BR112020003916A2 - cepa de bacillus amyloliquefaciens inovadora e método para preparar produto de soja fermentado usando a mesma - Google Patents

Abstract

A presente revelação refere-se a um método para preparar um produto de soja fermentado compreendendo: inocular uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja; e obter uma farinha de soja fermentada ou um concentrado de proteína de soja fermentado, que é fermentado cultivando-se a cepa de Bacillus amyloliquefaciens, um produto de soja fermentado preparado pelo método, e uma composição alimentar para animal compreendendo o produto fermentado. O produto de soja fermentado preparado pelo método não contém mucilagem, mostra uma excelente atividade antibacteriana e tem um alto teor de peptídeos de baixo peso molecular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CEPA DE BACILLUS

AMYLOLIQUEFACIENS INOVADORA E MÉTODO PARA PREPARAR PRODUTO DE SOJA FERMENTADO USANDO A MESMA” CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) inovadora e um método para preparar um produto de soja fermentado usando a mesma.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Em geral, ração animal contém farinha de peixe como uma fonte de proteína, mas o custo da farinha de peixe tem aumentado em todo o mundo à medida que a sua produção em países produtores de farinha de peixe tem diminuído recentemente ou a oferta e demanda de farinha de peixe se tornaram instáveis. Consequentemente, existe uma demanda crescente por fontes de proteína vegetal que pode ser usada como uma substituta da farinha de peixe, e esforços para desenvolvê-la estão continuamente em andamento. Proteínas vegetais típicas incluem proteínas contidas em nozes, feijões e grãos, mas a soja entre as proteínas da soja é conhecida por ser rica em proteínas, ácidos graxos e polissacarídeos que outras sojas.

[003] A farinha de soja desengordurada (em seguida referida como farinha de soja) é um subproduto remanescente depois da extração da gordura das sojas tendo altos teores de proteína e gordura. Entretanto, a farinha de soja contém uma variedade de fatores antinutricionais (ANF), que podem prejudicar a digestibilidade quando usada como um alimento (Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990). Em particular, um inibidor de tripsina (TI) é conhecido por ser um típico antioxidante que reduz a utilização de proteína pela inibição da atividade enzimática in vivo. Especialmente, quando os fatores antinutricionais são adicionados a um alimento para animais jovens, a quantidade de uso é restrita. Além disso, a proteína da soja é extraída da farinha de soja usando água ou sal. Essas proteínas de soja podem ser classificadas em produtos de proteína da soja processada de farinha de soja desengordurada,

concentrados de proteína da soja, proteínas de soja estruturadas, proteínas de soja hidrolizadas ou isolados de proteína da soja dependendo da extensão em que ingredientes não proteicos tais como carboidratos solúveis em água e não solúveis em água são removidos da farinha de soja desengordurada. Além disso, como as proteínas de soja têm um alto teor de proteína, elas podem ser usadas para alimentação de animais, além de produtos de carne processados, produtos de leite processados e alimentos tais como pão ou lanches.

[004] Entretanto, as proteínas de soja extraídas das farinhas de soja contêm proteínas de alto peso molecular que consistem em subunidades de proteína e muitos fatores antinutricionais (ANFs), que prejudicam a digestão, ou semelhantes. Em particular, esses fatores antinutricionais são conhecidos por prejudicar a capacidade digestiva de animais. Consequentemente, para usar as proteínas de soja na ração animal, existe uma necessidade de pesquisas focadas na redução dos fatores antinutricionais para aumentar a digestibilidade da ração animal e converter as proteínas de alto peso molecular em peptídeos de baixo peso molecular.

[005] Entretanto, os produtos de proteína da soja processada tais como concentrados de proteína da soja, isolados de proteína da soja ou proteínas de soja hidrolizadas, que são correntemente produzidos, são produzidos por tratamentos químicos ou enzimáticos. Entretanto, o método de processamento químico impõe problemas, pois o custo de produção é alto e o tratamento térmico, tratamento químico, secagem por calor ou semelhantes, no curso do processo de fabricação leva à desnaturação da proteína e perda de aminoácidos solúveis em água, o que diminui substancialmente a solubilidade da proteína. Por causa disso, o método de processamento químico é submetido ao tratamento térmico a uma extensão em que a desnaturação extrema de proteínas não ocorra. Assim, uma quantidade considerável de inibidores de tripsina, que são fatores antinutricionais, está presente no produto de proteína da soja final.

[006] Como um meio de resolver os problemas do método de processamento químico dos produtos de proteína da soja processada, um produto de soja fermentado de um método de processamento biológico por fermentação usando Bacillus ou fungos foi desenvolvido (Patentes Coreanas Nos 10-0645284, 10-0459240, 10- 0925173 e 10-1139027). Entretanto, mesmo para uma farinha de soja fermentada ou um concentrado de proteína de soja fermentado preparado pelo método de processamento biológico, o teor de peptídeos de baixo peso molecular e o teor dos fatores antinutricionais em um produto processado, que está relacionado à melhoria da digestibilidade, pode variar dependendo da espécie e cepas do microorganismo tal como Bacillus, bactérias do ácido láctico e levedura. Em particular, mesmo com a mesma espécie de microorganismos, o teor pode variar dependendo da capacidade de produção de enzima e taxa de crescimento de cada cepa (Patente Coreana N o 10- 1517326). Isto é, a cepa usada no método de processamento biológico é um fator crucial para indicar a diferença nas características e a digestibilidade de um produto de proteína da soja processado final.

[007] A técnica anterior relacionada inclui as Patentes Coreanas Nos 10-0645284, 10-0459240, 10-0925173 e 10-1139027. De acordo com a técnica revelada nas patentes, é verdade que um material proteico de alta qualidade para alimento que tem uma alta taxa de absorção na digestão pode ser implementado visto que muitos fatores antinutricionais podem ser removidos durante o processo de fermentação usando-se uma cultura de sementes de populações de microorganismo de Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Lactobacilo reuteri e Saccharomyces cerevisiae, e ainda uma proteína ou carboidrato pode ser decomposto em um forma de peptídeo de baixo peso molecular. Entretanto, as populações de microorganismo, especialmente, Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens, que são usados para a fermentação de uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja, têm a desvantagem de terem baixa resistência a contaminantes externos e baixa capacidade de produção de protease devido à baixa atividade antibacteriana. Além disso, algumas cepas microbianas produzem mucilagem durante o processo de fermentação, e devido a essa mucilagem, a permeabilidade do produto fermentado é deteriorada, deteriorando-se assim a eficiência da fermentação aeróbica.

[008] Entretanto, como a técnica anterior relacionada à presente revelação, a cepa K2G de Bacillus amyloliquefaciens revelada pela requerente na Patente Coreana No 10-1517326 é capaz de remover fatores antinutricionais, incluindo inibidores de tripsina, tem uma alta capacidade proteolítica e uma atividade antibacteriana, e é útil para fornecer uma ração animal contendo peptídeos de baixo peso molecular. Entretanto, as referências da técnica anterior mencionadas acima não revelam nem envolvem uma cepa inovadora tendo uma atividade antibacteriana contra vários microorganismos patogênicos incluindo Salmonella, Vibrio e Photobacterium e capaz de aumentar o teor de peptídeos de baixo peso molecular e suprimir a produção de mucilagem, e um método para preparar um produto de soja fermentado usando a mesma.

[009] Sob essas circunstâncias, os presentes inventores fizeram grandes esforços para desenvolver um método para preparar um produto de soja fermentado de peptídeos de baixo peso molecular inoculando-se uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) inovadora em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja, e desenvolveram um produto de soja fermentado tendo uma excelente atividade antibacteriana e nenhuma produção de mucilagem com um teor aumentado de peptídeos de baixo peso molecular, completando assim a presente revelação.

DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS PATENTEADOS

[010] (Documento Patenteado 1) Patente Coreana No 10-0645284 (registrada em 06/11/2006)

[011] (Documento Patenteado 2) Patente Coreana No 10-0459240 (registrada em 19/11/2004)

[012] (Documento Patenteado 3) Patente Coreana No 10-0925173 (registrada em 29/10/2009)

[013] (Documento Patenteado 4) Patente Coreana No 10-1517326 (registrada em 27/04/2015)

[014] (Documento Patenteado 5) Patente Coreana No 10-1139027 (registrada em 16/04/2012)

DOCUMENTO NÃO PATENTEADO

[015] (Documento Não Patenteado 1) Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[016] Nessas circunstâncias, os presentes inventores fizeram extensivos esforços para desenvolver um método para preparar um produto de soja fermentado de peptídeos de baixo peso molecular inoculando-se uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) inovadora em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja, e desenvolveram um produto de soja fermentado tendo uma excelente atividade antibacteriana e nenhuma produção de mucilagem com um teor aumentado de peptídeos de baixo peso molecular, completando assim a presente revelação.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[017] Um ojetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar um produto de soja fermentado de peptídeos de baixo peso molecular inoculando-se uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) inovadora em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja.

[018] Um outro ojetivo da presente revelação é fornecer uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) inovadora, em que o teor de peptídeos de baixo peso molecular é aumentado e que tem uma excelente atividade antibacteriana e nenhuma produção de mucilagem.

[019] Ainda um outro ojetivo da presente revelação é fornecer um produto de soja fermentado preparado pelo método acima tendo uma excelente atividade antibacteriana e nenhuma produção de mucilagem.

[020] Ainda um outro ojetivo da presente revelação é fornecer uma composição alimentar para animal compreendendo o produto de soja fermentado.

