BR112020002413A2 - agentes rnai e composições para inibir a expressão de apolipoproteína c-iii (apoc3) - Google Patents

agentes rnai e composições para inibir a expressão de apolipoproteína c-iii (apoc3) Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a agentes RNAi, por exemplo, agentes RNAi de filamento duplo, capazes de inibir o gene de expressão da apo-lipoproteína C-III (também chamada APOC3, apoC-III, APOC-III e APO C-III) e composições que incluem agentes RNAi de APOC3. Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente documento podem ser conjugados aos ligantes de direcionamento, incluindo ligantes que incluem N-acetil-galactosamina, para facilitar a liberação a células, incluindo aos hepatócitos. As composições farmacêuticas que incluem um ou mais agentes RNAi de APOC3, opcionalmente com um ou mais terapêuticos adicionais, também são descritas. A liberação dos agentes RNAi de APOC3 in vivo provê a inibição da expressão do gene de APOC3, e pode resultar em menores níveis de triglicerídeos e/ou colesterol no indivíduo. Os agentes RNAi de APOC3 podem ser usados em métodos de tratamento de doenças e distúrbios relacionados a APOC3, incluindo hipertrigliceridemia, doença cardiovascular e outros distúrbios e doenças relacionados a problemas metabólicos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGEN-
TES RNAI E COMPOSIÇÕES PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE APOLIPOPROTEÍNA C-III (APOC3)".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente pro- visório Norte-americano No. de série 62/720,434, depositado em 21 de agosto de 2018, Pedido de Patente provisório Norte-americano No. de série 62/643,927, depositado em 16 de março de 2018, e Pedido de Patente provisório Norte-americano No. de série 62/556,818, deposi- tado em 11 de setembro de 2017, cujo conteúdo de cada um deles é incorporado no presente documento a título de referência em sua tota- lidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Este pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida em formato ASCII e é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII é denominada 30655_SeqList e tem 195 kb de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente divulgação refere-se a agentes de RNA interfe- rente (RNAi), por exemplo, agentes RNAi de filamento duplo, para a inibição da expressão genética de apolipoproteína C-III, composições que incluem agentes RNAi de apolipoproteína C-III, e métodos de uso dos mesmos.
HISTÓRICO
[004] Apolipoproteína C-III (também chamada APOC3, apoC-III, APOC-III e APO C-III), codificada pelo gene da apolipoproteína C-III humana, emergiu recentemente como um alvo promissor para o trata- mento de doenças associadas com hipertrigliceridemia. Os níveis ele- vados de triglicerídeo no soro (TG) foram identificados como um fator de risco independente para doença cardiovascular, e como um fator de contribuição no desenvolvimento de aterosclerose. Os indivíduos com hipertrigliceridemia grave (frequentemente > 1000 mg/dL) também es- tão sob risco de pancreatite recorrente. Os triglicerídeos são primaria- mente transportados no sangue como um componente principal de li- poproteína de densidade muito baixa (VLDL) e partículas de quilomí- crons, que são conhecidas como lipoproteínas ricas em TG. As lipo- proteínas são compostas de um triacilglicerol hidrofóbico e núcleo de colesteril éster, e uma camada externa hidrofílica de fosfolipídios, co- lesterol e apoproteínas. APOC3 é uma dessas apoproteínas.
[005] APOC3 é primariamente sintetizada no fígado e tem um papel importante na produção, metabolismo e depuração de lipoprote- ínas ricas em TG do plasma. Vários polimorfismos de ganho de função foram identificados na região promotora do gene APOC3, os quais são postulados como os fatores contribuintes no desenvolvimento de hiper- trigliceridemia (Vide, por exemplo, Wang, Y., et al, Association of Apo- lipoprotein C3 Genetic Polymorphisms with the Risk of Ischemic Stroke in the Northern Chinese Han Population, 11 PLoS One eO 163910 (2016); Li, Y., et al, Apolipoprotein C3 gene variants and the risk of co- ronary heart disease: A meta-analysis 9Meta Gene 104-109 (2016)). A síntese aumentada de APOC3 no fígado promove a secreção de VLDL rico em TG. Além disso, a superabundância de APOC3 inibe a ativida- de da lipoproteína lipase e lipase hepática, aumentando também os níveis de TG no soro ao retardar o catabolismo de lipoproteínas ricas em TG. Além disso, APOC3 elevada também retarda a depuração he- pática da lipoproteína rica em TG e suas partículas remanescentes ao interferir com a sua ligação aos receptores hepáticos. Vários estudos de análise genética grandes reportaram que os indivíduos com muta- ções de perda de função de APOC3 exibem baixos níveis de triglicerí- deo e incidência reduzida de doença cardiovascular. (Vide, por exem- plo, Bernelot Moens, S. I, et al, Inhibition of ApoCIII: the next PCSK9?
25 Curr Opin Lipidol 418-422 (2014); Saleheen, D., et al., Human knockouts and phenotypic analysis in a cohort with a high rate of con- sanguinity, 544 Nature 235-239 (2017)).
[006] Atualmente, a hipertrigliceridemia é frequentemente tratada com fibratos ou em combinação com estatinas nos casos moderados; no entanto, na maioria dos casos, a redução do TG no soro é modes- ta. Adicionalmente, os produtos terapêuticos disponíveis são frequen- temente ineficazes em pacientes com causas monogênicas de hiper- trigliceridemia muito grave (tais como pacientes com síndrome de qui- lomicronemia familiar) porque as mutações que causam a doença le- vam à lipoproteína lipase disfuncional e a lipoproteína lipase funcional é necessária para a resposta ideal a terapias padrão. Existe uma ne- cessidade de um produto terapêutico eficaz que possa prover um efei- to de redução substancial de TG para o tratamento de doenças onde APOC3 pode ter um papel, tal como pancreatite induzida por hipertri- gliceridemia, síndrome metabólica, diabetes mellitus do tipo II, síndro- me de quilomicronemia familiar, lipodistrofia parcial familiar, obesida- de, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, metabolismo anormal do lipídio e/ou colesterol, aterosclerose, doença cardiovascular, doença arterial coronariana, e outros distúrbios e doenças relacionados a problemas metabólicos. Certos agentes de RNA interferente (RNAi) específicos de APOC3 mostraram inibir a expressão da expressão genética de APOC3, por exemplo, na Publicação do pedido de patente internacio- nal No. WO 2016/011123 A 1, de Weiler et al , o qual é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Os agen- tes RNAi de APOC3 divulgados no presente documento, no entanto, não foram divulgados ou conhecidos e proveem a inibição altamente potente e eficiente da expressão de um gene de APOC3.
SUMÁRIO
[007] Existe uma necessidade de novos agentes interferentes de
RNA (RNAi) de APOC3 (no presente documento também denomina- dos agente RNAi, desencadeador de RNAi ou desencadeador) que são capazes de inibir de forma seletiva e eficiente a expressão de um gene de APOC3. Além disso, existe uma necessidade por composi- ções que incluem novos agentes RNAi específicos de APOC3 para o tratamento de doenças associadas com, entre outras coisas, níveis elevados de triglicerídeo (TG).
[008] Em geral, a presente divulgação caracteriza agentes RNAi específicos do gene de APOC3, composições que incluem agentes RNAi de APOC3, e métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3 in vitro e/ou in vivo usando os agentes RNAi de APOC3 e composições que incluem agentes RNAi de APOC3 descritos no pre- sente documento. Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presen- te documento podem reduzir ou inibir de forma seletiva e eficiente a expressão de um gene de APOC3, e com isso reduzem os níveis de TG e/ou níveis de colesterol em um indivíduo, por exemplo, um indiví- duo humano ou animal.
[009] Os agentes RNAi de APOC3 descritos podem ser usados para tratamento terapêutico (incluindo o tratamento profilático e trata- mento preventivo) de sintomas e doenças associados com níveis ele- vados de TG e/ou níveis elevados de colesterol, incluindo, porém sem se limitar a, obesidade, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, metabolis- mo anormal do lipídio e/ou colesterol, aterosclerose, doença cardio- vascular, doença arterial coronariana, pancreatite induzida por hipertri- gliceridemia, síndrome metabólica, diabetes mellitus do tipo II, síndro- me de quilomicronemia familiar, lipodistrofia parcial familiar, e outros distúrbios e doenças relacionados a problemas metabólicos. Os agen- tes RNAi APOC3 divulgados no presente documento podem reduzir de forma seletiva a expressão genética de APOC3, o que pode levar a uma redução de, entre outras coisas, níveis de TG e/ou níveis de co-
lesterol, em um indivíduo. Os métodos divulgados no presente docu- mento incluem a administração de um ou mais agentes RNAi de APOC3a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano ou animal, usando qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como administração com injeção subcutânea ou administração intravenosa.
[0010] Em um aspecto, a divulgação caracteriza agentes RNAi pa- ra inibir a expressão do gene de APOC3 humano, em que o agente RNAi inclui um filamento senso e um filamento antissenso. Também estão descritas no presente documento composições que incluem ou consistem de um agente RNAi capaz de inibir a expressão de um gene APOC3, em que o agente RNAi de APOC3 inclui ou consiste em um filamento senso e um filamento antissenso, e a composição ainda in- clui pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. As com- posições descritas no presente documento que incluem um ou mais dos agentes RNAi de APOC3 divulgados que são capazes de reduzir de forma seletiva e eficiente a expressão de um gene de APOC3. As composições que incluem um ou mais agentes RNAi de APOC3 po- dem ser administradas a um indivíduo, tal como um indivíduo humano ou animal, para o tratamento (incluindo tratamento profilático ou inibi- ção) de sintomas e doenças associados com níveis elevados de TG, colesterol elevado, e/ou expressão de APOC3 aumentada.
[0011] Um agente RNAi de APOC3 descrito no presente documen- to inclui um filamento senso (também referido como um filamento pas- sageiro), e um filamento antissenso (também referido como um fila- mento guia). O filamento senso e o filamento antissenso podem ser parcialmente, substancialmente ou totalmente complementares um ao outro. O comprimento dos filamentos senso e antissenso do agente RNAi descritos no presente documento de cada pode ser de 16 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamen- tos senso e antissenso são independentemente de 17 a 26 nucleotí-
deos de comprimento. Os filamentos senso e antissenso podem ter o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes. Em algumas moda- lidades, os filamentos senso e antissenso são independentemente de 21 a 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos senso e antissenso são independentemente de 21 a 24 nu- cleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, ambos o fila- mento senso e o filamento antissenso são de 21 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, os filamentos senso e/ou antis- senso são independentemente de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Os agentes RNAi descritos no presente documento, mediante a liberação a uma célula expressando APOC3, inibem a expressão de um ou mais genes de APOC3 in vivo ou in vitro.
[0012] Um filamento senso dos agentes RNAi de APOC3 descritos no presente documento inclui pelo menos 16 nucleotídeos consecuti- vos que têm pelo menos 85% de identidade com uma sequência de extensão nuclear (também referida no presente documento como uma "extensão nuclear" ou “sequência nuclear") do mesmo número de nucleotídeos em um mRNA de APOC3. Em algumas modalidades, a extensão nuclear do filamento senso tendo pelo menos 85% de identi- dade com uma sequência em um mRNA de APOC3 mRNA é de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de comprimento. Em algu- mas modalidades, a extensão nuclear do filamento senso tendo pelo menos 85% de identidade com uma sequência em um mRNA de APOC3 é de 19 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, esta extensão nuclear do filamento senso é de 17 nucleotídeos de comprimento.
[0013] Um filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 inclui pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos que têm pelo menos 85% de complementariedade com uma extensão nuclear do mesmo número de nucleotídeos em um mRNA de APOC3 e a uma extensão nuclear do mesmo número de nucleotídeos no filamento senso corres- pondente. Em algumas modalidades, a extensão nuclear do filamento antissenso tendo pelo menos 85% complementariedade com uma se- quência em um mRNA de APOC3 ou o filamento senso corresponden- te é de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, esta extensão nuclear do filamento antis- senso é de 19 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, esta extensão nuclear do filamento antissenso é de 17 nucleotí- deos de comprimento.
[0014] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 di- vulgados no presente documento direcionam a porção de um gene APOC3 tendo a sequência de qualquer uma das sequências divulga- das na Tabela 1.
[0015] Exemplos dos filamentos senso e antissenso de RNAi APOC3 que podem ser incluídos nos agentes RNAi APOC3 divulga- dos no presente documento são providos nas Tabelas 3, 4 e 5. Exem- plos de dúplices do agente RNAi de APOC3 são providos nas Tabelas 3 e 6. Exemplos de sequências de filamento nuclear de 19 nucleotí- deos que consistem de ou são incluídos nos filamentos senso e fila- mentos antissenso dos agentes RNAi de APOC3 divulgados no pre- sente documento, são providos na Tabela 2.
[0016] Em um outro aspecto, a divulgação caracteriza métodos para liberar agentes RNAi de APOC3 em células hepáticas em um in- divíduo, tal como mamífero, in vivo. Também estão descritas no pre- sente documento composições para uso nos referidos métodos. Um ou mais agentes RNAi de APOC3 podem ser liberados a células alvo ou tecidos usando alguma tecnologia de liberação de oligonucleotí- deos conhecida na técnica. Os métodos de liberação de ácido nucleico incluem, porém não se limitam, em encapsulação em lipossomas, ion-
toforese, ou incorporação em outros veículos, tais como hidrogéis, ci- clodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microesferas bioadesi- vas, vetores proteináceos ou Dynamic Polyconjugates™ (DPCs) (vide, por exemplo, publicações internacionais WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 e WO 2012/083185, cada uma delas é incorporada no presente documento a título de referência).
[0017] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é liberado em células ou tecidos alvo através da ligação covalente ou conjugação do agente RNAi em um grupo de direcionamento, tal como um ligante do receptor de asialoglicoproteína. Em algumas modalida- des, um ligante do receptor de asialoglicoproteína inclui, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma galactose ou grupamento do de- rivado de galactose. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é ligado a um ligante de direcionamento compreendendo a N- acetil-galactosamina derivada de galactose. Em algumas modalidades, um grupamento do derivado de galactose inclui um trímero de N-acetil- galactosamina ou um tetrâmero de N-acetil-galactosamina. Em algu- mas modalidades, um grupamento derivado de galactose é um trímero de N-acetil-galactosamina ou um tetrâmero de N-acetil-galactosamina. Em algumas modalidades, os agentes RNAi APOC3 que são conjuga- dos aos ligantes de direcionamento que incluem N-acetil- galactosamina são seletivamente internalizados pelas células hepáti- cas, e hepatócitos em particular, seja através da endocitose mediada pelo receptor ou através de outros meios. Os grupos de direcionamen- to exemplificadores úteis para liberar agentes RNAi são divulgados, por exemplo, nas Publicações dos pedidos de patente intenacional Nos. WO 2018/044350 e WO 2017/156012, os quais são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0018] Um grupo de direcionamento pode ser ligado à extremidade 3' ou 5' de um filamento senso ou um filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3. Em algumas modalidades, um grupo de dire- cionamento é ligado à extremidade 3’ ou 5’ do filamento senso. Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento é ligado à extre- midade 5’ do filamento senso. Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento é ligado internamente a um nucleotídeo no filamento senso e/ou filamento antissenso do agente RNAi. Em algumas modali- dades, um grupo de direcionamento é ligado ao agente RNAi através de um ligante.
[0019] Um grupo de direcionamento, com ou sem um ligante, pode ser ligado à extremidade 5' ou 3' de qualquer um dos filamentos senso e/ou antissenso divulgados nas Tabelas 2, 3, 4 e 5. Um ligante, com ou sem um grupo de direcionamento, pode ser ligado à extremidade 5 ou 3' de qualquer filamentos senso e/ou antissenso divulgados nas Tabelas 2, 3, 4 e 5.
[0020] Em algumas modalidades, estão descritas no presente do- cumento composições que incluem um ou mais agentes RNAi de APOC3 tendo as sequências dúplex divulgadas na Tabela 6.
