BR112020022593A2 - método para tratar polpa de dissolução, polpa de dissolução, fibra têxtil ou celulose derivatizada, e, uso de uma monoxigenase lítica de polissacarídeo. - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA TRATAR POLPA DE DISSOLUÇÃO, POLPA DE DISSOLUÇÃO, FIBRA TÊXTIL OU CELULOSE DERIVATIZADA, E, USO DE UMA MONOXIGENASE LÍTICA DE POLISSACARÍDEO. A presente invenção se refere ao tratamento de polpa de dissolução com uma monoxigenase lítica de polissacarídeo. O tratamento com monoxigenase lítica de polissacarídeo resulta em viscosidade reduzida e/ou controle de viscosidade melhorado no processo de produção de polpa de dissolução e/ou maior reatividade da polpa de dissolução.

Description

1 / 36 MÉTODO PARA TRATAR POLPA DE DISSOLUÇÃO, POLPA DE DISSOLUÇÃO, FIBRA TÊXTIL OU CELULOSE DERIVATIZADA, E,

USO DE UMA MONOXIGENASE LÍTICA DE POLISSACARÍDEO Referência à LISTAGEM de sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador. O formato legível por computador é incorporado no presente documento por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao tratamento de polpa de dissolução com uma ou mais enzimas. O tratamento enzimático resulta em viscosidade reduzida e/ou controle de viscosidade melhorado no processo de produção de polpa de dissolução e/ou maior reatividade da polpa de dissolução final.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A polpa de dissolução comercial ou a polpa de grau de dissolução comercial é uma polpa branqueada química com um teor de celulose suficientemente alto para ser adequada para a produção ou regeneração de celulose e derivados de celulose. A polpa de dissolução comercial tem propriedades específicas, tais como um alto nível de brilho e distribuição de peso molecular uniforme. A polpa de dissolução comercial é fabricada para usos que exigem uma alta pureza de celulose química e, especificamente, um baixo teor de hemicelulose, visto que a hemicelulose quimicamente semelhante pode interferir com processos subsequentes. A polpa de dissolução é assim designada pois não é transformada em papel, mas sim dissolvida ou num solvente ou por derivatização numa solução homogênea, o que a torna completamente acessível quimicamente e remove qualquer estrutura fibrosa remanescente. Uma vez dissolvida, a mesma pode ser repuxada em fibras têxteis, como viscose ou Lyocell, ou reagida quimicamente para produzir celuloses derivatizadas, tais como triacetato de

2 / 36 celulose, um material semelhante a plástico formado em fibras ou filmes, ou éteres de celulose, tais como metilcelulose, utilizadas como um espessante.

[004] A fabricação de viscose convencional que usa polpas de dissolução como matéria prima exige uma melhora com relação a seu impacto ambiental, bem como ao seu custo de produção. Existe uma necessidade na técnica de fornecer um método para tratar a polpa de dissolução com custos reduzidos e menos impacto ambiental.

[005] A presente invenção fornece uma solução à base de monoxigenase lítica de polissacarídeo que reduz a viscosidade e/ou melhora o controle da viscosidade na produção de polpa de dissolução, por exemplo, polpa de dissolução kraft e sulfito. A solução de enzima descrita nesta invenção permite uma despolimerização mais seletiva da celulose e, assim, um melhor controle da viscosidade da polpa em comparação com os métodos convencionais em uso que são não seletivos com muitas reações colaterais, tal como hidrólise de oxigênio, peróxido de hidrogênio, ozônio, hipoclorito de sódio e ácida. Além disso, a reatividade da polpa de dissolução na presente invenção é melhorada, reduzindo, assim, a quantidade de produtos químicos usados no processo de produção de viscose e/ou melhorando a processabilidade em termos de filtrabilidade de graxa de viscose no processo de fabricação de viscose. A economia na quantidade de produtos químicos utilizados na produção de celulose regenerada como dissulfeto de carbono (CS2) no processo de fabricação de viscose reduzirá custos e o impacto ambiental. Da mesma forma, espera-se que o aumento da reatividade da polpa em dissolução beneficie o processo de produção dos derivados da celulose, tal como os processos subsequentes de esterificação e eterificação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A invenção fornece um método para tratar a polpa de dissolução, compreendendo uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo.

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[007] O método da presente invenção gera polpa de dissolução com viscosidade reduzida e/ou controle de viscosidade melhorado no processo de produção de polpa de dissolução e/ou maior reatividade para fabricação de viscose e/ou maior teor de grupos oxidados, em comparação com a polpa de dissolução obtida pelo mesmo processo em que o tratamento com monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO) é omitido. A referida polpa de dissolução é polpa de dissolução kraft e/ou polpa de dissolução de sulfito.

[008] A presente invenção fornece ainda uma polpa de dissolução feita pelo método da presente invenção.

[009] A presente invenção fornece ainda uma fibra têxtil ou uma celulose derivatizada feita da polpa de dissolução da presente invenção.

[0010] A presente invenção fornece ainda a utilização de uma monoxigenase lítica de polissacarídeo para o tratamento de polpa de dissolução.

DEFINIÇÕES

[0011] Polpa de dissolução: A polpa de dissolução é uma polpa de alto grau de celulose, com baixo teor de hemicelulose, lignina e resina. Essa polpa tem propriedades especiais, tais como um alto nível de brilho e distribuição de peso molecular uniforme. A mesma é usada para fabricar produtos que incluem fibras têxteis de acetato e raiom, celofane, filme fotográfico e vários aditivos químicos. Em grande medida, o uso de polpa de madeira de dissolução depende de sua pureza (teor de celulose), que depende principalmente do processo de produção. Para obter produtos de alta qualidade, estas chamadas polpas “especiais” precisam atender a certas exigências, como alto teor de celulose, baixo teor de hemicelulose, uma distribuição uniforme de peso molecular e alta reatividade de celulose. A maioria das polpas de dissolução comerciais atendem a estas demandas a uma certa medida. Todavia, alcançar alta acessibilidade de celulose bem como reatividade de solvente e reagente não é uma tarefa fácil devido à estrutura

4 / 36 complexa e compacta apresentada pela celulose. Cerca de 77% de toda a polpa de dissolução é usada na fabricação de fibras celulósicas (raiom e acetato).

[0012] São utilizados dois processos básicos para produzir polpa de dissolução: (a) o processo sulfito; e b) o processo sulfato (kraft).

[0013] Para fabricar polpas de grau de dissolução, a remoção de hemiceluloses da fibra de madeira é crucial, devido ao fato de que as hemiceluloses podem afetar a filtrabilidade da viscose, a xantação da celulose e a resistência do produto final durante a produção de viscose. As hemiceluloses são removidas durante o cozimento de madeira e o subsequente branqueamento. Na polpação de sulfito, as condições ácidas usadas são responsáveis pela remoção da maior parte da hemicelulose, enquanto no processo de sulfato/kraft, normalmente é necessária uma etapa de pré- hidrólise para remover hemiceluloses. Outro método para remover hemiceluloses é por meio do tratamento de polpas com enzimas que reagem apenas com a porção de hemicelulose da polpa.

