 nm (O.D. 450) foi medida num leitor de placas SpectraMax.
[0233] Os resultados são representados na Figura 2B e Tabela 2. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R impedem o CD112R humano de se ligar ao CD112 humano. A inibição percentual foi calculada como [100 – ((O.D. 450 de amostra de teste/O.D. 450 má- xima)*100%)]. A O.D. 450 máxima foi definida como absorbância a 450 nm na ausência de anticorpo. TABELA 2: SUMÁRIO DA LIGAÇÃO E BLOQUEIO DE ANTICORPO Anticorpo gMFI de Jurkat (au- gMFI de Jurkat-CD112R superex- IC50 de bloqueio de Inibição máxima de ELISA de inibição mento de vezes em pressas (OE) (aumento de vezes CD112 em Jurkat- bloqueio de CD112 máxima de bloqueio relação ao isotipo) em relação ao isotipo) CD112R OE (ng/ml) em Jurkat-CD112R de CD112 (%) OE (%) Anticorpo 2 4,7 63,9 0,83 94,1 97,0 Anticorpo 5 3,8 63,3 0,17 97,0 97,4 Anticorpo 10 4,6 55,7 0,69 96,8 96,3 Anticorpo 15 4 53,2 0,51 97,9 97,0 Anticorpo 32 2,5 27,9 23,57 96,0 75,1 Anticorpo 33 3,4 34,2 21,89 97,4 78,8 Anticorpo 34 3,8 33,8 13,22 96,9 80,0 Anticorpo 35 3,3 32,1 16,19 97,4 81,7 Anticorpo 36 3,5 31 24,37 97,5 86,2 Anticorpo 38 3,8 51,7 0,19 95,5 97,2
Anticorpo gMFI de Jurkat (au- gMFI de Jurkat-CD112R superex- IC50 de bloqueio de Inibição máxima de ELISA de inibição mento de vezes em pressas (OE) (aumento de vezes CD112 em Jurkat- bloqueio de CD112 máxima de bloqueio relação ao isotipo) em relação ao isotipo) CD112R OE (ng/ml) em Jurkat-CD112R de CD112 (%) OE (%) Anticorpo 44 4,8 46,9 0,81 97,7 96,8 Anticorpo 46 4,2 23,8 16,22 95,5 97,6 Anticorpo 58 4,5 37,3 2,8 96,3 97,3 EXEMPLO 4. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R INTENSIFICAM O EX-
TERMÍNIO MEDIADO POR CÉLULA NK
[0234] ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DE NK
[0235] Para determinar o efeito de anticorpos CD112R anti-huma- nos na citotoxicidade mediada por células NK, células NK humanas fo- ram cocultivadas com células-alvo REH (linhagem celular de leucemia linfocítica aguda de células não T/B, ATCC nº CRL-8286) na presença de anticorpo anti-CD112R ou controle de isotipo.
[0236] Em suma, as células NK foram isoladas das PBMCs de três doadores saudáveis por meio de seleção negativa (kit de isolamento de células NK EasysepTM, Stemcell nº 17955) e ativadas por 16 horas com IL-2 (10 unidades/ml) (Peprotech nº 200-02) e IL-12 (20 ng/ml (Pepro- tech nº 200-12) em RPMI + FBS 10% + Penicilina-Estreptomicina 1% (R10) (ThermoFisher). As células REH foram lavadas, ressuspensas em PBS (ThermoFisher) e identificadas com violeta CellTrace TM (CTV) (ThermoFisher nº C34557) por 12 minutos a 37ºC. Subsequentemente, as células REH foram lavadas com PBS + FBS 10% e então ressuspen- sas em R10. Após a ativação, as células NK foram lavadas e ressus- pensas em R10. 2,5 x 105 células NK e 5 x 104 células REH foram adici- onadas a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços para uma razão entre célula efetora-alvo de 5:1. O anti-CD112R e um anti- corpo de isotipo IgG1 foram diluídos em R10 e também adicionados a cada poço numa concentração final de 10 µg/ml. Cada condição foi exe- cutada em duplicata. As placas foram então incubadas por 4 horas a 37ºC. As células foram então lavadas e incubadas à temperatura ambi- ente por 30 minutos no escuro com corante de viabilidade 7-AAD (1 µg/ml) (Biolegend nº 420404) para identificar especificamente as células mortas. Os dados de viabilidade celular foram adquiridos usando um LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) e analisados com o software FlowJo (Tree Star). As células REH mortas foram definidas como célu- las duplamente positivas para CTV e 7-AAD.
[0237] Os resultados são apresentados na Figura 3. A citotoxici- dade (porcentagem em relação ao isotipo) foi calculada como ((morte em porcentagem de teste menos morte em porcentagem de isotipo) di- vidido pela morte em porcentagem de isotipo) x 100. O tratamento de células NK com cada um dos anticorpos anti-CD112R descritos no pre- sente documento resultou citotoxicidade mediada por célula aumentada contra células REH em comparação com um controle de isotipo. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R aumentam o extermínio mediado por célula NK. EXEMPLO 5. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R INTENSIFICAM A ATI- VAÇÃO ACIONADA POR ANTÍGENO DE CÉLULAS T CD8 +.
[0238] ENSAIO DE CÉLULAS T CD8 + ESPECÍFICO PARA ANTÍ- GENOS.
[0239] O efeito dos anticorpos anti-CD112R na ativação acionada por antígeno de células T CD8 + foi avaliado. Uma linhagem de células T CD8 + específica para citomegalovírus (CMV) restrita a HLA-A*0201 primária (Astarte Biologics nº 1049, Lote nº 3782DE17) foi incubada com células Colo205 pulsadas com peptídeo (linhagem de células de Ade- nocarcinoma do cólon, ATCC nº CCL-222) na presença de anticorpo anti-CD112R ou controle de isotipo.
[0240] Em suma, células T específicas para CMV foram desconge- ladas, lavadas e ressuspensas em X-VIVO 10 (ThermoFisher nº BW04380Q). 2 x 104 células T CMV foram adicionadas a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços e deixadas em repouso por 4 horas a 37ºC. Após o período inicial de repouso, 5 x 104 células Colo205 e peptídeo CMV pp65 (1 ng/ml) (Anaspec nº AS-63937) foram adiciona- das a cada poço. Em seguida, os anticorpos anti-CD112R e de isotipo foram diluídos em X-VIVO 10 e adicionados a cada poço numa concen- tração final de 10 µg/ml. Cada condição foi executada em duplicata. As placas foram então incubadas por 16 horas a 37ºC. Os sobrenadantes de cada poço foram coletados e submetidos a um ciclo de congela- mento/descongelamento antes da avaliação de citocinas. Após o des- congelamento, os sobrenadantes do ensaio foram diluídos 1:5 em X- VIVO 10 e o interferon gama (IFNg) foi então medido no sobrenadante do ensaio pelo ensaio multiplex de painel de microesferas magnéticas de células T CD8 + humanas Luminex (Millipore Sigma nº HCD8MAG- 15K) e executado num Millipore FlexMap 3D.
[0241] Os resultados são apresentados na Figura 4 Os níveis de IFNg de condição de teste foram quantificados com base numa curva padrão gerada com concentrações definidas de IFNg. As células T CD8+ tratadas com anticorpos anti-CD112R 2 e 5 resultaram em maior secreção de IFNg do que observado com o controle de isotipo. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R intensificam a ativação de células T CD8 + acionada por antígeno. EXEMPLO 6. A COMBINAÇÃO DE ANTICORPOS CD112R ANTICA- MUNDONGO E TIGIT ANTICAMUNDONGO TEM EFEITO TERAPÊU- TICO NO MODELO DE TUMOR CT-26 DE CAMUNDONGO.