[0021] Em um aspecto adicional, são descritas no presente docu- mento as composições farmacêuticas que incluem um ou mais agen- te(s) RNAi de APOC3, opcionalmente combinadas com um ou mais produtos terapêuticos adicionais (isto é, segundos, terceiros, etc.). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que incluem um ou mais agente(s) RNAi de APOC3 descritos, opcionalmente combi- nados com um ou mais produtos terapêuticos adicionais (isto é, se- gundos, terceiros, etc), podem ser formulados em um veículo ou dilu- ente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, essas composições podem ser administradas a um indivíduo, tal como um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0022] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento incluem uma combinação ou coquetel de pelo menos dois agentes RNAi de APOC3 tendo diferentes sequências nu- cleotídicas. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes RNAi de APOC3 diferentes são cada separadamente e independentemente ligados aos grupos de direcionamento. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes RNAi de APOC3 diferentes são cada ligados aos grupos de direcionamento que incluem ou consistem de ligantes de direcionamento que incluem uma ou mais porções que direcionam o ligante receptor da asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes RNAi de APOC3 diferentes são cada ligados aos grupos de direcionamento que incluem ou consistem de ligantes de direcionamento que incluem um ou mais derivados de galactose. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes RNAi de APOC3 dife- rentes são cada ligados aos grupos de direcionamento que incluem ou consistem de ligantes de direcionamento que incluem uma ou mais N- acetil-galactosaminas.
[0023] Em um outro aspecto, a divulgação caracteriza métodos para inibir a expressão genética de APOC3 em um indivíduo, em que os métodos incluem administrar a um indivíduo ou a uma célula de um indivíduo uma quantidade de um agente RNAi de APOC3 capaz de inibir a expressão de um gene de APOC3, em que o agente RNAi de APOC3 compreende um filamento senso e um filamento antissenso, e em que o filamento antissenso inclui a sequência de qualquer uma das sequências nucleotídicas do filamento antissenso na Tabela 2, Tabela 3 ou Tabela 4. Em algumas modalidades, as composições para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática, particularmente hepatócitos, in vivo são descritas, as composições compreendendo: um agente RNAi de APOC3 conjugado a um grupo de direcionamento. Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento é um ligante do receptor da asialoglicoproteína.
[0024] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do-
cumento métodos de inibição da expressão de um gene de APOC3, em que os métodos incluem administrar a um indivíduo ou a uma célu- la de um indivíduo uma quantidade de um agente RNAi de APOC3 ca- paz de inibir a expressão de um gene APOC3, em que o agente RNAi de APOC3 compreende um filamento senso e um filamento antissen- so, e em que o filamento senso inclui a sequência de qualquer uma das sequências nucleotídicas do filamento senso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5. Também estão descritas no presente documento as com- posições para uso nos referidos métodos.
[0025] Em um aspecto adicional, a divulgação caracteriza métodos de tratamento (incluindo tratamento preventivo ou profilático) de doen- ças ou sintomas causados por níveis elevados de TG e/ou níveis ele- vados de colesterol, em que os métodos incluem administrar a um in- divíduo que precisa do mesmo um agente RNAi de APOC3 tendo um filamento antissenso que inclui a sequência de qualquer uma das se- quências nas tabelas 2, 3 ou 4. Em algumas modalidades, são descri- tos no presente documento métodos de tratamento (incluindo trata- mento preventivo ou profilático) de doenças ou sintomas causados por níveis elevados de TG e/ou níveis elevados de colesterol, em que os métodos incluem administrar a um indivíduo que precisa do mesmo um agente RNAi de APOC3 tendo um filamento senso compreenden- do a sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou
5. Também estão descritas no presente documento as composições para uso nos referidos métodos.
[0026] Também estão descritos métodos de tratamento de um in- divíduo humano tendo um estado patológico (tal como uma condição ou doença), ou estando em risco de desenvolver um estado patológi- co, que é mediado pelo menos em parte pela expressão genética de APOC3, os métodos compreendendo a etapa de administração ao in- divíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente
RNAi de APOC3 e/ou composição contendo o agente RNAi de APOC3. O método de tratamento de um indivíduo com um agente RNAi de APOC3 e/ou composição contendo agente RNAi de APOC3 pode ser opcionalmente combinado com uma ou mais etapas de ad- ministração de um ou mais produtos ou tratamentos terapêuticos adi- cionais (isto é, segundos, terceiros, etc.). O agente RNAi de APOC3 e os produtos terapêuticos adicionais podem ser administrados em uma composição única ou eles podem ser administrados separadamente. Um produto terapêutico adicional pode ser um outro agente RNAi de APOC3 (por exemplo, um agente RNAi de APOC3 que direciona uma sequência diferente dentro do gene APOC3). Um produto terapêutico adicional também pode ser um fármaco de molécula pequena, anticor- po, fragmento de anticorpo e/ou aptâmero. Em algumas modalidades, um ou mais produtos terapêuticos adicionais são uma estatina, tal co- mo atorvastatina, fluvastatina, pravastatina, pravastatina, rosuvastatina ou sinvastatina.
[0027] Em algumas modalidades, o(s) agente(s) RNAi de APOC3 descritos são opcionalmente combinados com um ou mais produtos terapêuticos adicionais, em que um ou mais produtos terapêuticos adi- cionais são administrados separadamente em formas farmacêuticas separadas do agente RNAi (por exemplo , o agente RNAi de APOC3 é administrado através de injeção subcutânea, enquanto o produto tera- pêutico adicional envolvido no regime de dosagem do método de tra- tamento é administrado oralmente). Em algumas modalidades, o(s) agente(s) RNAi de APOC3 descritos são administrados a um indivíduo que precisa do mesmo através de injeção subcutânea, e um ou mais produtos terapêuticos adicionais opcionais são administrados oralmen- te, os quais juntos proveem um regime de tratamento para doenças e condições associadas com níveis elevados de TG e/ou colesterol. Em algumas modalidades, o(s) agente(s) RNAi de APOC3 descritos são administrados a um indivíduo que precisa do mesmo através de inje- ção subcutânea, e um ou mais produtos terapêuticos adicionais opcio- nais são administrados através de uma injeção subcutânea separada. Em algumas modalidades, o agente RNAi de APOC3 e um ou mais produtos terapêuticos adicionais são combinados em uma única forma farmacêutica (por exemplo, um "coquetel" formulado em uma única composição para injeção subcutânea). Os agentes RNAi de APOC3, com ou sem um ou mais produtos terapêuticos adicionais, podem ser combinados com um ou mais excipientes para formar composições farmacêuticas.
[0028] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3, os métodos incluem administrar à célula ou indivíduo um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente da sequência de qualquer uma das sequências na tabelas 2, 3 ou 5. Em algumas modalidades, são divul- gados no presente documento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3, em que os métodos incluem administrar um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso compreendendo a se- quência de qualquer uma das sequências na tabela 5, e o filamento antissenso compreendendo, consistindo em, ou consistindo essenci- almente da sequência de qualquer uma das sequências na tabela 4.
[0029] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3 em uma célula ou um indivíduo, em que os métodos incluem administrar à célula ou indivíduo um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso que inclui a sequência nucleobase de qualquer uma das se- quências na tabela 5, e um filamento antissenso que inclui a sequência nucleobase de qualquer uma das sequências na tabela 4. Em outras modalidades, são divulgados no presente documento métodos para inibir a expressão de um gene APOC3, em que os métodos incluem administrar a um indivíduo um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso consistindo da sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 5, e o filamento antissenso con- sistindo da sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 4.
[0030] Em algumas modalidades, composições para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática, particularmente hepa- tócitos, in vivo, são descritas como composições compreendendo: um agente RNAi de APOC3 conjugado a um grupo de direcionamento. Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento é um ligante do re- ceptor de asialoglicoproteína (isto é, um ligante que inclui um compos- to tendo afinidade pelo receptor de asialoglicoproteína). Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento compreende N- acetilgalactosamina.
[0031] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3 em uma célula, os métodos incluem administrar um ou mais agentes RNAi de APOC3 tendo a estrutura dúplex de um dúplex apresentado na ta- bela 6.
[0032] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doenças, distúrbios ou sintomas causados por níveis elevados de TG e/ou níveis elevados de colesterol, em que os méto- dos incluem administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento antissenso que é pelo menos parcialmente complementar à porção do mRNA de APOC3 tendo a sequência na tabela 1. Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doenças ou sintomas causados por níveis elevados de TG e/ou níveis elevados de colesterol, em que os métodos incluem administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento antissenso compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências na tabelas 2, 3 ou 4, e um filamento senso que com- preende qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 5 que é pe- lo menos parcialmente complementar ao filamento antissenso. Em al- gumas modalidades, são divulgados no presente documento métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doen- ças ou sintomas causados por níveis elevados de TG e/ou níveis ele- vados de colesterol, em que os métodos incluem administrar a um in- divíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso que compreende qualquer uma das sequências na tabelas 2, 3 ou 5, e um filamento antissenso compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 4 que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento senso.
[0033] Em algumas modalidades, são divulgados no presente do- cumento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3 em uma célula, em que os métodos incluem administrar à célula um agen- te RNAi de APOC3 que inclui um filamento antissenso que é pelo me- nos parcialmente complementar à porção do mRNA de APOC3 tendo a sequência na tabela 1. Em algumas modalidades, são divulgados no presente documento métodos para inibir a expressão de um gene de APOC3 em uma célula, em que os métodos incluem administrar a uma célula um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento antissenso compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 4, e um filamento senso que compreende qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 5 que é pelo menos parcial-
mente complementar ao filamento antissenso. Em algumas modalida- des, são divulgados no presente documento métodos para inibir a ex- pressão de um gene APOC3 em uma célula, em que os métodos in- cluem administrar um agente RNAi de APOC3 que inclui um filamento senso que compreende qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 5, e um filamento antissenso que inclui a sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 4 que é pelo menos parcial- mente complementar ao filamento senso.
[0034] Em algumas modalidades, são divulgadas no presente do- cumento composições para inibir a expressão de um gene de APOC3 em uma célula, em que os métodos incluem administrar uma composi- ção que compreende um agente RNAi de APOC3 tendo a estrutura dúplex de um dúplex apresentado na tabela 6.
[0035] Em algumas modalidades, são divulgadas no presente do- cumento composições para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática in vivo, a composição incluindo um agente RNAi de APOC3 conjugado ou ligado a um grupo de direcionamento. Em algu- mas modalidades, o grupo de direcionamento é um ligante receptor de asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, as composições para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática in vivo são descritas, a composição incluindo um agente RNAi de APOC3 ligado a um ligante de direcionamento de N-acetil-galactosamina.
[0036] Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente docu- mento são designados para direcionar posições específicas em um gene APOC3 (SEQ ID NO: 1). Conforme definido no presente docu- mento, uma sequência do filamento antissenso é designado para dire- cionar um gene APOC3 em uma dada posição no gene quando a nu- cleobase 5' terminal do filamento antissenso seria alinhada com a po- sição está 19 nucleotídeos a jusante (na direção da extremidade 3') a partir da posição no gene quando a base se pareia ao gene. Por exemplo, conforme ilustrado nas tabelas 1 e 2 no presente documento, uma sequência do filamento antissenso designada para direcionar um gene APOC3 na posição 438 necessita isso quando a base se pareia ao gene, a nucleobase 5' terminal do filamento antissenso é alinhada com a posição 456 do gene APOC3.
[0037] Conforme provido no presente documento, um agente RNAi de APOC3 não necessita que a nucleobase na posição 1 (5’  3’) do filamento antissenso seja complementar ao gene, contanto que haja pelo menos 85% de complementariedade (por exemplo, pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de complementariedade) do filamento antissenso e do gene em torno de uma sequência de extensão nuclear de pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos. Por exemplo, para um agente RNAi de APOC3 divulga- do no presente documento que é designado para direcionar a posição 438 de um gene APOC3, a nucleobase 5' terminal do filamento antis- senso do agente RNAi APOC3 deve estar alinhada com a posição 456 do gene; no entanto, a nucleobase 5' terminal do filamento antissenso pode ser, mas não é necessário que seja complementar à posição 456 de um gene APOC3, contanto que haja pelo menos 85% de comple- mentariedade (por exemplo, pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de complementariedade) do fila- mento antissenso e do gene em torno de uma sequência de extensão nuclear de pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos. Conforme apre- sentado, entre outras coisas, os vários exemplos divulgados no pre- sente documento, o sítio específico de ligação do gene pelo filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 (por exemplo, se o agente RNAi de APOC3 é designado para direcionar um gene de APOC3 na posição 438, na posição 506, na posição 432, ou em alguma outra po- sição) é importante para o nível de inibição alcançado pelo agente RNAi de APOC3.
[0038] O uso de agentes RNAi de APOC3 provê métodos para tra- tamento terapêutico (incluindo profilático) de doenças/distúrbios asso- ciados com níveis elevados de TG e/ou colesterol e/ou expressão au- mentada ou elevada de APOC3. Os agentes RNAi de APOC3 descri- tos mediam a interferência de RNA para inibir a expressão de um ou mais genes necessários para a produção de APOC3. Os agentes RNAi de APOC3 também podem ser usados para tratar ou prevenir várias doenças ou distúrbios, incluindo obesidade, hiperlipidemia, hi- pertrigliceridemia, metabolismo anormal de lipídios e/ou colesterol, ate- rosclerose, doença cardiovascular, doença arterial coronariana, pan- creatite mediada por hipertrigliceridemia, síndrome metabólica, diabe- tes mellitus do tipo II, síndrome de quilomicronemia familiar, lipodistro- fia parcial familiar, e outros distúrbios e doenças relacionados a pro- blemas metabólicos. Além disso, as composições para liberação dos agentes RNAi de APOC3 nas células hepáticas in vivo são descritas.
[0039] As composições farmacêuticas incluindo um ou mais agen- tes RNAi de APOC3 podem ser administradas de várias formas de- pendendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado. A adminis- tração pode ser, porém não se limita a, administração intravenosa, in- traarterial, subcutânea, intraperitoneal, subdérmica (por exemplo, atra- vés de um dispositivo implantado) e intraparenquimal. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são administradas através de injeção subcutânea.
[0040] Em algumas modalidades, são divulgadas no presente do- cumento composições para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática in vivo, em que a composição inclui um agente RNAi de APOC3 conjugado ou ligado a um grupo de direcionamento. Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento é um ligante recep- tor de asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, composições pa- ra liberar um agente RNAi de APOC3 a uma célula hepática in vivo são descritas, em que a composição inclui um agente RNAi de APOC3 ligado a um ligante de direcionamento que que inclui N-acetil- galactosamina.
[0041] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 descritos no presente documento podem incluir um ou mais grupos de direcionamento tendo a estrutura de (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s, cada uma conforme definida no pre- sente documento na tabela 7.
[0042] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 descritos no presente documento incluem um grupo de direcionamento na extremidade 5' do filamento senso tendo a estrutura de (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s, cada uma con- forme definida no presente documento na tabela 7.
[0043] Os agentes RNAi de APOC3 descritos e/ou composições que incluem agentes RNAi de APOC3 podem ser usados em métodos para tratamento terapêutico de doenças ou condições causadas por níveis elevados de TG. Os referidos métodos incluem a administração de um agente RNAi de APOC3 conforme descrito no presente docu- mento a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano ou animal. Em algumas modalidades, um ou mais dos agentes RNAi de APOC3 descritos são administrados a um indivíduo, tal como um mamífero, em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0044] Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente docu- mento podem ser incorporados em uma composição compreendendo um ou mais agente RNAi de APOC3 divulgado e pelo menos um exci- piente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições divulgadas no presente documento compreendendo um ou mais dos agentes RNAi de APOC3 divulgados e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável é uma composição farmacêu- tica.
[0045] Em algumas modalidades, as composições compreenden- do um ou mais agentes RNAi de APOC3 divulgados e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável podem ainda compreender um ou mais produtos terapêuticos adicionais ou tratamentos.
