CN110577907A - 一种动物双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动生物技术领域，公开了一种动物双歧杆菌及其应用。本发明属于动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)B18，保藏号为CGMCC No.17535，保藏日期为2019年04月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明对胃酸和胆盐有较强耐受性，存活时间长，存活率高，对大肠杆菌有较好的抑制作用，并可以与其他类型乳酸菌有较好的协同生长作用。用于饲养奶牛，可有效提高奶牛生产性能，提升生鲜乳品质及降低体细胞数量。

Description

一种动物双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及动生物技术领域，特别是涉及一种动物双歧杆菌及其应用。
背景技术
动物双歧杆菌与人类、动物的生活关系密切，是一种常见于婴儿及动物肠道中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，例如拥有维持肠道内菌群的平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成、调节免疫、延缓衰老等多种功能，目前研究报道较多的应用领域包括食品、饲料、医疗保健、化妆品、美容、水产养殖、工农业生产、生物防腐剂、益生菌制剂等等。
动物双歧杆菌的多种生理功能，可作为宿主氮的来源，其起始生长pH值为6.7～7.0，在pH4.5～5.0以下或pH值为8.0～8.5以上的环境下都不生长；当菌体的耐酸，耐胆盐能力不足时，还未等到其进入肠道，就会失去它的活性作用，更加无法顺利通过胃并在肠道内定植，调节肠道内的菌群平衡。
要发挥这些益生作用，须首先能耐受人体胃肠的消化过程，能抵御胃液和胆汁对其的杀灭作用。Berrada等曾在报导中提及，食物在胃中排空的时间是90min，胃内PH值为3.0，最低可达1.3，人体小肠胆汁液浓度在0.03％～0.3％之间。因此，筛选培养可耐受胃酸和胆盐浓度的动物双歧杆菌具有极其重要的作用。
发明内容
本发明提供一种对胃酸和胆盐有较强耐受性，存活时间长，存活率高，可有效提高奶牛产奶量，降低体细胞数量的动物双歧杆菌及其应用。
解决的技术问题是：
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明动物双歧杆菌，属于动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)B18，保藏号为CGMCC No.17535，保藏日期为2019年04月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明动物双歧杆菌，进一步的，所述动物双歧杆菌B18对人体或动物的胃酸和胆盐有耐受性。
本发明动物双歧杆菌，进一步的，所述动物双歧杆菌B18在室温下放置60d后，菌液中的活菌总数不小于8.0×1011cfu/ml。
本发明动物双歧杆菌，进一步的，所述动物双歧杆菌B18对大肠杆菌菌群有抑制作用。
本发明动物双歧杆菌，进一步的，所述动物双歧杆菌B18与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophius)；
德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)；
干酪乳杆菌亚种(Lactobacillus casei subsp.Casei)；
嗜热链球菌(Streptococcus thermophius)；
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)；
乳酸链球菌(Streptococcus lactis)；
屎肠球菌(Enterococcus faecium)；
乳酸乳球菌乳亚种(L.lactis subsp.lactis)；
布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)；
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
一种动物双歧杆菌的培养方法，所述动物双歧杆菌B18的菌种接种至发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基包括酵母膏，蔗糖和K2HPO4。
一种动物双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，将权利要求1所述动物双歧杆菌B18的发酵菌泥与保护剂按照质量比1:4～6混匀后，于-30～-40℃下冷冻干燥。
一种动物双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，进一步的，所述保护剂包括以下重量组分：脱脂乳5～20g，T809淀粉5～15g，乳糖5～10g，海藻糖8～15g，低聚果糖0.5～1.5g，低聚木糖1～3g，低聚异麦芽糖0.5～1.5g，菊糖0.5～1g，水苏糖0.5～1g，谷氨酸钠1～2g，蒸馏水100～200ml。
动物双歧杆菌的应用，所述动物双歧杆菌B18在食品或动物饲料中的应用。
一种动物双歧杆菌冻干菌粉的应用，由动物双歧杆菌B18制得的冻干菌粉在奶牛饲养中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明从健康奶牛肠道中分离得到，经鉴定为动物双歧杆菌乳亚种B18。其在改良的发酵培养基中可获得较高活菌数，含有2.0×109～8.0×109cfu/ml以上的活菌；在优化后冻干保护剂及工艺中可达较高存活率，仍汉含有2.5×1011～9.2×1011cfu/g以上的活菌。动物双歧杆菌B18加入到奶牛饲料中可减少抗生素的使用量，提高奶牛生产性能，提升生鲜乳品质及降低体细胞数量。