[0242] EFICÁCIA IN VIVO DE BLOQUEIO DE COMBINAÇÃO DE CD112R E TIGIT
[0243] A eficácia do bloqueio de CD112R e TIGIT como agentes únicos e de combinação foi testada num modelo de tumor singênico de camundongo de adenocarcinoma de cólon CT26. Camundongos fê- meas Balb/c de 7 semanas de idade (Charles River Laboratories, nº 028) foram implantados subcutaneamente com 0,1 x 106 células CT26.WT (ATCC nº CRL-2638) em 0,1 ml de matriz de inoculação de matrigel 50%. Os camundongos foram randomizados em grupos de 10 camundongos cada (total de 40 camundongos) de uma maneira estrati- ficada na faixa de volume do tumor de 80 a 120 mm3 e tratados duas vezes por semana por duas semanas por injeção intraperitoneal como na Tabela 3. TABELA 3: DETALHES DE GRUPO DE TRATAMENTO Grupo Tratamento 1 Tratamento 2 Anticorpo Dose (µg/camundongo) Anticorpo Dose (µg/camundongo) Isotipo Isotipo 1 500 Isotipo 2 500 CD112R Isotipo 1 500 Anti-CD112R 500 TIGIT Anti-TIGIT 500 Isotipo 2 500 CD112R+TIGIT Anti-CD112R 500 Anti-TIGIT 500
[0244] Os volumes dos tumores foram medidos a cada 2 a 3 dias até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3). TABELA 4: DETALHES DO ANTICORPO Grupo Clone Isotipo 1 Clone C1.18.4, Controle de Isotipo IgG2a de Camundongo Isotipo 2 Controle de Isotipo de IgG Humana Policlonal Anti-Tigit 10A7, IgG2a de camundongo Anti-CD112R IgG4 humana anti-CD112R
[0245] Os resultados são apresentados na Figura 5 O gráfico re- presenta os volumes médios de tumor para cada grupo de tratamento como uma função de tempo. Os resultados demonstram que a combi- nação de anti-CD112R com anti-TIGIT foi eficaz na redução do cresci- mento do tumor em comparação com os animais tratados com isotipo, enquanto as monoterapias anti-CD112R ou anti-TIGIT não mostraram nenhuma atividade ou mostraram apenas um efeito modesto na redu- ção do crescimento do tumor. Embora o anti-CD112R sozinho não tenha mostrado atividade neste ensaio, outros experimentos apresentados no presente documento mostram o benefício da monoterapia com anti- CD112R. Consultar, por exemplo, a Figura 9. EXEMPLO 7. EXPRESSÃO AUMENTADA DE CD112R EM PBMC
APÓS ATIVAÇÃO DE ANTI-CD3
[0246] CD112R É CRESCENTEMENTE REGULADO EM PBMCS
ATIVADAS IN VITRO
[0247] Para determinar o efeito da ativação celular na expressão de CD112R, PBMCs humanas foram estimuladas in vitro com anticorpo anti-CD3. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de do- adores saudáveis foram isoladas dos cremes leucocitários (Research Blood Components). Os cremes leucocitários individuais foram proces- sados separadamente. 15 ml de creme leucocitário foram adicionados a cada tubo cônico de 50 ml (Corning nº 430290) e diluídos com 15 ml de PBS (Thermofisher nº 14190144) + EDTA 2 mM (Fisher Scientific nº BP2482-500) para um volume total de 30 ml cada tubo. Os cremes leu- cocitários diluídos foram sustentados com 14 ml de Ficolpaque (GE Healthcare Life Science nº 17-544203) e centrifugados a 2000 RPM por 20 minutos à temperatura ambiente com o freio desativado. A interfase de gradiente foi coletada e lavada duas vezes com PBS + EDTA 2 mM. As células isoladas foram contadas e ressuspensas a 2,5 a 5 x 10 7 cé- lulas/ml em 10% de DMSO (Sigma-Aldrich nº 472301) + 90% de FBS inativado por calor (ThermoFisher nº 16140-071).
[0248] PBMCs congeladas foram descongeladas rapidamente e ressuspensas em meio RPMI suplementado, que continha RPMI+Glu- taMax (1x) (ThermoFisher nº 61870-036), 10% de FBS inativado por ca- lor, 1x solução de aminoácidos não essenciais MEM (ThermoFisher nº 15140-122), Piruvato de sódio 1 mM (ThermoFisher nº 11360070), 100 U/ml de Pen/Estrep (ThermoFisher nº 15140-122), 1x 2-mercaptoetanol (ThermoFisher nº 21985023), Hepes 10 mM (ThermoFisher nº 15630- 080). As PBMCs isoladas foram lavadas, contadas e ressuspensas a uma concentração de 0,5 x 106 células/ml. 1 x 106 células por poço fo- ram colocadas numa placa de fundo plano de 24 poços (Corning nº 3526) e estimuladas com 0,25 µg/ml de anticorpo anti-CD3 (clone
UCHT1, Biolegend nº 300414). As células foram coletadas nos pontos de tempo indicados, lavadas em tampão FACS contendo 1x PBS, FBS 2% e EDTA 2 mM e transferidas para uma placa de 96 poços com fundo em V (Costar nº 3894) para manchamento de anticorpo.
[0249] As células foram centrifugadas a 1500 RPM por 3 minutos, e o sobrenadante foi removido por agitação. As células foram ressuspen- sas em tampão FACS e incubadas por 1 hora a 4ºC com anticorpos primários na Tabela 5 da seguinte forma: TABELA 5 Anticorpo Clone Empresa CD3-A700 SK7 Biolegend nº 344822 CD8-FITC RPA-T8 Biolegend nº 301006 CD4-PEcy7 RPA-T4 Biolegend nº 300511 CD19-PEdazzle HIB19 Biolegend nº 302251 NKp46-PE 9E2 Biolegend nº 331907 CD11b-BV785 ICRF44 Biolegend nº 301345 PD1 -BV421 EH12.1 Biolegend nº 565935 CD226-BV711 DX11 BD Biosciences nº 564796 CD112R Interna Interna Fc de IgG Humana HP6017 Biolegend nº 409320
[0250] As células foram lavadas duas vezes e incubadas por 30 mi- nutos a 4ºC com anticorpo IgG anti-humano conjugado com Alexa 647 diluído 1:100 (clone HP6017, Biolegend nº 409320). As células foram lavadas uma vez com tampão FACS e manchadas com corante de via- bilidade Live/Dead Aqua diluído 1:500 em 1x PBS (Thermofisher nº L34966) por 10 minutos a 4ºC. As células foram lavadas uma vez e ad- quiridas diretamente no citômetro de fluxo X-20 Fortessa (BD Bioscien- ces). Os dados foram analisados usando Flowjo (TreeStar) e Graphpad prism (Graphpad Software).
[0251] Os resultados são representados na Figura 6 A quantifica- ção da ligação de anticorpo CD112R foi avaliada pela intensidade fluo- rescente média geométrica (gMFI) do sinal Alexa Fluor® 647 para o tipo de célula indicado. A ligação de anti-CD112R é descrita como negativa (FON, (gMFI de CD112R dividida pela gMFI de isotipo)). Estes resulta- dos demonstram que a expressão de CD112R aumenta em células NK e células T após a ativação de anti-CD3. EXEMPLO 8. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R INTENSIFICAM A DESGRANULAÇÃO DE CÉLULAS NK EM COCULTURAS DE CÉLU- LAS TUMORAIS.
[0252] Para determinar o efeito do anticorpo anti-CD112R na des- granulação mediada por célula NK, células NK humanas foram coculti- vadas com células-alvo Raji (linhagem de células de linfoma de Burkitt, ATCC nº CCL-86) que foram previamente transduzidas com lentivírus para expressar CD112 (Origene, nº RC213693L2), na presença dos an- ticorpos 35, 38, 44 e controle de isotipo.
[0253] Em suma, as células NK foram isoladas e agrupadas das PBMCs de três doadores saudáveis por meio de seleção negativa (kit de isolamento de células NK EasysepTM, Stemcell nº 17955) e cultivadas por 16 horas em DMEM + FBS 10% + Penicilina-Estreptomicina 1% (D10) (ThermoFisher). Após incubação de um dia para o outro a 37 º C, as células NK foram lavadas e ressuspensas em D10. As células Raji.CD112 foram coletadas, lavadas e então ressuspensas em D10. 1 x 105 células NK e 5 x 104 células Raji.CD112 foram adicionadas a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços para uma razão entre célula efetora-alvo de 2:1. Os anticorpos anti-CD112R e um anticorpo de controle de isotipo IgG1 foram diluídos em D10 e adicionados a cada poço numa concentração inicial de 10 µg/ml, com diluições seriais de 10 vezes. Cada condição foi executada em duplicata. O anticorpo PE anti- CD107a (Biolegend, nº 328608) e a Monensina (Biolegend, nº 420701) também foram adicionados a cada poço nas concentrações indicadas pelo fabricante. O volume final para cada poço foi de 200 µl. As placas foram então incubadas por 4 horas a 37ºC. Após 4 horas, os anticorpos
Anti-CD3 FITC (Biolegend, nº 300306) e Anti-NKp46 APC (Biolegend nº 331914) foram diluídos em D10, e 50 µl foram adicionados a cada poço. As placas foram então incubadas por mais 30 minutos a 4 ºC até man- charem. As células foram então transferidas para placas de fundo em V e lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS + FBS 2%. Os dados foram adquiridos usando um citômetro de fluxo LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) e analisados com o software FlowJo (Tree Star). A desgra- nulação de NK foi definida como a frequência de células CD107a+ den- tro da porta de linfócitos CD3- NKp46+.