[0046] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento compreendendo um ou mais agentes RNAi de APOC3 são acondicionadas em um kit, recipiente, embalagem, dis- pensador, seringas preenchidas ou frascos. Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento são administradas de forma parenteral.
[0047] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’  3’) UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UCACUGAGAAUACUGUC- CCUC (SEQ ID NO:3), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UCACU- GAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3), em que a SEQ ID NO:3 está localizada nas posições 1-21 (5’  3’) do filamento antissenso.
[0048] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) usCfsasCfuGfagaauAfcUf- gUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf, e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complementar ao fi- lamento antissenso. Como o versado na técnica claramente compre- enderia, a inclusão de uma ligação fosforotioato conforme mostrada na sequência nucleotídica modificada divulgada no presente documento substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotí- deos (vide, por exemplo, Figs. 1A até 1I mostrando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antis- senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5’  3’) usCfsasCfuGfagaauAfcUf- gUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complementar ao fi- lamento antissenso.
[0049] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UCACUGAGAAUACUGUC- CCGU (SEQ ID NO:5), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UCACU- GAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5), em que a SEQ ID N0 5 está localizada nas posições 1-21 (5’  3’) do filamento antissenso.
[0050] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu- cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) usCfsasCfuG- fagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4), em que a, c, g e u represen- tam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectiva- mente; Af, Cf, Gf, e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, gua- nosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosfo- rotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complementar ao filamento antissenso. Como o versado na técnica claramente compreenderia, a inclusão de uma ligação fosforotioato conforme mostrada na sequência nucleotídica modificada divulgada no presente documento substitui a ligação fosfodiéster tipicamente pre- sente em oligonucleotídeos (vide, por exemplo, Figs. 1A até 1I mos- trando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5’  3’)(5’  3’) usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citi- dina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma liga- ção fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substanci- almente complementar ao filamento antissenso.
[0051] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu- cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) usCfsascu- gagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6), em que a, c, g e u represen- tam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectiva- mente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, gua- nosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosfo- rotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complementar ao filamento antissenso. Como o versado na técnica claramente compreenderia, a inclusão de uma ligação fosforotioato conforme mostrada na sequência nucleotídica modificada divulgada no presente documento substitui a ligação fosfodiéster tipicamente pre- sente em oligonucleotídeos (vide, por exemplo, Figs. 1A até 1I mos-
trando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5’  3’) us- CfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, res- pectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso.
[0052] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UUCUUGUCCAG- CUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferin- do em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO:8), em que a SEQ ID NO:8 está localizada nas posições 1-21 (5’  3’) do filamento antis- senso.
[0053] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di-
vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu- cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) usUfscsUfuG- fuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7), em que a, c, g e u repre- sentam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respecti- vamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso. Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5'  3') usU- fscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citi- dina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma liga- ção fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substanci- almente complementar ao filamento antissenso.
[0054] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) AGAAUACUGUC- CCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferin- do em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’)(5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10), em que a SEQ ID NO: 10 está localizada nas posições 1-21 (5’  3’) do filamen- to antissenso.
[0055] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu- cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) asGfsasAfu- AfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9), em que a, c, g e u repre- sentam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respecti- vamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso. Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5'  3') asGfsa- sAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, res- pectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso.
[0056] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5 ' 3') AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) AGAAUACUGUC- CCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferin- do em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12), em que a SEQ ID NO: 12 está localizada nas posições 1-21 (5’  3’) do filamento antis- senso.
[0057] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu- cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) asGfsasAfu- AfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11), em que a, c, g e u re- presentam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respec- tivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso. Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial-
mente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5'  3') asGfsa- sAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, res- pectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancial- mente complementar ao filamento antissenso.
[0058] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UGAGAAUACUGUC- CCUUUGCC (SEQ ID NO: 14), em que todos ou substancialmente to- dos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas moda- lidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14), em que a SEQ ID NO: 14 está localizada nas posições 1-21 (5'  3') do filamento antis- senso.
[0059] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada diferindo em não mais do que 1 nu-
cleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) usGfsasGfaAfu- AfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13), em que a, c, g e u represen- tam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectiva- mente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, gua- nosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosfo- rotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complementar ao filamento antissenso. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica (5'  3') usGfsasGfaAfuAfcUf- gUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato, e em que o filamento senso é pelo menos substancialmente complemen- tar ao filamento antissenso.
[0060] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e um filamento senso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GAGG- GACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 16). (I representa um nucleo- sídeo inosina). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5' 3') UCACUGAGAAUACUGUC-
CCUC (SEQ ID NO:3), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GAGGGACAGUAUUCUCA- GUIA (SEQ ID NO: 16), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0061] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5) e um filamento senso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) ACGG- GACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 18). (I representa um nucleo- tídeo inosina). Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUC- CCGU (SEQ ID NO:5), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) ACGGGACAGUAUUCUCA- GUIA (SEQ ID NO: 18), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0062] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e um filamento senso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GAGG- GACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO:21). Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5'  3') UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5'  3') GAGG- GACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO:21), em que todos ou subs- tancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0063] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’  3’) UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e um filamento senso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA (SEQ ID NO:23). Em algumas moda- lidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5'  3') UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO:8), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5'  3') GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA (SEQ ID NO:23), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0064] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’  3’) UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e um filamento senso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GCCAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO:25). Em algumas moda- lidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencial- mente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO:8), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GCCAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO:25), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0065] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10) e um filamento senso que consiste em, consiste essenci- almente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:27). Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí- deos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:27), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí- deos modificados.
[0066] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12) e um filamento senso que consiste em, consiste essenci- almente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:29). Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es-
sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí- deos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:29), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí- deos modificados.
[0067] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da se- quência nucleotídica (5’ -> 3’) UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14) e um filamento senso que consiste em, consiste essenci- almente em, ou compreende uma sequência nucleobase diferindo em 0 ou 1 nucleobase a partir da sequência nucleotídica (5’  3’) GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:31). Em algumas mo- dalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí- deos modificados, e um filamento senso que consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica diferin- do em não mais do que 1 nucleotídeo a partir da sequência nucleotídi- ca (5’  3’) GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:31), em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotí-
deos modificados.
[0068] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usCfsasCfuGfagaauAfcUf- gUfcCfcUfsc (SEQ ID NO: 2), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 15), em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina, ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'- fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usCfsas- CfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a se- quência nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 15), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos abásicos invertidos na extremidade 3' terminal e na extremidade 5' da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade 5' ter- minal, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0069] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usCfsasCfuGfagaauAfcUf- gUfcCfcGfsu (SEQ ID NO: 4), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) acgggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 17), em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'- fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usCfsas- CfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a se- quência nucleotídica modificada (5’  3’) acgggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 17), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade 3' terminal e na extremidade 5' da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade 5' ter- minal, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0070] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usCfsascugagaauAfcUf- gUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfuAfuUfcucaguia (SEQ ID NO: 19), em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'- fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usCfsascu- gagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO: 6), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfuAfuUfcucaguia (SEQ ID NO: 19), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade 3' terminal e na extremidade 5' da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcio- namento que é covalentemente ligado à extremidade 5' terminal, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina.
[0071] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usCfsasCfuGfagaauAfcUf- gUfcCfcUfsc (SEQ ID NO: 2), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfUfAfuucucaguga (SEQ ID NO:20), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro ade- nosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antis- senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usCfsasCfuG- fagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5’  3’) gagggacaGfUfAfuucucaguga (SEQ ID NO:20), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos in- vertidos abásicos na extremidade 3' terminal e na extremidade 5' da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade 5', em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina.
[0072] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuA- fuUfgGfsc (SEQ ID NO: 7), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gccaauaaAfGfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:22), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro ade- nosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antis- senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usUfscsUfuGfuCfcAfg- CfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleo- tídica modificada (5’  3’) gccaauaaAfGfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:22), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcio- namento que é covalentemente ligado à extremidade terminal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina.
[0073] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuA- fuUfgGfsc (SEQ ID NO: 7), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gccaauaaAflfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:24), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf, If e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usUfscsU- fuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a se- quência nucleotídica modificada (5’  3’) gccaauaaAflfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:24), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos in- vertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade termi- nal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0074] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfu- AfgGfsg (SEQ ID NO:9), e um filamento senso que consiste em, con- siste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) cccuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO: 26), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosi- na ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s repre- senta uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compre- ende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) asGfsasAfuAfcUf-
gUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO: 9), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5’  3’) cccuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO: 26), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade termi- nal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0075] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuA- faGfsc (SEQ ID NO: 11), e um filamento senso que consiste em, con- siste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) gcuuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO:28), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro ade- nosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antis- senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) asGfsasAfuAfcUf- gUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5’  3’) gcuuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO: 28), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade termi-
nal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0076] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequên- cia nucleotídica modificada (5'  3') usGfsasGfaAfuAfcUf- gUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13), e um filamento senso que consis- te em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nu- cleotídica modificada (5’  3’) ggcaaaggGfAfCfaguauucuca (SEQ ID NO: 30), em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'- fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência nucleotídica modificada (5’  3’) usGfsasG- faAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13), e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a se- quência nucleotídica modificada (5’  3’) ggcaaaggGfAfCfaguauucuca (SEQ ID NO:30), e em que o filamento senso ainda inclui resíduos in- vertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade termi- nal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil- galactosamina.
[0077] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5’  3’):
UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10); AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14); em que o agente RNAi de APOC3 ainda inclui um filamento senso que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento antissenso; e em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambos o filamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modifica- dos.
[0078] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10); AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14); em que o agente RNAi de APOC3 ainda inclui um filamento senso que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento antissenso; em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambos o fi- lamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modificados; e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotí- dica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade terminal 5’, em que o li-
gante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina.
[0079] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10); AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14); em que o agente RNAi de APOC3 ainda inclui um filamento senso que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento antissenso; em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambos o fi- lamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modificados; e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotí- dica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalentemente ligado à extremidade terminal 5’, em que o li- gante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina; e em que a respectiva sequência de filamento antissenso está localizada nas posi- ções 1-21 do filamento antissenso.
[0080] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso, em que o filamento antissenso e o filamento senso consistem de, consistem essencialmente de, ou compreendem se- quências nucleotídicas que diferem em 0 ou 1 nucleotídeos a partir de um dos seguintes pares da sequência nucleotídica (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e
GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 16); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5) e ACGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 18); UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO:21); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA (SEQ ID NO:23); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e GCCAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO:25); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10) e CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:27); AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12) e GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:29); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14) e GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:31); em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambos o filamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modifica- dos.
[0081] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso, em que o filamento antissenso e o filamento senso consistem de, consistem essencialmente de, ou compreendem se- quências nucleotídicas que diferem em 0 ou 1 nucleotídeos a partir de um dos seguintes pares de sequências nucleotídicas (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 16); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5) e ACGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 18); UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3) e GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO:21);
UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e GC C AAU AAAGCUGGAC AAGAA (SEQ ID NO:23); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8) e GCCAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO:25); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10) e CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:27); AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12) e GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO :29); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14) e GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:31); em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambos o filamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modifica- dos; e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abási- cos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nu- cleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direciona- mento que é covalentemente ligado à extremidade terminal 5’, em que o ligante de direcionamento inclui N-acetil-galactosamina.
[0082] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5’  3’): usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4); usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11); ou usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13);
em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guanosi- na ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s repre- senta uma ligação fosforotioato; e em que o agente RNAi de APOC3 ainda inclui o filamento senso que é pelo menos parcialmente com- plementar ao filamento antissenso; e em que todos os substancialmen- te todos os nucleotídeos no filamento senso são nucleotídeos modifi- cados.
[0083] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica modificada que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5’  3’): usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4); usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11); ou usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13); em que o agente RNAi APOC3 ainda inclui o filamento senso que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento antissenso; em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos no filamento senso são nucleotídeos modificados; em que todos ou substancial- mente todos os nucleotídeos em ambos o filamento antissenso e o fi- lamento senso são nucleotídeos modificados; e em que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade termi- nal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalente-
mente ligado à extremidade terminal 5’, em que o ligante de direcio- namento inclui N-acetil-galactosamina.
[0084] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende sequências nucleotídicas modificadas que diferem em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de um dos seguintes pares de sequência nu- cleotídica (5’  3’): usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2) e gagggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 15); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4) e acgggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 17); usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6) e gagggacaGfuAfuUfcucaguia (SEQ ID NO: 19); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2) e gagggacaGfUfAfuucucaguga (SEQ ID NO:20); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccaauaaAfGfCfuggacaagaa (SEQ ID NO: 22); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccaauaaAflfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:24); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9) e cccuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO:26); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11) e gcuuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO: 28); ou usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13) e ggcaaaggGfAfCfaguauucuca (SEQ ID NO: 30); em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guano- sina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf, If e Uf represen- tam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respec- tivamente; e s representa uma ligação fosforotioato.
[0085] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende um dos seguintes pares de sequência nucleotídica (5’  3’): usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2) e gagggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 15); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4) e acgggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 17); usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6) e gagggacaGfuAfuUfcucaguia (SEQ ID NO: 19); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2) e gagggacaGfUfAfuucucaguga (SEQ ID NO:20); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccaauaaAfGfCfuggacaagaa (SEQ ID NO: 22); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccaauaaAflfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:24); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9) e cccuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO:26); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11) e gcuuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO: 28); ou usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13) e ggcaaaggGfAfCfaguauucuca (SEQ ID NO: 30); em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citidina, guano- sina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf, If e Uf represen- tam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respec- tivamente; s representa uma ligação fosforotioato; e em que o filamen- to senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade ter- minal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica, e o filamento senso também inclui um ligante de direcionamento que é covalente-
mente ligado à extremidade terminal 5’, em que o ligante de direcio- namento inclui N-acetil-galactosamina.
[0086] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que inclui uma sequência nucleobase que difere em 0 ou 1 nucleobase a partir das sequências nucleotídicas selecionadas a partir do grupo consistindo em (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO:53); AGAAUACUGUCCCUUUUAA (SEQ ID NO:57); AGAAUACUGUCCCUUUUAG (SEQ ID NO:58); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUG (SEQ ID NO: 106).
[0087] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que inclui uma sequência nucleobase que difere em 0 ou 1 nucleobase a partir das sequências nucleotídicas selecionadas a partir do grupo consistindo em (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO:53); AGAAUACUGUCCCUUUUAA (SEQ ID NO:57); AGAAUACUGUCCCUUUUAG (SEQ ID NO:58); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUG (SEQ ID NO: 106); e em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleo- tídeos modificados.
[0088] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso que inclui uma sequência nucleobase que difere em 0 ou 1 nucleobase a partir das sequências nucleotídicas selecionadas a partir do grupo consistindo em (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49);
UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO:53); AGAAUACUGUCCCUUUUAA (SEQ ID NO:57); AGAAUACUGUCCCUUUUAG (SEQ ID NO:58); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUG (SEQ ID NO: 106); e em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleo- tídeos modificados, e em que a SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO: 106, respectivamente, está localizada nas posições do nucleotídeo 1-19 (5’  3’) do filamento an- tissenso.
[0089] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso que cada inclui uma sequência nucleobase que difere em 0 ou 1 nucleobase a partir dos pares de sequências nucleotídicas selecionados a partir do grupo consistindo em (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49) e GGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 113); UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49) e GGGACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO: 112); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO: 53) e CAAUAAAGCUGGACAAGAA (SEQ ID NO: 117); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO: 53) e CAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO: 118); AGAAUACUGUCCCUUUUAA (SEQ ID NO:57) e UUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:122); AGAAUACUGUCCCUUUUAG (SEQ ID NO:58) e CUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:123); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUG (SEQ ID NO:106) e CAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:171).