[0014] Polpa de dissolução kraft: “Polpa de dissolução kraft” é sinônimo de “polpa de dissolução de sulfato”. Um exemplo preferencial é uma polpa de dissolução kraft pré-hidrólise. A polpa de dissolução kraft é produzida digerindo-se cavacos de madeira em temperaturas acima de cerca de 120 °C com uma solução de hidróxido de sódio e sulfeto de sódio. Também são realizadas algumas produções de polpa kraft em que o sulfeto de sódio tem sua quantidade aumentada por oxigênio ou antraquinona. Em comparação à produção de polpa de soda, a produção de polpa kraft é particularmente útil para a produção de polpa de madeiras de resinosas, que contêm uma porcentagem mais alta de lignina que as madeiras de folhosas. O termo “polpa de dissolução kraft” é sinônimo de “celulose de dissolução kraft” e “polpa de grau de dissolução kraft” e se refere à polpa que tem um alto teor de celulose. O teor de celulose da polpa de dissolução kraft é

5 / 36 preferencialmente pelo menos 90% (peso/peso), tal como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% (p/p). A polpa de dissolução kraft é fabricada para utilizações que exijam uma alta preza química, e particularmente um baixo teor de hemicelulose. O teor de hemicelulose da polpa de dissolução é preferencialmente de menos que 10% (peso/peso) tal como menos que 9%, menos que 8%, menos que 7%, menos que 6%, menos que 5%, menos que 4%, menos que 3%, menos que 2% ou menos que 1% (p/p). A polpa de dissolução kraft pode, por exemplo, ser utilizada para a geração de celulose regenerada ou para a geração de derivados de celulose. “Polpa de grau de dissolução kraft” também pode ser definida como polpa que foi purificada suficientemente para uso na produção de raiom de viscose, éteres de celulose ou ésteres de celulose com ácidos orgânicos ou inorgânicos.

[0015] Polpa de dissolução de sulfito: O processo de sulfito produz polpa de madeira que são fibras de celulose quase puras por meio do uso de vários sais de ácido sulfuroso para extrair a lignina de cavacos de madeira em grandes recipientes de pressão denominados digestores. Os sais usados no processo de polpação são sulfitos (SO32−) ou bissulfitos (HSO3−), dependendo do pH. O contraíon pode ser sódio (Na+), cálcio (Ca2+), potássio (K+), magnésio (Mg2+) ou amônio (NH4+).

[0016] A polpação de sulfito é executada entre pH 1,5 e 5, dependendo do contraíon para sulfito (bissulfito) e a razão entre base e ácido sulfuroso. A polpa está em contato com os produtos químicos de polpação por 4 a 14 horas e a temperaturas na faixa de 130 a 160 °C (266 a 320 °F), novamente dependendo dos produtos químicos usados.

[0017] A maioria dos intermediários envolvidos na deslignificação na polpação de sulfito são carbocátions estabilizados por ressonância formados ou por protonação de ligação dupla de carbono-carbono ou clivagem ácida de

6 / 36 ligações de éter que conectam muitos dos constituintes de lignina. É a última reação que é responsável pela maior parte da degradação de lignina no processo de sulfito. Não é esperado que o processo de sulfito degrade lignina na mesma medida que o processo kraft e os lignossulfonatos do processo de sulfito são subprodutos úteis.

[0018] O licor de cozimento gasto da polpação de sulfito é usualmente chamado de licor marrom, mas os termos licor vermelho, licor espesso e licor de sulfito também são usados (em comparação com licor preto no processo kraft). Lavadoras de polpa, que usam fluxo em contracorrente, removem os produtos químicos de cozimento gastos e a lignina e hemicelulose degradadas.

[0019] O “branqueamento” é a remoção de cor da polpa, principalmente a remoção de traços de lignina que permanecem ligados à fibra após a operação de produção de polpa primária. O branqueamento geralmente envolve o tratamento com agentes oxidantes, tais como cloro (estágio de C), dióxido de cloro (estágio de D), oxigênio (estágio de O), peróxido de hidrogênio (estágio de P), ozônio (estágio de Z) e ácido paracético (CH3CO3H; estágio de Paa) ou um agente redutor, tal como ditionito de sódio (estágio de Y). Há processos livres de cloro (Cl2; estágio de C), tais como o branqueamento livre de cloro elementar (ECF) em que dióxido de cloro (ClO2; estágio de D) é usado principalmente e é tipicamente seguido de um estágio de extração alcalina. O branqueamento completamente livre de cloro (TCF) é outro processo em que principalmente produtos químicos à base de oxigênio são utilizados. O processo de branqueamento de polpa, de, tipicamente compreende uma sequência de etapas de branqueamento com lavagem entre as mesmas para remover os produtos de degradação provenientes das reações de branqueamento.’

[0020] Extração Cáustica a Frio (CCE) : Uma extração alcalina a frio, também chamada de Extração Cáustica a Frio (CCE), é um método usado

7 / 36 para remover carboidratos não celulósicos de cadeia curta (purificação de celulose) que é baseado em efeitos físicos como intumescimento e solubilização. Geralmente, um estágio de CCE ocorre a temperaturas abaixo de 45oC e com o uso de uma dosagem muito alta de NaOH que, em fase líquida, pode alcançar valores de até 100 g/l. Dependendo da consistência da polpa em uso, isso determinará a quantidade de NaOH por peso seco de polpa. As condições típicas para um estágio de CCE podem ser 5 a 10% em p/p de NaOH na fase líquida por pelo menos 10 minutos.

[0021] Extração Cáustica a Quente (HCE): o termo “extração cáustica a quente” (HCE) é sinônimo de “extração alcalina a quente”. A HCE é um método para se remover hemicelulose de cadeia curta e celulose amorfa em polpas. Um estágio de extração cáustica a quente (HCE) é um processo de purificação que é baseado em reações químicas, em particular, descamação alcalina de hemiceluloses, que é executado a temperaturas mais elevadas e concentração de NaOH inferior em comparação com a CCE.

[0022] Brilho ISO: O brilho ISO é definido na ISO 2470-1 (método de medição de brilho ISO de polpas, papéis e tábuas), e é o fator de radiância intrínseca [refletância] medido com um refletômetro que tem as características descritas na ISO 2469.

[0023] Viscosidade de polpa: é medida por meio da dissolução da polpa em solvente de celulose adequado como em cupri-etilenodiamina (CED) e medindo a viscosidade de solução. Essa medição fornece uma indicação do grau médio de polimerização da celulose. Essa propriedade pode ser referida como viscosidade intrínseca em ml/g e medida de acordo com o ISO 5351 ou como viscosidade TAPPI em cP e medida de acordo com TAPPI T 230.'

[0024] Polpa de dissolução kraft não branqueada ou parcialmente branqueada ou extraída alcalina: é produzida por um processo de cozimento à base de kraft como cozimento kraft pré-hidrólise (PHK), mas não

8 / 36 completamente branqueada e purificada até se tornar uma polpa de dissolução kraft comercial e, dessa forma, não é um produto finalizado. Tipicamente, tem um brilho ISO abaixo de 90% (tal como abaixo de 85%, tal como abaixo de 80%, tal como abaixo de 75%, tal como abaixo de 70%, tal como abaixo de 65%, tal como abaixo de 60%, tal como abaixo de 55%, tal como abaixo de 50%, tal como abaixo de 45%, tal como abaixo de 40%, tal como abaixo de 35% e tal como abaixo de 30%).'

[0025] Polpa de dissolução de sulfito não branqueada ou parcialmente branqueada ou extraída alcalina: é produzida por um processo de cozimento à base de sulfito, mas não completamente branqueada e purificada até se tornar uma polpa de dissolução de sulfito comercial e, dessa forma, não é um produto finalizado. Tipicamente, tem um brilho ISO abaixo de 90% (tal como abaixo de 85%, tal como abaixo de 80%, tal como abaixo de 75%, tal como abaixo de 70%, tal como abaixo de 65%, tal como abaixo de 60%, tal como abaixo de 55%, tal como abaixo de 50%, tal como abaixo de 45%, tal como abaixo de 40%, tal como abaixo de 35% e tal como abaixo de 30%).'

[0026] Pasta de dissolução kraft branqueada e pasta de dissolução de sulfito branqueada: é produzida por uma pasta de dissolução kraft ou um processo de cozimento à base de sulfito, mas totalmente branqueada e purificada até se tornar uma polpa de dissolução comercial. Tipicamente, tem um brilho ISO acima de 90% (acima de 91%, acima de 92%, acima de 93%, acima de 94%, acima de 95%, acima de 96%, acima de 97 %, tal como acima de 98%, tal como acima de 99%, tal como 100%).