[0254] Os resultados são apresentados na Figura 7. O tratamento de células NK com anticorpos anti-CD112R descritos no presente docu- mento resultou em desgranulação de NK aumentada, conforme medido por manchamento de CD107a, em comparação com um controle de iso- tipo. EXEMPLO 9. OS ANTICORPOS ANTI-CD112R AUMENTAM A ATI- VAÇÃO DE CÉLULAS NK EM COCULTURAS DE CÉLULAS TUMO- RAIS PBMC.
[0255] Para avaliar o impacto dos anticorpos CD112R na ativação de células NK, vários anticorpos foram avaliados em coculturas de cé- lulas tumorais PBMC. A regulação positiva de CD137 (4-1BB), que foi previamente estabelecida como um marcador de ativação de células NK (Baessler et al. (2010) Blood 115 (15); André et al. (2018) Cell 175, 1731-1743) foi medida nas células NK de PBMCs cocultivadas com cé- lulas-alvo K562 (linhagem celular de leucemia mieloide crônica, ATCC nº CCL-243) com anticorpos anti-CD112R ou de controle de isotipo.
[0256] Em suma, PBMCs congeladas isoladas dos cremes leucoci- tários de doadores saudáveis foram descongeladas, lavadas, ressus- pensas em DMEM + FBS 10% + Penicilina-Estreptomicina 1% (D10) e plaqueadas em placas de fundo plano de 96 poços a uma concentração de 5 x 105 células por poço e deixadas em repouso por 4 horas a 37ºC antes da adição de células-alvo e anticorpos. Em seguida, num primeiro experimento (Figuras 8A e 8B), os anticorpos CD112R e um anticorpo de controle do isotipo IgG1 foram diluídos em D10 e adicionados a cada poço na concentração inicial de 10 µg/ml, com diluições seriais de 10 vezes. Num experimento seguinte (Figuras 8C e 8D), uma única con- centração (1 µg/ml) de anticorpo anti-CD112R ou de controle de isotipo IgG1 foi adicionada a cada poço. Para ambos os experimentos, cada condição foi executada em duplicata. As células K562 foram então co- letadas, lavadas e ressuspensas em D10 e adicionadas a cada poço a uma concentração de 5 x 104 células por poço. O volume final para cada poço foi de 200 µl. As placas foram então incubadas por 16 horas a 37ºC. Após 16 horas, as células foram então transferidas para placas de fundo em V e lavadas duas vezes em PBS + FBS 2%. As células foram manchadas com FITC Anti-CD3 (Biolegend, nº 300306), BV421 Anti-NKp46 (Biolegend nº 331914) e APC anti-CD137 (Biolegend, nº 309810) em PBS + FBS 2% por 30 minutos a 4ºC. As células foram subsequentemente lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS + FBS 2%. Os dados foram adquiridos usando um citômetro de fluxo LSRFor- tessa X-20 (BD Biosciences) e analisados com o software FlowJo (Tree Star). A ativação de células NK foi definida como a frequência de células CD137+ dentro da porta de linfócitos CD3- NKp46+.
[0257] Os resultados de dois doadores individuais de dois experi- mentos independentes são apresentados nas Figuras 8A a 8D. A adi- ção de anticorpo anti-CD112R a coculturas de células PBMC-K562 re- sultou em ativação significativa de células NK em comparação com o controle de isotipo, conforme medido pela regulação crescente de CD137 em células NK. EXEMPLO 10. ANTI-CD112R DIMINUI O CRESCIMENTO DO TUMOR NO MODELO CT-26.
[0258] A eficácia in vivo do bloqueio de CD112R foi avaliada no mo- delo de tumor singênico de camundongo de adenocarcinoma de cólon CT26.WT. Camundongos fêmeas BALB/cAnNTac de 7 semanas de idade (Taconic Biosciences, número de catálogo BALB-F) foram subcu- taneamente implantados no flanco direito com 0,2 x 106 CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL-2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432-02) e meio isento de soro RPMI- 1640 50% (GIBCO, número de catálogo A10491-01). Os camundongos com tumores palpáveis foram randomizados no dia 4 após implantação e tratados intraperitonealmente duas vezes por semana durante três se- manas, começando no dia da randomização como segue na Tabela 6. TABELA 6: Grupo Tratamento Dose (µg/camundongo) Controle de isotipo Controle de isotipo IgG2a de camundongo 500 Anticorpo 46 IgG2a de camundongo anti-CD112R 500
[0259] Os volumes dos tumores foram medidos com um calibre a cada 2 a 3 dias até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3). O volume do tumor (mm3) foi calculado da seguinte forma: largura (mm) x [comprimento (mm)] 2 x 0,5.
[0260] Os resultados são apresentados na Figura 9. O gráfico re- presenta os dados agrupados de três experimentos independentes que mostram os volumes médios do tumor para cada grupo de tratamento como uma função de tempo. Estes resultados demonstram que o trata- mento de camundongos que portam tumor com o anticorpo CD112R resultou em inibição significativa do crescimento do tumor, conforme medido no dia 24 após inoculação. EXEMPLO 11. O BLOQUEIO DE CD112R RESULTA EM IMUNIDADE
ANTITUMORAL EM CAMUNDONGOS COM REJEIÇÃO COMPLETA DO TUMOR NO MODELO CT26
[0261] A imunidade antitumoral foi avaliada em camundongos trata- dos com anti-CD112R que exibiram respostas completas de desafios de tumor primário CT26.WT. Para o desafio primário, camundongos fê- meas BALB/cAnNTac de 7 semanas de idade (Taconic Biosciences, nú- mero de catálogo BALB-F) foram subcutaneamente implantados no flanco direito com 0,2 x 106 CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL- 2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432- 02) e meio isento de soro RPMI-1640 50% (GIBCO, número de catálogo A10491-01). Os camundongos com tumores palpáveis foram randomi- zados no dia 4 após implantação e tratados intraperitonealmente duas vezes por semana durante três semanas, começando no dia da rando- mização como segue na Tabela 7. TABELA 7: Grupo Tratamento Dose (µg/camundongo) Controle de isotipo Controle de isotipo IgG2a de camundongo 500 Anticorpo 46 IgG2a de camundongo anti-CD112R 500
[0262] Os volumes dos tumores foram medidos com um calibre a cada 2 a 3 dias até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3). O volume do tumor (mm3) foi calculado da seguinte forma: largura (mm) x [comprimento (mm)] 2 x 0,5.
[0263] Todos os camundongos sobreviventes no dia 50 após im- plantação que não apresentavam quaisquer tumores discerníveis foram considerados como sobreviventes/respondedores completos. Os ca- mundongos respondedores completos (n = 8) do grupo tratado com anti- CD112R foram desafiados novamente por meio de inoculação no flanco esquerdo com 1 x 106 células CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL-2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432-02) e meio isento de soro RPMI-1640 50% (GIBCO, número de catálogo A10491-01), um aumento de cinco vezes da dose de inocula- ção primária. Como um controle, camundongos fêmeas Balb/c virgens de mesma idade (n = 5) também foram inoculados de forma semelhante no flanco esquerdo com 1 x 106 células CT26.WT em 0,1 ml de Geltrex
50% e meio isento de soro RPMI-1640 50%. Os camundongos não re- ceberam nenhum tratamento adicional. Os volumes dos tumores foram medidos a cada 2 a 3 dias até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3). O volume do tumor (mm3) foi calculado da seguinte forma: largura (mm) x [comprimento (mm)] 2 x 0,5.