[021] Outros objetivos e vantagens da presente revelação tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada junto com as reivindicações e desenhos anexos. Os teores não descritos nesta especificação podem ser suficientemente reconhecidos e inferidos pelos especilistas no campo técnico ou campo técnico semelhante da presente revelação e, portanto, a sua descrição será omitida.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[022] A cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, tem atividade antibacteriana e capacidade proteolítica excelentes e tem baixa capacidade de produção de mucilagem. Assim, um produto de soja fermentado de alta qualidade tendo um alto teor de peptídeos de baixo peso molecular e uma excelente atividade antibacteriana pode ser preparado inoculando-se a cepa em uma farinha de soja ou concentrado de proteína de soja. Em particular, se o produto de soja fermentado da presente revelação for entrgue a um animal suscetível de ser exposto a várias bactérias patogênicas, não apenas a taxa de infecção resultante de bactérias patogênicas pode ser diminuída e a taxa de sobrevivência pode ser aumentada devido à sua atividade antibacteriana, mas também, a taxa de absorção na digestão pode ser intensificada devido a um alto teor de peptídeos de baixo peso molecular.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[023] A Figura 1 é uma fotografia que mostra o concentrado de proteína de soja fermentado.

[024] A Figura 2 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE dos concentrados de proteína da soja fermentados.

[025] A Figura 3 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE da farinha de soja fermentada.

[026] A Figura 4 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE da farinha de soja fermentada sob uma baixa condição de umidade.

[027] A Figura 5 é uma árvore filogênica que mostra a relação filogenética da cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens inovadora da presente revelação.

MODALIDADE PREFERENCIAL PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[028] Cada descrição e modalidade reveladas na presente revelação podem ser aplicadas a outras descrições e modalidades, respectivamente. Isto é, todas as combinações de vários elementos aqui revelados se enquadram no escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não é intencionado a ser limitado pela descrição específica descrita abaixo.

[029] Em um aspecto para obter os objetivos acima, a presente revelação fornece um método para preparar um produto de soja fermentado compreendendo: inocular uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja; e obter uma farinha de soja fermentada ou um concentrado de proteína de soja fermentado que é fermentado cultivando-se a cepa de Bacillus amyloliquefaciens.

[030] A cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, tem uma excelente atividade de protease e uma excelente atividade antibacteriana contra patógenos, e tem capacidade produtiva reduzida de mucilagem durante a fermentação e, assim, um produto de soja fermentado de alta qualidade pode ser produzido.

[031] Como aqui usado, o termo “produto de soja fermentado” refere-se a um produto, um concentrado de proteína de soja fermentado ou uma farinha de soja fermentada obtido inoculando-se a cepa da presente revelação ou uma cepa controle no concentrado de proteína de soja ou farinha de soja.

[032] Como aqui usado, o termo “concentrado de proteína de soja” refere-se a um concentrado de proteína extraído da soja, que é uma leguminosa. A proteína extraída da soja é produzida extraindo-se a óleo de soja da soja usando um solvente orgânico tal como hexano ou semelhantes e depois removendo-se os ingredientes não proteicos tais como carboidratos solúveis em água e não solúveis em água de uma soja desengordurada residual.

[033] Como aqui usado, o termo “farinha de soja” refere-se a um alimento de proteína vegetal mais comumente usado como um produto resultante da transformação da soja, que é uma leguminosa, em leite. A farinha de soja é o alimento de proteína vegetal mais econômico e de alta qualidade para animais e é um subproduto produzido durante a extração de óleo de soja.

[034] Como aqui usado, o termo “Bacillus amyloliquefaciens”, que é um microorganismo do gênero Bacillus, é uma bactéria gram-positiva do solo. É conhecido por ter uma estreita relação com Bacillus subtilis e produz um antibiótico chamado barnase, um tipo de enzima BamH1 e uma ribonuclease. As bactérias do solo são conhecidas como bactérias antibacterianas ativas contra as infecções nas raízes das plantas, especialmente na agricultura.

[035] Nos últimos anos, o uso de antibióticos foi limitado na ração animal, e produtos de soja fermentados, que são proteínas vegetais, estão sendo usados como uma fonte de proteína. Portanto, as propriedades antibacterianas naturais de uma composição alimentar, em particular, a atividade antibacteriana dos produtos de soja fermentados se tornou mais importantes em termos de reduz as doenças causadas por microorganismos patogênicos. Consequentemente, os presentes inventores fizeram extensivos esforços para desenvolver uma cepa tendo uma atividade antibacteriana contra vários patógenos enquanto é capaz de produzir uma protease tendo uma excelente atividade e reduzir a capacidade produtiva de mucilagem durante a fermentação, simultaneamente. Especificamente, o Bacillus amyloliquefaciens conhecido por ser usado para preparar produtos de soja fermentados convencionais foi preparado, e as cepas foram selecionadas e isoladas por irradiação UV para melhoria da cepa, dentre elas, a CJ24-34 do Bacillus amyloliquefaciens da presente revelação tendo uma excelente atividade antibacteriana contra vários microorganismos patogênicos pode ser selecionada. Como aqui usado, o termo “melhoria” pode ser obtido por meio de mutação, recombinação genética, clonagem de genes ou semelhantes, de modo a melhorar os defeitos ou a produtividade da cepa, e a mutação pode incluir um gene, um cromossomo ou uma mutação genômica. Uma mutação física, uma mutação química ou uma mutação biológica usando raios UV pode ser usada para induzir a mutação, e os raios UV podem ser irradiados usando uma lâmpada UV por um período de tempo durante o qual um comprimento de onda de 200 nm a 300 nm atinge uma taxa de mortalidade de 95% a 100%. Na presente revelação, o comprimento de onda de UV de 254 nm é irradiado por um período de tempo durante o qual a taxa de mortalidade para a cepa do tipo selvagem atinge 99,99%, isolando e obtendo, desse modo, apenas as cepas mutantes que formaram colônias.

[036] De acordo com uma modalidade, a CJ24-34 do Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, tem uma excelente atividade antibacteriana contra patógenos. Por exemplo, a CJ24-34 do Bacillus amyloliquefaciens tem uma atividade antibacteriana contra pelo menos um patógeno selecionado do grupo que consiste em Salmonella typhimurium, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda. A atividade antibacteriana pode ser medida usando um método de diluição, um teste de difusão em disco, E-TEST ou semelhantes.

[037] Especificamente, a Salmonella pode causar intoxicação alimentar em animais, e outras bactérias, incluindo a espécie Vibrio, são conhecidas por causar doenças em peixes criados em fazendas incluindo sepse, Vibrio cholerae, vibriose em camarão, pasteurelose em savelha e edwardsielose em solha. Em realação a essas bactérias patogênicas, o Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, inibe eficazmente o crescimento das mesmas e, assim, um produto de soja fermentado preparado usando-se o mesmo ou um produto de soja fermentado contendo o mesmo pode ter uma atividade antibacteriana contra esses patógenos.

[038] Produtos de soja fermentados convencionais têm problemas em que a mucilagem pegajosa é produzida devido à polimerização de um fructano na forma de levano e um poliglutamato derivado de um sacarídeo e uma proteína de matéria-prima de soja, respectivamente, por uma enzima produzida durante o processo de fermentação. A produção dessa mucilagem faz com que os produtos de soja fermentados sejam agregados em pedaços, que dificulta a agitação e dificulta o controle e a transferência de oxigênio dissolvido e temperatura nos produtos fermentados, causando assim muitos problemas no processo de produção em massa.

A produção de mucilagem pode ser determinada medindo-se a viscosidade ou brilho da mesma por observação fenotípica de colônias ou medindo-se o teor de uma substância polimérica tal como ácido poli-γ-glutâmico.

[039] De acordo com uma modalidade, a CJ24-34 do Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode ter uma baixa capacidade produtiva de mucilagem. Mais especificamente, o produto de soja fermentado produzido a partir do Bacillus amyloliquefaciens tem um baixo teor de mucilagem pegajosa e dificilmente se agrega em pedaços e, assim, produtos de soja fermentados de alta qualidade podem ser preparados usando o mesmo (ver Exemplo 4).

[040] De acordo com uma modalidade, a CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode produzir uma protease altamente ativa e hidroliza a maioria da proteína da soja, que é composta de polímeros, decompondo-a em peptídeos de baixo peso molecular, desse modo, aumentando significativamente a taxa de absorção na digestão do produto de soja fermentado. Os peptídeos da presente revelação formam um polímero por várias combinações de aminoácidos através de uma ligação peptídica e geralmente consistem de 2 a 50 aminoácidos ligados juntos. O peptídeo de baixo peso molecular é um peptídeo pequeno que tem um baixo peso molecular e tem a vantagem de facilitar a absorção durante a digestão, aumentando assim sua digestibilidade quando aplicado como ração animal. Dependendo da razão de tipo e composição do peptídeo de baixo peso molecular incluído no hidrolisado desejado a ser finalmente preparado, as condições do teor de umidade, teor de proteína ou semelhantes do concentrado de proteína de soja, que é a matéria-prima, podem ser apropriadamente selecionadas e usadas.

[041] De acordo com uma modalidade, o produto de soja fermentado preparado pelo Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode compreender 40% ou mais de peptídeos de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos. Mais especificamente, o produto de soja fermentado compreende de 40% a 100%, 50% a 95%, 60% a 90%, 70% a 90%, 75% a 90%, 75% a 85% ou 80% a 85% de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos.

Além disso, o produto de soja fermentado pode compreender 15% ou mais de peptídeos tendo 10 kDa ou menos. Mais especificamente, o produto de soja fermentado pode compreender de 15% a 80%, 20% a 70%, 30% a 65%, 40% a 65% ou 50% a 60% de peptídeos tendo um peso molecular de 10 kDa ou menos. A dita % pode se referir a uma razão de porcentagem da área parcial que representa uma faixa de peso molecular em particular sobre a área total na distribuição de peso molecular da proteína por GPC. De acordo com uma modalidade, o produto de soja fermentado preparado a partir do Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode ter um teor aumentado de proteína em comparação com antes da fermentação. Isso indica que o tempo de fermentação pode ser reduzido aumentando-se o teor de proteína em um período de tempo mais curto, mesmo quando comparado com produtos de soja fermentados que foram fermentados com uma cepa convencionalmente conhecida. Isto é, o Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode melhorar a qualidade de um alimento aumentando-se significativamente o teor dos peptídeos de baixo peso molecular no produto de soja fermentado e pode reduzir o tempo de fermentação aumentando-se o teor de proteína mais rapidamente.