[0027] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[0028] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

9 / 36 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] A invenção se refere a um método para tratar a polpa de dissolução, compreendendo uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO).

[0030] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma celulase.

[0031] Em um método preferido da presente invenção, a etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e a etapa de submeter a polpa de dissolução a uma celulase são realizadas simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em uma modalidade adicional preferida da presente invenção, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo é adicionada à polpa de dissolução juntamente com a celulase. Em uma modalidade adicional preferida da presente invenção, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo é adicionada à polpa de dissolução antes da adição de uma celulase. Em uma modalidade adicional preferida da presente invenção, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo é adicionada à polpa de dissolução após a adição de uma celulase.

[0032] Em uma modalidade preferida, o presente método da presente

10 / 36 invenção compreende uma etapa de branquear a polpa de dissolução. Em um método preferido da presente invenção, a etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e a etapa de branquear a polpa de dissolução são realizadas simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

[0033] Em um método preferido da presente invenção, a etapa de branqueamento da polpa de dissolução é realizada usando um produto químico selecionado do grupo que consiste em ClO2, O2, O3, H2O2, CH3CO3H e NaOCl.

[0034] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda a etapa de Extração Alcalina. No método da presente invenção, a Extração Alcalina é um estágio E, HCE ou CCE. Tratamentos de purificação alcalina especial como tratamentos de HCE ou CCE podem render níveis superiores de celulose em processos de sulfito e kraft. No caso de polpas de sulfito, a HCE é tipicamente empregada como purificar ainda mais a polpa após o cozimento de sulfito.

[0035] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e um doador de elétrons do mesmo, de preferência ácido ascórbico, ácido gálico, pirogalol ou cisteína. O doador de elétrons pode existir na polpa de dissolução a ser tratada. Em uma modalidade, nenhuma ou uma pequena quantidade de doador de elétrons é adicionada à polpa de dissolução. Em outra modalidade, uma quantidade eficaz de doador de elétrons é adicionada à polpa de dissolução.

[0036] Em um método preferido da presente invenção, a pasta de dissolução é uma pasta de dissolução não branqueada, parcialmente branqueada, branqueada ou extraída com alcalinidade. Em um método preferido da presente invenção, a pasta de dissolução é pasta kraft ou pasta sulfito.

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[0037] Em uma modalidade, a monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% de identidade [tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 99%] com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:2, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, a celulase adicionada no método da presente invenção tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% de identidade (tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 99%) com a SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7.

[0038] Em uma modalidade preferida, a monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção compreende ou consiste na SEQ ID NO: 1 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 2 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 3 ou no seu polipeptídeo maduro; ou a celulase compreende ou consiste na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 5 ou no seu polipeptídeo maduro, na SEQ ID NO: 6 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 7 ou no seu polipeptídeo maduro.

[0039] Em uma outra modalidade preferida, a monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção compreende 19 a 226 aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. Em uma outra modalidade preferida, a monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção compreende 20 a 254 aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. Em uma outra modalidade preferida, a

12 / 36 monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção compreende 22 a 249 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. Em outra modalidade preferida, a celulase adicionada no método da presente invenção compreenda SEQ ID NO: 4 ou o seu comprimento total, ou uma sua sequência homóloga, uma sua variante alélica ou um seu fragmento funcional. Em uma outra modalidade preferida, a celulase adicionada no método da presente invenção compreende 22-305 aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. Em uma outra modalidade preferida, a celulase adicionada no método da presente invenção compreende 22 a 293 aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. Em uma outra modalidade preferida, a celulase adicionada no método da presente invenção compreende 19 a 409 aminoácidos da SEQ ID NO: 7 ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional.

[0040] A concentração da monoxigenase lítica de polissacarídeo adicionada no método da presente invenção é preferencialmente de 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 100000 mg/kg de polpa seca em forno, tal como uma concentração selecionada dentre o grupo que consiste em 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 250 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 1000 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 2000 mg/kg de polpa seca em forno, de 1,0 mg/kg de polpa seca em forno a 5000 mg/kg de polpa seca em forno, de 5,0 mg/kg de polpa seca em forno a 10000 mg/kg de polpa seca em forno, de 10,0 mg/kg de polpa seca em forno a 15000 mg/kg de polpa seca em forno, de 15,0 mg/kg de polpa seca em forno a 20000 mg/kg de polpa seca em forno, de 20,0 mg/kg de polpa seca em forno a 30000 mg/kg de polpa seca em forno, de 30,0 mg/kg de polpa seca em forno a 40000 mg/kg de polpa seca em forno, de 40,0

13 / 36 mg/kg de polpa seca em forno a 60000 mg/kg de polpa seca em forno, de 60,0 mg/kg de polpa seca em forno a 80000 mg/kg de polpa seca em forno e de 80,0 mg/kg de polpa seca em forno a 100000 mg/kg de polpa seca em forno, ou qualquer combinação destes intervalos.

[0041] A concentração da celulase adicionada na presente invenção é de 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 100 mg/kg de polpa seca em forno, tal como uma concentração selecionada dentre o grupo que consiste em 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 80,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 60,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 40,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 20,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 10,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 5,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 85,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 65,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 45,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 25,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 15,0 mg/kg de polpa seca em forno e de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 5,0 mg/kg de polpa seca em forno, ou qualquer combinação destes intervalos.

[0042] O método de acordo com a invenção resulta num controle de viscosidade melhorado, permitindo, assim, a redução na produção de polpa de dissolução fora da especificação de viscosidade final/alvo, tipicamente mais que 50% (como mais que 60% ou mais que 70%) de redução na produção de polpa de dissolução fora do grau em relação à viscosidade. Em uma modalidade, o método de acordo com a invenção resulta em reatividade aumentada da polpa de dissolução kraft e/ou de sulfito, particularmente a polpa de dissolução kraft que tem uma reatividade aumentada de pelo menos 10% (tal como pelo menos 20% ou pelo menos 30%).

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[0043] Em uma modalidade preferida, o método resulta em viscosidade reduzida e/ou controle de viscosidade melhorado no processo de produção de polpa de dissolução; e/ou o método resulta em maior reatividade da polpa de dissolução, de preferência maior reatividade de Fock relacionada ao processo de fabricação de viscose e, portanto, permitindo economia em CS2 e, portanto, reduzindo custos e o impacto ambiental; e/ou o método resulta em maior teor de grupos oxidados da polpa de dissolução. Este aumento em grupos oxidados pode aumentar a reatividade da polpa de dissolução não apenas em termos de intumescimento da fibra e acessibilidade química, mas também considerando que mais pontos de ancoragem (grupos carbonila e/ou carboxila) na celulose estarão disponíveis para processos de derivatização subsequentes no produção de derivados de celulose.

[0044] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda submeter a polpa de dissolução a uma xilanase e/ou uma mananase e/ou uma lipase e/ou lacase e/ou peroxidase.

[0045] Uma polpa de dissolução produzida por meio do método descrito acima também faz parte da invenção. Uma fibra têxtil ou uma celulose derivatizada produzida da polpa de dissolução descrita acima também faz parte da invenção.

[0046] A invenção também se refere à utilização de uma monoxigenase lítica de polissacarídeo para o tratamento de polpa de dissolução. Monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO)

[0047] O termo “monoxigenase lítica de polissacarídeo” significa uma enzima que oxida carbonos sp(3) em polissacarídeos tais como quitina, celulose e amido na presença de um doador de elétrons exterior e, como hipotetizado atualmente, utiliza cobre no sítio ativo para ativar o oxigênio molecular. No presente, aquelas enzimas que pertencem às famílias de Atividade Auxiliar AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 e AA15, conforme

15 / 36 definido no banco de dados de enzimas ativas de carboidratos (http://www.cazy.org/).