动物双歧杆菌B18对胃酸和胆盐有较强的耐受性，试验证明，动物双歧杆菌B18可耐受PH值为2.0的酸性环境，以及可耐受1.5％的胆盐浓度，确保可以进入人体及动物体内发挥功效。
动物双歧杆菌B18对大肠杆菌有较好的抑制作用，在涂布有活菌数为106cfu/ml大肠杆菌的营养琼脂平板中，抑菌圈可达20mm。
动物双歧杆菌B18在室温下存活60天后仍然有8.0×1011cfu/ml的存活菌数，存活360天后，依然具有3.0×1011cfu/ml活菌数，存活率为33.3％；动物双歧杆菌B18可以增加产品货架期，有效降低成本。
动物双歧杆菌B18与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，可用于食品及动物饲料添加剂。
生物保藏说明
分类命名：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)B18，保藏号为CGMCC No.17535，保藏日期为2019年04月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
下面结合附图对本发明的动物双歧杆菌作进一步说明。
附图说明
图1为本发明动物双歧杆菌B18的菌体形态图(显微镜放大倍数为1500倍)。
具体实施方式
本发明动物双歧杆菌B18，CGMCC No.17535，从奶牛肠道中分离得到，经鉴定为动物双歧杆菌乳亚种，其具体的分离和鉴定方法如下。
1、分离方法
称取样品25g至225ml无菌缓冲盐溶液中(加适量玻璃珠)作为母液，震荡10min充分混匀，以无菌缓冲盐溶液做梯度稀释，选择三到五个合适的梯度，吸取0.1ml于MRS培养基中进行划线分离，每个稀释梯度做两个重复。培养皿放入37℃培养箱中培养48～72小时后挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在MRS培养基中进行再此分离、纯化，直到菌落完全纯化。
形态学鉴定：革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢，菌体形态图如图1所示。
生理生化鉴定：接触酶，氧化酶，碳水化合物产酸。
分子生物学鉴定:16SrRNA序列分析和tuf基因序列分析。
2、试验结果
2.1、生理生化特性测定
细胞形态和生理生化特性的具体测定结果如表1所示。
表1 生理生化特性测定结果
2.2、根据16SrRNA和tuf基因序列测定结果，鉴定B18为动物双歧杆菌乳亚种。
3、鉴定结果
结合以上鉴定结果，本发明的B18为动物双歧杆菌乳亚种。
本发明动物双歧杆菌B18的培养方法如下。
试验菌种：动物双歧杆菌B18。
培养基及培养条件：
活化和计数培养选用MRS培养基，也可采用其他具有同等活化功效的常用培养基；其中MRS培养基由以下组分组成：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH2PO4 2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween 80 1ml、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g，用蒸馏水定容至1L，调pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min。
菌种发酵使用自制的发酵培养基，发酵培养基包括以下组分：酵母膏10～30g、K2HPO4 1～5g、柠檬酸二胺1～5g、乙酸钠1～5g、蔗糖5～30g、西红柿汁5～20ml、胡萝卜汁5～20ml、猪肝浸液1～5ml、Tween 80 0.5～2ml、MgSO4·7H2O 0.5～3g、MnSO4·4H2O 0.05～1g、谷氨酸钠0.05～1g，用蒸馏水定容至1L，调pH 5.5～7.0，105℃～125℃灭菌5～20min。
其中自主研发的发酵培养基中，对于碳源、氮源和磷源的使用，进行了优化选择，以MRS培养基为对照组和试验基础，对比了乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖作为不同碳源，胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作为的不同氮源，K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4作为不同磷源，获得不同的培养基，在培养基中接入活化后的B18，在37℃的条件下培养24h，稀释10倍后，在600nm波长下测定菌液OD值，以MRS培养基为对照，比较不同的碳源、氮源及磷源对B18生长的影响，确定最佳碳源、氮源、磷源分别是蔗糖、酵母膏、K2HPO4。
通过正交试验，确定各因素对B18的生长影响次序依次是:酵母膏>蔗糖>K2HPO4，并获得上述发酵培养基的具体组成配方。
动物双歧杆菌B18分别以接种量2-5％接入150ml上述发酵培养基与MRS培养基中，37℃静置培养24h，稀释10倍后37℃下计数培养48h。
检测可知，本发明发酵培养基中的活菌数量为7.6×109cfu/ml，明显高于MRS培养基的1.2×109cfu/ml。本发明发酵培养基中选择的碳源、氮源和磷源，可以更好的促进B18的生长。
本发明动物双歧杆菌B18的培养方法，具体包括以下步骤：
步骤一、甘油种子活化：取甘油保藏菌种接种到MRS液态试管中，于35℃～40℃下静置培养10～15小时；
步骤二、种子培养：按2％～5％的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有150mlMRS液体培养基的250ml三角瓶中，于35℃～40℃下静置培养10～15小时；
步骤三、发酵培养：按2％～5％的接种量，从培养液中取适当量，接入装有发酵培养基的10L发酵罐中，调节温度35℃～40℃、转速50～100r/min，在初始pH 6.5～7.0环境下进行培养；
步骤四、补料调酸：11h～15h发酵培养后，调速至1～5ml/min，补料400～500ml，调节pH控制在5.5～6.5范围内，继续进行发酵；