[042] O 16S rRNA da cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens da presente revelação foi analisado e, como um resultado, mostrou uma estreita relação com a FZB42T de Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum (CP000560), que é uma cepa padrão, e a homologia da sequência de genes de 16S rRNA foi confirmada como sendo 99,93% (1507 bp/1508 bp). Assim, a cepa CJ24-34 mutante, de acordo com a presente revelação, foi denominada CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum e foi depositada sob o Tratado de Budapeste para a Cultura Coreana de Microorganismos (KCCM) em 15 de junho de 2017, com um número acesso KCCM12038P.

[043] De acordo com uma modalidade, o método para preparar um produto de soja fermentado pode compreender ainda as etapas de controlar o teor de umidade da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja e submetê-lo ao tratamento térmico e arrefecimento antes de inocular a cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens na farinha de soja ou concentrado de proteína de soja. É preferido realizar o tratamento térmico por um tempo predeterminado depois de controlar o teor de umidade da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja, que é uma matéria- prima, pulverizando-se ou misturando-se diretamente uma quantidade apropriada de água antes da fermentação sólida. Especificamente, o teor de umidade pode ser controlado pelo teor de proteínas ou peptídeos de baixo peso molecular do produto de soja fermentado desejado ou para o propósito de ajustar o tempo de fermentação. Além disso, o propósito do tratamento térmico é matar vários germes na matéria-prima e desnaturar a proteína destruindo-se a parede da célula da matéria-prima, fornecendo assim um ambiente no qual o microorganismo desejado pode crescer vigorosamente. O método de tratamento térmico pode ser realizado usando vários métodos amplamente conhecidos na técnica sem limitação. Especificamente, pode ser realizado usando vapor ou vapor superaquecido.

[044] De acordo com uma modalidade, a farinha de soja ou concentrado de proteína de soja da presente revelação pode ser preparado controlando-se o teor de umidade na faixa de 30% (v/p) a 80% (v/p) e realizando tratamento térmico por 10 minutos a 30 minutos enquanto controla a temperatura do tratamento térmico em 70 °C a 130 °C, seguido por arrefecimento em 30 °C a 50 °C. A solução de cultura para a cepa CJ24-34 do Bacillus amyloliquefaciens da presente revelação pode ser inoculada em uma quantidade de 10% em peso com base no peso de cada farinha de soja e concentrado de proteína de soja e fermentado em 20 °C a 50 °C por 8 horas a 72 horas.

[045] Mais especificamente, o teor de umidade controlado (v/p) da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja pode ser na faixa de 30% a 80%, 30% a 70%, 30% a 60%, 30% a 50%, 30% a 40%, 40% a 80%, 40% a 70%, 40% a 60% ou 40% a 50%. O teor de umidade da farinha de soja pode ser apropriadamente controlado em uma condição de baixa umidade ou uma condição de alta umidade para o teor de proteínas ou peptídeos de baixo peso molecular da farinha de soja fermentada desejada ou para o propósito de ajustar o tempo de fermentação.

[046] De acordo com uma modalidade, quando a temperatura do tratamento térmico é baixa ou o tempo de tratamento é curto, existe um problema em que o efeito germicida de germes pode deteriorar e o processo de fermentação subsequente pode não ser facilmente realizado. Ao contrário, quando a temperatura do tratamento térmico é alta ou o tempo de tratamento é longo, a digestibilidade é reduzida devido à desnaturação das proteínas na farinha de soja e, portanto, a qualidade do produto final é deteriorada. Consequentemente, é preferido selecionar a temperatura do tratamento térmico ou o tempo de tratamento dentro da faixa acima para evitar tais problemas. Através do processo de tratamento térmico, ele tem um efeito de criar um ambiente químico onde os contaminantes presentes na farinha de soja ou concentrado de proteína de soja são quase mortos e o processo de fermentação sólida subsequente é facilmente realizado. Também, espera-se que os fatores antinutricionais, tais como inibidor de tripsina (TI), que prejudicam a digestibilidade, possam ser levemente reduzidos.

[047] Mais especificamente, a temperatura do tratamento térmico pode ser na faixa de 70 °C a 120 °C, 70 °C a 110 °C, 70 °C a 100 °C, 80 °C a 130 °C, 80 °C a 120 °C, 80 °C a 110 °C, 80 °C a 100 °C, 90 °C a 130 °C, 90 °C a 120 °C, 90 °C a 110 °C ou 90 °C a 100 °C. Além disso, o tempo de tratamento térmico pode ser mais especificamente de 10 minutos a 30 minutos ou de 20 minutos a 30 minutos.

[048] A farinha de soja ou concentrado de proteína de soja tratado termicamente como descrito acima pode ser esfriado a uma temperatura em que fermentação sólida é possível. O processo de arrefecimento pode ser realizado através de um processo de transferência usando um resfriador de ar do tipo trasnportador. Mais especificamente, pode ser realizado até a temperatura da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja atingir 30 °C a 50 °C, 35 °C a 45 °C ou 35 °C a 40 °C.

[049] A temperatura de cultura para a fermentação pode ser de 20 °C a 50 °C, mais especificamente de 30 °C a 50 °C, 40 °C a 50 °C, 30 °C a 40 °C ou 20 °C a 40

°C, mas não está limitada e pode variar dependendo da qualidade do produto de soja fermentado desejado. Além disso, o tempo de cultura para a fermentação pode ser de 8 horas a 72 horas, mais especificamente, 10 horas a 70 horas, 10 horas a 60 horas, 10 horas a 50 horas, 10 horas a 40 horas, 10 horas a 30 horas, 10 horas a 20 horas ou 8 horas a 18 horas, mas não está limitado a estes e pode variar dependendo da qualidade do produto de soja fermentado desejado.

[050] De acordo com uma modalidade, a cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode ser inoculada na farinha de soja ou concentrado de proteína de soja em uma quantidade de 10 5 CFU/g a 109 CFU/g, 105 CFU/g a 108 CFU/g, 106 CFU/g a 109 CFU/g ou 106 CFU/g a 108 CFU/g. A quantidade da cepa a ser inoculada pode ser um fator importante que afeta a fermentação sólida da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja. Quando a quantidade da cepa a ser inoculada é pequena, pode levar um longo tempo para preparar o produto fermentado e, assim, o tempo de fermentação é prolongado e existe uma alta probabilidade de contaminação por outros microorganismos. Ao contrário, quando a quantidade da cepa a ser inoculada é muito alta, o tempo de fermentação pode ser reduzido, mas pode ser difícil para manter apropriadamente o ambiente de fermentação. Em particular, como o desempenho da fermentação pode depender em grande parte das características de crescimento da cepa de fermentação e o tipo de aparelho de fermentação, é preferido selecionar apropriadamente a quantidade de inoculação considerando as características da cepa no estágio de produção.

[051] De acordo com uma modalidade, o produto de soja fermentado pode ser obtido inoculando-se a cepa de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, na farinha de soja ou concentrado de proteína de soja, seguido por fermentação sólida. Por exemplo, um fermentor de leito compacto pode ser usado no processo de fermentação. O fermentor de leito compacto pode incluir vários tipos, tais como um aparelho de cultura de aeração do tipo batelada, aparelho de cultura do tipo fechado, aparelho de cultura de aeração do tipo contínuo ou semelhantes e qualquer tipo podem ser usados no método da presente revelação sem limitação, desde que possam ser usados para a preparação de produtos de soja fermentados, e um aparelho apropriado pode ser selecionado e usado de acordo com a escala de produção. Por exemplo, a farinha de soja ou concentrado de proteína de soja inoculada com a cepa pode ser colocado no fermentador de leito compacto com uma espessura de 5 cm a 50 cm e fermentado em 20 °C a 50 °C por 8 horas a 72 horas.

[052] De acordo com uma modalidade, o método da presente revelação pode compreender ainda as etapas de secagem e pulverização do produto de soja fermentado obtido depois da etapa de fermentação em baixa temperatura e baixa umidade. O teor de umidade residual do produto de soja fermentado imediatamente depois da fermentação pode ser de 20% (v/p) a 50% (v/p). Um processo de secagem pode ser adicionado para preparar o produto final do produto de soja fermentado tendo um teor de umidade de 10% (v/p) a 12% (v/p). Depois da fermentação ser concluída, um processo de pulverização pode ser adicionado depois do processo de secagem, de modo a tornar o tamanho de partícula do produto de soja fermentado uniforme, pois podem ter formado pedaços no produto de soja fermentado. O processo de secagem e pulverização pode ser realizado por vários métodos conhecidos na técnica. Entretanto, se a secagem é realizada a uma temperatura excessivamente alta, as bactérias vivas no produto de soja fermentado podem ser mortas e, assim, o processo de secagem é preferivelmente realizado a uma temperatura baixa. Além disso, o processo de pulverização pode ser realizado para ter vários tamanhos dependendo do uso intencionado do produto de soja fermentado; por exemplo, um moinho de martelos pode ser usado.

[053] O produto de soja fermentado preparado usando-se a cepa de amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, pode melhorar a taxa de absorção na digestão de um animal devido a um alto teor dos peptídeos de baixo peso molecular e é, portanto, altamente aplicável como um material alimentar de proteína de alta qualidade que pode substituir a proteína animal devido a um alto teor de proteína.

[054] De acordo com uma modalidade, a presente revelação fornece uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P), uma cultura da cepa, um concentrado da cultura ou um produto seco da cultura. Como descrito acima, a cepa é uma cepa inovadora, e o produto de soja fermentado preparado usando a cepa tem um baixo teor de mucilagem, mas tem um alto teor de peptídeos de baixo peso molecular e mostra uma atividade antibacteriana.