[0048] Em um primeiro aspecto, a LPMO compreende os seguintes motivos: [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(4)-[HNQ] e [FW]-[TF]-K- [AIV], em que x é qualquer aminoácido, x(4,5) é quaisquer quatro ou cinco aminoácidos contíguos, e x(4) é quaisquer quatro aminoácidos contíguos.

[0049] A LPMO compreendendo os motivos acima mencionados, pode ainda compreender: H-x(1,2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV], [EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV], ou H-x(1,2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-x-Y-x(2)-C-x- [EHQN]-[FILV]-x-[ILV], em que x é qualquer aminoácido, x(1,2) é qualquer um ou dois aminoácidos contíguos, x(3) é quaisquer três aminoácidos contíguos e x(2) é quaisquer dois aminoácidos contíguos.

[0050] Em um aspecto preferido, a LPMO compreende ainda H- x(1,2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]. Em um aspecto preferido, a LPMO compreende ainda [EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]. Em um outro aspecto preferido, a LPMO compreende ainda H-x(1,2)-G-P-x(3)- [YW]-[AILMV] e [EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV].

[0051] Em um segundo aspecto, a LPMO compreende os seguintes motivos: [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que x é qualquer aminoácido, x(4,5) é quaisquer quatro ou cinco aminoácidos contíguos, e x(3) é quaisquer três aminoácidos contíguos. No motivo acima, é empregue a abreviatura para aminoácidos IUPAC com

16 / 36 uma única letra.

[0052] Em um aspecto, a LPMO compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 2 (Lentinus similis), SEQ ID NO: 3 (Thermoascus aurantiacus), SEQ ID NO: 8 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 9 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 10 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 11 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 12 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 13 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 14 (Trichoderma reesei), SEQ ID NO: 15 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID NO: 16 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID NO: 17 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID NO: 18 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID NO: 19 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID NO: 20 (Thermoascus aurantiacus), SEQ ID NO: 21 (Aspergillus fumigatus), SEQ ID NO: 22 (Penicillium pinophilum), SEQ ID NO: 23 (Thermoascus sp.), SEQ ID NO: 24 (Penicillium sp.), SEQ ID NO: 25 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 26 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 27 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 28 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 29 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 30 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 31 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 32 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 33 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 34 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 35 (Thielavia terrestris), SEQ ID NO: 36 (Thermoascus crustaceus), SEQ ID NO: 37 (Thermoascus crustaceus), ou SEQ ID NO: 38 (Talaromyces stipitatus) de pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %.

[0053] Em outro aspecto, a LPMO é uma variante artificial compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (ou

17 / 36 vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ou SEQ ID NO: 38; ou uma sua sequência homóloga, uma sua variante alélica ou um seu fragmento funcional.

[0054] De preferência, as alterações de aminoácidos são de uma natureza secundária, isto é, substituições de aminoácidos conservadores ou inserções que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, normalmente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxil, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação, alterando a carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0055] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As permutas ocorrendo mais commmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,

18 / 36 Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0056] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0057] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou a mutagênese de rastreio da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Nesta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade celulolítica intensificadora para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4.699 a 4.708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais podem ser também inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados ao polipeptídeo parental.

[0058] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos de um procedimento de triagem relevante, como aqueles divulgados por Reidhaar-

19 / 36 Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso a erros, exibição em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; Patente dos EUA n.º 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0059] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com alta produtividade, métodos de triagem automatizada para detectar atividade de polipeptídeos clonados, submetidos a mutagênese expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0060] O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos da LPMO madura da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ou SEQ ID NO: 38 não é mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0061] Em um aspecto, a LPMO é utilizada na presença de um cátion metálico bivalente solúvel de ativação como descrito em WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de cobre.

[0062] Em um aspecto, a LPMO é usada na presença de um seu

20 / 36 doador de elétrons. O doador de elétrons pode existir na polpa de dissolução a ser tratada. Em uma modalidade, nenhuma ou uma pequena quantidade de doador de elétrons pode ser adicionada à polpa de dissolução. Em outra modalidade, uma quantidade eficaz de doador de elétrons pode ser adicionada à polpa de dissolução.

[0063] Na presente invenção, o doador de elétrons pode ser um composto dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, ou um composto contendo enxofre.

[0064] O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída como descrito aqui. Os compostos dióxi podem compreender um ou mais (vários) grupos hidroxila e/ou derivados de hidroxila, mas incluem também frações arila substituídas não tendo hidroxila e derivados de hidroxila. Exemplos não limitativos de compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol, ácido cafeico; ácido 3,4-di- hidroxibenzoico, 4-tert-butil-5-metoxi-1,2-benzenodiol; ácido ascórbico, pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-tri-hidroxibenzoato; 2,3,4-tri- hidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-di- hidroxibenzoico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; glicolato de metila; ácido di-hidroxifumárico; 2-butino- 1,4-diol; ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol, 3-etioxi-1,2-propanodiol; 2,4,4'-tri-hidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4- diol; 3,4-di-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; di-hidroxiacetona; acetal de acroleína; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzoico; e metil-3,5- dimetoxi-4-hidroxibenzoato; ou um seu sal ou solvato.

[0065] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado como descrito aqui. Os compostos podem compreender um ou mais (vários) anéis adicionais, e não estão limitados a um número específico de anéis a não ser que referido de outro modo. Em um

21 / 36 aspecto, o composto bicíclico é um flavonoide. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonoide opcionalmente substituído. Em outro aspecto, o composto bicíclico é um íon de flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou seu derivado. Exemplos não limitativos de compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; campferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; queracianina, ou um seu sal ou solvato.

[0066] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído compreendendo um heteroátomo, como descrito aqui. Em um aspecto, o composto heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração heterocicloalquila com 5 membros opcionalmente substituída ou heteroarila com 5 membros opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, di-hidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzo-oxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilhidantoína, pirazinila, tetrahidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morfolinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila e oxepinila. Em outro aspecto, a fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitativos de

22 / 36 compostos heterocíclicos incluem (1,2-di-hidroxietil)-3,4-di-hidroxifuran- 2(5H)-ona; 4-hidroxi-5-metil-3-furanona; 5-hidroxi-2(5H)-furanona; [1,2-di- hidroxietil]-furan-2,3,4(5H)-triona; α-hidroxi-γ-butirolactona; γ-lactona ribónica; γ-lactona do ácido aldohexuronicaldohexurónico; δ-lactona do ácido glucónico, 4-hidroxicumarina; hidrobenzofurano; 5-(hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)-furanona; 5,6-di-hidro-2H-piran-2-ona; e 5,6-di-hidro-4- hidroxi-6-metil-2H-piran-2-ona; ou um seu sal ou solvato.

[0067] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina, ou fração nitróxido. Exemplos não limitativos de compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina; e ácido maleâmico; ou um seu sal ou solvato.

[0068] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado compreendendo uma fração quinona como descrito aqui. Exemplos não limitativos de compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidroxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-di-hidroxiantraquinona; 3-hidroxi-1-metil-5,6-indolinodiona ou adrenocromo; 4-tert-butil-5-metoxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um seu sal ou solvato.

[0069] O composto contendo enxofre pode ser qualquer composto adequado compreendendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico. Exemplos não limitativos de compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; ácido 2-mercaptoetanossulfônico;

23 / 36 benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um seu sal ou um seu solvato. Celulases

[0070] Celulases ou enzimas celulolíticas são enzimas envolvidas na hidrólise de celulose. Na hidrólise de celulose nativa, sabe-se que há três tipos principais de enzimas de celulase envolvidas, a saber, celobio-hidrolase (1,4- β-D-glucano celobio-hidrolase, EC 3.2.1.91, por exemplo, celobio-hidrolase I e celobio-hidrolase II), endo-β-1,4-glucanase (endo-1,4-β-D-glucano 4- glucano-hidrolase, EC 3.2.1.4) e β-glucosidase (EC 3.2.1.21).