[0090] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 di- vulgado no presente documento inclui um filamento antissenso e um filamento senso que cada inclui uma sequência nucleobase que difere em 0 ou 1 nucleobase a partir dos pares das sequências nucleotídicas selecionados a partir do grupo consistindo em (5’  3’): UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49) e GGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 113); UCACUGAGAAUACUGUCCC (SEQ ID NO:49) e GGGACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO: 112); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO: 53) e CAAUAAAGCUGGACAAGAA (SEQ ID NO: 117); UUCUUGUCCAGCUUUAUUG (SEQ ID NO: 53) e CAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO: 118); AGAAUACUGUCCCUUUUAA (SEQ ID NO:57) e UUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO: 122); AGAAUACUGUCCCUUUUAG (SEQ ID NO: 58) e CUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO: 123); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUG (SEQ ID NO: 106) e CAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO: 171); e em que todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleo- tídeos modificados.
[0091] Conforme usado no presente documento, os termos "oligo- nucleotídeo" e "polinucleotídeo" significam um polímero de nucleosí- deos ligados cada um dos quais pode ser independentemente modifi- cado ou não modificado.
[0092] Conforme usado no presente documento, um "agente RNAi" (também referido como um "desencadeador de RNAi") significa uma composição que contém um RNA ou molécula oligonucleotídica do tipo RNA (por exemplo, RNA quimicamente modificado) que é ca- paz de degradar ou inibir (por exemplo, degrada ou inibe sob condi- ções apropriadas) a tradução dos transcritos do RNA mensageiro (mRNA) de um mRNA alvo de uma maneira específica da sequência.
Conforme usado no presente documento, os agentes RNAi podem operar através do mecanismo de interferência do RNA (isto é, indução da interferência do RNA através da interação com o maquinário da via de interferência do RNA (complexo de silenciamento induzido pelo RNA ou RISC) de células de mamíferos), ou através de qualquer me- canismo ou via alternativa. Enquanto se acredita que os agentes RNAi, como o termo é usado no presente documento, opera primariamente através do mecanismo de interferência do RNA, os agentes RNAi di- vulgados não são ligados ou limitados por qualquer via ou mecanismo de ação específico. Os agentes RNAi divulgados no presente docu- mento são compreendidos de um filamento senso e um filamento an- tissenso, e incluem, porém não se limitam a: RNAs interferentes curtos (ou pequenos) (siRNAs), RNAs de filamento duplo (dsRNA), micro RNAs (miRNAs), RNAs grampo de cabelo curtos (shRNA), e substra- tos dicer. O filamento antissenso dos agentes RNAi descritos no pre- sente documento é pelo menos parcialmente complementar ao mRNA sendo direcionado (isto é, APOC3 mRNA). Os agentes RNAi podem incluir um ou mais nucleotídeos modificados e/ou uma ou mais liga- ções de não fosfodiéster.
[0093] Conforme usado no presente documento, os termos "silen- ciar", "reduzir", "inibir", "infrarregular" ou "knockdown" quando se refere à expressão de um dado gene, significa que a expressão do gene, conforme medido pelo nível de RNA transcrito a partir do gene ou o nível de polipeptídeo, proteína, ou subunidade de proteína traduzida do mRNA em uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo no qual o gene é transcrito, é reduzido quando a célula, grupo de célu- las, tecido, órgão ou indivíduo é tratado com os agentes RNAi descri- tos no presente documento conforme comparado com uma segunda célula, grupo de células, tecido, órgão, ou indivíduo que não é ou não foi tratado.
[0094] Conforme usado no presente documento, os termos "se- quência" e "sequência nucleotídica" significam uma sucessão ou or- dem de nucleobases ou nucleotídeos, descritos com uma sucessão de letras usando a nomenclatura padrão.
[0095] Conforme usado no presente documento, uma "base", "ba- se nucleotídica" ou "nucleobase" é um composto heterocíclico de piri- midina ou purina que é um componente de um nucleotídeo, e inclui as bases purina primárias adenina e guanina, e as bases pirimidina pri- márias citosina, timina e uracila. Uma nucleobase pode ser ainda mo- dificada para incluir, sem limitação, bases universais, bases hidrofóbi- cas, bases promíscuas, bases de tamanho expandido e bases fluora- das. (Vide, por exemplo, Modified Nucleosides in Biochemistry, Bio- technology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley -VCH, 2008). A sín- tese das referidas nucleobase modificadas (incluindo compostos de fosforamidita que incluem nucleobase modificadas) é conhecida na técnica.
[0096] Conforme usado no presente documento, e a menos que indicado de outra forma, o termo "complementar" quando usado para descrever uma primeira nucleobase ou sequência nucleotídica (por exemplo, filamento senso do agente RNAi ou mRNA direcionado) em relação a uma segunda nucleobase ou sequência nucleotídica (por exemplo, filamento antissenso do agente RNAi ou um oligonucleotí- deos antissenso de filamento único), significa a capacidade de um oli- gonucleotídeos ou polinucleotídeo incluindo a primeira sequência nu- cleotídica a hibridizar (formar ligações de hidrogênio par de base sob condições fisiológicas de mamífero (ou condições similares in vitro)) e formar um dúplex ou estrutura helicoidal dupla sob certas condições padrão com um oligonucleotídeos ou polinucleotídeo incluindo a se- gunda sequência nucleotídica. As sequências complementares inclu- em pares de base Watson-Crick ou pares de base não-Watson-Crick e incluem nucleotídeos naturais ou modificados ou imitadores de nucleo- tídeos, pelo menos até o grau em que os requisitos de hibridização acima são atendidos. A identidade sequencial ou de complementarie- dade é independente de modificação. Por exemplo, a e Af, conforme definidos no presente documento, são complementares a U (ou T) e idênticas a A para a finalidade de determinar a identidade ou comple- mentariedade.
[0097] Conforme usado no presente documento, "perfeitamente complementar" ou "totalmente complementar" significa que em um par hibridizado de nucleobases ou moléculas da sequência nucleotídica, todas (100%) das bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeos irão se hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A se- quência contígua pode compreender toda ou parte de uma primeira ou segunda sequência nucleotídica.
[0098] Conforme usado no presente documento, "parcialmente complementar" significa que em um par hibridizado de nucleobases ou moléculas da sequência nucleotídica, pelo menos 70%, mas não to- das, as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonu- cleotídeos irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma se- quência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contí- gua pode compreender toda ou uma parte de uma primeira ou segun- da sequência nucleotídica.
[0099] Conforme usado no presente documento, "substancialmen- te complementar" significa que em um par hibridizado de nucleobases ou moléculas da sequência nucleotídica, pelo menos 85%, mas não todas, as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonu- cleotídeos irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma se- quência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contí- gua pode compreender toda ou uma parte de uma primeira ou segun-
da sequência nucleotídica.
[00100] Conforme usado no presente documento, os termos "com- plementar", "totalmente complementar", "parcialmente complementar" e "substancialmente complementar" são usados com relação à corre- lação da nucleobase ou nucleotídeo entre o filamento senso e o fila- mento antissenso de um agente RNAi, ou entre o filamento antissenso de um agente RNAi e uma sequência de um mRNA de APOC3.
[00101] Conforme usado no presente documento, o termo "subs- tancialmente idêntica" ou "identidade substancial" conforme aplicado a uma sequência de ácido nucleico significa que uma sequência nucleo- tídica (ou uma porção de uma sequência nucleotídica) tem pelo menos cerca de 85% de identidade sequencial ou mais, por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade, comparado com uma sequência de referência. A porcentagem de iden- tidade sequencial é determinada pela comparação de duas sequências adequadamente alinhadas sobre uma janela de comparação. A por- centagem é calculada ao se determinar o número de posições nas quais o mesmo tipo de base de ácido nucleico acontece em ambas as sequências para render o número de posições correlatas, dividindo o número de posições correlatas pelo número total de posições na jane- la de comparação e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade sequencial. As invenções divulgadas no presente documento abrangem sequências nucleotídicas substancial- mente idênticas àquelas divulgadas no presente documento.
[00102] Conforme usado no presente documento, os termos "tra- tar", "tratamento" e similares, significam os métodos ou etapas toma- das para prover atenuação ou alívio do número, gravidade e/ou fre- quência de um ou mais sintomas de uma doença em um indivíduo. Conforme usado no presente documento, "tratar" e "tratamento" po- dem incluir o tratamento preventivo, gerenciamento, tratamento profilá-
tico e/ou inibição ou redução do número, gravidade e/ou frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um indivíduo.
[00103] Conforme usado no presente documento, a frase "introdu- zindo em uma célula", quando se refere a um agente RNAi, significa liberar de forma funcional o agente RNAi em uma célula. A frase "libe- ração funcional", significa liberar o agente RNAi na célula de uma for- ma que permita que o agente RNAi tenha a atividade biológica espe- rada, por exemplo, inibição específica à sequência da expressão gené- tica.
[00104] A menos que declarado de outra forma, o uso do símbolo conforme usado no presente documento significa que qualquer grupo ou grupos podem estar ligados aos mesmos, o que está de acordo com o escopo das invenções descritas no presente documento.
[00105] Conforme usado no presente documento, o termo "isôme- ros" se refere a compostos que têm fórmulas moleculares idênticas, mas que diferem na natureza ou na sequência de ligação de seus átomos ou na disposição de seus átomos no espaço. Os isômeros que diferem na disposição dos seus átomos no espaço são denominados "estereoisômeros". Os estereoisômeros que não são imagens espe- lhadas um do outro são denominados "diastereoisômeros" e os este- reoisômeros que são imagens espelhadas não sobreponíveis são de- nominados "enantiômeros" ou algumas vezes isômeros óticos. Um átomo de carbono ligado a quatro substituintes não idênticos é deno- minado um "centro quiral".
[00106] Conforme usado no presente documento, a menos que identificado em uma estrutura tendo uma conformação específica, para dada estrutura na qual centros assimétricos estão presentes e assim dão origem aos enantiômeros, diastereômeros ou outras configura- ções estereoisoméricas, cada estrutura divulgada no presente docu- mento pretende representar todos os possíveis isômeros, incluindo as suas formas opticamente puras e racêmicas. Por exemplo, as estrutu- ras divulgadas no presente documento pretendem cobrir misturas de diastereômeros assim como estereoisômeros únicos.
[00107] Conforme usado em uma reivindicação no presente docu- mento, a frase "consistindo em exclusões de qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Quando usado em uma reivindicação no presente documento, a frase "consistindo essen- cialmente de limites de escopo de uma reivindicação aos materiais es- pecificados ou etapas e aquelas que não afetam materialmente a(s) característica(s) básicas e novas da invenção reivindicada.
[00108] O versado na técnica compreenderia prontamente e afirma- ria que os compostos e composições divulgados no presente docu- mento podem ter certos átomos (por exemplo, átomos de N, O ou S) em um estado protonado ou desprotonado, dependendo do ambiente no qual o composto ou composição é colocado. Consequentemente, conforme usado no presente documento, as estruturas divulgadas no presente documento consideram que certos grupos funcionais, tais como, por exemplo, OH, SH ou NH, podem ser protonados ou despro- tonados. A divulgação no presente documento pretende cobrir os compostos e composições divulgados independente do seu estado de protonação com base no ambiente (tal como pH), conforme seria pron- tamente compreendido pelo versado na técnica.
[00109] Conforme usado no presente documento, o termo "ligado" ou "conjugado" quando se refere à conexão entre dois compostos ou moléculas significa que dois compostos ou moléculas são ligados por uma ligação covalente. A menos que declarado, os termos "ligado" e "conjugado" conforme usado no presente documento podem se referir à conexão entre um primeiro composto e um segundo composto seja com ou sem qualquer átomo interveniente ou grupo de átomos.
[00110] Conforme usado no presente documento, o termo "incluin-
do" é usado no presente documento para significar, e é usado de for- ma intercambiável com, a frase "incluindo porém sem se limitar a". O termo "ou" é usado no presente documento para significar, e é usado de forma intercambiável com, o termo "e/ou", a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[00111] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo signi- ficado como comumente compreendido por um versado na técnica. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descri- tos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, valerá. Além disso, os materi- ais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes.
[00112] Outros objetos, características, aspectos e vantagens da invenção ficarão aparentes da descrição detalhada, figuras anexas e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00113] FIG. 1A. Diagrama esquemático dos filamentos senso e an- tissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05251 (vide a ta- belas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1A divulga as SEQ ID NOs: 2 e 501.
[00114] As abreviações que seguem são usadas nas Figuras 1A a 1I: a, c, g, i e u são 2'-0- metil nucleotídeos modificados (para i, a nu- cleobase é hipoxantina (isto é, a base para nucleotídeos inosina)); Af, Cf, Gf, If e Uf são 2'-fluoro nucleotídeos modificados (para I, a nucleo-
base é hipoxantina (isto é, a base para nucleotídeos inosina); p é uma ligação fosfodiéster; s é uma ligação fosforotioato; invAb é um resíduo abásico invertido (desoxirribose) (vide a tabela 7); e (NAG37)s é um ligante de direcionamento de N-acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura apresentada na tabela 7.
[00115] FIG. 1B. Diagrama esquemático dos filamentos senso e an- tissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05876 (vide a ta- belas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1B divulga as SEQ ID NOs: 4 e 572.
[00116] FIG. 1C. Diagrama esquemático dos filamentos senso e antissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05769 (vide a tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1C divulga as SEQ ID NOs: 6 e 557.
[00117] FIG. 1D. Diagrama esquemático dos filamentos senso e antissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05169 (vide a tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1D divulga as SEQ ID NOs: 2 e 482.
[00118] FIG. 1E. Diagrama esquemático dos filamentos senso e an- tissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05220 (vide a ta- belas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de(NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1E divulga as SEQ ID NOs: 7 e 494.
[00119] FIG. 1F. Diagrama esquemático dos filamentos senso e an- tissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05547 (vide as tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1F divulga as SEQ ID NOs: 7 e 545.
[00120] FIG. 1G. Diagrama esquemático dos filamentos senso e antissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05299 (vide a tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1G divulga as SEQ ID NOs: 9 e 521.
[00121] FIG. 1H. Diagrama esquemático dos filamentos senso e antissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05223 (vide as tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1H divulga as SEQ ID NOs: 11 e 497.
[00122] FIG. 1I. Diagrama esquemático dos filamentos senso e an- tissenso modificados do agente RNAi de APOC3 AD05171 (vide as tabelas 4-6), conjugado a um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentada tendo a estrutura de (NAG37)s (vide a tabela 7). A Fig. 1A divulga as SEQ ID NOs: 13 e 483.
[00123] Fig. 2 A a 2D. Representação da estrutura química do agente RNAi de APOC3 AD05251, incluindo um ligante de direciona- mento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento sen- so, mostrado com um ácido livre.
[00124] Fig. 3A a 3D. Representação da estrutura química do agen- te RNAi de APOC3 AD05251, incluindo um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento senso, mostrado com um sal de sódio.
[00125] Fig. 4A a 4D. Representação da estrutura química do agen- te RNAi de APOC3 AD05876, incluindo um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento senso, mostrado com um ácido livre.
[00126] Fig. 5A a 5D. Representação da estrutura química do agen- te RNAi de APOC3 AD05876, incluindo um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento senso, mostrado com um sal de sódio.
[00127] Fig. 6A a 6D. Representação da estrutura química do agen- te RNAi de APOC3 AD05220, incluindo um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento senso, mostrado com um ácido livre.
[00128] Fig. 7A a 7D. Representação da estrutura química do agen- te RNAi de APOC3 AD05220, incluindo um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentada (tendo a estrutura de (NAG37)s) conjugado na extremidade terminal 5’ do filamento senso, mostrado com um sal de sódio.