[055] De acordo com uma modalidade, a presente revelação fornece uma composição antibacteriana compreendendo uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens, uma cultura da cepa, um concentrado da cultura ou um produto seco da cultura e tendo uma atividade antibacteriana contra pelo menos um patógeno selecionado do grupo que consiste em Salmonella typhimurium, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda. Para mais detalhes a respeito do exposto acima, a referência pode ser feita ao conteúdo descrito acima e Exemplos.

[056] De acordo com uma modalidade, a presente revelação fornece uma composição alimentar compreendendo o produto de soja fermentado preparado pelo método acima. O teor do produto de soja fermentado na composição alimentar, de acordo com a presente revelação, pode ser adequadamente controlado dependendo do tipo e idade dos animais a ser aplicado, forma de aplicação, efeitos desejados ou semelhantes. Por exemplo, pode ser usado em uma quantidade de 1% em peso a 99% em peso, mais especificamente 10% em peso a 90% em peso, e 20% em peso a 80% em peso, mas não está limitado a estas.

[057] Para a administração, a composição alimentar da presente revelação pode incluir anda uma mistura de pelo menos um de um ácido orgânico, tal como ácido cítrico, ácido fumárico, ácido adípico, ácido láctico ou semelhantes; fosfato, tal como fosfato de potássio, fosfato de sódio, polifosfato ou semelhantes; um antioxidante natural, tal como polifenol, catequina, tocoferol, vitamina C, extrato de chá verde, quitosana, ácido tânico ou semelhantes; além do produto de soja fermentado. Se necessário, outro aditivo típico, tal como um agente anti-influenza, um tampão, um agente bacteriostático ou semelhantes podem ser adicionados. Além disso, um diluente, um agente dispersante, um tensoativo, um aglutinante ou um lubrificante podem ser adicionalmente adicionados para formular a composição em uma preparação injetável tal como uma solução aquosa, uma suspensão, uma emulsão ou semelhantes, uma cápsula, um grânulo ou um comprimido.

[058] Além disso, a composição alimentar da presente revelação pode ser usada junto com vários auxiliaries, tais como aminoácidos, sais inorgânicos, vitaminas, antioxidantes, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos ou semelhantes, e um suplemento nutritivo, um acelerador de crescimento, um acelerdor de absorção na digestão e um agente profilático, além dos ingredientes principais, incluindo um alimento de proteína vegetal tal como trigo, cevada, milho ou semelhantes pulverizados ou fragmentados, um alimento de proteína animal, tal como farinha de sangue, farinha de carne, farinha de peixe ou semelhantes, gordura animal e óleo vegetal.

[059] Quando a composição alimentar da presente revelação é usada como um aditivo alimentar, a composição alimentar pode ser adicionada como é ou usada junto com outros componentes, e pode ser apropriadamente usada de acordo com o método típico. A composição alimentar pode ser preparada na forma de administração de uma formulação de liberação imediata ou uma formulação de liberação sustentada, em combinação com portadores farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. Os portadores comestíveis podem ser amido de milho, lactose, sacarose ou propileno glicol. O portador sólido pode estar na forma administração de comprimidos, pós, pastilhas ou semelhantes, e o portador líquido pode estar na forma de administração de xaropes, suspensões líquidas, emulsões, soluções ou semelhantes. Além disso, o agente de administração pode incluir um conservante, um lubrificante, um acelerador de solução ou um estabilizador e também pode incluir outros agentes para melhorar doenças inflamatórias e uma substância útil para a prevenção contra vírus.

[060] A composição alimentar da presente revelação pode ser aplicada à dieta de um animal, isto é, um alimento para muitos animais incluindo mamíferos, aves,

peixes e crustáceos. Pode ser usada em mamíferos comercialmente importantes, tais como porcos, gado, cabras ou semelhantes, animais de zoológico, tais como elefantes, camelos ou semelhantes, ou animais, tais como cães, gatos, etc. Aves comercialmente importantes podem incluir galinhas, patos, gansos ou semelhantes, e peixes e crustáceos comercialmente importantes, tais como truta e camarão, também podem ser incluídos.

[061] A composição alimentar, de acordo com a presente revelação, pode ser misturada em uma quantidade de aproximadamente 10 g a 500 g, preferivelmente 10 g a 100 g por 1 kg, com base no peso seco da alimentação de animais. Depois de ser completamente misturada, a composição alimentar pode ser preferivelmente fornecida como mistura ou ainda submetida a um processo de peletização, extensificação ou extrusão.

[062] A cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens, de acordo com a presente revelação, fornece um uso para preparar um produto de soja fermentado.

MODALIDADE PARA A INVENÇÃO

[063] A presente revelação refere-se a uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens inovadora, um método para preparar um produto de soja fermentado usando a mesma e um produto fermentado da mesma. Em seguida, a presente revelação será descrita em detalhes por via de Exemplos e Exemplos Experimentais. Entretanto, estes Exemplos são fornecidos apenas para propósitos ilustrativos, e não devem ser interpretados como limitativos do escopo da presente revelação.

[064] Em seguida, a presente revelação será descrita em detalhes por via de Exemplos e Exemplos Experimentais. [EXEMPLO 1] ISOLAMENTO DE CEPA DE BACILLUS

AMYLOLIQUEFACIENS INOVADORA

[065] Bacillus amyloliquefaciens (em seguida referido como “cepa CJ823”, ver Patente Coreana No 10-1517326), conhecido por ser tipicamente usado para a fermentação de uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja, foi preparado e, depois, a melhoria da cepa foi realizada da seguinte maneira.

[066] Primeiro, a cepa CJ823 foi ativada cultivando-se em um meio de placa TSB (composição do meio: 17,0 g de digestão enzimática de caseína, 3,0 g de digestão enzimática de farinha de soja, 5,0 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de fosfato de dipotássio, 2,5 g de dextrose, 15,0 g de ágar, 25 ºC, pH final: 7,3±0,2) a 37 ºC por 12 horas. A cepa ativada foi usada como uma cultura de sementes suspendendo-se cerca de 2 platinas (diluídas a uma absorvância de cerca de 0,2 a 660 nm) em 9 ml de uma solução esterilizante de NaCl a 0,8%. 50 ml do TSB previamente preparado foram inoculados com a suspensão de cultura de sementes a 1% e, depois, cultivados a 37 ºC com uma velocidade de 180 rpm até que a absorvância a 660 nm atingisse cerca de 4,0 a 5,0. Depois de cultivar a cultura de sementes, a solução de cultura foi centrifugada (8.000 rpm, 4 ºC, 10 minutos) para isolar as células do sobrenadante. As células isoladas foram lavadas duas vezes com solução esterilizante de NaCl a 0,8% na mesma quantidade como a solução de cultura. 20 ml da solução esterilizante de NaCl a 0,8% foram misturados com as células de modo que a concentração celular atingisse uma absorvância a 660 nm de cerca de 0,8, e 15 ml da mistura foram aplicados a uma placa de Petri estéril. Em seguida, raios UV foram irradiados às células a uma altura de cerca de 50 cm com um comprimento de onda de 254 nm usando uma lâmpada UV (VIBER LOURMAT, 115 V, 60 Hz). A irradiação UV foi realizada por um período de tempo até que a taxa de mortalidade da cepa do tipo selvagem atingisse 99,99% de acordo com o tempo de irradiação UV. Subsequentemente, 0,1 ml da mistura irradiada por UV foi adicionado ao meio de placa TSA (composição do meio: ágar tríptico de soja, 15 g de digestão enzimática de caseína, 5 g de digestão enzimática de farinha de soja, 5 g de NaCl, 15 g de ágar, 25 ºC, pH final: 7,3±0,2) a 37 ºC por 12 horas, e apenas as cepas mutantes que formaram as colônias foram isoladas e obtidas. [EXEMPLO 2] MEDIÇÃO DE CAPACIDADE PROTEOLÍTICA E

ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

[067] A capacidade proteolítica e atividade antibacteriana de cada cepa mutante obtida por isolamento de acordo com o Exemplo 1 foram confirmadas pelo seguinte método. Como um controle, Bacillus subtilis (No de acesso KCCM11438P) e Bacillus amyloliquefaciens (cepa CJ823) conhecidos na técnica foram usados (em seguida referidos como Controle 1 e Controle 2, respectivamente). 1) CAPACIDADE PROTEOLÍTICA

[068] Para medir a capacidade proteolítica das cepas mutantes obtidas no Exemplo 1, as cepas foram cultivadas por inoculação em um meio de ágar YM (3,0 g de extrato de levedura, 3,0 g de extrato de malte, 10,0 g de peptona, 20,0 g de ágar) contendo leite desnatado a 2% (p/v) (Difco, EUA), e o tamanho da zona clara (C) formada pela degradação do substrato foi medido ao mesmo tempo ao medir o diâmetro da colônia formada (crescimento (G)).

[069] Mais especificamente, cada cepa mutante foi cultivada no meio TSB (composição do meio: 17,0 g de digestão enzimática de caseína, 3,0 g de digestão enzimática de farinha de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato de dipotássio, 2,5 g de dextrose, pH final: 7,3±0,2 at 25 ºC) a 37 ºC por 12 horas com uma velocidade de agitação de 200 rpm. Depois, 1,0 μl da solução de cultura para cada cepa mutante foi aliquotado para o meio de ágar YM contendo leite desnatado e cultivado a 37 ºC por 16 horas. Depois da conclusão da cultura, o diâmetro (G) das colônias formadas no meio de cultura e o tamanho (C) da zona clara foram medidos. 2) ATIVIDADE ANTIBACTERIANA CONTRA SALMONELLA

TYPHIMURIUM

[070] Salmonella typhimurium (ATCC14028), um patógeno típico capaz de causar doenças em enimais, foi usado para medir a atividade antibacteriana das cepas mutantes obtidas no Exemplo 1 acima. Mais especificamente, as cepas mutantes foram cultivadas em um meio GYP (composição do meio: 10 g de glicose, 8 g de extrato de levedura, 2 g de polipeptone, pH: 7,0) a 37 ºC por 12 horas a uma velocidade de agitação de 180 rpm. 1,5 μl da solução de cultura para cada cepa mutante foi aliquotado para um meio de ágar GYP (composição do meio: 10 g de glicose, 8 g de extrato de levedura, 2 g de polipeptone, 15 g de ágar, pH: 7,0)

suplementado com 1x105 CFU/ml de Salmonella typhimurium e cultivado por 37 ºC por 15 horas.