[0071] A fim de ser eficiente, a digestão de celulose e hemicelulose exige diversos tipos de enzimas que atuam em cooperação. Pelo menos três categorias de enzimas são necessárias para converter celulose em açúcares fermentáveis: endo-glucanases (EC 3.2.1.4) que cortam as cadeias de celulose aleatoriamente; celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91) que clivam unidades de celobiosila da cadeia de celulose e beta-glucosidases (EC 3.2.1.21) que convertem celobiose e celodextrinas solúveis em glicose. Entre estas três categorias de enzimas envolvidas na biodegradação decelulose, celobio- hidrolases são as enzimas-chave para a degradação de celulose cristalina nativa. O termo “celobio-hidrolase I” é definido no presente documento como uma celulose 1,4-beta-celobiosidase (também chamada de exo-glucanase, atividade de exo-celobio-hidrolase ou 1,4-beta-celobio-hidrolase), conforme definido na classe de enzima EC 3.2.1.91, que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose e celotetraose, por meio da liberação de celobiose das extremidades não redutoras das cadeias. A definição do termo “atividade de celobio-hidrolase II” é idêntica, exceto que a celobio-hidrolase II ataca das extremidades redutoras das cadeias.

[0072] Endoglucanases (n.º EC 3.2.1.4) catalisam a hidrólise de ligações 1,4- beta -D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, uniões de beta-1,4 em

24 / 36 beta-1,3 glucanos misturados como beta-D-glucanos de cereal ou xiloglucanos e outro material vegetal contendo partes celulósicas. O nome autorizado é endo-1,4-beta-D-glucano 4-glucano hidrolase, mas o termo abreviado endoglucanase é usado no presente relatório descritivo. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a celulase utilizada na presente invenção é uma endoglucanase.

[0073] As celulases podem compreender um módulo de ligação de carboidrato (CBM) que intensifica a ligação da enzima a uma fibra contendo celulose e aumenta a eficácia da parte ativa catalítica da enzima. Um CBM é definido como sequência de aminoácidos contíguos numa enzima ativa de carboidrato com uma dobre discreta tendo atividade de ligação de carboidrato. Para informações adicionais sobre CBMs, consulte o servidor de Internet CAZy (Supra) ou Tomme et al., (1995) em Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler, J.N. & Penner, M., eds.), Cellulose- binding domains: classification and properties. páginas 142 a 163, American Chemical Society, Washington, EUA.

[0074] Em uma modalidade preferencial, as celulases podem ser uma preparação conforme definido em WO 2008/151079, que está aqui incorporado, por referência. A preparação de celulase pode compreender, ainda, um beta-glucosidase, como a proteína de fusão revelada no documento US 60/832.511. Em uma modalidade, a preparação de celulase também compreende um CBH II, de preferência celobio-hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris. Em uma modalidade, a preparação de celulase também compreende uma preparação de enzimas de celulase, de preferência aquela derivada de Trichoderma reesei. As celulases são sintetizadas por um grande número de micro-organismos que incluem fungos, actinomicetos, mixobactérias e bactérias verdadeiras, mas também por plantas. Especialmente, foram identificadas endoglucanases de uma ampla variedade de especificidades

25 / 36

[0075] A atividade de celulase pode, em uma modalidade preferencial, ser derivada de uma fonte fúngica, como uma cepa do gênero Trichoderma, de preferência, uma cepa de Trichoderma reesei; uma cepa do gênero Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, de preferência, uma cepa de Chrysosporium lucknowense ou uma cepa do gênero Thielavia, preferencialmente Thielavia terrestris.

[0076] Em um aspecto, a celulase compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 100%. Em outro aspecto, a celulase é uma variante artificial compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos da SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7; ou uma sua sequência homóloga, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento funcional. O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7 não é mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0077] Fungos e bactérias produzem um espectro de enzimas celulolíticas (celulases) que, na base de similaridades de sequência (análise de agrupamentos hidrofóbicos), pode ser classificado em diferentes famílias de glicosil hidrolases [Henrissat B & Bairoch A; Biochem. J. 1993 293 781-788]. Atualmente, são conhecidas celulases que pertencem às famílias 5, 6, 7, 8, 9,

26 / 36 10, 12, 26, 44, 45, 48, 60 e 61 de glicosil hidrolases. Enzimas adicionais

[0078] Qualquer enzima com atividade de xilanase, mananase, lipase, lacase e/ou peroxidase pode ser usada como enzimas adicionais no uso e no processo da invenção. As enzimas adicionais e uma monoxigenase lítica de polissacarídeo são adicionadas simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Alguns exemplos não limitativos de tais enzimas adicionais são listados em baixo. As enzimas escritas em maiúsculas são enzimas comerciais disponíveis da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca. A atividade de qualquer uma destas enzimas adicionais pode ser analisada usando qualquer método conhecido na técnica para a enzima em questão, incluindo os métodos mencionados nas referências citadas.

[0079] Um exemplo de uma xilanase é a hemicelulase PULPZYME HC.

[0080] Exemplos de mananases são as endo-beta-mananases de Trichoderma reesei descritas em Ståhlbrand et al, J. Biotechnol. 29 (1993), 229-242.

[0081] Um exemplo de uma lipase é a lipase RESINASE A2X. Um exemplo de uma xilanase é a hemicelulase PULPZYME HC.

[0082] Exemplos de peroxidases e lacases são revelados em EP 730641; WO 01/98469; EP 719337; EP 765394; EP 767836; EP 763115; e EP 788547. No presente contexto, sempre que a peroxidade ou lacase são mencionadas uma enzima oxidorreductase que requeira ou beneficie da presença de aceitadores (por exemplo, peróxido de hidrogênio ou oxigênio), intensificadores, mediadores e/ou ativadores, tais compostos devem ser considerados como estando incluídos. Exemplos de potenciadores e mediadores são revelados em EP 705327; WO 98/56899; EP 677102; EP 781328; e EP 707637. Se desejado, uma distinção pode ser feita através da

27 / 36 definição de uma lacase, ou um sistema de enzimas de peroxidase, como a combinação da enzima em questão e do seu aceitador, e, opcionalmente, também um intensificador e/ou mediador para a enzima em questão. Temperatura para o método da presente invenção

[0083] A temperatura para o método da presente invenção é tipicamente de 20 °C a 100 °C como um intervalo de temperatura selecionado dentre o grupo que consiste em 20 oC a 30 oC, de 30 oC a 40 oC, de 40 oC a 50 o C, de 50 oC a 60 oC, de 60 oC a 70 oC, de 70 oC a 80 oC, de 80 oC a 90 oC, de 90 oC a 100 oC, ou qualquer combinação desses intervalos. Tempo de incubação para o método da presente invenção

[0084] O tempo de incubação utilizado para o método da presente invenção é tipicamente de 1 minuto a 60 horas, tal como um intervalo de tempo selecionado do grupo que consiste em 1 minuto a 15 minutos, de 15 minutos a 30 minutos, de 30 minutos a 45 minutos, de 45 minutos a 60 minutos, de 1 hora a 3 horas, de 3 horas a 6 horas, de 6 horas a 10 horas, de 10 horas a 12 horas, de 12 horas a 15 horas, de 15 horas a 20 horas, de 20 horas a 22 horas, de 22 horas a 25 horas, de 25 horas a 30 horas, de 30 horas a 40 horas, de 40 horas a 50 horas, de 50 horas a 60 horas, ou qualquer combinação destes intervalos de tempo. Polpa usada e produzida no método de acordo com a invenção:

[0085] A polpa de dissolução utilizada na presente invenção pode ser polpa de madeira proveniente, por exemplo, de árvores de madeira de resinosas (tais como picea, pinheiro, abeto, larício e pinácea) e/ou madeiras de folhosas (tais como eucalipto, álamo e vidoeiro) ou outras fontes vegetais, tais como bambu.