步骤五、终止发酵：当菌生长20～24h后，将发酵罐降温到20℃左右，完成发酵下罐。
培养出的动物双歧杆菌B18为了延长保藏期限和应用更加便捷，通常会进行冻干处理，制成冻干菌粉，具体的制备方法如下。
将动物双歧杆菌B18的发酵菌液在4℃下离心5-10min，离心转速4000-8000r/min，弃掉上清液，以缓冲盐洗菌，再于4℃下离心，5-10min，离心转速4000-8000r/min，弃掉上清液，收集菌泥；将菌泥与保护剂以质量比1:4～6混匀，按一定量装入冷阱预冻至-30～-40℃，然后提出冷阱，并设定冷冻干燥参数进行干燥，即可获得冻干菌粉，其中冷冻干燥的具体控制参数如表2所示。
表2 冷冻干燥的条件参数控制
控制温度(℃) 干燥时间(小时)
-25～-35 1～4
-15～-25 1～4
-5～0 4～6
1～5 1～8
15～25 1～4
25～35 1～4
其中，与菌泥混合的保护剂包括以下组分：脱脂乳5～20g、T809淀粉5～15g、乳糖5～10g、海藻糖8～15g、低聚果糖0.5～1.5g、低聚木糖1～3g、低聚异麦芽糖0.5～1.5g、菊糖0.5～1g、水苏糖0.5～1g和谷氨酸钠1～2g溶解于100～200ml水中。于105～115℃灭菌10～20min。
将冻干菌粉采用稀释倾注平板计数法测定活菌数，具体的测定结果如表3所示。
表3 冻干菌粉的形状结果
参数 结果
颜色 白色
性状 粉末
水份％ 1.27％
活菌数cfu/ml 9.2×10<sup>11</sup>
动物双歧杆菌B18的耐胆盐、耐酸测试试验
1、试验方法
1.1、胆盐耐受试验
动物双歧杆菌B18用灭菌的改良MRS培养液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中(胆盐浓度为0.2％、0.5％1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)，同时以不含胆盐的改良MRS培养液为对照。在37℃培养0h、2h、4h、6h、24h后取样测定活菌数。
1.2、酸耐受试验
动物双歧杆菌B18用无菌改良MRS培养液37℃严格厌氧培养培养15h，将活化的培养液以2％的接种量接入不同pH值的无菌改良MRS中(pH分别为2.0、2.5、3.0)，同时以pH6.5的培养液为对照。37℃厌氧培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min后取样测定活菌数。
2、试验结果
2.1、胆盐耐受试验结果
动物双歧杆菌B18对不同胆盐浓度的耐受性见表4，胆盐浓度小于等于1.5％时，对其无抑制作用，6h内活菌数不断增加，说明动物双歧杆菌B18对胆盐的耐受性很强。
表4 B18对不同浓度胆盐的耐受性
胆盐浓度 0h(cfu/ml) 2h 4h 6h 24h
CK 4.1×10<sup>7</sup> 1.2×10<sup>8</sup> 2.5×10<sup>8</sup> 3.5×10<sup>8</sup> 3.9×10<sup>9</sup>
0.2％ 2.0×10<sup>7</sup> 2.2×10<sup>7</sup> 3.0×10<sup>7</sup> 5.7×10<sup>7</sup> 8.2×10<sup>8</sup>
0.5％ 2.9×10<sup>6</sup> 6.4×10<sup>6</sup> 9.5×10<sup>6</sup> 1.6×10<sup>7</sup> 3.4×10<sup>8</sup>
1.0％ 3.3×10<sup>6</sup> 5.0×10<sup>6</sup> 6.2×10<sup>6</sup> 1.8×10<sup>7</sup> 1.9×10<sup>8</sup>
1.5％ 1.9×10<sup>6</sup> 4.5×10<sup>6</sup> 6.3×10<sup>6</sup> 9.8×10<sup>6</sup> 8.9×10<sup>7</sup>
2.0％ 2.5×10<sup>6</sup> 3.5×10<sup>6</sup> 5.4×10<sup>6</sup> 8.7×10<sup>5</sup> 7.1×10<sup>5</sup>
2.5％ 2.3×10<sup>6</sup> 3.3×10<sup>6</sup> 3.5×10<sup>6</sup> 3.7×10<sup>6</sup> 3.1×10<sup>6</sup>
人体小肠内的胆盐浓度在0.03-0.3％之间，本试验中，由空白对照试验可知，随着试验时间的延长，试验环境内的活菌数在不断增加；在最为接近实际小肠内胆盐浓度的0.2％和0.5％两组试验中，试验环境内的活菌数也在不断的增加，且增长倍数与CK组相似，没有太大区别。在胆盐浓度明显较高的1.0％和1.5％两组试验中，试验环境内的活菌数也在不断的增加，只是在6h后，活菌数的增长略微减缓，但并没有明显的抑制作用。在胆盐浓度高于2.0％的两组试验中，6h以内活菌数的增长涨势虽然明显缓慢，但仍然处于增长的趋势中，6h-24h之间，活菌数略有降低，此时才体现出胆盐对动物双歧杆菌B18的抑制作用。可见，动物双歧杆菌B18对胆盐具有极强的耐受性，在正常的生理情况下，均可顺利通过小肠，进入大肠，调节肠内菌群平衡。
2.2、酸耐受试验结果
动物双歧杆菌B18在不同的酸性培养液中活菌数变化见表5，在pH2.0的条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明动物双歧杆菌B18对酸有很强的耐受性。
表5 B18对酸的耐受性
0min 30min 60min 90min 120min
pH6.5 2.6×10<sup>7</sup> 3.3×10<sup>7</sup> 4.4×10<sup>7</sup> 5.1×10<sup>7</sup> 4.9×10<sup>7</sup>
pH3.0 1.3×10<sup>7</sup> 2.8×10<sup>7</sup> 3.2×10<sup>7</sup> 3.3×10<sup>7</sup> 3.0×10<sup>7</sup>