Depois da conclusão da cultura, o tamanho da zona clara formada em torno das colônias das cepas mutantes foi medido e o título da atividade antibacteriana foi medido.

TABELA 1

Nome da cepa C G C/G C-G Atividade antibacteriana

Controle 1 6,6 6,6 1,00 0,00 ++

Controle 2 12,46 8,31 1,50 4,15 ++++

CJ24-1 13,02 7,05 1,85 5,97 +++++

CJ24-3 13,91 6,78 2,05 7,13 +++++

CJ24-4 14 6,76 2,07 7,24 +++++

CJ24-5 14,06 7,02 2,00 7,04 +++++

CJ24-6 13,79 6,78 2,03 7,01 +++++

CJ24-7 13,56 6,57 2,06 6,99 +++++

CJ24-9 13,45 6,34 2,12 7,11 +++++

CJ24-10 13,15 6,46 2,04 6,69 +++++

CJ24-11 13,5 6,82 1,98 6,68 +++++

CJ24-12 13,31 6,68 1,99 6,63 +++++

CJ24-13 13,76 6,62 2,08 7,14 +++++

CJ24-14 13,6 7,23 1,88 6,37 -

CJ24-15 14,15 6,94 2,04 7,21 +++++

CJ24-16 13,26 5,92 2,24 7,34 +++++

CJ24-17 13,27 6,07 2,19 7,20 +++++

CJ24-18 13,37 5,95 2,25 7,42 +++++

Nome da cepa C G C/G C-G Atividade antibacteriana CJ24-19 13,7 6,94 1,97 6,76 +++++ CJ24-20 13,94 7,38 1,89 6,56 +++++ CJ24-21 13,18 6,86 1,92 6,32 +++++ CJ24-22 13,26 6,35 2,09 6,91 ++++ CJ24-23 13,73 6,69 2,05 7,04 +++++ CJ24-24 13,79 7,5 1,84 6,29 +++++ CJ24-25 13,4 6,45 2,08 6,95 +++++ CJ24-26 14,08 7,23 1,95 6,85 +++++ CJ24-27 13,9 7,93 1,75 5,97 ++ CJ24-28 13,82 5,92 2,33 7,90 +++++ CJ24-29 13,93 5,87 2,37 8,06 +++++ CJ24-30 13,55 5,99 2,26 7,56 +++++ CJ24-31 13,22 5,91 2,24 7,31 ++++ CJ24-32 13,64 5,81 2,35 7,83 +++ CJ24-33 13,91 6,11 2,28 7,80 ++++ CJ24-34 14,13 6,21 2,28 7,92 +++++ CJ24-35 15,11 7,13 2,12 7,98 + CJ24-36 12,91 5,11 2,53 7,80 +++

[071] A Tabela 1 mostra a atividade antibacteriana através das medições do tamanho da zona clara (C), do diâmetro da colônia (G), da razão dos mesmos (C/G), da diferença de tamanho dos mesmos (C-G) e do tamanho da zona clara medido depois que a cultura das cepas foi concluída.

[072] De acordo com a Tabela 1, entre as cepas mutantes, CJ24-28, CJ24-29,

CJ24-32, CJ24-33, CJ24-34, e CJ24-36 apresentaram uma razão mais alta do tamanho da zona clara para o tamanho das colônias formadas (C/G) (2,28 a 2,53), entre as quais CJ24-28, CJ24-29 e CJ24-34 apresentaram a atividade antibacteriana mais alta (todas +++++). Ao contrário, o Controle 1 apresentou o valor de C/G mais baixo, e o Controle 2 apresentou o segundo valor de C/G mais baixo (1,00 e 1,50, respectivamente), e as atividades antibacterianas dos mesmos foram apenas ++ e ++++, respectivamente. Isto é, foi confirmado que as cepas mutantes apresentaram capacidade proteolítica e atividade antibacteriana intensificadas em comparação com Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens convencionalmente conhecidos. Assim, quando as cepas foram aplicadas a um concentrado de proteína de soja ou uma farinha de soja oara preparar um produto de soja fermentado, era de esperar que o produto de soja fermentado mostrasse uma atividade antibacteriana. [EXEMPLO 3] MEDIÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DA CEPA CJ24-34

[073] Um experimento foi conduzido adicionalmente para confirmar se a cepa CJ24-34, que apresentou uma excelente capacidade proteolítica por causa do maior tamanho da zona clara (C) e do diâmetro da colônia (G) entre as cepas (CJ24-28, CJ24-29 e CJ24-34) selecionadas como tendo uma excelente atividade antibacteriana no Exemplo 2, tem uma atividade antibacteriana contra microorganismos patogênicos exceto Salmonella. Para confirmar a atividade antibacteriana, os microorganismos patogênicos tais como Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum, Lactococcus garvieae e Edwardsiella tarda foram usados, e eles são conhecidos por causar doenças em peixes criados em fazendas tais como sepse, Vibrio cholerae, vibriose em camarão, pasteurelose em savelha, estreptococose em solha e edwardsielose em solha. Entre os microorganismos patogênicos, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel e Lactococcus garvieae foram cepas obtidas de Gyeongsang National University Hospital Branch of National Culture Collection to Pathogens, e Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda foram cepas obtidas de KCTC. Cada microorganismo patogênico foi cultivado no meio e temperatura correspondentes de acordo com a Tabela 2 abaixo.

Depois, colônias únicas foram selecionadas, e elas foram transferidas a um tubo de ensaio e pré-cultivadas no meio líquido correspondente durante a noite.

A solução de pré-cultura foi novamente inoculada a 0,1% em 100 ml do meio líquido correspondente para cada bactéria patogênica e cultivada por cerca de 12 horas.

A solução de cultura foi usada para preparar um meio de ágar para cada bactéria patogênica para testar a atividade antibacteriana.

TABELA 2

Bactérias Doença No de Condição de cultura patogênicas induzida acesso Meio de Meio Temperatura ágar líquido (ºC)

Vibrio vulnificus Vibriose em P4710 Ágar Caldo 30 camarão marinho marinho (BD Difco) (BD Difco)

Vibrio Vibriose em P4712 Ágar Caldo 30 parahaemolyticus camarão marinho marinho (BD Difco) (BD Difco)

Photobacterium Pasteurelose P4482 Ágar Caldo 30 damsela em savelha marinho marinho (BD Difco) (BD Difco)

Listonella Vibriose em KCTC MRS ágar Caldo 30 anguillarum savelha 2711 (BD Difco) MRS (BD Difco)

Lactococcus Estreptococose P4737 Ágar Caldo 30 garvieae em solha marinho marinho (BD Difco) (BD Difco)

Edwardsiella Edwardsielose KCTC Caldo de Caldo de 37

Bactérias Doença No de Condição de cultura patogênicas induzida acesso Meio de Meio Temperatura ágar líquido (ºC) tarda em solha 12267 nutriente nutriente (BD Difco) + (BD Difco) ágar a 0,2%

[074] As colônias únicas obtidas cultivando-se CJ24-34 deste pedido no meio de ágar GYP (glicose a 1%, extrato de levedura a 0,8%, peptona a 0,2%, ágar a 0,2%) foram inoculadas em um tubo de ensaio contendo 3 ml de um meio GYP (glicose a 1%, extrato de levedura a 0,8%, peptona a 0,2%) e pré-cultivadas a 37 ºC com uma velocidade de 180 rpm durante a noite. A solução de pré-cultura foi novamente inoculada a 0,1% em 100 ml do meio GYP e cultivada a 37 ºC com uma velocidade de 180 rpm. Em seguida, as soluções de cultura depois de 16 horas e 20 horas da cultura foram guardadas, e 10 ml de cada solução de cultura foi centrifugada com uma velocidade de 8.000 rpm por 10 minutos a 4 ºC para recuperar o sobrenadante. O sobrenadante foi novamente filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 μm para preparar um filtrado.

[075] Para testar a atividade antibacteriana das substâncias antibacterianas secretadas da cepa CJ24-34 no meio de ágar, um meio de ágar que corresponde às condições de cultura de cada bactéria patogênica foi preparado e esterilizado a 121 ºC por 15 minutos. O meio de ágar foi esfriado, e a solução de cultura de cada bactéria patogênica preparada previamente antes do meio de ágar ser solidificado foi adicionada ao meio de ágar a 1% e misturada e, depois, a mistura foi transferida para uma placa quadrada para solidificar os meios de ágar inoculados com cada bactéria patogênica. Um copo penicilindro foi colocado na placa do meio de ágar completamente solidificado, e 300 μl de cada CJ24-34 filtrada (16 horas, 20 horas) preparada previamente foram carregados em cada copo, e as bactérias correspondentes foram cultivadas de acordo com as condições de cultura de cada bactéria patogênica.

Depois da conclusão da cultura, foi medido o tamanho da zona clara no meio de ágar cultivado com cada bactéria patogênica.

Neste momento, o tamanho do copo penicilindro foi de 7 mm, e o tamanho da zona clara foi comparada medindo-se o diâmetro da mancha incluindo a zona clara gerada pela substância antibacteriana.

Um aumento no tamanho da zona clara indica que as bactérias patogênicas não puderam crescer devido às substâncias antibacterianas secretadas por CJ24-34. Além disso, neste experimento, a zona clara gerada dentro do copo penicilindro foi interpretada como um indicador da atividade antibacteriana, mas o tamanho da mesma não foi medido como a zona clara gerada fora do copo penicilindro.