DESCRIÇÃO DETALHADA Agentes RNAi
[00129] Os agentes RNAi para a inibição da expressão de um gene APOC3 (referidos no presente documento como agentes RNAi de APOC3 ou desencadeadores de RNAi de APOC3) são descritos no presente documento. Cada agente RNAi de APOC3 compreende um filamento senso e um filamento antissenso. O filamento senso e o fila- mento antissenso podem ser cada de 16 a 30 nucleotídeos de com- primento. Os filamentos senso e antissenso podem ser tanto do mes- mo comprimento ou eles podem ter comprimentos diferentes. Em al- gumas modalidades, os filamentos senso e antissenso são cada inde- pendentemente de 17 a 27 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos senso e antissenso são cada independen- temente de 17-21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modali- dades, os filamentos senso e antissenso são cada de 21-26 nucleotí-
deos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos senso e antissenso são cada de 21-24 nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, o filamento senso é de cerca de 19 nucleotídeos de comprimento enquanto o filamento antissenso é de cerca de 21 nu- cleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o filamento senso é de cerca de 21 nucleotídeos de comprimento enquanto o fila- mento antissenso é de cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um filamento senso é de 23 nucleotídeos de comprimento e um filamento antissenso é de 21 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, ambos os filamentos senso e an- tissenso são cada de 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos senso e antissenso do agente RNAi são cada independentemente de 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 ou 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um agente RNAi de filamento duplo tem um comprimento dúplex de cerca de 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos.
[00130] Em algumas modalidades, a região de complementariedade perfeita, substancial ou parcial entre o filamento senso e o filamento antissenso é de 16-26 (por exemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26) nucleotídeos de comprimento e acontece em ou próximo da extremidade 5' do filamento antissenso (por exemplo, esta região pode ser separada da extremidade 5' do filamento antissenso em 0, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos que não perfeitamente, substancialmente ou parci- almente complementares).
[00131] O filamento senso e o filamento antissenso contém cada uma extensão nuclear (também referida no presente documento como uma "sequência nuclear” ou uma "sequência de extensão nuclear") que é de 16 a 23 nucleotídeos de comprimento. Uma extensão nuclear do filamento antissenso é 100% (perfeitamente) complementar ou pelo menos cerca de 85% (substancialmente) complementar a uma se-
quência nucleotídica (algumas vezes referida, por exemplo, como uma sequência alvo) presente no alvo do mRNA de APOC3. Uma sequên- cia de extensão nuclear do filamento senso é 100% (perfeitamente ) complementar ou pelo menos cerca de 85% (substancialmente ) com- plementar a uma sequência de extensão nuclear no filamento antis- senso, e assim a sequência da extensão nuclear do filamento senso é tipicamente perfeitamente idêntica ou pelo menos cerca de 85% idên- tica a uma sequência nucleotídica (sequência alvo) presente no alvo de mRNA de APOC3. Uma sequência de extensão nuclear do filamen- to senso pode ter o mesmo comprimento como uma sequência antis- senso correspondente ou ela pode ter um comprimento diferente. Em algumas modalidades, a sequência da extensão nuclear do filamento antissenso é de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, a sequência da extensão nuclear do filamento senso é de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 nucleotídeos de comprimento.
[00132] Exemplos de sequências nucleotídicas do filamento senso e antissenso usados na formação dos agentes RNAi de APOC3 são providos nas Tabelas 2, 3, 4 e 5. Exemplos de dúplices de agentes RNAi, que incluem as sequências do filamento senso e filamento an- tissenso nas tabelas 2, 4 e 5, são mostrados na tabela 6.
[00133] Os filamentos senso e antissenso do agente RNAi de APOC3 se anelam para formar um dúplex. Um filamento senso e um filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 pode ser parcial- mente, substancialmente ou totalmente complementar um ao outro. Dentro da região dúplex complementar, a sequência da extensão nu- clear do filamento senso é pelo menos 85% complementar ou 100% complementar à sequência da extensão nuclear do antissenso. Em algumas modalidades, a sequência da extensão nuclear do filamento senso contém uma sequência de pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22 ou pelo menos 23 nucleotídeos que é pelo menos 85% ou 100% complementar a uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos correspondentes da sequência da extensão nuclear do filamento antissenso (isto é, as sequências da extensão nuclear senso e antissenso de um agente RNAi de APOC3 têm uma região de pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22 ou pelo menos 23 nucleotídeos que é pelo menos 85% base pareada ou 100% base pareada).
[00134] Em algumas modalidades, o filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos a partir de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4. Em algumas modalidades, o filamento senso de um agente RNAi de APOC3 divul- gado no presente documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos a par- tir de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5.
[00135] O filamento senso e/ou o filamento antissenso podem opci- onalmente e independentemente conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos adicionais (extensão) na extremidade 3', extremidade 5' ou ambas as extremidades 3' e 5' das sequências de extensão nuclear. Os nucleotí- deos adicionais do filamento antissenso, caso presentes, podem ou não ser complementares à sequência correspondente no mRNA de APOC3. Os nucleotídeos adicionais do filamento senso, caso presen- tes, podem ou não ser idênticos à sequência correspondente no mRNA de APOC3. Os nucleotídeos adicionais do filamento antissenso, caso presentes, podem ou não ser complementares aos nucleotídeos adicionais do filamento senso correspondente, caso presentes.
[00136] Conforme usada no presente documento, uma extensão compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3'
da sequência da extensão nuclear do filamento senso e/ou sequência da extensão nuclear do filamento antissenso. Os nucleotídeos de ex- tensão em um filamento senso podem ou não ser complementares aos nucleotídeos, sejam nucleotídeos da sequência de extensão nuclear ou nucleotídeos de extensão, no filamento antissenso correspondente. Inversamente, os nucleotídeos de extensão em um filamento antissen- so podem ou não ser complementares aos nucleotídeos, sejam nucle- otídeos de extensão nuclear ou nucleotídeos de extensão, no filamen- to senso correspondente. Em algumas modalidades, ambos o filamen- to senso e o filamento antissenso de um agente RNAi contêm exten- sões 3' e 5'. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão 3’ de um dos pares de base de um filamento um ou mais nucleotídeos de extensão 5’ do outro filamento. Em outras modalida- des, um ou mais dos nucleotídeos de extensão 3’ de um filamento não pareiam com um ou mais nucleotídeos de extensão 5’ do outro fila- mento. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 tem um filamento antissenso tendo uma extensão 3' e um filamento senso ten- do uma extensão 5'. Em algumas modalidades, o(s) nucleotídeo(s) de extensão são não pareados e formam uma saliência. Conforme usado no presente documento, uma "saliência" se refere a uma extensão de um ou mais nucleotídeos não pareados localizados em uma extremi- dade terminal seja do filamento senso ou do filamento antissenso que não faz parte da porção hibridizada ou duplexada de um agente RNAi divulgado no presente documento.
[00137] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso tendo uma extensão 3' de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso tendo uma extensão 3' de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de comprimento. Em algu- mas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão do fila-
mento antissenso compreendem nucleotídeos uracila ou timidina ou nucleotídeos que são complementares à sequência correspondente do mRNA de APOC3.
[00138] Em algumas modalidades, a extremidade 3' do filamento antissenso pode incluir resíduos abásicos (Ab), que também são refe- ridos como um "sítio abásico" ou "nucleotídeo abásico". Um resíduo abásico (Ab) é um nucleotídeo ou nucleosídeo que carece de uma nu- cleobase na posição 1' da porção açúcar. (Vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5,998,203). Em algumas modalidades, Ab ou AbAb podem ser adicionados à extremidade 3' do filamento antissen- so.
[00139] Em algumas modalidades, o filamento senso ou o filamento antissenso pode incluir um "cap terminal", o qual conforme usado no presente documento é um composto não nucleotídico ou outra porção que pode ser incorporada em um ou mais terminais de um filamento de um agente RNAi divulgado no presente documento, e pode prover o agente RNAi, em alguns casos, com certas propriedades benéficas, tal como, por exemplo, proteção contra a degradação de exonuclease. Em algumas modalidades, os resíduos invertidos abásicos (invAb) são adicionados como caps terminais (vide a tabela 76). (vide, por exem- plo, F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003,31(11), 2705-16). Os caps terminais são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exem- plo, resíduos invertidos abásicos assim como cadeias de carbono tais como os grupos terminais C3, C6 ou C12. Em algumas modalidades, um cap terminal está presente seja na extremidade terminal 5', extre- midade terminal 3' ou ambas as extremidades terminais 5' e 3' do fila- mento senso.
[00140] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento senso tendo uma expressão 3' de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão do filamento senso compreendem nucleotídeos adenosina, uracila ou timidina, dinucleotídeo AT ou nu- cleotídeos que correspondem aos nucleotídeos na sequência do mRNA de APOC3. Em algumas modalidades, a extensão do filamento senso 3' inclui ou consiste em uma das sequências que seguem, po- rém não se limita a: T, UT, TT, UU, UUT, TTT ou TTTT (cada uma lis- tada 5' a 3').
[00141] Em algumas modalidades, a extremidade 3' do filamento senso pode incluir resíduos abásicos adicionais ou caps terminais in- vertidos abásicos. Em algumas modalidades, UUAb, UAb ou Ab são adicionados à extremidade 3' do filamento senso.
[00142] Em algumas modalidades, um ou mais resíduos invertidos abásicos (invAb) são adicionados à extremidade 3' do filamento senso. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos invertidos abásicos ou sítios invertidos abásicos são inseridos entre o ligante de direciona- mento e a sequência de nucleobase do filamento senso do agente RNAi. Em algumas modalidades, a inclusão de um ou mais resíduos invertidos abásicos ou sítios invertidos abásicos em ou próximo à ex- tremidade terminal ou extremidades terminais do filamento senso de um agente RNAi permite atividade melhorada ou outras propriedades desejadas de um agente RNAi.
[00143] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento senso tendo uma extensão 5' de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão do filamento senso compreendem nucleotídeos uracila ou adenosina ou nucleotídeos que correspondem aos nucleotídeos na sequência de mRNA de APOC3. Em algumas modalidades, a extensão do filamento senso 5' é uma das seguintes sequências, porém não se limita a: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U,
UU (cada listado 5' a 3'). Um filamento senso pode ter uma extensão 3' e/ou uma extensão 5'.
[00144] Em algumas modalidades, a extremidade 5' do filamento senso pode incluir um ou mais resíduos abásicos adicionais (por exemplo, (Ab) ou (AbAb)). Em algumas modalidades, um ou mais re- síduos invertidos abásicos (invAb) são adicionados à extremidade 5’ do filamento senso. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos invertidos abásicos podem ser inseridos entre o ligante de direciona- mento e a sequência nucleobase do filamento senso do agente RNAi. Em algumas modalidades, a inclusão de um ou mais resíduos inverti- dos abásicos em ou próximo da extremidade terminal ou extremidades terminais do filamento senso de um agente RNAi pode permitir ativida- de aumentada ou outras propriedades desejadas de um agente RNAi. Em algumas modalidades, um resíduo abásico (desoxirribose) pode ser substituído com um resíduo de ribitol (ribose abásica).
[00145] Em algumas modalidades, a extremidade 3' da sequência da extensão nuclear do filamento antissenso, ou a extremidade 3' da sequência do filamento antissenso, pode incluir um resíduo invertido abásico (invAb (vide a tabela 7)).
[00146] Os exemplos de sequências usados na formação de agen- tes RNAi de APOC3 são providos nas Tabelas 2, 3, 4 e 5. Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 in- clui uma sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2, 3 ou 4. Em certas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em qualquer uma das se- quências modificadas na tabela 4. Em algumas modalidades, um fila- mento antissenso do agente RNAi de APOC3 inclui a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5' – extremidade 3') 1-17, 2-15, 2-17, 1 - 18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1 -21 , 2-21 , 1 -22, 2-22, 1 -23, 2-23, 1 -24 ou 2-24 de qualquer uma das sequências nas tabelas 2 ou 4. Em algumas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 inclui a sequência de qualquer uma das sequências nas tabelas 2 ou
5. Em algumas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 inclui a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5' – ex- tremidade 3') 1-18, 1 -19, 1-20, 1-21, 1 -22, 1-23, 1-24, I -25, 1-26, 2- 19, 2-20, 2-21, 2-22, 2-23, 2-24, 3-20, 3-21, 3-22, 3-23, 3-24, 4-21, 4- 22, 4-23, 4-24, 5-22, 5-23 ou 5-24 de qualquer uma das sequências nas tabelas 2 ou 5. Em certas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 5.
[00147] Em algumas modalidades, os filamentos senso e antissen- so dos agentes RNAi descritos no presente documento contêm o mesmo número de nucleotídeos. Em algumas modalidades, os fila- mentos senso e antissenso dos agentes RNAi descritos no presente documento contêm números diferentes de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a extremidade 5’ do filamento senso e a extremidade 3’ do filamento antissenso de um agente RNAi formam uma extremidade cega. Em algumas modalidades, a extremidade 3’ do filamento senso e a extremidade 5’ do filamento antissenso de um agente RNAi for- mam uma extremidade cega. Em algumas modalidades, ambas as ex- tremidades de um agente RNAi formam extremidades cegas. Em al- gumas modalidades, nenhuma extremidade de um agente RNAi é de extremidade cega. Conforme usado no presente documento, uma "ex- tremidade cega" se refere a uma extremidade de um agente RNAi de filamento duplo no qual os nucleotídeos terminais dos dois filamentos anelados são complementares (formam um par de base complemen- tar).
[00148] Em algumas modalidades, a extremidade 5’ do filamento senso e a extremidade 3’ do filamento antissenso 3' de um agente RNAi formam uma extremidade desgastada. Em algumas modalida-
des, a extremidade 3’ do filamento senso 3' e a extremidade 5’ do fila- mento antissenso de um agente RNAi formam uma extremidade des- gastada. Em algumas modalidades, ambas as extremidades de um agente RNAi formam uma extremidade desgastada. Em algumas mo- dalidades, nenhuma extremidade de um agente RNAi é uma extremi- dade desgastada. Conforme usado no presente documento uma ex- tremidade desgastada se refere a uma extremidade de um agente RNAi de filamento duplo na qual os nucleotídeos terminais dos dois filamentos anelados a partir de um par (isto é, não formam uma saliên- cia) mas não são complementares (isto é, formam um par não com- plementar). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos não pareados na extremidade de um filamento de um agente RNAi de fila- mento duplo formam uma saliência. Os nucleotídeos não pareados podem estar no filamento senso ou no filamento antissenso, criando ambas saliências 3' ou 5'. Em algumas modalidades, o agente RNAi contém: uma extremidade cega e uma extremidade desgastada, uma extremidade cega e extremidade 5’ saliente, uma extremidade cega e uma extremidade 3’ saliente, uma extremidade desgastada e uma ex- tremidade 5’ saliente, uma extremidade desgastada e uma extremida- de 3’ saliente, duas extremidades 5’ salientes, duas extremidades 3' salientes, uma extremidade 5’ saliente e uma extremidade 3’ saliente, duas extremidades desgastadas ou duas extremidades cegas. Tipica- mente, quando presentes, as saliências estão localizadas nas extremi- dades 3' terminais do filamento senso, o filamento antissenso, ou am- bos o filamento senso e o filamento antissenso.
[00149] Nucleotídeos modificados, quando usados em vários cons- trutos de polinucleotídeo ou oligonucleotídeo, podem preservar a ativi- dade do composto em células enquanto ao mesmo tempo aumentam a estabilidade do soro desses compostos, e também podem minimizar a possibilidade da ativação da atividade de interferon em humanos me-
diante administração do construto de polinucleotídeo ou oligonucleotí- deo.