[0264] Os resultados são apresentados nas Figuras 10A e 10B. A Figura 10A representa os dados agrupados de 3 experimentos indepen- dentes que mostram a frequência de sobrevivência de camundongos implantados com tumores primários CT26 tratados com anti-CD112R. A Figura. 11B representa os volumes médios do tumor para respondedo- res completos tratados com anti-CD112R após o tumor novamente de- safiado e os controles desafiados virgens de desafio como uma função de tempo. A análise estatística foi realizada pelo teste de Mantel-Cox no dia 50 após implante (Figura 10A) e pelo teste de Mann-Whitney no dia 15 após implante (Figura 10B). Estes resultados demonstram que os camundongos tratados com anti-CD112R exibiram respostas completas após o desafio do tumor primário, e a rejeição rápida subsequente após o novo desafio do tumor nestes camundongos também demonstrou que o tratamento com anticorpo anti-CD112R leva ao desenvolvimento de memória imunológica e imunidade protetora. EXEMPLO 12. TANTO AS CÉLULAS NK QUANTO AS CÉLULAS T CD8 CONTRIBUEM PARA A ATIVIDADE TERAPÊUTICA DE ANTI- CD112R NO DESAFIO DO TUMOR CT26.
[0265] A eficácia in vivo do bloqueio de CD112R foi avaliada no mo- delo de tumor de camundongo singênico CT26 após a depleção de cé- lulas NK ou células T CD8. Para depletar as células NK e T CD8, os camundongos foram tratados duas vezes por semana por três semanas começando na randomização com o anticorpo Asialo-GM1 ("asGM1" na Figura 11; Biolegend; número de catálogo 146002; dose de 100 ul/ca-
mundongo; intraperitonealmente) e anticorpo anti-CD8a (Bioxcell; nú- mero de catálogo BE0085; 200 µg/camundongo; intraperitonealmente), respectivamente.
[0266] Camundongos fêmeas BALB/cAnNTac de 7 semanas de idade (Taconic Biosciences, número de catálogo BALB-F) foram subcu- taneamente implantados no flanco direito com 0,2 x 106 CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL-2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432-02) e meio isento de soro RPMI- 1640 50% (GIBCO, número de catálogo A10491-01). Os camundongos com tumores palpáveis foram randomizados no dia 4 após implantação e tratados intraperitonealmente duas vezes por semana durante três se- manas, começando no dia da randomização com anticorpo 46 (IgG2a de camundongo anti-CD112R; 12,5 mg/kg; intraperitonealmente).
[0267] Os volumes dos tumores foram medidos com um calibre a cada 2 a 3 dias até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3). O volume do tumor (mm3) foi calculado da seguinte forma: largura (mm) x [comprimento (mm)]2 x 0,5.
[0268] Os resultados são apresentados na Figura 11. O gráfico re- presenta os volumes médios de tumor para cada grupo de tratamento como uma função de tempo. Estes resultados demonstram que o efeito terapêutico de anti-CD112R é significativamente diminuído após a de- pleção de células NK ou células T CD8. Estes resultados indicam que tanto as células T CD8 quanto as células NK são exigidas para a inibição efetiva do crescimento tumoral mediada por anti-CD112R. EXEMPLO 13. O BLOQUEIO DE CD112R ATIVA CÉLULAS TUMO- RAIS NK IN VIVO.
[0269] AVALIAÇÃO EX VIVO DE MARCADORES DE ATIVAÇÃO NK APÓS A DOSAGEM COM MONOTERAPIA COM ANTI-CD112R.
[0270] Para determinar os efeitos do anticorpo anti-CD112R na ati- vação de células NK in vivo, camundongos fêmeas BALB/cAnNTac de
7 semanas de idade (Taconic Biosciences, número de catálogo BALB- F) foram implantados subcutaneamente no flanco direito com 0,2 x 10 6 CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL-2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432-02). Os camundongos com tumores palpáveis foram randomizados no dia 4 após implantação e ad- ministrados com 500 µg de anticorpo de controle de isotipo (clone C1.18.4, BioXcell, número de catálogo 0085) ou anticorpo 46 (IgG2a de camundongo anti-CD112R). Ambos os grupos também foram coadmi- nistrados com 500 µg de um controle de isotipo (clone MOPC-21, Bioxcell, número de catálogo 0083). Os tratamentos foram preparados em PBS 1x estéril (GIBCO número de catálogo 14190-136) e um volume total de 100 µl foi injetado por via intraperitoneal.
[0271] Processamento de tumor: Os camundongos foram sacrifi- cados e os tumores foram ressecados 24 horas após o tratamento. O tumor foi processado em suspensões de célula única quebrando-se o tecido através de um filtro de malha de 440 mícrons (Costar nº 3480) colocado sobre um tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon nº 352350) usando a extremidade áspera de um êmbolo de seringa de 3 ml CBD 301077) em tampão FACS (1x PBS, 2% de FBS inativado por calor, GIBCO número de catálogo 16140-071; EDTA 2 mM, Fisher Biorea- gents, número de catálogo BP2482-500). Os tumores desprendidos fo- ram filtrados mais uma vez numa peneira de 70 mícrons (Falcon número de catálogo 352350) e qualquer tecido restante foi ainda quebrado usando um êmbolo de seringa de 3 ml. As células foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos. Os péletes celulares foram ressuspensos em tampão FACS.
[0272] Reestimulação ex vivo: Aproximadamente metade da sus- pensão de célula única foi transferida uma placa de polipropileno de fundo em U de 96 poços com 2 ml de profundidade (Thermofisher nº AB-0932) e centrifugada a 1000 g por 5 minutos a 4ºC. As células foram ressuspensas em meio RPMI + Glutamax (GIBCO nº 61870-035) 1x pré- aquecido com FBS inativado por calor 10%, contendo 20 ng/ml de PMA (Abcam nº ab120297), 500 ng/ml de sal de Ca2+ de Ionomicina (Abcam nº ab120116), 5 µg/ml de Brefeldina A (Biolegend nº 420601) e Monen- sina 2 µM (Biolegend nº 420701). As células foram incubadas por 3,5 horas a 37ºC, 5% de CO2. As células foram centrifugadas novamente conforme descrito acima.
[0273] Manchamento de anticorpo de antígeno de superfície para FACS: Os péletes celulares foram lavados uma vez com 500 µl de tampão FACS frio. As células foram ressuspensas em 100 µl de tampão FACS com TruStain fcXTM (CD16/32 anticamundongo, na diluição indi- cada na Tabela 8. As células foram incubadas em gelo por 15 minutos. O coquetel de anticorpos de superfície foi preparado (consultar a Tabela 8 para detalhes) e adicionado diretamente às células pré-bloqueadas. As células foram incubadas por 1 hora em gelo. As células foram então lavadas duas vezes com 500 µl de tampão FACS.
[0274] Manchamento de corantes de viabilidade: Células man- chadas com corante de viabilidade Live/Dead Aqua diluído 1:500 em 1x PBS (Thermofisher nº L34966) por 10 minutos a 4ºC.
[0275] Fixação: As células foram lavadas uma vez e fixadas com 200 µl de Fixador eBioscience Foxp3/tampão de permeabilização (Ther- mofisher nº 00-5523-00, usando o protocolo do fabricante para diretrizes de diluição) de um dia para o outro a 4ºC.
[0276] Manchamento de anticorpo de antígeno intracelular para FACS: As células foram permeabilizadas adicionando-se diretamente 200 µl de tampão de permeabilização 1x eBioscience (consultar o pro- tocolo do fabricante para diretrizes de diluição). As células foram centri- fugadas a 1.000 g por 5 minutos e manchadas com painel intracelular de anticorpos na diluição final em tampão de permeabilização 1x eBios- cience. As células foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente.
As células foram lavadas duas vezes com 500 µl de tampão de perme- abilização e ressuspensas em 150 µl de tampão FACS.