TABELA 3

Bactérias Doença induzida No de Tamanho da zona clara de acordo patogênicas acesso com o tempo de cultura (mm) * tamanho do copo penicilindro: 7 mm

16 horas 20 horas

Vibrio vulnificus Vibriose em P4710 9 10 camarão

Vibrio Vibriose em P4712 7 (zona clara 7 (zona clara parahaemolyticus camarão interna gerada) interna gerada)

Photobacterium Pasteurelose em P4482 15 15 damsela savelha

Listonella Vibriose em KCTC 14 14 anguillarum savelha 2711

Lactococcus Estreptococose P4737 Nenhuma zona Nenhuma zona garviaeae em solha clara clara

Edwardsiella tarda Edwardsielose KCTC 25 25

Bactérias Doença induzida No de Tamanho da zona clara de acordo patogênicas acesso com o tempo de cultura (mm) * tamanho do copo penicilindro: 7 mm 16 horas 20 horas em solha 12267

[076] Com referência ao tamanho da zona clara descrito na Tabela 3, foi confirmado que a CJ24-34 da presente revelação secretou substâncias antibacterianas tendo uma atividade antibacteriana contra uma bactéria patogênica específica. O tamanho do copo penicilindro foi de 7 mm e, com base nisto, foi confirmado que as substâncias antibacterianas de CJ24-34 inibiram o crescimento de Vibrio vulnificus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda. Entretanto, o tamanho da zona clara de Vibrio parahaemolyticus foi de 7 mm, que foi o mesmo como o tamanho do copo penicilindro, e pode ser avaliado como não tendo nenhuma atividade antibacteriana ao medir o tamanho da zona clara externa. Entretanto, foi confirmado que a zona clara existia parcialmente dentro do copo penicilindro quando substancialmente vista na placa e, assim, pode-se inferir que havia alguma atividade antibacteriana contra este patógeno. Isto é, a cepa CJ24-34 mostrou uma atividade antibacteriana contra 5 bactérias patogênicas (Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda) entre 6 bactérias patogênicas testadas neste experimento. Assim, quando a cepa CJ24-34 da presente revelação é aplicada a um concentrado de proteína de soja ou uma farinha de soja, espera-se que um produto de soja fermentado, no qual a proliferação de bactérias patogênicas seja impedida, e uma composição alimentar para animal contendo o mesmo pode ser preparada. [EXEMPLO 4] MEDIÇÃO DA CAPACIDADE PRODUTIVA DE

MUCILAGEM DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

[077] Para confirmar a capacidade produtiva de mucilagem das cepas mutantes

CJ24-28, CJ24-29 e CJ24-34, que foram selecionadas como tendo capacidade proteolítica e atividade antibacteriana excelentes no Exemplo 2, as cepas foram cultivadas no meio de ágar GYP, e o fenótipo de cada colônia foi observado de perto. Como um grupo controle, o Controle 2 (Bacillus amyloliquefaciens, CJ823 cepa) descrito no Exemplo 2 foi usado.

[078] Como um resultado do experimento, a colônia de cepa do Controle 2 foi observada como viscosa e lustrosa, que confirmou a produção de mucilagem, enquanto nas colônias das cepas mutantes CJ24-28, CJ24-29 e CJ24-34 selecionadas no Exemplo 2, foi confirmado que a produção de mucilagem foi suprimida, pois não foi observado brilho ou viscosidade. [EXEMPLO 5] CAPACIDADE PRODUTIVA DE MUCILAGEM E CAPACIDADE DE FERMENTAÇÃO DE CEPA CJ24-34 EM CONCENTRADO DE

PROTEÍNA DE SOJA

[079] Um experimento foi conduzido para confirmar a produção de mucilagem e capacidade de fermentação das cepas quando a cepa CJ24-34, que foi confirmada como tendo capacidade proteolítica e atividade antibacteriana excelentes entre as cepas mutantes selecionadas no Exemplo 2 e Exemplo 3, foi fermentada sendo inoculada no concentrado de proteína de soja. Como um grupo controle da mesma, foram usados os grupos Controle 1 (Bacillus subtilis: No de acesso KCCM11438P) e Controle 2 (Bacillus amyloliquefaciens: CJ823) mencionados no Exemplo 2.

[080] A cepa CJ24-34 foi pré-cultivada no meio GYP (composição do meio: glicose 10 g/l, extrato de levedura 8 g/l, peptona de soja 2 g/l), e a solução de cultura obtida pela pré-cultura foi inoculada novamente no meio GYP de modo que sua quantidade representasse 1% e cultivada até que a absorvância a 660 nm fosse 6 ou mais.

[081] O concentrado de proteína de soja foi preparado controlando-se o teor de umidade para cerca de 43% (v/p) e tratando-se termicamente a 100 ºC por 30 minutos, seguido por arrefecimento entre 30 ºC a 50 ºC. 10% em peso da solução de cultura da cepa CJ24-34 foi inoculada no concentrado de proteína de soja pré-tratado com base no peso do concentrado de proteína de soja, e o teor de umidade da solução de cultura inoculada foi controlado para cerca de 46%.

[082] O concentrado de proteína de soja foi fermentado por 16 horas em uma temperatura constante e a câmara de umidade mentida a uma temperatura de 37 ºC e uma umidade de 95%. Antes da fermentação, o pH do concentrado de proteína de soja foi de cerca de 6,8, e cada cepa foi inoculada em uma quantidade de cerca de 107 CFU/g. Depois da conclusão da fermentação, a produção de mucilagem foi examinada e, a umidade, a contagem de células viáveis e o pH do produto fermentado foram novamente medidos.

[083] O teor de proteína e o aumento no teor de proteína do produto fermentado foram medidos com base no peso seco depois de secar o produto fermentado.

[084] A Figura 1 é uma fotografia que mostra concentrados de proteína de soja fermentados fermentados aplicando-se CJ24-34 e duas cepas controle. As FIGS. 1A e C são fotografias de concentrados de proteína de soja fermentados fermentados com o Controle 1 (Bacillus subtilis) e CJ24-34 de acordo com a presente revelação, respectivamente, e foi confirmado que a produção de mucilagem foi suprimida, pois não foram observadas viscosidade ou pedaços nos produtos fermentados. Ao contrário, a Figura 1B é uma fotografia do concentrado de proteína de soja fermentado fermentado com o Controle 2 (Bacillus amyloliquefaciens). O produto fermentado foi muito viscoso e formou pedaços. Isto é, o Bacillus amyloliquefaciens convencional produz uma quantidade considerável de mucilagem durante o processo de fermentação, enquanto a CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens de acordo com a presente revelação dificilmente produz mucilagem, confirmando que pode ser útil para a produção em massa do produto fermentado. TABELA 4

Nome da cepa Te Umid Contagem de p Teor de Aumento no teor mpo ade células viáveis H proteína de proteína (hor (%) (CFU/g) (%, peso (%, peso seco) as) seco) Controle 1 0 45,4 1,1 × 108 6, 63,3 (Bacillus subtilis) 9 84 16 38,9 7,8 × 109 8, 68,0 4,0 4 45 Controle 2 0 45,9 1,6 × 108 6, 63,9 (CJ823) 4 76 16 39,1 4,6 × 109 8, 68,0 4,1 9 23 CJ24-34 da 0 45,8 6,1 × 107 6, 64,2 presente revelação 6 83 16 37,7 1,8 × 109 8, 68,3 4,0 3 28

[085] Para examinar as características do produto fermentado preparado usando CJ24-34 da presente revelação, o teor de umidade de acordo com o tempo (0 horas, 16 horas), a contagem de células viáveis, o pH, o teor de proteína e o aumento no teor de proteína dos concentrados de proteína de soja fermentados, nos quais cada cepa incluindo os controles foi aplicada, foram confirmados (Tabela 4). Como um resultado do experimento, o concentrado de proteína de soja fermentado fermentado com CJ24- 34 de acordo com a presente revelação apresentou um teor de umidade de cerca de 37% a 39%, um pH de 8 ou mais, e uma contagem de células viáveis de cerca de 10 9 CFU/g ou mais. Além disso, o teor de proteína foi aumentado por cerca de 4% em relação ao teor de proteína da matéria-prima, confirmando a capacidade de fermentação.

[EXEMPLO 6] DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA E DISTRIBUIÇÃO DE

PESO MOLECULAR DE CONCENTRADO DE PROTEÍNA DE SOJA FERMENTADO

[086] Neste Exemplo, a degradação de proteína e distribuição de peso molecular dos concentrados de proteína de soja fermentados do Exemplo 5 foram analisadas para confirmar o tamanho e distribuição dos peptídeos incluídos no produto fermentado. Eles foram medidos por SDS-PAGE e GPC, respectivamente.

[087] 1) SDS-PAGE (Eletroforese em Gel de Poliacrilamida)

[088] 100 mg da matéria-prima (concentrado de proteína de soja) e dos concentrados de proteína de soja fermentados (o concentrado de proteína de soja fermentado de CJ24-34 e o concentrado de proteína de soja fermentado de Controle 1) preparados de acordo com o Exemplo 5 foram colocados em suspensão em 5 ml de solvente de ureia 8 M, sonicados e depçois centrifugados (a 8.000 rpm por 10 minutos) para isolar o sobrenadante. O sobrenadante foi quantificado como ácido bicinconínico e carregado em gel de SDS-PAGE.

[089] A Figura 2 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE dos concentrados de proteína de soja fermentados. A partir da faixa esquerda da Figura 2, M representa o biomarcador, 1 representa a distribuição de proteína da matéria- prima (concentrado de proteína de soja), 2 e 3 representam a distribuição de proteína do concentrado de proteína de soja fermentado de CJ24-34 de acordo com a presente revelação, e 4 e 5 representam a distribuição de proteína do concentrado de proteína de soja fermentado de Controle 1. De acordo com a distribuição de proteína mostrada na Figura 2, pode ser confirmado que o concentrado de proteína de soja fermentado de CJ24-34 de acordo com a presente revelação não continha quase nenhuma proteína polimérica e era composto principalmente de peptídeos de baixo peso molecular e, assim, uma melhoria na taxa de absorção de digestão pode ser esperada quando a cepa correspondente foi aplicada como um alimento. Ao contrário, o concentrado de proteína de soja fermentado de Controle 1 ainda continha as proteínas poliméricas, confirmando que as proteínas poliméricas não foram decompostas adequadamente.