[00150] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é preparado ou provido como um sal, sal misto ou um ácido livre. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é preparado como um sal de sódio. As referidas formas que são bem conhecidas na téc- nica estão dentro das invenções divulgadas no presente documento. Nucleotídeos modificados
[00151] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 con- tém um ou mais nucleotídeos modificados. Conforme usado no pre- sente documento, um "nucleotídeo modificado" é um nucleotídeo dife- rente de um ribonucleotídeo (2'-hidroxil nucleotídeo). Em algumas mo- dalidades, pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) dos nucleo- tídeos são nucleotídeos modificados. Conforme usado no presente do- cumento, os nucleotídeos modificados podem incluir, porém não se limitam a, desoxirribonucleotídeos, imitadores de nucleotídeos, nucleo- tídeos abásicos (representados no presente documento como Ab), 2'- nucleotídeos modificados, ligações nucleotídicas 3' a 3' (invertidos) (representados no presente documento como invdN, invN, invn), nu- cleotídeos compreendendo nucleobase modificada, nucleotídeos em ponte, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), imitadores 2',3'-seco nu- cleotídicos (análogos de nucleobase não desbloqueados, representa- dos no presente documento como NuNA ou NUNA), nucleotídeos blo- queados (representados no presente documento como NLNA ou NLNA), nucleotídeos de 3'-O-metóxi (ligados a 2' internucleosídeo) (representados no presente documento como 3'-OMen), nucleotídeos 2'-F-Arabino (representados no presente documento como NfANA ou NfANA), 5'-Me, 2'-fluoro nucleotídeos (representados no presente do-
cumento como 5Me-Nf), nucleotídeos morfolino, desoxirribonucleotí- does de vinil fosfonato (representados no presente documento como vpdN), nucleotídeos contendo vinil fosfonato, e nucleotídeos contendo ciclopropil fosfonato (cPrpN). 2'-nucleotídeos modificados (isto é, um nucleotídeo com um grupo diferente de um grupo hidroxila na posição 2' do anel de açúcar de cinco membros) incluem, porém não se limitam a, 2'-0-metil nucleotídeos (representados no presente documento co- mo uma letra minúscula 'n' em uma sequência nucleotídica), 2'-desoxi- 2'-fluoro nucleotídeos (também referidos no presente documento como 2'-fluoro nucleotídeo, e representados no presente documento como Nf), 2'-desóxi nucleotídeos (representados no presente documento como dN), 2'-metoxietil (2'-O-2-metoxiletil) nucleotídeos (também refe- ridos no presente documento como 2'-MOE, e representados no pre- sente documento como NM), 2'-amino nucleotídeos, e 2'-alquil nucleo- tídeos. Não é necessário para todas as posições em um dado compos- to ser uniformemente modificados. Inversamente, mais de uma modifi- cação pode ser incorporada em um único agente RNAi de APOC3 ou ainda em um único nucleotídeo do mesmo. Os filamentos senso e an- tissenso do agente RNAi de APOC3 podem ser sintetizados e/ou mo- dificados através de métodos conhecidos na técnica. A modificação em um nucleotídeo é independente de modificação em um outro nu- cleotídeo.
[00152] As nucleobase modificadas incluem nucleobase sintéticas e naturais, tais como pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e O-6 purinas substituídas, (por exemplo, 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracila ou 5-propinilcitosina), 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetil citosina, inosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados 6-alquil (por exemplo, 6-metil, 6-etil, 6-isopropil ou 6-n-butil) de adenina e guanina, 2-alquil (por exemplo, 2-metil, 2-etil, 2-isopropil ou 2-n-butil) e outros alquil derivados de adenina e guanina, 2-
tiouracila, 2-tiotimina, 2-tiocitosina, 5-halouracila, citosina, 5-propinil uracila, 5-propinil citosina, 6-azo uracila, 6-azo citosina, 6-azo timina, 5-uracil (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-sulfidrila, 8- tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas. 5- halo (por exemplo, 5-bromo), 5-trifluorometila e outras uracilas e cito- sinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina e 3- deazaadenina.
[00153] Em algumas modalidades, todos ou substancialmente todos os nucleotídeos de um agente RNAi são nucleotídeos modificados. Conforme usado no presente documento, um agente RNAi em que substancialmente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modificados é um agente RNAi tendo quatro ou menos (isto é, 0, 1, 2, 3 ou 4) nucleotídeos em ambos o filamento senso e o filamento antis- senso sendo ribonucleotídeos (isto é, não modificados). Conforme usado no presente documento, um filamento senso em que substanci- almente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modifica- dos é um filamento senso tendo dois ou menos (isto é, 0, 1 ou 2) nu- cleotídeos no filamento senso sendo ribonucleotídeos não modifica- dos. Conforme usado no presente documento, um filamento senso an- tissenso em que substancialmente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modificados é um filamento antissenso tendo dois ou menos (isto é, 0, 1 ou 2) nucleotídeos no filamento senso sendo ribo- nucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de um agente RNAi é um ribonucleotídeo não modifica- do. Ligações internucleosídicas modificadas
[00154] Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de um agente RNAi de APOC3 são ligados por ligações ou estruturas princi- pais não padrão (isto é, ligações internucleosídicas modificadas ou es-
truturas principais modificadas). As ligações ou estruturas principais internucleosídicas modificadas incluem, porém não se limitam a, gru- pos fosforotioato (representados no presente documento como um "s" minúsculo), fosforotioatos quirais, tiofosfatos, fosforoditioatos, fosfotri- ésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, alquilfosfonatos (por exemplo, me- tilfosfonatos ou 3'-alquilenofosfonatos), fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos (por exemplo, 3 '-aminofosforamidato, arninoalquilfosfo- ramidatos ou tionofosforamidatos), tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfos- fotri ésteres, ligações morfolino, boranofosfatos tendo ligações 3'-5' normais, análogos 2'-5' ligados de boranofosfatos ou boranofosfatos tendo polaridade invertida em que os pares adjacentes das unidades nucleosídicas são ligadas 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Em algumas mo- dalidades, uma ligação ou estrutura principal internucleosídica modifi- cada carece de um átomo de fósforo. As ligações internucleosídicas modificadas que carecem de um átomo de fósforo incluem, porém não se limitam a, alquila de cadeia curta ou ligações de cicloalquila inter- açúcar, heteroátomo misto ou ligações de cicloalquila inter-açúcar ou uma ou mais ligações inter-açúcar heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Em algumas modalidades, as estruturas principais inter- nucleosídicas modificadas incluem, porém não se limitam a, estruturas principais de siloxano, estruturas principais de sulfeto, estruturas prin- cipais de sulfóxido, estruturas principais de sulfona, estruturas princi- pais de formacetila e tioformacetila, estruturas principais de metileno formacetila e tioformacetila, estruturas principais contendo alqueno, estruturas principais de sulfamato, estruturas principais de metilenoi- mino e metilenoidrazino, estruturas principais de sulfonato e sulfona- mida, estruturas principais de amida e outras estruturas principais de tendo componentes mistos de N, O, S e CH2.
[00155] Em algumas modalidades, um filamento senso de um agen- te RNAi de APOC3 pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações de fosforoti-
oato, um filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações de fosforotioato, ou ambos o filamento senso e o filamento antissenso independentemente podem conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações de fosforotioato. Em algumas modalidades, um filamento senso de um agente RNAi de APOC3 pode conter 1, 2, 3 ou 4 ligações de fosforotioato, um filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 pode conter 1, 2, 3 ou 4 ligações de fosforotioato, ou ambos o filamento senso e o filamento antissenso independentemente podem conter 1, 2, 3 ou 4 ligações de fosforotioato.
[00156] Em algumas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 contém pelo menos duas ligações internucleosídicas de fosforotioato. Em algumas modalidades, pelo menos duas ligações internucleosídicas de fosforotioato estão entre os nucleotídeos nas po- sições 1-3 a partir da extremidade 3' do filamento senso. Em algumas modalidades, uma ligação internucleosídica de fosforotioato está na extremidade 5’ do filamento senso, e uma outra ligação de fosforotioa- to está na extremidade 3’ do filamento senso. Em algumas modalida- des, duas ligações internucleosídicas de fosforotioato estão localiza- das na extremidade 5’ do filamento senso, e uma outra ligação de fos- forotioato está na extremidade 3’ do filamento senso. Em algumas mo- dalidades, o filamento senso não inclui qualquer ligação internucleosí- dica de fosforotioato entre os nucleotídeos, mas contém uma, duas ou três ligações de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais em am- bas as extremidades 5' e 3' e os caps terminais do resíduo invertido abásico opcionalmente presentes. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado ao filamento senso via uma ligação fosforo- tioato.
[00157] Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 contém quatro ligações internucleosídicas de fosforotioato. Em algumas modalidades, as quatro ligações internu-
cleosídicas de fosforotioato estão entre os nucleotídeos nas posições 1-3 a partir da extremidade 5' do filamento antissenso e entre os nu- cleotídeos nas posições 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25 ou 24-26 a partir da extremidade 5'. Em algumas modalidades, três ligações inter- nucleosídicas de fosforotioato estão localizadas entre as posições 1-4 a partir da extremidade 5' do filamento antissenso, e uma quarta liga- ção internucleosídica de fosforotioato está localizada entre as posições 20-21 a partir da extremidade 5' do filamento antissenso. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 contém pelo menos três ou quatro ligações internucleosídicas de fosforotioato no filamento antis- senso.
[00158] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 con- tém um ou mais nucleotídeos modificados e uma ou mais ligações in- ternucleosídicas modificadas. Em algumas modalidades, um nucleosí- deo 2'-modificado é combinado com ligação internucleosídica modifi- cada. Agentes RNAi de APOC3
[00159] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 di- vulgados no presente documento direcionam um gene de APOC3 em ou próximo das posições do gene APOC3 mostrado na tabela 1. Em algumas modalidades, o filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento inclui uma sequência de extensão nuclear que é totalmente, substancialmente ou pelo menos parcialmente complementar a uma sequência 19-mer APOC3 alvo di- vulgada na tabela 1.
Tabela 1. Sequências-alvo de mRNA de APOC3 19-mer (retiradas do transcrito da apolipoproteína C3 (APOC3) de homo sapiens, GenBank NM_000040.1 (SEQ ID NO: 1)). SEQ ID Sequências-alvo de APOC3 19-mer Posições corres- No. (5' → 3') pondentes na SEQ ID NO: 1 32 GGGACAGUAUUCUCAGUGC 438-456 33 CAAUAAAGCUGGACAAGAA 506-524 34 UUAAAAGGGACAGUAUUCU 432-450 35 CGGGUACUCCUUGUUGUUG 56-74 36 GGUACUCCUUGUUGUUGCC 58-76 37 GCUGGGUGACCGAUGGCUU 228-246 38 GACCGAUGGCUUCAGUUCC 235-253 39 GCUUCAGUUCCCUGAAAGA 243-261 40 UCAGUUCCCUGAAAGACUA 246-264 41 GACUACUGGAGCACCGUUA 260-278 42 ACUACUGGAGCACCGUUAA 261-279 43 GCACCGUUAAGGACAAGUU 270-288 44 ACCGUUAAGGACAAGUUCU 272-290 45 CCGUUAAGGACAAGUUCUC 273-291 46 CCUCAAUACCCCAAGUCCA 349-367 47 AAAAGGGACAGUAUUCUCA 434-452 48 AGGGACAGUAUUCUCAGUG 437-455
[00160] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 in- clui um filamento antissenso em que a posição 19 do filamento antis- senso (5'  3') é capaz de formar um par de base com a posição 1 de uma sequência alvo 19-mer divulgada na tabela 1. Em algumas moda- lidades, um agente RNAi de APOC3 inclui um filamento antissenso em que a posição 1 do filamento antissenso (5' 3') é capaz de formar um par de base com a posição 1 da sequência alvo 19-mer divulgada na tabela 1.
[00161] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 in- clui um filamento antissenso em que a posição 2 do filamento antis- senso (5'  3') é capaz de formar um par de base com a posição 18 da sequência alvo 19-mer divulgada na tabela 1. Em algumas modali- dades, um agente RNAi de APOC3 inclui um filamento antissenso em que as posições 2 até 18 do filamento antissenso (5'  3') são capa- zes de formar pares de base com cada uma das respectivas bases complementares localizadas nas posições 18 até 2 da sequência alvo 19-mer divulgada na tabela 1.
[00162] Para os agentes RNAi divulgados no presente documento, o nucleotídeo na posição 1 do filamento antissenso (da extremidade 5' a extremidade 3') pode ser perfeitamente complementar ao gene APOC3 ou pode ser não complementar ao gene APOC3. Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 do filamento antissenso (da extremidade 5’ -> extremidade 3’) é uma U, A ou dT. Em algumas mo- dalidades, o nucleotídeo na posição 1 do filamento antissenso (da ex- tremidade 5'  extremidade 3') forma um par de base A:U ou U:A com o filamento senso.
[00163] Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5'  extremidade 3') 2-18 ou 2-19 de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4. Em algumas modalidades, um filamento senso do RNAi de APOC3 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5’ -> ex- tremidade 3’) 1-17, 1-18 ou 2-18 de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5.
[00164] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é compreendido de (i) um filamento antissenso compreendendo a se- quência de nucleotídeos (da extremidade 5’ -> extremidade 3’) 2-18 ou 2-19 de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na ta-
bela 2, tabela 3, ou tabela 4, e (ii) um filamento senso compreendendo a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5'  extremidade 3') 1- 17 ou 1-18 de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5.
[00165] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 in- cluem sequências nucleotídicas nucleares 19-mer na tabela 2 que se- gue.