[0086] Em uma modalidade preferida, a pasta de dissolução é selecionada a partir do grupo que consiste em polpa de dissolução de madeira de folhosas e polpa de dissolução de madeira de resinosas, ou uma sua mistura.

28 / 36

[0087] A invenção se refere numa modalidade a uma polpa de dissolução produzida por meio do método de acordo com a invenção. A invenção se refere em uma modalidade a uma polpa de dissolução kraft ou polpa de dissolução de sulfito produzida por meio do método de acordo com a invenção.

[0088] A invenção se refere, ainda, ao uso da polpa de dissolução de acordo com a invenção para a produção de fibras têxteis. A polpa de dissolução produzida pode ser usada na fabricação de celulose regenerada como raiom de viscose, Lyocell e fibras modais. Realização do método da invenção na presença de um ou mais tensoativos

[0089] O método da presente invenção pode ser realizado na presença de um ou mais tensoativos, como um ou mais tensoativos aniônicos e/ou um ou mais tensoativos não iônicos e/ou um ou mais tensoativos catiônicos.

[0090] Os tensoativos podem incluir, numa modalidade, tensoativos à base de poli(alquilenoglicol), dialquilfenóis etoxilados, dialquilfenóis etoxilados, álcoois etoxilados e/ou tensoativos à base de silicone.

[0091] São exemplos de tensoativo à base de poli(alquilenoglicol) alquiléster de poli(etilenoglicol), alquiléter de poli(etilenoglicol), homo e copolímeros de óxido de etileno/óxido de propileno, ou alquilésteres ou éteres de poli(óxido de etileno-co-óxido de propileno). Outros exemplos incluem derivados etoxilados de álcoois primários, tais como dodecanol, álcoois secundários, poli[óxido de propileno], derivados dos mesmos, éster de fosfato de tridecilálcool etoxilado e semelhantes.

[0092] Os materiais de tensoativos aniônicos presentemente preferenciais específicos úteis na prática da invenção compreendem alfa-sulfo metil laureato de sódio, (que pode incluir algum alfa-sulfo etil laureato) por exemplo, conforme comercialmente disponível sob a marca registrada ALPHA-STEPTM-ML40; xilenossulfonato de sódio, por exemplo, conforme comercialmente disponível sob a marca registrada STEPANATETM-X;

29 / 36 laurilssulfato de trietanolamônio, por exemplo, conforme comercialmente disponível sob a marca registrada STEPANOLTM-WAT; lauril sulfossuccinato de dissódio, por exemplo, conforme comercialmente disponível sob a marca registrada STEPANTM-Mild SL3; mesclas adicionais de vários tensoativos aniônicos também podem ser utilizadas, por exemplo, uma mescla de 50%- 50% ou de 25%-75% dos materiais APHA-STEPTM e STEPANATETM mencionados anteriormente, ou uma mescla de 20%-80% dos materiais de ALPHA-STEPTM e STEPANOLTM mencionados anteriormente (todos os materiais comercialmente disponíveis mencionados anteriormente podem ser obtidos junto a Stepan Company, Northfield, Ill.).

[0093] Os materiais tensoativos não iônicos específicos presentemente preferenciais úteis na prática da invenção compreendem cocodietanolamida, tal como comercialmente disponível sob a marca registrada NINOLTM-11CM; éteres de alquil polixoialquileno glicol, tais como os copolímeros de bloco de butil óxido de etileno-óxido de propileno de peso molecular relativamente alto comercialmente disponíveis sob a marca registrada TOXIMULTM-8320 da Stepan Company. Éteres de alquil polixoialquileno glicol adicionais podem ser selecionados, por exemplo, conforme revelado na Patente dos EUA N.º 3,078,315. Mesclas dos vários tensoativos não iônicos também podem ser utilizadas, por exemplo, uma mescla de 50%-50% ou de 25%-75% dos materiais de NINOLTM e TOXIMULTM mencionados anteriormente.

[0094] As mesclas de tensoativo aniônico/não iônico presentemente preferenciais específicas úteis na prática da invenção incluem várias misturas dos materiais acima, por exemplo, mesclas de 50%-50% dos materiais de ALPHA-STEPTM e NINOLTM mencionados anteriormente ou uma mescla de 25%-75% dos materiais de STEPANATETM e TOXIMULTM mencionados anteriormente.

[0095] Preferencialmente, as várias mesclas de tensoativos aniônicos,

30 / 36 não iônicos, aniônicos/não iônicos utilizadas na prática da invenção têm um teor de sólidos ou ativos de até cerca de 100% em peso e preferencialmente têm um teor de ativos na faixa de cerca de 10% a cerca de 80%. De fato, outro teor de mesclas ou de teor de sólidos (ativos) também pode ser utilizado e esses tensoativos aniônicos, tensoativos não iônicos e misturas dos mesmos também podem ser utilizados com produtos químicos de produção de polpa conhecidos, tais como, por exemplo, antraquinona e derivados da mesma e/ou outros produtos químicos de papel típicos, tais como cáusticas, agentes antiespuma e semelhantes.

[0096] A invenção descrita e reivindicada neste documento não é para estar limitada no escopo pelas modalidades específicas divulgadas neste documento, uma vez que essas modalidades se destinam como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisquer modalidades equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas neste documento se tornarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

[0097] Diversas referências são citadas no presente documento, cujas divulgações são incorporadas a título de referência em suas totalidades.

EXEMPLOS Materiais e Métodos

[0098] A viscosidade intrínseca da polpa foi medida de acordo com a ISO 5351 (International Organization for Standardization 5351).

[0099] A viscosidade da polpa foi medida por mViPr de acordo com WO 2011/107472 A9.

[00100] A quantidade de grupos aldeído (teor de CHO) foi medida espetrofotometricamente de acordo com o procedimento descrito por

31 / 36 Obolenskaya et al., “Determination of aldehyde groups in oxidized pulps”, Laboratory Manipulations in Wood and Cellulose Chemistry, Ecologia, Moscou, 211-212, 1991, que se baseia na reação do cloreto de 2,3,5- trifeniltetrazólio (TTC) com os grupos aldeído levando à formação de formazano (corante vermelho).

[00101] A reatividade de Fock é uma medida de quanto de uma quantidade conhecida de polpa reage com CS2 como uma simulação em pequena escala do processo de fabricação de viscose e foi realizada com NaOH a 9%. Enzima Descrição LPMO Thielavia terrestris Tt LPMO mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID (Tt LPMO) NO: 1 aqui, também mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8 de WO 2010/080532A LPMO Lentinus similis Ls LPMO mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID (Ls LPMO) NO: 2 aqui, também mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6 de WO2014/066141A LPMO Thermoascus aurantiacus Ta LPMO mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID (Ta LPMO) NO: 3 aqui, também mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de WO2005/074656A Endoglucanase-1 Endoglucanase mostrada como SEQ ID NO: 4 aqui, que é uma variante Q120H da endoglucanase madura mostrada como SEQ ID NO: 9 de WO 96/29397A Endoglucanase-2 Endoglucanase mostrada como SEQ ID NO: 5 aqui, que é uma celulase mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 em WO1991/017243A Endoglucanase-3 Endoglucanase mostrada como SEQ ID NO: 6 aqui, que é uma celulase GH45 mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 em WO 2015/058700A Endoglucanase-4 Endoglucanase mostrada como SEQ ID NO: 7 aqui, que é uma endoglucanase GH5 mostrada como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 em WO2013/019780A Exemplo 1: Tratamento LPMO de polpa de dissolução kraft de madeira de folhosas não branqueada

[00102] Pasta de dissolução kraft de madeira de folhosas não branqueada com um número capa de 6,8 (procedimento TAPPI T 236), brilho ISO de 51% e uma viscosidade intrínseca de 1025 mL/g produzida por um processo de polpação kraft de pré-hidrólise e posteriormente tratada com um estágio de extração cáustica a frio de um processo de produção de polpa de dissolução. Esta polpa foi tratada com várias LPMO em um ensaio de pequena escala usando 24 mg de fibra seca em estufa a 0,4% de consistência,

32 / 36 45 °C, pH 5,0 (tampão de acetato, 50 mM) durante 20 horas. O tratamento enzimático (denominado estágio X) foi realizado na dosagem de 5 mg EP (proteína enzimática) / g odp (polpa seca em estufa).