[090] 2) GPC (Cromatografia de Permeação em Gel)

[091] A GPC é um método para derivar a distribuição de proteína de peso molecular em uma amostra a ser medida, analisando-se proteínas padrão tendo diferentes pesos moleculares para determinar o tempo de retenção de cada proteína, e depois calculando-se uma curva padrão para o relacionamento entre o peso molecular e o tempo de retenção. Mais especificamente, depois que o tempo de retenção da proteína tendo um peso molecular específico foi calculado, o cromatograma é dividido em partes de acordo com o tempo, e a razão da área parcial de cada faixa de peso molecular em toda a área do cromatograma é calculada.

[092] 100 mg da matéria-prima (concentrado de proteína de soja) e dos concentrados de proteína de soja fermentados (o concentrado de proteína de soja fermentado de CJ24-34 e o concentrado de proteína de soja fermentado de Controle 1) preparado de acordo com o Exemplo 5 foram colocados em suspensão em 5 ml de solvente de ureia 8 M, sonicados, e depois centrifugados (a 8.000 rpm por 10 minutos) para isolar o sobrenadante. Subsequentemente, o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 μm, e o filtrado foi analisado por GPC. Os resultados são mostrados na Tabela 5. TABELA 5 MW Matéria- Concentrado Concentrado Concentrado Concentrado (kDa) prima de proteína de proteína de proteína de proteína (concentrado de soja de soja de soja de soja de proteína fermentado fermentado fermentado fermentado de soja) de CJ24-34 de CJ24-34 de Controle 1 de Controle 1 (1) (2) (1) (2) >75 22,40 5,59 6,05 17,22 18,28 30-75 46,99 14,07 13,57 36,30 38,08 10-30 15,92 24,57 24,27 21,99 20,71

MW Matéria- Concentrado Concentrado Concentrado Concentrado (kDa) prima de proteína de proteína de proteína de proteína (concentrado de soja de soja de soja de soja de proteína fermentado fermentado fermentado fermentado de soja) de CJ24-34 de CJ24-34 de Controle 1 de Controle 1 (1) (2) (1) (2) 5-10 4,70 22,04 21,86 8,94 8,17 <5 9,98 33,73 34,26 15,54 14,76 Total 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

[093] A Tabela 5 mostra os resultados de GPC da matéria-prima e dos concentrados de proteína de soja fermentados. Como mostrado na Tabela 5, os concentrados de proteína de soja fermentados (1) e (2) de CJ24-34 de acordo com a presente revelação continham cerca de 80% de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos e cerca de 55% de peptídeos tendo um peso molecular de 10 kDa ou menos, confirmando que eles foram em grande parte compostos de peptídeos de baixo peso molecular. Ao contrário, embora os concentrados de proteína de soja fermentados de Controle 1 continham mais de peptídeos de baixo peso molecular em comparação com a matéria-prima, o teor dos peptídeos tendo um peso molecular de 10 kDa ou menos foi apenas cerca de 23% a 24%, confirmando que eles foram compostos principalmente de peptídeos de alto peso molecular. [EXEMPLO 7] CAPACIDADE DE FERMENTAÇÃO DE FARINHA DE SOJA, DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA E DISTRIBUIÇÃO DE PESO MOLECULAR DE CEPA CJ24-34

[094] Para confirmar se a cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens de acordo com a presente revelação tem uma excelente capacidade de fermentação mesmo quando aplicada a uma farinha de soja, dois tipos de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM11471P e KCCM11906P), que foram convencionalmente usados como uma cepa de produção de farinhas de soja fermentadas, foram usados como um controle, e sua capacidade de fermentação foi confirmada. KCCM11471P e KCCM11906P foram marcados como os grupos Controle 3 e Controle 4, respectivamente.

[095] As cepas de Bacillus foram pré-cultivadas no meio GYP (composição do meio: glicose 10 g/l, extrato de levedura 8 g/l, peptona de soja 2 g/l), e a solução de cultura obtida pela pré-cultura foi inoculada novamente no meio GYP a 1% e cultivada até que a absorvância a 660 nm atingisse 6 ou mais.

[096] A farinha de soja foi preparada controlando-se o teor de umidade para cerca de 43% (v/p) e tratando-se termicamente a 100 ºC por 30 minutos, seguido por arrefecimento entre 30 ºC a 50 ºC. 10% em peso das soluções de cultura de Bacillus foram inoculadas na farinha de soja pré-tretada com base no peso da farinha de soja, e o teor de umidade da solução de cultura inoculada foi controlado para cerca de 46%. Antes da fermentação, o pH da farinha de soja foi de cerca de 6,8, e cada cepa foi inoculada em uma quantidade de cerca de 10 7 CFU/g. A farinha de soja inoculada com a solução de cultura foi fermentada por 18 horas em uma temperatura constante e câmara de umidade maintida a uma temperatura de 37 ºC e uma umidade de 95%. A farinha de soja fermentada depois de 14, 16 e 18 horas a partir do início da fermentação foi experimentada e a mudança no teor de proteína com o passar do tempo foi medido, e os resultados são mostrados na Tabela 6. TABELA 6 Categoria Tempo Farinha de Farinha de Farinha de soja de soja soja fermentada de fermentaç fermentada fermentada de CJ24-34 ão de Controle 4 (horas) Controle 3 1 1 2 1 2 3 Teor de proteína 0 54,1 54,2 54,1 54,2 54,1 54,1 (%, peso seco) 14 58,9 59,5 59,6 59,9 59,9 60,0

Categoria Tempo Farinha de Farinha de Farinha de soja de soja soja fermentada de fermentaç fermentada fermentada de CJ24-34 ão de Controle 4 (horas) Controle 3 1 1 2 1 2 3 16 59,4 59,7 59,5 60,2 60,0 60,0 18 59,4 59,6 59,8 60,8 60,5 60,1 Aumento no teor 14 4,7 5,3 5,5 5,7 5,8 5,9 de proteína (%, 16 5,3 5,5 5,4 6 5,9 5,9 peso seco) 18 5,2 5,4 5,6 6,6 6,3 5,9

[097] A Tabela 6 mostra o teor de proteína e o aumento no teor de proteína das farinhas de soja fermentadas. Como mostrado na Tabela 6, o teor de proteína e o aumento no teor de proteína da farinha de soja fermentada de CJ24-34 foram mais altos do que aqueles de Controle 3 ou Controle 4. Mais especificamente, quando a fermentação foi realizada durante a mesma quantidade de tempo, o teor de proteína de farinha de soja fermentada de CJ24-34 foi de cerca de 1% mais alto do que aquele de Controle 3 e de cerca de 0,5% mais alto do que aquele de Controle 4 em média. A partir do ponto de vista da técnica para preparar uma farinha de soja fermentada, é muito importante encurtar o tempo de fermentação aumentando-se rapidamente o teor de proteína e, assim, a CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens da presente revelação apresenta vantagens, pois pode melhorar a produtividade do produto de soja fermentado e reduzir o custo de produção.

[098] Entretanto, para confirmar o tamanho dos peptídeos que constituem a farinha de soja fermentada, a degradação de proteína e distribuição de peso molecular da farinha de soja fermentada fermentada com CJ24-34 e a matéria-prima (farinha de soja) foram analisadas. A este respeito, GPC foi usada na mesma maneira como descrito no Exemplo 6.

[099] A Figura 3 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE da matéria-prima (farinha de soja) e da farinha de soja fermentada fermentada com CJ24-

34. A partir da faixa esquerda da Figura 3, M representa o biomarcador, 1 representa a distribuição de proteína da matéria-prima (farinha de soja) e 2 representa a distribuição de proteína da farinha de soja fermentada fermentada com CJ24-34 de acordo com a presente revelação. Como mostrado na Figura 3, foi confirmado que a farinha de soja fermentada de CJ24-34 de acordo com a presente revelação não continha quase nenhuma proteína polimérica e foi composta principalmente de peptídeos de baixo peso molecular e, assim, uma melhoria na taxa de absorção de digestão pode ser esperada quando a cepa correspondente foi aplicada como um alimento. TABELA 7 MW (kDa) Matéria-prima Farinha de soja fermentada de CJ24- (farinha de soja) 34 >75 44,9% 8,1% 30 a 75 36,9% 10,0% 10 a 30 9,1% 23,5% 5 a 10 2,4% 22,5% <5 6,7% 35,9% Total 100,0% 100,0%

[0100] A Tabela 7 mostra os resultados de GPC para examinar a composição de peptídeo da matéria-prima (farinha de soja) e da farinha de soja fermentada. Como mostrado na Tabela 7, a matéria-prima (farinha de soja) continha cerca de 82% de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou mais e foi composta principalmente de peptídeos de alto peso molecular. Ao contrário, a farinha de soja fermentada fermentada com CJ24-34 de acordo com a presente revelação continha cerca de 82%

de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos e cerca de 58% de peptídeos tendo um peso molecular de 10 kDa ou menos, confirmando que ela foi em grande parte composta de peptídeos de baixo peso molecular. Isto é, a maioria das proteínas poliméricas contidas na matéria-prima foram decompostas em peptídeos de baixo peso molecular e, assim, pode ser esperado que a digestibilidade pode aumentar quando a cepa é aplicada como um alimento. [EXEMPLO 8] CAPACIDADE DE FERMENTAÇÃO DE FARINHA DE SOJA DE CJ24-34 SOB CONDIÇÃO DE BAIXA UMIDADE

[0101] A cepa CJ24-34 de acordo com a presente revelação foi pré-cultivada no meio GYP (composição do meio: glicose 10 g/l, extrato de levedura 8 g/l, peptona de soja 2 g/l), e a solução de cultura obtida pela pré-cultura foi inoculada novamente no meio GYP a 1% e cultivada até que a absorvância a 660 nm atingisse 6 ou mais.