Tabela 2. Sequências base da extensão nuclear senso e antissenso do agente RNAi de APOC3 (N=qualquer nucleo- base). SEQ ID Sequência de base do filamento an- SEQ ID Sequência de base do filamento sen- Posições No. tissenso No. so correspon- (5′ → 3′) (5′ → 3′) dentes na (Mostrada como uma sequência nu- (Mostrada como uma sequência nu- SEQ ID NO: 1 cleotídica não modificada) cleotídica não modificada) 49 UCACUGAGAAUACUGUCCC 114 GGGACAGUAUUCUCAGUGA 438-456 49 UCACUGAGAAUACUGUCCC 115 GGGACAGUAUUCUCAGUIA 438-456
80/223 50 GCACUGAGAAUACUGUCCC 116 GGGACAGUAUUCUCAGUGC 438-456 51 NCACUGAGAAUACUGUCCC 117 GGGACAGUAUUCUCAGUGN 438-456 52 NCACUGAGAAUACUGUCCN 118 NGGACAGUAUUCUCAGUGN 438-456 53 UUCUUGUCCAGCUUUAUUG 119 CAAUAAAGCUGGACAAGAA 506-524 53 UUCUUGUCCAGCUUUAUUG 120 CAAUAAAICUGGACAAGAA 506-524 54 NUCUUGUCCAGCUUUAUUG 121 CAAUAAAGCUGGACAAGAN 506-524 55 NUCUUGUCCAGCUUUAUUN 122 NAAUAAAGCUGGACAAGAN 506-524 56 UGAAUACUGUCCCUUUUAA 123 UUAAAAGGGACAGUAUUCA 432-450 57 AGAAUACUGUCCCUUUUAA 124 UUAAAAGGGACAGUAUUCU 432-450 58 AGAAUACUGUCCCUUUUAG 125 CUAAAAGGGACAGUAUUCU 432-450 59 NGAAUACUGUCCCUUUUAA 126 UUAAAAGGGACAGUAUUCN 432-450
SEQ ID Sequência de base do filamento an- SEQ ID Sequência de base do filamento sen- Posições No. tissenso No. so correspon- (5′ → 3′) (5′ → 3′) dentes na (Mostrada como uma sequência nu- (Mostrada como uma sequência nu- SEQ ID NO: 1 cleotídica não modificada) cleotídica não modificada) 60 NGAAUACUGUCCCUUUUAG 127 CUAAAAGGGACAGUAUUCN 432-450 61 NGAAUACUGUCCCUUUUAN 128 NUAAAAGGGACAGUAUUCN 432-450 62 UAACAACAAGGAGUACCCG 129 CGGGUACUCCUUGUUGUUA 56-74 63 CAACAACAAGGAGUACCCG 130 CGGGUACUCCUUGUUGUUG 56-74
81/223 64 NAACAACAAGGAGUACCCG 131 CGGGUACUCCUUGUUGUUN 56-74 65 NAACAACAAGGAGUACCCN 132 NGGGUACUCCUUGUUGUUN 56-74 66 UGCAACAACAAGGAGUACC 133 GGUACUCCUUGUUGUUGCA 58-76 67 GGCAACAACAAGGAGUACC 134 GGUACUCCUUGUUGUUGCC 58-76 68 NGCAACAACAAGGAGUACC 135 GGUACUCCUUGUUGUUGCN 58-76 69 NGCAACAACAAGGAGUACN 136 NGUACUCCUUGUUGUUGCN 58-76 70 UAGCCAUCGGUCACCCAGC 137 GCUGGGUGACCGAUGGCUA 228-246 71 AAGCCAUCGGUCACCCAGC 138 GCUGGGUGACCGAUGGCUU 228-246 72 NAGCCAUCGGUCACCCAGC 139 GCUGGGUGACCGAUGGCUN 228-246 73 NAGCCAUCGGUCACCCAGN 140 NCUGGGUGACCGAUGGCUN 228-246 74 UGAACUGAAGCCAUCGGUC 141 GACCGAUGGCUUCAGUUCA 235-253
SEQ ID Sequência de base do filamento an- SEQ ID Sequência de base do filamento sen- Posições No. tissenso No. so correspon- (5′ → 3′) (5′ → 3′) dentes na (Mostrada como uma sequência nu- (Mostrada como uma sequência nu- SEQ ID NO: 1 cleotídica não modificada) cleotídica não modificada) 75 GGAACUGAAGCCAUCGGUC 142 GACCGAUGGCUUCAGUUCC 235-253 76 NGAACUGAAGCCAUCGGUC 143 GACCGAUGGCUUCAGUUCN 235-253 77 NGAACUGAAGCCAUCGGUN 144 NACCGAUGGCUUCAGUUCN 235-253 78 UCUUUCAGGGAACUGAAGC 145 GCUUCAGUUCCCUGAAAGA 243-261
82/223 79 NCUUUCAGGGAACUGAAGC 146 GCUUCAGUUCCCUGAAAGN 243-261 80 NCUUUCAGGGAACUGAAGN 147 NCUUCAGUUCCCUGAAAGN 243-261 81 UAGUCUUUCAGGGAACUGA 148 UCAGUUCCCUGAAAGACUA 246-264 82 NAGUCUUUCAGGGAACUGA 149 UCAGUUCCCUGAAAGACUN 246-264 83 NAGUCUUUCAGGGAACUGN 150 NCAGUUCCCUGAAAGACUN 246-264 84 UAACGGUGCUCCAGUAGUC 151 GACUACUGGAGCACCGUUA 260-278 85 NAACGGUGCUCCAGUAGUC 152 GACUACUGGAGCACCGUUN 260-278 86 NAACGGUGCUCCAGUAGUN 153 NACUACUGGAGCACCGUUN 260-278 87 UUAACGGUGCUCCAGUAGU 154 ACUACUGGAGCACCGUUAA 261-279 88 NUAACGGUGCUCCAGUAGU 155 ACUACUGGAGCACCGUUAN 261-279 89 NUAACGGUGCUCCAGUAGN 156 NCUACUGGAGCACCGUUAN 261-279
SEQ ID Sequência de base do filamento an- SEQ ID Sequência de base do filamento sen- Posições No. tissenso No. so correspon- (5′ → 3′) (5′ → 3′) dentes na (Mostrada como uma sequência nu- (Mostrada como uma sequência nu- SEQ ID NO: 1 cleotídica não modificada) cleotídica não modificada) 90 UACUUGUCCUUAACGGUGC 157 GCACCGUUAAGGACAAGUA 270-288 91 AACUUGUCCUUAACGGUGC 158 GCACCGUUAAGGACAAGUU 270-288 92 NACUUGUCCUUAACGGUGC 159 GCACCGUUAAGGACAAGUN 270-288 93 NACUUGUCCUUAACGGUGN 160 NCACCGUUAAGGACAAGUN 270-288
83/223 94 UGAACUUGUCCUUAACGGU 161 ACCGUUAAGGACAAGUUCA 272-290 95 AGAACUUGUCCUUAACGGU 162 ACCGUUAAGGACAAGUUCU 272-290 96 NGAACUUGUCCUUAACGGU 163 ACCGUUAAGGACAAGUUCN 272-290 97 NGAACUUGUCCUUAACGGN 164 NCCGUUAAGGACAAGUUCN 272-290 98 UAGAACUUGUCCUUAACGG 165 CCGUUAAGGACAAGUUCUA 273-291 99 GAGAACUUGUCCUUAACGG 166 CCGUUAAGGACAAGUUCUC 273-291 100 NAGAACUUGUCCUUAACGG 167 CCGUUAAGGACAAGUUCUN 273-291 101 NAGAACUUGUCCUUAACGN 168 NCGUUAAGGACAAGUUCUN 273-291 102 UGGACUUGGGGUAUUGAGG 169 CCUCAAUACCCCAAGUCCA 349-367 103 NGGACUUGGGGUAUUGAGG 170 CCUCAAUACCCCAAGUCCN 349-367 104 NGGACUUGGGGUAUUGAGN 171 NCUCAAUACCCCAAGUCCN 349-367
SEQ ID Sequência de base do filamento an- SEQ ID Sequência de base do filamento sen- Posições No. tissenso No. so correspon- (5′ → 3′) (5′ → 3′) dentes na (Mostrada como uma sequência nu- (Mostrada como uma sequência nu- SEQ ID NO: 1 cleotídica não modificada) cleotídica não modificada) 105 UGAGAAUACUGUCCCUUUU 172 AAAAGGGACAGUAUUCUCA 434-452 106 UGAGAAUACUGUCCCUUUG 173 CAAAGGGACAGUAUUCUCA 434-452 107 NGAGAAUACUGUCCCUUUU 174 AAAAGGGACAGUAUUCUCN 434-452 108 NGAGAAUACUGUCCCUUUG 175 CAAAGGGACAGUAUUCUCN 434-452
84/223 109 NGAGAAUACUGUCCCUUUN 176 NAAAGGGACAGUAUUCUCN 434-452 110 UACUGAGAAUACUGUCCCU 177 AGGGACAGUAUUCUCAGUA 437-455 111 CACUGAGAAUACUGUCCCU 178 AGGGACAGUAUUCUCAGUG 437-455 112 NACUGAGAAUACUGUCCCU 179 AGGGACAGUAUUCUCAGUN 437-455 113 NACUGAGAAUACUGUCCCN 180 NGGGACAGUAUUCUCAGUN 437-455
[00166] Os filamentos senso e antissenso do agente RNAi de APOC3 que compreendem ou consistem das sequências nucleotídicas na tabela 2 podem ser nucleotídeos modificados ou nucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os agentes RNAi de APOC3 tendo as sequências do filamento senso e filamento antissenso que compreendem ou consistem das sequências nucleotídicas na tabela 2 são todos ou substancialmente todos nucleotídeos modificados.
[00167] Em algumas modalidades, o filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos a partir de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 2. Em algumas modalidades, o filamen- to senso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos a partir de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2.
[00168] Conforme usado no presente documento, cada N listado em uma sequência divulgada na tabela 2 pode ser independentemente selecionado a partir de qualquer uma e todas as nucleobases (incluin- do aquelas encontradas em ambos os nucleotídeos modificados e nu- cleotídeos não modificados). Em algumas modalidades, um nucleotí- deo N listado em uma sequência divulgada na tabela 2 tem uma nu- cleobase que é complementar ao nucleotídeo N na posição corres- pondente no outro filamento. Em algumas modalidades, um nucleotí- deo N listado em uma sequência divulgada na tabela 2 tem uma nu- cleobase que não é complementar ao nucleotídeo N na posição cor- respondente no outro filamento. Em algumas modalidades, um nucleo- tídeo N listado em uma sequência divulgada na tabela 2 tem uma nu- cleobase que é a mesma que o nucleotídeo N na posição correspon- dente no outro filamento. Em algumas modalidades, um nucleotídeo N listado em uma sequência divulgada na tabela 2 tem uma nucleobase que é diferente do nucleotídeo N na posição correspondente no outro filamento.
[00169] Certos filamentos antissenso do agente RNAi de APOC3, assim como as suas sequências de nucleobase não modificadas sub- jacentes, são providos nas Tabelas 3 e 4. Certos filamentos senso do agente RNAi de APOC3, assim como as suas sequências de nucleo- base não modificadas subjacentes, são providos nas Tabelas 3 e 5. Na formação dos agentes RNAi de APOC3, cada um dos nucleotídeos em cada uma das sequências de base subjacentes listadas nas tabe- las 3, 4 e 5, assim como na tabela 2, acima, podem ser um nucleotí- deo modificado.
[00170] Os agentes RNAi de APOC3 descritos no presente docu- mento são formados através do anelamento de um filamento antissen- so com um filamento senso. Um filamento senso contendo uma se- quência listada na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5, pode ser hibridizado a qualquer filamento antissenso contendo uma sequência listada na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4, contanto que as duas sequências te- nham uma região de pelo menos 85% de complementariedade sobre uma sequência nucleotídeo contígua 16, 17, 18, 19, 20 ou 21.
[00171] Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende uma sequência nucleotídica de qualquer uma das sequências na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4.
[00172] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em um dúplex tendo as sequências de nu- cleobase do filamento senso e o filamento antissenso de qualquer uma das sequências na tabela 2, tabela 3, tabela 4 ou tabela 5.
[00173] Exemplos de filamentos antissenso contendo nucleotídeos modificados são providos na Tabela 4. Exemplos de filamentos senso contendo nucleotídeos modificados são providos na Tabela 5. Os exemplos adicionais de filamentos antissenso e filamentos senso con- tendo nucleotídeos modificados são providos na Tabela 3.
[00174] Conforme usado nas tabelas 3, 4 e 5, as notações que se- guem são usadas para indicar nucleotídeos modificados, grupos de direcionamento e grupos de ligação: A = adenosina-3'-fosfato; C = citidina-3 '-fosfato; G = guanosina-3 '-fosfato; U = uridina-3'-fosfato I = inosina-3 '-fosfato n = qualquer nucleotídeo modificado 2’-OMe a = 2'-0-metiladenosina-3'-fosfato as = 2'-0-metiladenosina-3'-fosforotioato c = 2'-0-metilcitidina-3'-fosfato cs = 2'-0-metilcitidina-3'-fosforotioato g = 2'-0-metilguanosina-3 '-fosfato gs = 2'-0-metilguanosina-3'-fosforotioato t = 2'-0-metil-5-metiluridina-3'-fosfato ts = 2'-0-metil-5-metiluridina-3'-fosforotioato u = 2'-0-metiluridina-3 '-fosfato us = 2'-0-metiluridina-3'-fosforotioato i = 2'-0-metilinosina-3 '-fosfato is = 2'-0-metilinosina-3'-fosforotioato Nf = qualquer nucleotídeo 2’-fluoro modificado Af = 2'-fluoroadenosina-3 '-fosfato Afs = 2'-fluoroadenosina-3'-fosforotioato Cf = 2'-fluorocitidina-3 '-fosfato Cfs = 2'-fluorocitidina-3'-fosforotioato Gf = 2'-fluoroguanosina-3 '-fosfato Gfs = 2'-fluoroguanosina-3'-fosforotioato If = 2'-fluoroinosina-3'-fosfato Ifs = 2'-fluoroinosina-3'-fosforotioato
Tf = 2'-fluoro-5'-metiluridina-3 '-fosfato Tfs = 2'-fluoro-5'-metiluridina-3'-fosforotioato Uf = 2'-fluorouridina-3 '-fosfato Ufs = 2'-fluorouridina-3'-fosforotioato dN = qualquer 2'-desoxirribonucleotídeo dA = 2'-desoxiadenosina-3 '-fosfato dAs = 2'-desoxiadenosina-3'-fosforotioato dC = 2'-desoxicitidina-3'-fosfato dCs = 2'-desoxicitidina-3'-fosforotioato dG = 2'-desoxiguanosina-3'-fosfato dGs = 2'-desoxiguanosina-3'-fosforotioato dT = 2'-desoxitimidina-3'-fosfato dTs = 2'-desoxitimidina-3'-fosforotioato dU = 2'-desoxiuridina-3 '-fosfato dUs = 2'-desoxiuridina-3'-fosforotioato NUNA = imitadores de nucleotídeo 2',3'-seco (análogos desblo- queados de nucleobase)-3'-fosfato NUNAS = imitadores de nucleotídeo 2',3'-seco (análogos desblo- queados de nucleobase)-3'-fosforotioato AUNA = 2',3'-seco-adenosina-3'-fosfato AUNAS = 2',3'-seco-adenosina-3'-fosforotioato CUNA = 2',3'-seco-citidina-3'-fosfato CUNAS = 2',3'-seco-citidina-3'-fosforotioato GUNA = 2',3'-seco-guanosina-3'-fosfato GUNAS = 2',3'-seco-guanosina-3'-fosforotioato UUNA = 2',3'-seco-uridina-3'-fosfato UUNAS = 2',3'-seco-uridina-3'-fosforotioato a_2N = vide a tabela 7 a_2Ns = vide a tabela 7 pu_2N = vide a tabela 7 pu_2Ns = vide a tabela 7 NLNA = nucleotídeo bloqueado NfANA = nucleotídeo 2'-F-Arabino NM = 2'-0-metoxietil nucleotídeo AM = 2'-0-metoxietiladenosina-3 '-fosfato AMs = 2'-0-metoxietiladenosina-3'-fosforotioato GM = 2'-0-metoxietilguanosina-3 '-fosfato GMs = 2'-0-metoxietilguanosina-3'-fosforotioato TM = 2'-0-metoxietiltimidina-3 '-fosfato TMs = 2'-0-metoxietiltimidina-3'-fosforotioato mCM = vide a tabela 7 mCMs = vide a tabela 7 R = ribitol (invdN) = qualquer desoxirribonucleotídeo invertido (nucleotídeo ligado 3'-3') (invAb) = desoxirribonucleotídeo abásico invertido (ligado 3'-3'), vide a tabela 7 (invAb)s = desoxirribonucleotídeo-5’-fosforotioato abásico invertido (ligado 3'-3'), vide a tabela 7 (invn) = qualquer nucleotídeo 2'-OMe invertido (nucleotídeo li- gado 3'-3') s = ligação de fosforotioato sp = vide a tabela 7 D2u = vide a tabela 7 pD2u = vide a tabela 7 vpdN = vinil fosfonato desoxirribonucleotídeo (5Me-Nf) = 5'-Me, 2'-fluoronucleotídeo cPrp = ciclopropil fosfonato, vide a tabela 7 epTcPr = vide a tabela 7 epTM = vide a tabela 7
[00175] Como o versado na técnica prontamente compreenderia, a menos que indicado de outra forma pela sequência (tal como, por exemplo, por uma ligação fosforotioato "s"), quando presente em um oligonucleotídeo, os monômeros do nucleotídeo são mutuamente liga- dos por ligações 5'-3'-fosfodiéster. Como o versado na técnica clara- mente compreenderia, a inclusão de uma ligação fosforotioato confor- me mostrada na sequência nucleotídica modificada divulgada no pre- sente documento substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (vide, por exemplo, Figs. 1A até 1I mostrando todas as ligações internucleosídicas). Além disso, o versado na técnica prontamente compreenderia que o nucleotídeo terminal na extremida- de 3’ de uma dada sequência oligonucleotídica tipicamente teria um grupo hidroxila (-OH) na respectiva posição 3' do dado monômero em vez de uma porção fosfato ex vivo. Além do mais, como o versado na técnica prontamente compreenderia, enquanto as estruturas químicas de fosforotioato apresentadas no presente documento tipicamente mostram o ânion no átomo de enxofre, as invenções divulgadas no presente documento abrangem todos os tautômeros e/ou diastereôme- ros de fosforotioato (por exemplo, onde o átomo de enxofre tem uma ligação dupla e o ânion é um átomo de oxigênio). A menos que indica- do expressamente de outra forma no presente documento, os referidos entendimentos do versado na técnica são usados quando se descre- vem os agentes RNAi de APOC3 e as composições dos agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente documento.