[0277] As células foram adquiridas no citômetro de fluxo X-20 For- tessa (BD Biosciences). Os dados foram analisados usando Flowjo (Flowjo, LLC) e Graphpad prism (Graphpad Software). TABELA 8: ANTICORPOS USADOS NA FIGURA 12 A E B. Fluoróforo Anticorpo Clone Empresa Nº de catálogo Diluição Tipo de mancha N/A FcBlock 93 Biolegend 101320 1:100 Bloqueio de Fc Alexa700 CD45 I3/2.3 Biolegend 147716 1:100 Superfície PEDazzle NKp46 29A1.4 Biolegend 137630 1:100 Superfície APC/FireTM TCRbeta H57-597 Biolegend 109246 1:100 Superfície BV785 CD69 H1.2F3 Biolegend 101243 1:100 Superfície BV510 Live/Dead Termofisher L34966 1:500 Viabilidade APC Gzmb NGZB Termofisher 17-8898-82 1:100 Intracelular
[0278] Os resultados são representados nas Figuras 12A e B. A Fi- gura 12A mostra a frequência de células NK de infiltração de tumor que expressam CD69. A Figura 12B mostra a frequência de células NK de infiltração de tumor que expressam Granzima B após reestimulação ex vivo. As células NK foram acionadas como segue: população de CD45+, CD45+ SSC-ABaixo, Viva, Singletos, NKp46+ TCRb- . A porta positiva foi definida com base na fluorescência de controles negativos-menos um (FMO). O valor P foi derivado usando o teste t não pareado (*, p <0,05; **, p <0,01, ***, p <0,001). Estes resultados demonstram que o bloqueio de CD112R aumenta significativamente a expressão do marcador de ativação precoce CD69 e da proteína granular citotóxica, granzima B, em células NK intratumorais no modelo de tumor CT-26. EXEMPLO 14. A COMBINAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD112R E ANTI-PD1 TEM EFEITO TERAPÊUTICO E SOBREVIVÊNCIA SEM TUMOR AUMENTADA NO MODELO DE TUMOR CT-26 DE CAMUN- DONGO.
[0279] EFICÁCIA IN VIVO DE BLOQUEIO DE COMBINAÇÃO DE CD112R E PD-1
[0280] A eficácia do bloqueio de CD112R e PD-1 como uma mono- terapia e como uma terapia de combinação foi testada em modelo de tumor singênico de adenocarcinoma de cólon CT-26. Camundongos fê- meas BALB/cAnNTac de 6 semanas de idade (Taconic Biosciences, Balb-F) foram subcutaneamente implantados no flanco direito com 0,2 x 106 CT26.WT (ATCC, número de catálogo CRL-2638) em 0,1 ml de Geltrex 50% (GIBCO, número de catálogo A1432-02) e meio isento de soro RPMI-1640 50% (GIBCO, número de catálogo A10491-01). Os ca- mundongos foram randomizados em grupos de 10 camundongos cada um com volume médio do tumor de 90 mm3 usando o método de rando- mização de distribuição correlacionada. Os camundongos foram trata- dos duas vezes por semana durante duas semanas por injeção intrape- ritoneal como na Tabela 9. Detalhes sobre os agentes de tratamento estão incluídos na Tabela 10. TABELA 9: DETALHES DE GRUPO DE TRATAMENTO Grupo Tratamento 1 Tratamento 2 Anticorpo Dose (mg/kg) Anticorpo Dose (mg/kg) Isotipo Isotipo 1 12,5 Isotipo 2 10 CD112R Anti-CD112R 12,5 Isotipo 2 10 PD-1 Isotipo 1 12,5 Anti-PD-1 10 CD112R+PD-1 Anti-CD112R 12,5 Anti-PD-1 10 TABELA 10: DETALHES DO ANTICORPO Grupo Clone Isotipo 1 Controle de Isotipo Clone C1.18.4, IgG2a de camundongo Isotipo 2 Controle de Isotipo Clone 2A3, IgG2a de rato Anti-CD112R Anticorpo 46, IgG2a de camundongo Anti-PD-1 RMP1-14, IgG2a de rato
[0281] Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por se- mana até que os tumores atingissem o tamanho limite IACUC (< 2000 mm3) O volume do tumor (mm3) foi calculado da seguinte forma: largura (mm) x [comprimento (mm)] 2 x 0,52.
[0282] Os resultados são apresentados nas Figuras 13A a F. As Figuras 13A a E representam as medições do volume tumoral médio e individual, respectivamente, para cada grupo de tratamento com uma função de tempo. Os resultados mostrados na Figura 13A demonstram que a combinação de anti-CD112R com anti-PD-1 foi eficaz e estatisti- camente significativa (conforme medido no dia 21 por teste t não pare- ado) na redução do crescimento tumoral em comparação com animais tratados com isotipo. Monoterapias com anti-CD112R ou anti-PD-1 tam- bém mostraram atividade na redução do crescimento tumoral. A Figura 13F representa a sobrevivência sem tumor geral no dia 50 após implan- tação indicada como fração de sobreviventes sem tumor por grupo após o tratamento conforme descrito acima. Estes resultados demonstram que a combinação de anti-CD112R com anti-PD-1 confere maior taxa de sobrevivência sem tumor do que o controle de isotipo ou qualquer agente monoterapêutico. EXEMPLO 15. LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD112R A CÉLU- LAS QUE EXPRESSAM CD112R MURINO
[0283] A capacidade de anticorpos anti-CD112R para se ligarem a CD112R de camundongo foi avaliada em células que superexpressam CD112R de camundongo. 0,8 x 105 células 293T (ATCC CRL-3216) que foram geneticamente modificadas para superexpressar CD112R de ca- mundongo (293T.mCD112R) foram adicionadas a cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços e manchadas com anticorpos anti- CD112R ou um controle de isotipo IgG1 numa concentração inicial de 10 µg/ml, com diluições seriais de 3 vezes por 30 minutos a 4ºC. As células foram lavadas duas vezes com PBS + FCS 2% e ressuspensas com anticorpo IgG Fc anti-humano Alexa Fluor® 647 (Biolegend, nú- mero de catálogo 409320) diluído 1:100 em PBS+FCS 2% e incubadas a 4ºC por 20 minutos. As células foram subsequentemente lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS + FCS 2%. Os dados celulares foram adquiridos usando um LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) e analisa- dos com o software FlowJo (Tree Star).
[0284] Os resultados são representados na Figura 17 e Tabela 11. A quantificação da ligação de anticorpo a células 293T.mCD112R foi avaliada pela intensidade fluorescente média geométrica (gMFI) do si- nal Alexa Fluor® 647. Estes resultados demonstram que diversos anti- corpos anti-CD112R se ligaram a células que expressaram CD112R de camundongo. EXEMPLO 16. LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD112R A CD112R
MURINO SOLÚVEL
[0285] A capacidade dos anticorpos anti-CD112R para se ligarem a CD112R de camundongo solúvel foi avaliada por ELISA. Em suma, pla- cas Nunc Maxisorp de 96 poços foram revestidas com 1 µg/ml de anti- corpos anti-CD112R ou controle de isotipo (Biolegend, número de catá- logo 403502) em PBS de um dia para o outro a 4ºC. As placas foram então lavadas 6x com PBS + Tween-20 0,01% (PBST) e subsequente- mente bloqueadas com 200 µl de PBS + BSA 1% por 1,5 hora à tempe- ratura ambiente. Após o bloqueio, as placas foram lavadas 6X com PBST. Em seguida, 100 µl de uma proteína de fusão CD112R-hIgG4 de camundongo em PBS + BSA 1% foram adicionados a uma concentra- ção inicial final de 10 µg/ml, com diluições em série de 4 vezes. As pla- cas foram incubadas à temperatura ambiente por 1,5 hora. Em seguida, as placas foram lavadas 6X com PBST e então incubadas com HRP anti-IgG4 (Thermo Fisher, número de catálogo MA1-33437) em 100 µl por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 6X com PBST e desenvolvidas com substrato TMB (Life Technologies, nú- mero de catálogo 002023). A reação foi interrompida com um volume igual de solução de interrupção (Life Technologies, número de catálogo SS04). A absorbância a 450 nm (O.D. 450) foi medida num leitor de placas SpectraMax.
[0286] Os resultados são representados na Figura 18 e Tabela 11.
Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R se liga- ram a CD112R de camundongo solúvel. EXEMPLO 17. INIBIÇÃO OU BLOQUEIO DA LIGAÇÃO DE CD112R MURINO A CD112
[0287] A capacidade das espécies de anticorpos anti-CD112R de reação cruzada para bloquear a ligação de CD112R de camundongo a CD112 de camundongo foi avaliada por ELISA. Em suma, placas Nunc Maxisorp de 96 poços foram revestidas com 1 µg/ml de CD112 de ca- mundongo (Sino Biological, número de catálogo 50318-M08H) em PBS de um dia para o outro a 4ºC. As placas foram então lavadas 6x com PBS + Tween-20 0,01% (PBST) e subsequentemente bloqueadas com 200 µl de PBS + BSA 1% por 1,5 hora à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as placas foram lavadas 6X com PBST. Em seguida, 50 µl de anticorpos anti-CD112R ou controle de isotipo (Biolegend, número de catálogo 403502) em PBS + BSA 1% foram adicionados a uma concen- tração inicial final de 40 µg/ml, com diluições seriais de 2 vezes. 50 µL de uma proteína de fusão CD112R-hIgG4 de camundongo também fo- ram adicionados a cada poço a uma concentração final de 2 µg/ml. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1,5 hora. Em se- guida, as placas foram lavadas 6X com PBST e então incubadas com HRP anti-IgG4 (Thermo Fisher, número de catálogo MA1-33437) em 100 µl por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lava- das 6X com PBST e desenvolvidas com substrato TMB (Life Technolo- gies, número de catálogo 002023). A reação foi interrompida com um volume igual de solução de interrupção (Life Technologies, número de catálogo SS04). A absorbância a 450 nm (O.D. 450) foi medida num leitor de placas SpectraMax.
[0288] Os resultados são representados na Figura 19 e Tabela 11. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-CD112R inibiram a ligação de CD112R de camundongo ao CD112 de camundongo em vários graus. A inibição percentual foi calculada como [100 – ((O.D. 450 de amostra de teste /O.D. 450 máxima)*100%)] O.D. 450 máxima e foi definida como a absorbância a 450 nm na ausência de anticorpo.
[0289] Como mostrado na Tabela 11 e nas Figuras 17 a 19, os an- ticorpos 32, 33, 34, 35 e 36 têm a capacidade para bloquear a interação de CD112 humano com CD112R humano, mas, de acordo com a defi- nição de bloqueio descrita no presente documento, não têm a capaci- dade para bloquear a interação de ligação entre CD112R de camun- dongo e CD112 de camundongo. Consultar, por exemplo, as duas últi- mas colunas da Tabela 11 para os anticorpos 32, 33, 34, 35 e 36, mos- trando a % de inibição da interação de camundongo em 0, 28,3, 20,3, 24,2 e 41,6, respectivamente, em comparação com a % de inibição da interação humana em 75,1, 78,8, 80, 81,7 e 86,2, respectivamente. Os anticorpos que não pertencem à classe exemplificativa de anticorpos relacionados ao anticorpo 32 não exibem tal bloqueio diferencial. TABELA 11: SUMÁRIO DOS DETALHES DE ANTICORPO DE BLO- QUEIO E LIGAÇÃO DE ANTICORPO (CAMUNDONGO) gMFI CD112R 293T- camundongo (au- EC50 de ELISA de Liga- Inibição máxima de ELISA de blo- Inibição máxima de ELISA de Anticorpo mento em vezes em ção de CD112R de Ca- queio de CD112/CD112R de ca- bloqueio de CD112/CD112R relação ao isotipo) mundongo (ng/ml) mundongo (%) de ser humano (%) Anticorpo A 104,6 34,5 90,3 90,6 Anticorpo B 133,3 27,4 92,5 88,9 Anticorpo C 88,1 41,0 90,1 97,8 Anticorpo 32 14,9 269,5 0,0 75,1 Anticorpo 33 73,3 38,3 28,3 78,8 Anticorpo 34 72,2 24,2 20,3 80,0 Anticorpo 35 55,6 21,5 24,2 81,7 Anticorpo 36 76,3 25,1 41,6 86,2 Anticorpo 46 74,8 180,6 88,0 97,6 Anticorpo 58 79,4 411,7 85,7 97,3
[0290] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpreta- dos como limitantes ao escopo da invenção. As divulgações de toda literatura de patente e científica citadas no presente documento estão expressamente incorporadas em sua totalidade a título de referência. Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 1 2 CDR1 de VH FTFSEYTMN 2 2 CDR2 de VH AIVGSGDSTYYADSVKG 3 2 CDR3 de VH AKDYSSGDWIDYGMDV 4 2 CDR1 de VL QASQDISNYLN 5 2 CDR2 de VL DASNLAT 6 2 CDR3 de VL QQFDLLPPT 7 2 FR1 de VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG 8 2 FR2 de VH WVRQAPGKGLEWVS 9 2 FR3 de VH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 10 2 FR4 de VH WGQGTTVTVSS 11 2 DNA de VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGAATATACCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGTAGGTAGTGGTGACAGCACATACTACGCAGAC- TCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGGACTACAGCTCCGGAGACTGGA-
TCGATTATGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA 12 2 Proteína de VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSEYTMNWVRQAPGKGLEWVSAI-
VGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDYSSGDWIDYGMDVWGQGTTVT
VSS 13 2 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 14 2 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 15 2 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC 16 2 FR4 de VL FGGGTKVEIK 17 2 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGCAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGA- AGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTAC
TGTCAGCAGTTCGATCTCCTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 18 2 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLATGVPS-
RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPPTFGGGTKVEIK 19 a 100: não usadas 101 5 CDR1 de VH FTFSDYAMI 102 5 CDR2 de VH AISGGGESTYYADSVKG 103 5 CDR3 de VH AKDYSSGDWIDYGMDV 104 5 CDR1 de VL QASQDISNYLN 105 5 CDR2 de VL DASNLAT 106 5 CDR3 de VL QQFDLLPPT 107 5 FR1 de VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG 108 5 FR2 de VH WVRQAPGKGLEWVS 109 5 FR3 de VH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 110 5 FR4 de VH WGQGTTVTVSS 111 5 DNA de VH GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGACTATGCCATGATATGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTGGAGGTGAAAGCACATACTACGCAGAC- TCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGGACTACAGCTCCGGAGACTGGA-
TCGATTATGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA 112 5 Proteína de VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMIWVRQAPGKGLEWVSAISGGGES-
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDYSSGDWIDYGMDVWGQGTTVTVSS 113 5 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 114 5 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 115 5 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC 116 5 FR4 de VL FGGGTKVEIK 117 5 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGCAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGA- AGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTAC
TGTCAGCAGTTCGATCTCCTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 118 5 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLATGVPS-
RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPPTFGGGTKVEIK 119 a 200: não usadas 201 44 CDR1 de VH GTFDNYYIS 202 44 CDR2 de VH GIFPIFGTANYAQKFQG 203 44 CDR3 de VH AREVGHYSGSPYYMDV 204 44 CDR1 de VL RASQSINSWLA 205 44 CDR2 de VL DASSLES 206 44 CDR3 de VL QQVGPYLT 207 44 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 208 44 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 209 44 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 210 44 FR4 de VH WGKGTTVTVSS 211 44 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCGACAACTATTACATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCTTCCCTATCTTCGGTACCGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTCGGACACTACTCCGG-
CAGCCCATACTACATGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCA 212 44 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFDNYYISWVRQAPGQGLEWMGGIFPIFG-
TANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVGHYSGSPYYMDVWGKGTTVTVSS 213 44 FR1 de VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC 214 44 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIS 215 44 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 216 44 FR4 de VL FGGGTKVEIK 217 44 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAATAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência CCTAAGCTCCTGATCTCCGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG-
CAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATT
ACTGCCAGCAGGTCGGCCCCTACCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 218 44 Proteína de VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINSWLAWYQQKPGKAPKLLISDASSLESGVPS-
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQVGPYLTFGGGTKVEIK 219 a 300: não usadas 301 58 CDR1 de VH FTFGDYAMS 302 58 CDR2 de VH FIGSKFYGGETEYTASVKG 303 58 CDR3 de VH ARGPRRYTYGMDV 304 58 CDR1 de VL RASQSISSYLN 305 58 CDR2 de VL AASSLQS 306 58 CDR3 de VL QQSSTPLT 307 58 FR1 de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASG 308 58 FR2 de VH WFRQAPGKGLEWVG 309 58 FR3 de VH RFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC 310 58 FR4 de VH WGQGTTVTVSS 311 58 DNA de VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTACAGCTTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTTCATTGGAAGCAAATTCTATGGTGGGGAAACAGAATACAC- CGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGGTTCCAAAAGCATCGCCTATCTGCAAATGA ACAGCCTGAAAACCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGACCAAGACGCTACACA-
TACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA 312 58 Proteína de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIGSK-
FYGGETEYTASVKGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARGPRRYTYGMDVWGQGTTVTVSS 313 58 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 314 58 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 315 58 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 316 58 FR4 de VL FGGGTKVEIK 317 58 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCTCCACCCCCCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 318 58 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTPLTFGGGTKVEIK 319 a 400: não usadas 401 10 CDR1 de VH FTFDDYAVH 402 10 CDR2 de VH GISWSSGLIGYADSVKG 403 10 CDR3 de VH AKGPPTYQDYFDL 404 10 CDR1 de VL RASQSVSRYLA 405 10 CDR2 de VL DASNRAT 406 10 CDR3 de VL QQVSFFPPIT 407 10 FR1 de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 408 10 FR2 de VH WVRQAPGKGLEWVS 409 10 FR3 de VH RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC 410 10 FR4 de VH WGRGTLVTVSS 411 10 DNA de VH GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCGTGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGG GAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAGTAGTGGACTAATAGGCTATGCGGAC- TCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAG TCTGAGAGCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGGGCCCTCCTACCTACCAAGAC-
TACTTCGACCTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA 412 10 Proteína de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAVHWVR-
QAPGKGLEWVSGISWSSGLIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPPTYQDYFD
LWGRGTLVTVSS 413 10 FR1 de VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC 414 10 FR2 de VL WYQQKPGQAPRLLIY 415 10 FR3 de VL GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC 416 10 FR4 de VL FGGGTKVEIK 417 10 DNA de VL GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC-
CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGGTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAG- TGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTT
ATTACTGTCAGCAGGTCAGTTTCTTCCCTCCTATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 418 10 Proteína de VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR-
FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQVSFFPPITFGGGTKVEIK 419 a 500: não usadas 501 38 CDR1 de VH FTFSGHLMS 502 38 CDR2 de VH AISGSAGETYYADSVKG 503 38 CDR3 de VH ARDAYYDDWSGWADWYFDL 504 38 CDR1 de VL RASQSVSRYLA 505 38 CDR2 de VL DASNRAT 506 38 CDR3 de VL QQVSLLPPT 507 38 FR1 de VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG 508 38 FR2 de VH WVRQAPGKGLEWVS 509 38 FR3 de VH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 510 38 FR4 de VH WGRGTLVTVSS 511 38 DNA de VH GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGGACACCTAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGATCCGCAGGTGAAACATACTACGCAGAC- TCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGATGCGTACTACGACGACTGGA-
GCGGATGGGCCGATTGGTACTTCGATTTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA 512 38 Proteína de VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGHLMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSA-
GETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAYYDDWSGWADWYFDLWGRGTLVT
VSS 513 38 FR1 de VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC 514 38 FR2 de VL WYQQKPGQAPRLLIY