[0102] A farinha de soja foi preparada controlando-se o teor de umidade para cerca de 31% (v/p) e tratando-se termicamente a 100 ºC por 30 minutos, seguido por arrefecimento entre 30 ºC a 50 ºC. 10% em peso da solução de cultura de Bacillus foi inoculada na farinha de soja pré-tretada com base no peso da farinha de soja, e o teor de umidade do meio de cultura inoculado foi controlado sob uma condição de baixa umidade de cerca de 36%. A farinha de soja inoculada com a solução de cultura foi fermentada por 12 horas em uma temperatura constante e a câmara de umidade mantida a uma temperatura de 37 ºC e uma umidade de 95%. A farinha de soja fermentada a 8, 10, e 12 horas a partir do início da fermentação foi experimentada, e o teor de umidade, a contagem de células viáveis, o teor de proteína e o aumento no teor de proteína foram medidos. TABELA 8 Tempo Umidade Contagem de Teor de proteína Aumento no teor de (horas) (%) células viáveis (%, peso seco) proteína (CFU/g) (%, peso seco) 0 37,1 4,4 × 108 52,34 8 35,15 8,2 × 109 54,6 2,26

Tempo Umidade Contagem de Teor de proteína Aumento no teor de (horas) (%) células viáveis (%, peso seco) proteína (CFU/g) (%, peso seco) 10 33,25 7,6 × 109 55,93 3,59 12 31,55 7,0 × 109 56,1 3,76

[0103] Como mostrado na Tabela 8, com o passar do tempo de fermentação, o teor de umidade diminuiu gradualmente e a contagem de células viáveis aumentou para 7,0 × 109 CFU/g. Além disso, como o teor de açúcar da farinha de soja foi utilizado durante o crescimento de Bacillus, foi confirmado que o teor de proteína foi aumentado por cerca de 4% depois de 12 horas no produto fermentado. Isto é, foi confirmado que a cepa de acordo com a presente revelação apresentou uma capacidade de fermentação mesmo na farinha de soja sob uma condição de baixa umidade. Para confirmar a composição do tamanho de peptídeos na farinha de soja sob uma condição de baixa umidade, SDS-PAGE e GPC foram analisadas na mesma maneira como descrito no Exemplo 6 para confirmar a degradação de proteína e a distribuição de peso molecular.

[0104] A Figura 4 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE da farinha de soja fermentada sob uma condição de baixa umidade. A partir da faixa esquerda da Figura 4, M representa o biomarcador, 1 representa a distribuição de proteína da matéria-prima (farinha de soja), e 2, 3 e 4 representam a distribuição de proteína da farinha de soja fermentada fermentada por 8 horas, 10 horas e 12 horas, respectivamente. Como mostrado na Figura 4, quando as proteínas poliméricas da matéria-prima de farinha de soja foram decompostas durante a fermentação, o teor de peptídeos de baixo peso molecular aumentou, confirmando assim que isso poderia causar um efeito de maior digestibilidade quando aplicado a um alimento. TABELA 9

Peso molecular Matéria-prima Farinha de soja Farinha de soja Farinha de soja (kDa) (Farinha de fermentada fermentada fermentada soja) depois de 8 depois de 10 depois de 12 horas horas horas >75 54,9 27,5 21,6 20,9 30-75 28,8 30,2 27,1 27,1 10-30 8,0 22,9 26,7 27,2 5-10 2,2 9,1 12,2 12,4 <5 6,1 10,3 12,5 12,4 Total 100,0 100,0 100,0 100,0

[0105] A Tabela 9 mostra os resultados de GPC da farinha de soja fermentada sob uma condição de baixa umidade de acordo com a matéria-prima e tempo de fermentação (8, 10, 12 horas). Como mostrado na Tabela 9, o produto de soja fermentado fermentado com a cepa CJ24-34 de acordo com a presente revelação por 12 horas continha cerca de 52% de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos e cerca de 24,8% de peptídeos tendo um peso molecular de 10 kDa ou menos. Ao contrário, a matéria-prima (farinha de soja) foi composta principalmente de peptídeos poliméricos, que continha cerca de 16,3% de peptídeos tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos. Isto é, pode ser confirmado que uma quantidade considerável das proteínas poliméricas contidas na matéria-prima foi decomposta em peptídeos de baixo peso molecular e, assim, pode ser esperado que a farinha de soja fermentada com a cepa CJ24-34 da presente revelação pode causar um aumento na digestão quando aplicada a um alimento devido a um alto teor dos peptídeos de baixo peso molecular. [EXEMPLO 9] SEQUÊNCIA DO GENE DE 16S RRNA E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE CEPA CJ24-34 DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

MUTANTE DA PRESENTE REVELAÇÃO

[0106] Para a identificação da cepa CJ24-34 mutante da presente revelação, a sequência do gene de 16S rRNA da cepa foi analisada usando as sequências mostradas na Tabela 10 abaixo.

[0107] Para a identificação da cepa pelas sequências do gene de 16S rRNA, a cepa foi amplificada por PCR usando 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′, SEQ ID NO. 1) e 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG AGE T-3′, SEQ ID NO. 2) como um iniciador universal, e depois purificada. Para a determinação das sequências, 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′), 518F (5′-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3′, SEQ ID NO. 3), 805R (5′-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3′, SEQ ID NO. 4) e 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG AGE T-3′) foram usados para analisar as sequências de 1508 pf. As sequências foram sequenciadas usando Kits de Sequenciamento de Ciclo Terminator v3.1 BigDye® (Aplicado Biosystems Inc., EUA) e analisado by ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, 3,850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404, EUA). TABELA 10 SEQ ID NO. 1 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ SEQ ID NO. 2 5′-GGT TAC CTT GTT ACG AGE T-3′ SEQ ID NO. 3 5′-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3′ SEQ ID NO. 4 5′-TACCAGGGTATCTAATCC-3′ SEQ ID NO. 5 Sequência de 16S rRNA de CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum

[0108] Como o resultado da análise das sequências de 16S rRNA, foi confirmado que a cepa CJ24-34 mutante da presente revelação continha as sequências de 16S rRNA da SEQ ID NO. 5. A listagem de sequências é anexada no final dos Desenhos. A similaridade das sequências gênicas foi determinada em comparação com as sequências registradas do servidor EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) e GenBank/EMBL/DDBJ.

[0109] Após realizar um alinhamento de múltiplas sequências usando as sequências, uma árvore filogênica foi criada usando o programa MEGA 6 e a posição taxonômica foi analisada (Figura 5).

[0110] Como um resultado da análise filogenética, a cepa CJ24-34 mutante da presente revelação mostrou uma estreita relação com FZB42T de Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum (CP000560), que é uma cepa padrão, e a homologia da sequência do gene de 16S rRNA foi confirmada em 99,93% (1507 bp/1508 bp).

[0111] A cepa CJ24-34 mutante de acordo com a presente revelação foi denominada CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum e foi depositada sob o Tratado de Budapeste na Cultura Coreana de Microorganismos (KCCM) em 15 de junho 15 de 2017, com um número de acesso KCCM12038P.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0112] A presente revelação tem um excelente efeito em fornecer uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens inovadora tendo atividade antibacteriana e capacidade proteolítica excelentes e uma baixa capacidade produtiva de mucilagem, uma farinha de soja fermentada ou um concentrado de proteína de soja fermentado de peptídeos de baixo peso molecular nos quais a digestibilidade de ração animal é melhorada, e um método de preparação do mesmo. Assim, é uma invenção extremamente útil nas indústrias de ração animal, alimentos e farmacêuticas.

NÚMERO DE DEPÓSITO

[0113] Autoridade Depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (Autoridade Depositária Internacional)

[0114] No de Acesso: KCCM12038P

[0115] Data de Depósito: 15/06/2017

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0116] Arquivo eletrônico anexado

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um produto de soja fermentado caracterizado por compreender: inocular uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) em uma farinha de soja ou um concentrado de proteína de soja; e obter uma farinha de soja fermentada ou um concentrado de proteína de soja fermentado que é fermentado cultivando-se a cepa de Bacillus amyloliquefaciens.

2. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o produto de soja fermentado ter uma atividade antibacteriana contra pelo menos um patógeno selecionado do grupo que consiste em Salmonella typhimurium, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda.

3. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o produto de soja fermentado compreender 40% ou mais de peptídeos de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 30 kDa ou menos.

4. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender controlar adicionalmente o teor de umidade da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja e submetê-lo ao tratamento térmico antes de inocular a cepa na farinha de soja ou concentrado de proteína de soja.

5. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o teor de umidade da farinha de soja ou concentrado de proteína de soja fermentado ser controlado na faixa de 30% (v/p) a 80% (v/p), e o tratamento térmico ser realizado entre 70 ºC a 130 ºC por 10 minutos a 30 minutos.

6. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P) ser inoculada a uma contagem de células de 10 5

CFU/g a 109 CFU/g.

7. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a cultura ser realizada entre 20 ºC a 50 ºC por 8 horas a 72 horas.

8. Método para preparar um produto de soja fermentado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender adicionalmente secar e pulverizar a farinha de soja fermentada ou concentrado de proteína de soja fermentado obtidos acima.

9. Cepa CJ24-34 caracterizada por ser de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P).

10. Composição antibacteriana caracterizada por compreender uma cepa CJ24-34 de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM12038P), uma cultura da cepa, um concentrado da cultura ou um produto seco da cultura e ter uma atividade antibacteriana contra pelo menos um patógeno selecionado do grupo que consiste em Salmonella typhimurium, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum e Edwardsiella tarda.

11. Produto de soja fermentado caracterizado por ser preparado pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

12. Composição alimentar para animal caracterizada por compreender o produto de soja fermentado, de acordo com a reivindicação 11.