pH2.5 2.3×10<sup>7</sup> 2.2×10<sup>7</sup> 2.1×10<sup>7</sup> 1.8×10<sup>7</sup> 1.9×10<sup>7</sup>
pH2.0 2.5×10<sup>7</sup> 2.0×10<sup>7</sup> 1.5×10<sup>7</sup> 1.3×10<sup>7</sup> 1.1×10<sup>7</sup>
人体胃内的pH值在2-3之间，本实验中，由公知的邻近双歧杆菌的适宜生存pH6.5的试验组可知，随着试验时间的延长，试验环境内的活菌数在缓慢增长，并在90min以后没有明显减少。而在酸性环境pH3.0试验组中，试验环境内的活菌数也在缓慢增长，，并在90min以后没有明显减少，变化趋势与pH6.5相似，没有明显区别。在酸性环境pH2.5试验组中，逐渐体现出先期的抑制作用，在适应生长环境后，于90min后，活菌数还略有增长。在极酸性环境pH2.0下，虽然随着试验时间的延长，活菌数逐渐减少，但是2h的时间内，活菌数由2.5×107cfu/ml到1.1×107cfu/ml，数量级并没有变化，数量减少的并不明显，可见，动物双歧杆菌B18对酸性环境具有较强的耐受性，食物(尤其是流体)通过胃的时间相对较短，一般1～2h后便进入小肠，因此动物双歧杆菌B18的耐酸性可以确保其能够顺利通过胃到达肠道，并发挥其生理活性。
动物双歧杆菌B18对大肠杆菌和乳酸菌的生物拮抗性试验
1.试验方法
1.1、菌种
动物双歧杆菌B18，大肠杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸链球菌，德氏乳杆菌保加利亚种，布氏乳杆菌，短双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌均来自于本实验室。
1.2、培养基
MRS液体和固体培养基，番茄汁固体和液体培养基，营养肉汤固体和液体培养基。
1.3、菌种活化
动物双歧杆菌活化：将置于低温冰柜的动物双歧杆菌放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下，吸取0.2ml接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养12～14h，活化2～3代。
乳酸菌的活化：同动物双歧杆菌，乳酸杆菌采用MRS液体培养基活化，乳酸链球菌采用番茄汁培养基活化。
大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照2％的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃恒温培养12h，活化两代。
1.4、涂布营养琼脂平皿
将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。
1.5、倾注法培养乳酸菌
将活化好的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用倾注法均匀的铺在MRS平板上和番茄汁固体平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。
1.6、动物双歧杆菌发酵液的制备
将活化好的动物双歧杆菌发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为：4℃，5000～8000rpm，5～10min。
1.7、动物双歧杆菌发酵液抑菌效果观察
牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板、MRS固体平板和番茄汁固体平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。
2、试验结果
动物双歧杆菌B18发酵液的抑菌效果的观察结果具体如表6所示。
表6 动物双歧杆菌B18发酵液的抑菌效果
由表6可知，大部分的双歧杆菌和乳杆菌对大肠菌群都有抑制作用，但是本发明动物双歧杆菌B18的抑菌效果尤为明显。
试验表明，本发明动物双歧杆菌B18和大部分乳酸菌都能协同生长，这扩大了动物双歧杆菌B18的应用范围，具体试验结果如表7所示。
表7 动物双歧杆菌与乳酸菌的复配性(拮抗试验)
菌种名称 试验结果 菌种名称 试验结果
YDL200嗜酸乳杆菌 － YDL18干酪乳杆菌 －
YDL124嗜酸乳杆菌 － YDL267副干酪乳杆菌 －
YDL163嗜酸乳杆菌 － YDS151嗜热链球菌 －
YDL192嗜酸乳杆菌 － YDS179嗜热链球菌 －
YDL137嗜酸乳杆菌 － YDS194嗜热链球菌 －
YDL184保加利亚乳杆菌 － YDB176两歧双歧杆菌 －
YDL162保加利亚乳杆 － YDS125乳酸链球菌 －
YDL197干酪乳杆菌 － YDL174植物乳杆菌 －
YDL108干酪乳杆菌 － YDS011乳酸乳球菌 －
YDL261布氏乳杆菌 － YDS170嗜热链球菌 +
动物双歧杆菌B18的室温耐受试验
1、试验方法
将同一批次的动物双歧杆菌B18菌粉分装于7只灭菌的铝箔袋中，将各铝箔袋样品进行抽真空处理，将抽真空处理好的各铝箔袋样品放置于常温室内。每隔60天取一袋样品测定其中B18的活菌数。
2、试验结果
在室温保存条件下，活菌数的变化与天数的关系见表8。
表8 B18对室温的耐受性
储存天数(d) 活菌数(cfu/ml)
0 9.0×10<sup>11</sup>
60 8.0×10<sup>11</sup>
120 7.2×10<sup>11</sup>
180 6.1×10<sup>11</sup>
240 5.3×10<sup>11</sup>
300 4.5×10<sup>11</sup>
360 3.0×10<sup>11</sup>
一般含有动物双歧杆菌的产品室温保质期为半年左右，本试验中，动物双歧杆菌B18在室温下存放360天后依然具有3.0×1011cfu/ml活菌数，存活率为33.3％。因此，B18可以有效延长产品货架期，降低成本。