[00103] A suspensão da polpa com consistência de 0,4% foi desintegrada com uma barra magnética em tubos de ensaio de vidro colocados em um bloco de aquecimento a 45 °C. Ácido ascórbico, ácido gálico ou pirogalol foi adicionado como doador de elétrons para uma concentração final de 1 mM na suspensão, seguido pela adição da enzima LPMO para um volume final de 6 mL. Após o tempo de incubação de 20 horas após a adição da enzima, os tubos foram resfriados em gelo e, em seguida, 6 mL de solução de cuprietilenodiamina (CED) foram adicionados para dissolver as fibras. A dissolução da polpa foi realizada em agitador rotativo à temperatura ambiente de 25 °C por 25 min. As experiências de controle foram feitos da mesma maneira, mas sem a adição da enzima.

[00104] Após o tempo de dissolução, a viscosidade da polpa foi medida por mViPr. A pipeta mViPr consiste em uma pipeta Gilson Concept C300 modificada equipada com um sensor de pressão e pontas Diamond D300 Gilson. As amostras foram mantidas a uma temperatura constante dentro de ± 0,1 °C. Um volume de 200 µL de polpa dissolvida foi aspirado e dispensado dentro e fora da pipeta, respetivamente, enquanto registrava a pressão no espaço vazio da pipeta. Foi aplicada uma velocidade de pipeta de

4. As aspirações foram seguidas por um atraso de 2s e a dispensação foi seguida por um atraso de 5s. Cada medição de amostra consistiu em 15 ciclos de dispensação de aspiração, e os resultados da pressão foram em média de 15 pressões de aspiração ou dispensação, respetivamente.

[00105] Os resultados da pressão de aspiração das medições mViPr são apresentados na Tabela 1. Pode se observar que as LPMO podem reduzir o tamanho médio da celulose que se expressa como a redução da viscosidade da solução medida pela redução da pressão de aspiração. O desempenho de cada

33 / 36 LPMO também depende do doador de elétrons específico utilizado. Além disso, o próprio doador de elétrons também degrada a celulose quando comparado à polpa original, principalmente o ácido ascórbico. Tt LPMO é bastante eficaz na redução da viscosidade da polpa com todos os doadores de elétrons. Tabela 1. Pressão de aspiração das diferentes polpas não branqueadas dissolvidas em CED Enzima Pressão de aspiração (Pa) Redução vs. controle (%) Original -1900,9 --- Ácido ascórbico de controle -1408,8 0 Ta LPMO + Ácido ascórbico -1195,9 15 Ls LPMO + Ácido ascórbico -1135,8 19 Tt LPMO + Ácido ascórbico -656,6 53 Ácido Gálico de Controle -1753,8 0 Ta LPMO + Ácido gálico -1089,5 38 Ls LPMO + Ácido gálico -1091,6 38 Tt LPMO + Ácido gálico -580,2 67 Pirogalol de Controle -1605,9 0 Ta LPMO + Pirogalol -923,7 42 Ls LPMO + Pirogalol -232,9 85 Tt LPMO + Pirogalol -655,9 59 Exemplo 2: Tratamento LPMO de polpa de dissolução kraft de madeira de folhosas branqueada

[00106] Foi usada polpa kraft de madeira de folhosas branqueada nunca seca de grau de acetato produzida por um processo de polpação kraft de pré-hidrólise tendo um brilho ISO de 93,7% e uma viscosidade intrínseca de 684 mL/g. Esta polpa foi tratada com várias LPMO com três doadores de elétrons diferentes usando as mesmas condições e procedimentos do Exemplo

1.

[00107] Os resultados da pressão de aspiração das medições mViPr são apresentados na Tabela 2 para as polpas de dissolução branqueadas. As LPMO podem reduzir o tamanho médio das moléculas de celulose conforme expresso pela redução da viscosidade da solução (polpa dissolvida), medida pela redução da pressão de aspiração. Maior redução na viscosidade da polpa branqueada em comparação com os controles (sem enzima) foi alcançada quando as LPMO foram usadas junto com ácido gálico e pirogalol em

34 / 36 comparação com o ácido ascórbico, que também reduz significativamente a própria viscosidade. A Tt LPMO é uma LPMO mais robusta em relação à redução da viscosidade com todos os doadores de elétrons usados. Tabela 2. Pressão de aspiração das diferentes polpas branqueadas dissolvidas em CED Enzima Pressão de aspiração (Pa) Redução vs. controle (%) Original -450,9 --- Ácido ascórbico de controle -345,1 0 Ta LPMO + Ácido ascórbico -339,5 2 Ls LPMO + Ácido ascórbico -338,2 2 Tt LPMO + Ácido ascórbico -244,5 29 Ácido Gálico de Controle -523,1 0 Ta LPMO + Ácido gálico -245,3 53 Ls LPMO + Ácido gálico -235,2 55 Tt LPMO + Ácido gálico -160,3 69 Pirogalol de Controle -433,7 0 Ta LPMO + Pirogalol -260,9 40 Ls LPMO + Pirogalol -88,8 80 Tt LPMO + Pirogalol -43,7 90 Exemplo 3: Efeito do tratamento LPMO com/sem endoglucanase na consistência de polpa média na viscosidade, reatividade e teor de CHO da polpa de dissolução branqueada

[00108] Foi usada polpa de dissolução kraft de madeira de folhosas branqueada produzida por um processo de polpação kraft de pré-hidrólise de grau de viscose com uma viscosidade intrínseca de 512 mL/g. Esta polpa foi tratada com várias LPMO usando ácido gálico (1 mM) como doador de elétrons a 1,5% de consistência em vasos Distek (Distek modelo Symphony 7100) com aquecimento e agitação aérea contínua.

[00109] Assim que as polpas foram desintegradas e no ponto de ajuste de temperatura de 45 ºC, foi adicionado ácido gálico e a seguir a enzima (LPMO e/ou endoglucanase). O tratamento enzimático da polpa durou 25,5 horas a pH 5,0 (tampão acetato, 50 mM) usando 2 mg EP/g odp de LPMO e 1,2 mg EP/kg odp de endoglucanase. Após o tratamento enzimático, as polpas foram filtradas e lavadas em três etapas consecutivas com 1 L de água corrente. Parte da amostra de polpa foi seca antes da medição do teor de CHO e da reatividade de Fock e parte da amostra foi mantida úmida na geladeira

35 / 36 para testar a viscosidade intrínseca.