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 515 38 FR3 de VL GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC 516 38 FR4 de VL FGGGTKVEIK 517 38 DNA de VL GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC-
CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGGTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAG- TGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTT
ATTACTGTCAGCAGGTCAGTCTCCTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 518 38 Proteína de VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR-
FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQVSLLPPTFGGGTKVEIK 519 a 600: não usadas 601 15 CDR1 de VH FTFGDVAMS 602 15 CDR2 de VH YIGSKAYGGETEYTASVKG 603 15 CDR3 de VH ARAGHSYGSIASNWFDP 604 15 CDR1 de VL RASQSISSYLN 605 15 CDR2 de VL GASSLQS 606 15 CDR3 de VL QQGFYTPWT 607 15 FR1 de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASG 608 15 FR2 de VH WFRQAPGKGLEWVG 609 15 FR3 de VH RFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC 610 15 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 611 15 DNA de VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTACAGCTTCTGGATTCACCTTTGGTGATGTCGCTATGTCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTACATTGGAAGCAAAGCTTATGGTGGGGAAACAGAATACAC- CGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGGTTCCAAAAGCATCGCCTATCTGCAAATGA ACAGCCTGAAAACCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGCTGGACACAGCTACGGA-
TCCATCGCCAGCAACTGGTTCGACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 612 15 Proteína de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDVAMSWFR-
QAPGKGLEWVGYIGSKAYGGETEYTASVKGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARAGHSYGSIA
SNWFDPWGQGTLVTVSS 613 15 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 614 15 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 615 15 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 616 15 FR4 de VL FGGGTKVEIK 617 15 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAGGATTCTACACTCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 618 15 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGFYTPWTFGGGTKVEIK 619 a 700: não usadas 701 35 CDR1 de VH GTFSSAAIS 702 35 CDR2 de VH NIIPIVGIANYAQKFQG 703 35 CDR3 de VH ARDTGRGYTRHFWFDP 704 35 CDR1 de VL RASQSISSYLN
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 705 35 CDR2 de VL AASSLQS 706 35 CDR3 de VL QQSDILYT 707 35 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 708 35 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 709 35 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 710 35 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 711 35 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCTCCGCCGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAACATCATCCCTATCGTAGGTATAGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGACGGGGATACAC-
CAGACACTTCTGGTTTGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 712 35 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSAAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPIVGI-
ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS 713 35 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 714 35 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 715 35 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 716 35 FR4 de VL FGGGTKVEIK 717 35 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCGACATCCTCTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 718 35 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK 719 a 800: não usadas 801 47 CDR1 de VH GTFSNYAIS 802 47 CDR2 de VH GIIPIFGTANYAQKFQG 803 47 CDR3 de VH ARGRGALALVGPYYGMDV 804 47 CDR1 de VL RSSQSLLHSNGYNYLD 805 47 CDR2 de VL LGSHRAS 806 47 CDR3 de VL MQALRAPT 807 47 FR1 de VH EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 808 47 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 809 47 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 810 47 FR4 de VH WGQGTTVTVSS 811 47 DNA de VH GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGCAGAGGCGCTCTGGCAC-
TCGTCGGACCATACTACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA 812 47 Proteína de VH EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFG-
TANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRGALALVGPYYGMDVWGQGTTVTVSS 813 47 FR1 de VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 814 47 FR2 de VL WYLQKPGQSPQLLIY 815 47 FR3 de VL GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 816 47 FR4 de VL FGGGTKVEIK 817 47 DNA de VL GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGG-
CCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTCATCGGG- CCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAGGCACTCCGAGCCCCTAC-
TTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 818 47 Proteína de VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRAS-
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALRAPTFGGGTKVEIK 819 a 900: não usadas 901 46 CDR1 de VH FTFGDYAMS 902 46 CDR2 de VH FIGSKAYGGTTEYTASVKG 903 46 CDR3 de VH ARGPRRYTYGMDV 904 46 CDR1 de VL RASQSISSYLN 905 46 CDR2 de VL AASSLQS 906 46 CDR3 de VL QQSSTPLT 907 46 FR1 de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASG 908 46 FR2 de VH WFRQAPGKGLEWVG 909 46 FR3 de VH RFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC 910 46 FR4 de VH WGQGTTVTVSS 911 46 DNA de VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTACAGCTTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCTATGAGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTTCATTGGAAGCAAAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACAC- CGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGGTTCCAAAAGCATCGCCTATCTGCAAATGA ACAGCCTGAAAACCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGACCAAGACGCTACACA-
TACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA 912 46 Proteína de VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDYAMSWFRQAPGKGLEWVGFIGSKAYGGT-
TEYTASVKGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARGPRRYTYGMDVWGQGTTVTVSS 913 46 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 914 46 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 915 46 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 916 46 FR4 de VL FGGGTKVEIK 917 46 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCTCCACCCCCCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 918 46 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTPLTFGGGTKVEIK 919 a 1000: não usadas 1001 32 CDR1 de VH GTFSSYAIS 1002 32 CDR2 de VH GIIPISGTANYAQKFQG 1003 32 CDR3 de VH ARDTGRGYTRHFWFDP
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 1004 32 CDR1 de VL RASQSISSYLN 1005 32 CDR2 de VL AASSLQS 1006 32 CDR3 de VL QQSDILYT 1007 32 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 1008 32 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 1009 32 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 1010 32 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 1011 32 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTCTGGTACAGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGACGGGGATACAC-
CAGACACTTCTGGTTTGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 1012 32 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPISG-
TANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS 1013 32 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 1014 32 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 1015 32 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 1016 32 FR4 de VL FGGGTKVEIK 1017 32 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCGACATCCTCTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 1018 32 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK 1019 a 2000: não usadas 2001 33 CDR1 de VH GTFGNYAIS 2002 33 CDR2 de VH GIIPIPGIANYAQKFQG 2003 33 CDR3 de VH ARDTGRGYTRHFWFDP 2004 33 CDR1 de VL RASQSISSYLN 2005 33 CDR2 de VL AASSLQS 2006 33 CDR3 de VL QQSDILYT 2007 33 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 2008 33 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 2009 33 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 2010 33 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 2011 33 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCGGAAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCCCAGGTATCGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGACGGGGATACAC-
CAGACACTTCTGGTTTGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 2012 33 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFGNYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIPGI-
ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 2013 33 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 2014 33 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 2015 33 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 2016 33 FR4 de VL FGGGTKVEIK 2017 33 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCGACATCCTCTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 2018 33 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK 2019 a 3000: não usadas 3001 34 CDR1 de VH GTFSSAAIS 3002 34 CDR2 de VH GIFPISGHANYAQKFQG 3003 34 CDR3 de VH ARDTGRGYTRHFWFDP 3004 34 CDR1 de VL RASQSISSYLN 3005 34 CDR2 de VL AASSLQS 3006 34 CDR3 de VL QQSDILYT 3007 34 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 3008 34 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 3009 34 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 3010 34 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 3011 34 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCGCCGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTG GACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCTTCCCTATCTCCGGTCACGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGACGGGGATACAC-
CAGACACTTCTGGTTTGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 3012 34 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSAAISWVRQAPGQGLEWMGGIFPIS-
GHANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS 3013 34 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 3014 34 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 3015 34 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 3016 34 FR4 de VL FGGGTKVEIK 3017 34 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCGACATCCTCTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 3018 34 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK 3019 a 4000: não usadas 4001 36 CDR1 de VH GTFATYAIS 4002 36 CDR2 de VH GIFPLSGTANYAQKFQG
Tabela de Sequências SEQ ID NO Clone nº Descrição Sequência 4003 36 CDR3 de VH ARDTGRGYTRHFWFDP 4004 36 CDR1 de VL RASQSISSYLN 4005 36 CDR2 de VL AASSLQS 4006 36 CDR3 de VL QQSDILYT 4007 36 FR1 de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 4008 36 FR2 de VH WVRQAPGQGLEWMG 4009 36 FR3 de VH RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC 4010 36 FR4 de VH WGQGTLVTVSS 4011 36 DNA de VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG-
TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCGCAACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCTTCCCTCTCTCCGGTACAGCAAACTACGCACA- GAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGACGGGGATACAC-
CAGACACTTCTGGTTTGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA 4012 36 Proteína de VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFATYAISWVRQAPGQGLEWMGGIFPLSG-
TANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS 4013 36 FR1 de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 4014 36 FR2 de VL WYQQKPGKAPKLLIY 4015 36 FR3 de VL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 4016 36 FR4 de VL FGGGTKVEIK 4017 36 DNA de VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG- CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA
CTGTCAGCAAAGCGACATCCTCTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA 4018 36 Proteína de VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado caracterizado pelo fato de que compre- ende: i) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (b) HCDR2 que compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 2; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (e) LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; ou ii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 102; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106; ou iii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 202; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 203; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 204; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206; ou iv) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 301; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 302; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 303; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 305; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306; ou v) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 401; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 402; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 403; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 404; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 405; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 406; ou vi) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 501; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 502; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 503; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 504; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 505; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 506; ou vii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 601; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 602; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 603; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 604; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 605; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 606; ou viii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 701; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 702; (c) HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 703; (d) LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 704; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 705; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 706; ou ix) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 801; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 802; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 803; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 804; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 805; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 806; ou x) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 901; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 902; (c) HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 903; (d) LCDR1 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 904; (e) LCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 905; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 906; ou xi) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 1002; (c) HCDR3 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1004; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1006; ou xii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 2002; (c) HCDR3 que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 2003; (d) LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2004; (e) LCDR2 que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2006; ou xiii) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3002; (c) HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3003; (d) LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3006; ou xiv) (a) HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 4001; (b) HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4002; (c) HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4003; (d) LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4004; (e) LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4005; e (f) LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
4006.
2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região vari- ável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: i) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; ou ii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; ou iii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 218; ou iv) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 312 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 318; ou v) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 412 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 418; ou vi) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 512 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 518; ou vii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 612 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 618; ou viii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 718; ou ix) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 812 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 818; ou x) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 912 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 918; ou xi) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 1018; ou xii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 2018; ou xiii) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 3018; ou xiv) a VH é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012 e a VL é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 4018.
3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,
caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região va- riável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: i) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; ou ii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; ou iii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218; ou iv) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 312 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 318; ou v) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 412 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 418; ou vi) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 512 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 518; ou vii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 612 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618; ou viii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 718; ou ix) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 812 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 818; ou x) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 912 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 918; ou xi) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1012 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1018; ou xii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2012 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2018; ou xiii) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3012 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3018; ou xiv) a VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4012 e a VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4018.
4. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
5. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
6. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que o fragmento é um Fab, Fab’, Fv, scFv ou (Fab’)2.
7. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um an- ticorpo de comprimento completo.
8. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizado pelo fato de que a região Fc do anticorpo compreende IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
9. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compre- ende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana.
10. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compre- ende uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana.
11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região cons- tante de cadeia pesada de IgG4 humana mutante.
12. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 11, ca- racterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma mutação selecionada de uma substitui- ção em Ser228, uma substituição em Leu235, uma substituição em Asn297, ou uma combinação das mesmas, em que a numeração está de acordo com a numeração EU.
13. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 11, ca- racterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma substituição S228P e uma substituição L235E, em que a numeração está de acordo com a numeração EU.
14. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compre- ende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana, e em que o anticorpo i) aumenta a degranulação de célula NK; e/ou ii) aumenta a ativação de células NK; e/ou iii) aumenta a ativação de células NK intratumorais quando apresentada em combinação com um anticorpo anti-TIGIT; e/ou iv) inibe o crescimento tumoral in vivo; e/ou v) previne o enxerto tumoral mediante teste repetido com tu- mor.
15. Versão humanizada ou completamente humana do anti- corpo, caracterizada pelo fato de que está de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
16. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que compreende um antagonista de PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 ou TIM-3.
18. Método para intensificar, aumentar e/ou sustentar uma resposta imune antitumoral num indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou a composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo que tem um tumor.
19. Método para intensificar a ativação de célula T CD8 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar o an- ticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou a composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo que necessita de ativação de célula T CD8.
20. Método para intensificar a produção gama de interferon de célula T CD8 num indivíduo, caracterizado pelo fato de que compre- ende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 15, ou a composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo que necessita de produção gama de interferon de célula T CD8.
21. Método para intensificar a ativação de célula NK num in- divíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o an- ticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indi- víduo que necessita de ativação de célula NK.
22. Método para intensificar a citotoxicidade mediada por cé- lula NK num indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende ad- ministrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, ou a composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo que necessita de aumento de citotoxicidade mediada por célula NK.
23. Método para tratar câncer num indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou a composição, como defi- nido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo que tem um câncer.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma ou leucemia.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é câncer de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer pituitário, câncer esofágico, as- trocitoma, sarcoma de tecido mole, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo câncer de pulmão de células não pequenas de cé- lulas escamosas), adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointesti- nal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carci- noma de glândula salivar, câncer de rim, carcinoma de célula renal, cân- cer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, car- cinoma hepático, câncer de cérebro, câncer endometrial, câncer de tes- tículo, colangiocarcinoma, carcinoma de vesícula biliar, câncer gástrico, melanoma, ou vários tipos de câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço).
26. Método para intensificar as interações CD226 com
CD112 num indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende ad- ministrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, ou a composição, como definido na reivindicação 16 ou 17, a um indivíduo.
27. Método, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar uma segunda terapia.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é radioterapia ou cirurgia.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de uma qui- mioterapia, um agente opsonizante, ou um agente de esgotamento de célula T reguladora.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de PD-1, PD-L1, CTLA-4, Lag-3 ou TIM-3.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de TIGIT ou CD96.
32. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4 e CD155.
33. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de CD47.
34. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de CD39.
35. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri-
zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista de IL-27.
36. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a segunda terapia é a administração de um anta- gonista STING.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que o antagonista é um anticorpo.
38. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
39. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 38.
40. Método para produzir o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 39, sob condições em que o anticorpo é expresso.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de que compreende adicionalmente purificar o anticorpo.
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