动物双歧杆菌B18作为饲料添加剂在奶牛饲喂中的应用
1、试验方法
选择个体大小及日龄相近的奶牛200头，随机分成对照组和试验组，每组各100头进行饲喂实验。
对照组奶牛饲喂基础日粮，试验组饲喂添加了动物双歧杆菌B18冻干菌粉的基础日粮，其中动物双歧杆菌B18冻干菌粉的添加比例为1‰。
2、试验结果
每日对每组内的试验奶牛进行观察和记录，具体的试验结果见表9。
表9 B18对奶牛的影响
项目 对照组 试验组
日产奶量(kg) 2701 2853
体细胞数(万/ml) 57.57 30.13
由表9可知，与日常饲喂的对照组奶牛相比，添加了动物双歧杆菌B18冻干菌粉的试验组奶牛，日均产奶量提高了10.75％；体细胞数量比对照组体细胞数量降低了52.34％。由此说明，B18菌粉的添加，可有效的提高奶牛的产奶量，降低体细胞数量。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE NO.1
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
北京博锦元生物科技有限公司
王继彤
<120> 一种动物双歧杆菌及其应用
<130> 2019.06.19
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1428
<212> 16S rRNA基因
<213> Bifidobacterium lactis
<400> 1
aaggtctacc cttagacggc tccccccaca agggtcgggc caccggcttc gggtgctacc 60
cactttcatg acttgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgcattca ccgcggcgtt 120
gctgatccgc gattactagc gactccgcct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg 180
aactgagacc ggttttcagc gatccgcccc acgtcaccgt gtcgcaccgc gttgtaccgg 240
ccattgtagc atgcgtgaag ccctggacgt aaggggcatg atgatctgac gtcatcccca 300
ccttcctccg agttgacccc ggcggtccca catgagttcc cggcatcacc cgctggcaac 360
atgcggcgag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420
gacgaccatg caccacctgt gaaccggccc cgaagggaaa ccgtgtctcc acggcgatcc 480
ggcacatgtc aagcccaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaatcc gcatgctccg 540
ccgcttgtgc gggcccccgt caatttcttt gagttttagc cttgcggccg tactccccag 600
gcgggatgct taacgcgttg gctccgacac gggacccgtg gaaagggccc cacatccagc 660
atccaccgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720
gctcctcagc gtcagtgacg gcccagagac ctgccttcgc cattggtgtt cttcccgata 780
tctacacatt ccaccgttac accgggaatt ccagtctccc ctaccgcact ccagcccgcc 840
cgtacccggc gcagatccac cgttaggcga tggactttca caccggacgc gacgaaccgc 900
ctacgagccc tttacgccca ataaatccgg ataacgctcg caccctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc ggtgcttatt cgaacaatcc actcaacacg gccgaaaccg 1020
tgccttgccc ttgaacaaaa gcggtttaca acccgaaggc ctccatcccg cacgcggcgt 1080
cgctgcatca ggcttgcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140
tgggccgtat ctcagtccca atgtggccgg tcaccctctc aggccggcta cccgtcaacg 1200
ccttggtggg ccatcacccc gccaacaagc tgataggacg cgaccccatc ccatgccgca 1260
aaagcatttc ccaccccacc atgcgatgga gcggagcatc cggtattacc acccgtttcc 1320
aggagctatt ccggtgcaca gggcaggttg gtcacgcatt actcacccgt tcgccactct 1380
caccccgaca gcaagctgcc agggatcccg ttcgactgca tggtaagc 1428
SEQUENCE NO.2
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
北京博锦元生物科技有限公司
王继彤
<120> 动物双歧杆菌及其应用
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 873
<212> tuf基因序列
<213> 动物双歧杆菌乳亚种
<400> 1
Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys
20 25 30
Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Ala
35 40 45
Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Cys
50 55 60
Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys
65 70 75 80
Cys Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly
85 90 95
Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Thr
100 105 110
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys
115 120 125
Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
130 135 140
Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr
145 150 155 160
Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys
165 170 175
Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala
180 185 190
Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr
195 200 205
Gly Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys
210 215 220
Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys
225 230 235 240
Thr Cys Gly Thr Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala
245 250 255
Gly Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Thr
260 265 270
Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly
275 280 285
Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala
290 295 300
Gly Gly Thr Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys
305 310 315 320
Gly Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly
325 330 335
Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr
340 345 350
Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Thr
355 360 365
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly
370 375 380
Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Ala
385 390 395 400
Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Cys Cys
405 410 415
Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala
420 425 430
Thr Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala
435 440 445
Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly
450 455 460
Gly Thr Cys Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Gly Ala Cys Ala
465 470 475 480
Ala Gly Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys
485 490 495
Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys
500 505 510
Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly
515 520 525
Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly
530 535 540
Thr Cys Gly Thr Gly Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys
545 550 555 560
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala
565 570 575
Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Thr
580 585 590
Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys
595 600 605
Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala
610 615 620
Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Thr Thr
625 630 635 640
Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr
645 650 655
Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly
660 665 670
Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr
675 680 685
Gly Cys Thr Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys
690 695 700
Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Cys
705 710 715 720
Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Thr Cys
725 730 735
Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys
740 745 750
Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr
755 760 765
Thr Cys Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Cys Thr Ala
770 775 780
Cys Gly Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr
785 790 795 800
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Thr
805 810 815
Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Ala Ala
820 825 830
Cys Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys
835 840 845
Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly
850 855 860
Ala Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly
865 870

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于：属于动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)B18，保藏号为CGMCC No.17535，保藏日期为2019年04月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18对人体或动物的胃酸和胆盐有耐受性。
3.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18在室温下放置360d后，菌液中的活菌总数不小于3.0×1011cfu/ml。
4.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18对大肠杆菌菌群有抑制作用。
5.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophius)；
德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)；
干酪乳杆菌亚种(Lactobacillus casei subsp.Casei)；
嗜热链球菌(Streptococcus thermophius)；
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)；
乳酸链球菌(Streptococcus lactis)；
屎肠球菌(Enterococcus faecium)；
乳酸乳球菌乳亚种(L.lactis subsp.lactis)；
布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)；
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
6.权利要求1-5任意一项所述的动物双歧杆菌的培养方法，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18的菌种接种至发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基包括酵母膏，蔗糖和K2HPO4。
7.一种动物双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述动物双歧杆菌B18的发酵菌泥与保护剂按照质量比1:4～6混匀后，于-30～-40℃下冷冻干燥。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述保护剂包括以下重量组分：脱脂乳5～20g，T809淀粉5～15g，乳糖5～10g，海藻糖8～15g，低聚果糖0.5～1.5g，低聚木糖1～3g，低聚异麦芽糖0.5～1.5g，菊糖0.5～1g，水苏糖0.5～1g，谷氨酸钠1～2g，蒸馏水100～200ml。
9.权利要求1所述的动物双歧杆菌的应用，其特征在于：所述动物双歧杆菌B18在食品或动物饲料中的应用。
10.一种动物双歧杆菌冻干菌粉的应用，其特征在于：由动物双歧杆菌B18制得的冻干菌粉在奶牛饲养中的应用。
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