[00110] Na Tabela 3, pode ser visto que com uma dosagem mais baixa de 2 mg EP/g odp uma pequena redução na redução da viscosidade é obtida com as LPMO testadas, em comparação com os Exemplos 1 e 2 com uma dosagem mais alta de LPMOs. No entanto, quando combinado com uma endoglucanase, a redução da viscosidade é aumentada com um efeito sinérgico surpreendente. A mesma sinergia entre LPMO e endoglucanase é vista em termos de reatividade de Fock e a quantidade de grupos CHO. Tabela 3. Viscosidade intrínseca, reatividade de Fock e teor de CHO das polpas de dissolução branqueadas Enzima Viscosidade intrínseca Reatividade de Fock Teor de CHO (ml/g) (%) (mmol/kg odp) Original 512 16 17,8 Ácido Gálico de Controle 482 16 16,3 Tt LPMO + Ácido gálico 479 20 19,8 Ta LPMO + Ácido gálico 471 16 22,9 Endoglucanase 480 15 19,7 Tt LPMO + endoglucanase + 429 26 27,7 Ácido gálico Exemplo 4: Efeito do tratamento combinado de LPMO e endoglucanase na polpa de dissolução de kraft de madeira de folhosas não branqueada

[00111] A mesma polpa de dissolução kraft de madeira de folhosas não branqueada do Exemplo 1 foi usada e tratada com várias LPMO usando ácido gálico (1 mM) como doador de elétrons em combinação com várias endoglucanases em um ensaio em pequena escala usando 24 mg de fibra seca em forno com consistência de 0,4%, 50 °C, pH 6,0 (tampão fosfato, 50 mM) durante 20 horas. Os tratamentos com LPMO foram feitos nas dosagens de 2,5 mg EP (proteína enzimática) / g odp (dosagem alta) ou 0,5 mg EP / g odp (dosagem baixa). Os tratamentos com endoglucanase foram realizados na dosagem de 0,5 mg EP / kg odp. O ensaio e as medições de viscosidade foram realizados usando as mesmas condições e procedimentos descritos no Exemplo 1.

[00112] Os resultados da pressão de aspiração das medições mViPr são apresentados na Tabela 4. Pode-se observar que quanto maior a dosagem de

36 / 36

LPMO, maior a redução da viscosidade da polpa.

Uma alta dosagem de LPMO dá uma redução de viscosidade surpreendentemente maior do que os tratamentos com endoglucanase.

O tratamento com uma combinação de LPMO e uma endoglucanase mostra melhor desempenho na redução da viscosidade do que o tratamento individual com LPMO ou endoglucanase.

Utilizando esta polpa de alta viscosidade, observa-se um efeito de reforço na redução da viscosidade pelo uso de LPMO combinado com a endoglucanase, o que permite uma redução significativa na quantidade de LPMO necessária.

Por exemplo, a uma dosagem baixa de Tt LPMO (0,5 mg EP/g odp), a coadição de uma endoglucanase 2 e 3 dá uma redução de viscosidade ainda maior do que a alta dosagem de Tt LPMO sozinha (2,5 mg EP/g odp). Tabela 4. Pressão de aspiração das diferentes polpas não branqueadas dissolvidas em CED Pressão de aspiração Redução vs. contro- Enzima (Pa) le (%) Original -1594,1 --- Ácido Gálico de Controle -1565,3 0 Tt LPMO (elevada dose) + Ácido gálico -821,0 48 Tt LPMO (baixa dose) + Ácido gálico -1361,0 13 Ls LPMO (elevada dose) + Ácido gálico -665,3 57 Ls LPMO (baixa dose) + Ácido gálico -1141,0 27 Endoglucanase 1 -995,9 36 Tt LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 1 -415,1 73 Tt LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 1 -883,2 44 Ls LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 1 -646,2 59 Ls LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 1 -905,4 42 Endoglucanase 2 -1083,7 31 Tt LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 2 -341,9 78 Tt LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 2 -762,6 51 Ls LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 2 -485,7 69 Ls LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 2 -969,1 38 Endoglucanase 3 -1049,2 33 Tt LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 3 -441,7 72 Tt LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 3 -506,1 68 Ls LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 3 -284,6 82 Ls LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 3 -315,3 80 Endoglucanase 4 -1270,7 19 Tt LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 4 -732,9 53 Tt LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 4 -1169,2 25 Ls LPMO (elevada dose) + Ácido gálico + endoglucanase 4 -904,8 42 Ls LPMO (baixa dose) + Ácido gálico + endoglucanase 4 -1186,5 24

Claims (16)

1 /4 REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar polpa de dissolução, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma celulase, de preferência a uma endoglucanase.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e a etapa de submeter a polpa de dissolução a uma celulase serem realizadas simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de branqueamento da polpa de dissolução.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de submeter a polpa de dissolução a uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e a um seu doador de elétrons, de preferência ácido ascórbico, ácido gálico, pirogalol ou cisteína.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a polpa de dissolução ser uma polpa de dissolução não branqueada, parcialmente branqueada, branqueada ou extraída com alcalinidade; ou em que a polpa de dissolução é polpa kraft ou polpa sulfito.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a monoxigenase lítica de polissacarídeo ter uma identidade de sequência de pelo menos 60% (tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo

2 /4 menos 95%, tal como pelo menos 99%) com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a celulase ter uma identidade de sequência de pelo menos 60% (tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 99%) com a SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6 ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a monoxigenase lítica de polissacarídeo compreende ou consistir na SEQ ID NO: 1 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 2 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 3 ou no seu polipeptídeo maduro; ou a celulase compreende ou consiste na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 5 ou no seu polipeptídeo maduro, na SEQ ID NO: 6 ou no seu polipeptídeo maduro, ou na SEQ ID NO: 7 ou no seu polipeptídeo maduro.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a concentração da monoxigenase lítica de polissacarídeo ser de 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 100000 mg/kg de polpa seca em forno, tal como uma concentração selecionada dentre o grupo que consiste em 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 250 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 1000 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 2000 mg/kg de polpa seca em forno, de 1,0 mg/kg de polpa seca em forno a 5000 mg/kg de polpa seca em forno, de 5,0 mg/kg de polpa seca em forno a 10000 mg/kg de polpa seca em forno, de 10,0 mg/kg de polpa seca em forno a 15000 mg/kg de polpa

3 /4 seca em forno, de 15,0 mg/kg de polpa seca em forno a 20000 mg/kg de polpa seca em forno, de 20,0 mg/kg de polpa seca em forno a 30000 mg/kg de polpa seca em forno, de 30,0 mg/kg de polpa seca em forno a 40000 mg/kg de polpa seca em forno, de 40,0 mg/kg de polpa seca em forno a 60000 mg/kg de polpa seca em forno, de 60,0 mg/kg de polpa seca em forno a 80000 mg/kg de polpa seca em forno e de 80,0 mg/kg de polpa seca em forno a 100000 mg/kg de polpa seca em forno ou qualquer combinação destes intervalos.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a concentração da celulase ser de 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 100 mg/kg de polpa seca em forno, tal como uma concentração selecionada dentre o grupo que consiste em 0,05 mg/kg de polpa seca em forno a 80,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 60,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 40,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 20,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 10,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,25 mg/kg de polpa seca em forno a 5,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 85,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 65,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 45,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 25,0 mg/kg de polpa seca em forno, de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 15,0 mg/kg de polpa seca em forno e de 0,50 mg/kg de polpa seca em forno a 5,0 mg/kg de polpa seca em forno ou qualquer combinação destes intervalos.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método resultar em viscosidade reduzida e/ou controle de viscosidade melhorado no processo de produção de polpa de dissolução; e/ou em que o método resulta em maior reatividade da polpa de dissolução, de preferência maior reatividade de Fock; e/ou em que o

4 /4 método resulta em maior teor de grupos oxidados da polpa de dissolução.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda submeter a polpa de dissolução a uma xilanase e/ou mananase e/ou lipase e/ou lacase e/ou peroxidase.

14. Polpa de dissolução, caracterizada pelo fato de que ser produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Fibra têxtil ou celulose derivatizada, caracterizada pelo fato de que ser produzida a partir da polpa de dissolução, como definida na reivindicação 14.

16. Uso de uma monoxigenase lítica de polissacarídeo, caracterizado pelo fato de que ser para o tratamento de polpa de dissolução.