[00176] Certos exemplos de grupos de direcionamento e grupos de ligação usados com os agentes RNAi APOC3 divulgados no presente documento são providos abaixo na tabela 7. Mais especificamente, os grupos de direcionamento e grupos de ligação incluem os que se- guem, para os quais as suas estruturas químicas são providas abaixo na tabela 7: (PAZ), (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s,
(NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s . Cada filamento senso e/ou filamento antissenso pode ter qualquer grupo de direcionamento ou grupo de ligação listado no presente documento, assim como outros grupos de direcionamento ou grupos de ligação, conjugados na extremidade 5' e/ou 3' da se- quência.
Tabela 3. Dúplices de filamento senso e filamento antissenso modificado do agente RNAi de APOC3 DÚPLEX ID SEQ ID Sequência antissenso SEQ ID Sequência senso NO.: NO. (5' → 3') NO. (5' → 3') 56_1 181 uAfaCfaAfcAfAfGfgAfgUfaCfcCfguu 246 cgGfgUfaCfUfCfcUfuGfuUfgUfuauu 56_2 182 uAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcCfguu 247 cggguaCfUfCfcuuguuguuauu 56_3 183 uAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcCfggu 248 ccggguaCfUfCfcuuguuguua 56_4 184 uAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcCfggg 249 cccggguaCfUfCfcuuguuguua 56_5 185 uAfaCfaAfcaaggAfgUfaCfcCfggg 250 cccggguaCfUfCfcuuguuguua 58_1 186 uGfcAfaCfaAfCfAfaGfgAfgUfaCfcuu 251 ggUfaCfuCfCfUfuGfuUfgUfuGfcauu
92/223 58_2 187 uGfcAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcuu 252 gguacuCfCfUfuguuguugcauu 58_3 188 uGfcAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfccu 253 ggguacuCfCfUfuguuguugca 58_4 189 uGfcAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfccg 254 cggguacuCfCfUfuguuguugca 58_5 190 uGfcAfaCfaacaaGfgAfgUfaCfccg 255 cggguacuCfCfUfuguuguugca 228_1 191 uAfgCfcAfuCfGfGfuCfaCfcCfaGfcuu 256 gcUfgGfgUfGfAfcCfgAfuGfgCfuauu 228_2 192 uAfgCfcAfuCfgGfuCfaCfcCfaGfcuu 257 gcugggUfGfAfccgauggcuauu 228_3 193 uAfgCfcAfuCfgGfuCfaCfcCfaGfccu 258 ggcugggUfGfAfccgauggcua 228_4 194 uAfgCfcAfuCfgGfuCfaCfcCfaGfccc 259 gggcugggUfGfAfccgauggcua 228_5 195 uAfgCfcAfucgguCfaCfcCfaGfccc 260 gggcugggUfGfAfccgauggcua 235_1 196 uGfaAfcUfgAfAfGfcCfaUfcGfgUfcuu 261 gaCfcGfaUfGfGfcUfuCfaGfuUfcauu
DÚPLEX ID SEQ ID Sequência antissenso SEQ ID Sequência senso NO.: NO. (5' → 3') NO. (5' → 3') 235_2 197 uGfaAfcUfgAfaGfcCfaUfcGfgUfcuu 262 gaccgaUfGfGfcuucaguucauu 235_3 198 uGfaAfcUfgAfaGfcCfaUfcGfgUfcau 263 ugaccgaUfGfGfcuucaguuca 235_4 199 uGfaAfcUfgAfaGfcCfaUfcGfgUfcac 264 gugaccgaUfGfGfcuucaguuca 235_5 200 uGfaAfcUfgaagcCfaUfcGfgUfcac 265 gugaccgaUfGfGfcuucaguuca 243_1 201 uCfuUfuCfaGfGfGfaAfcUfgAfaGfcuu 266 gcUfuCfaGfUfUfcCfcUfgAfaAfgauu 243_2 202 uCfuUfuCfaGfgGfaAfcUfgAfaGfcuu 267 gcuucaGfUfUfcccugaaagauu 243_3 203 uCfuUfuCfaGfgGfaAfcUfgAfaGfccu 268 ggcuucaGfUfUfcccugaaaga
93/223 243_4 204 uCfuUfuCfaGfgGfaAfcUfgAfaGfcca 269 uggcuucaGfUfUfcccugaaaga 243_5 205 uCfuUfuCfagggaAfcUfgAfaGfcca 270 uggcuucaGfUfUfcccugaaaga 260_1 206 uAfaCfgGfuGfCfUfcCfaGfuAfgUfcuu 271 gaCfuAfcUfGfGfaGfcAfcCfgUfuauu 260_2 207 uAfaCfgGfuGfcUfcCfaGfuAfgUfcuu 272 gacuacUfGfGfagcaccguuauu 260_3 208 uAfaCfgGfuGfcUfcCfaGfuAfgUfcuu 273 agacuacUfGfGfagcaccguua 260_4 209 uAfaCfgGfuGfcUfcCfaGfuAfgUfcuu 274 aagacuacUfGfGfagcaccguua 260_5 210 uAfaCfgGfugcucCfaGfuAfgUfcuu 275 aagacuacUfGfGfagcaccguua 261_1 211 uUfaAfcGfgUfGfCfuCfcAfgUfaGfuuu 276 acUfaCfuGfGfAfgCfaCfcGfuUfaauu 261_2 212 uUfaAfcGfgUfgCfuCfcAfgUfaGfuuu 277 acuacuGfGfAfgcaccguuaauu 261_3 213 uUfaAfcGfgUfgCfuCfcAfgUfaGfucu 278 gacuacuGfGfAfgcaccguuaa
DÚPLEX ID SEQ ID Sequência antissenso SEQ ID Sequência senso NO.: NO. (5' → 3') NO. (5' → 3') 261_4 214 uUfaAfcGfgUfgCfuCfcAfgUfaGfucu 279 agacuacuGfGfAfgcaccguuaa 261_5 215 uUfaAfcGfgugcuCfcAfgUfaGfucu 280 agacuacuGfGfAfgcaccguuaa 270_1 216 uAfcUfuGfuCfCfUfuAfaCfgGfuGfcuu 281 gcAfcCfgUfUfAfaGfgAfcAfaGfuauu 270_2 217 uAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcuu 282 gcaccgUfUfAfaggacaaguauu 270_3 218 uAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcuu 283 agcaccgUfUfAfaggacaagua 270_4 219 uAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcuc 284 gagcaccgUfUfAfaggacaagua 270_5 220 uAfcUfuGfuccuuAfaCfgGfuGfcuc 285 gagcaccgUfUfAfaggacaagua
94/223 272_1 221 uGfaAfcUfuGfUfCfcUfuAfaCfgGfuuu 286 acCfgUfuAfAfGfgAfcAfaGfuUfcauu 272_2 222 uGfaAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuuu 287 accguuAfAfGfgacaaguucauu 272_3 223 uGfaAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfugu 288 caccguuAfAfGfgacaaguuca 272_4 224 uGfaAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfugc 289 gcaccguuAfAfGfgacaaguuca 272_5 225 uGfaAfcUfuguccUfuAfaCfgGfugc 290 gcaccguuAfAfGfgacaaguuca 273_1 226 uAfgAfaCfuUfGfUfcCfuUfaAfcGfguu 291 ccGfuUfaAfGfGfaCfaAfgUfuCfuauu 273_2 227 uAfgAfaCfuUfgUfcCfuUfaAfcGfguu 292 ccguuaAfGfGfacaaguucuauu 273_3 228 uAfgAfaCfuUfgUfcCfuUfaAfcGfguu 293 accguuaAfGfGfacaaguucua 273_4 229 uAfgAfaCfuUfgUfcCfuUfaAfcGfgug 294 caccguuaAfGfGfacaaguucua 273_5 230 uAfgAfaCfuugucCfuUfaAfcGfgug 295 caccguuaAfGfGfacaaguucua
DÚPLEX ID SEQ ID Sequência antissenso SEQ ID Sequência senso NO.: NO. (5' → 3') NO. (5' → 3') 349_1 231 uGfgAfcUfuGfGfGfgUfaUfuGfaGfguu 296 ccUfcAfaUfAfCfcCfcAfaGfuCfcauu 349_2 232 uGfgAfcUfuGfgGfgUfaUfuGfaGfguu 297 ccucaaUfAfCfcccaaguccauu 349_3 233 uGfgAfcUfuGfgGfgUfaUfuGfaGfguu 298 accucaaUfAfCfcccaagucca 349_4 234 uGfgAfcUfuGfgGfgUfaUfuGfaGfguc 299 gaccucaaUfAfCfcccaagucca 349_5 235 uGfgAfcUfuggggUfaUfuGfaGfguc 300 gaccucaaUfAfCfcccaagucca 434_1 236 uGfaGfaAfuAfCfUfgUfcCfcUfuUfuuu 301 aaAfaGfgGfAfCfaGfuAfuUfcUfcauu 434_2 237 uGfaGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuuu 302 aaaaggGfAfCfaguauucucauu
95/223 434_3 238 uGfaGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuau 303 uaaaaggGfAfCfaguauucuca 434_4 239 uGfaGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuaa 304 uuaaaaggGfAfCfaguauucuca 434_5 240 uGfaGfaAfuacugUfcCfcUfuUfuaa 305 uuaaaaggGfAfCfaguauucuca 437_1 241 uAfcUfgAfgAfAfUfaCfuGfuCfcCfuuu 306 agGfgAfcAfGfUfaUfuCfuCfaGfuauu 437_2 242 uAfcUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfcCfuuu 307 agggacAfGfUfauucucaguauu 437_3 243 uAfcUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfcCfuuu 308 aagggacAfGfUfauucucagua 437_4 244 uAfcUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfcCfuuu 309 aaagggacAfGfUfauucucagua 437_5 245 uAfcUfgAfgaauaCfuGfuCfcCfuuu 310 aaagggacAfGfUfauucucagua
Tabela 4. Sequências do filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06203-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcusu 311 UACUUGUCCUUAACGGUGCUU 603 AM06204-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcusc 312 UACUUGUCCUUAACGGUGCUC 604 AM06205-AS asAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcusu 313 AACUUGUCCUUAACGGUGCUU 655 AM06210-AS usGfsgsAfcUfuGfgGfgUfaUfuGfaGfgusu 314 UGGACUUGGGGUAUUGAGGUU 610
96/223 AM06211-AS usGfsgsAfcUfuGfgGfgUfaUfuGfaGfgusc 315 UGGACUUGGGGUAUUGAGGUC 611 AM06214-AS usCfsusUfuCfaGfgGfaAfcUfgAfaGfcusu 316 UCUUUCAGGGAACUGAAGCUU 597 AM06215-AS usCfsusUfuCfaGfgGfaAfcUfgAfaGfccsu 317 UCUUUCAGGGAACUGAAGCCU 598 AM06218-AS usGfsasAfcUfgAfaGfcCfaUfcGfgUfcusu 318 UGAACUGAAGCCAUCGGUCUU 594 AM06219-AS usGfsasAfcUfgAfaGfcCfaUfcGfgUfcasc 319 UGAACUGAAGCCAUCGGUCAC 596 AM06262-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfugsg 320 UGAGAAUACUGUCCCUUUUGG 656 AM06263-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfugcsg 321 UGAGAAUACUGUCCCUUUUGCG 657 AM06266-AS usAfsasCfgGfuGfcUfcCfaGfuAfgUfcusu 322 UAACGGUGCUCCAGUAGUCUU 500 AM06267-AS usAfsasCfgGfuGfcUfcCfaGfuAfgUfcgsu 323 UAACGGUGCUCCAGUAGUCGU 658 AM06272-AS usAfscsUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfcCfuusu 324 UACUGAGAAUACUGUCCCUUU 615 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06273-AS usAfscsUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfcCfugsu 325 UACUGAGAAUACUGUCCCUGU 659 AM06276-AS usUfsasAfcGfgUfgCfuCfcAfgUfaGfucsu 326 UUAACGGUGCUCCAGUAGUCU 602 AM06277-AS usUfsasAfcGfgUfgCfuCfcAfgUfaGfgcsu 327 UUAACGGUGCUCCAGUAGGCU 660 AM06309-AS usAfsgsCfcAfuCfgGfuCfaCfcCfaGfcusu 328 UAGCCAUCGGUCACCCAGCUU 591 AM06310-AS asAfsgsCfcAfuCfgGfuCfaCfcCfaGfcusu 329 AAGCCAUCGGUCACCCAGCUU 661
97/223 AM06314-AS usAfsgsAfaCfuUfgUfcCfuUfaAfcGfgusu 330 UAGAACUUGUCCUUAACGGUU 608 AM06315-AS usAfsgsAfaCfuUfgUfcCfuUfaAfcGfgusg 331 UAGAACUUGUCCUUAACGGUG 609 AM06318-AS usGfsasAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuusu 332 UGAACUUGUCCUUAACGGUUU 65 AM06319-AS asGfsasAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuusu 333 AGAACUUGUCCUUAACGGUUU 662 AM06320-AS usGfsasAfcUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfugsc 334 UGAACUUGUCCUUAACGGUGC 607 AM06324-AS usGfscsAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcusu 335 UGCAACAACAAGGAGUACCUU 588 AM06325-AS usGfscsAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfccsg 336 UGCAACAACAAGGAGUACCCG 590 AM06328-AS usAfsasCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcCfgusu 337 UAACAACAAGGAGUACCCGUU 585 AM06330-AS usGfscsAfcUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfccusu 338 UGCACUGAGAAUACUGUCCCUU 663 AM06331-AS asGfscsAfcUfgAfgAfaUfaCfuGfuCfccusu 339 AGCACUGAGAAUACUGUCCCUU 664 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06469-AS cPrpusAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcusu 340 UACUUGUCCUUAACGGUGCUU 603 AM06471-AS asAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcusc 341 AACUUGUCCUUAACGGUGCUC 666 AM06472-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfugsc 342 UACUUGUCCUUAACGGUGC 667 AM06475-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcucsc 343 UACUUGUCCUUAACGGUGCUCC 668 AM06476-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcucusu 344 UACUUGUCCUUAACGGUGCUCUU 669
98/223 AM06477-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcuccsa 345 UACUUGUCCUUAACGGUGCUCCA 670 AM06478-AS asAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfugsc 346 AACUUGUCCUUAACGGUGC 671 AM06481-AS asAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcucsc 347 AACUUGUCCUUAACGGUGCUCC 672 AM06507-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuusu 348 UGAGAAUACUGUCCCUUUUUU 612 AM06509-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfugsu 349 UGAGAAUACUGUCCCUUUUGU 673 AM06511-AS usGfsaGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfugsg 350 UGAGAAUACUGUCCCUUUUGG 656 AM06513-AS asGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfugsg 351 AGAGAAUACUGUCCCUUUUGG 674 AM06514-AS usGfscsAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfsc 352 UGCAACAACAAGGAGUACC 675 AM06517-AS usGfscsAfaCfaacaaGfgAfgUfaCfccsu 353 UGCAACAACAAGGAGUACCCU 589 AM06518-AS usGfscsAfaCfaacaaGfgAfgUfaCfcusu 354 UGCAACAACAAGGAGUACCUU 588 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06519-AS usGfscsaacaAfcAfaGfgAfguaccusu 355 UGCAACAACAAGGAGUACCUU 588 AM06521-AS usGfcAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcusu 356 UGCAACAACAAGGAGUACCUU 588 AM06523-AS asGfscsAfaCfaAfcAfaGfgAfgUfaCfcusu 357 AGCAACAACAAGGAGUACCUU 676 AM06712-AS usCfsusGfaAfgccauCfgGfuCfaCfcCfsa 358 UCUGAAGCCAUCGGUCACCCA 677 AM06714-AS asCfsusGfaAfgccauCfgGfuCfaCfcCfsa 359 ACUGAAGCCAUCGGUCACCCA 678
99/223 AM06716-AS usGfsgsAfaCfugaagCfcAfuCfgGfuCfsa 360 UGGAACUGAAGCCAUCGGUCA 679 AM06718-AS usGfsgsAfaCfugaagCfcAfuCfgGfuCfsc 361 UGGAACUGAAGCCAUCGGUCC 680 AM06720-AS usUfscsUfuUfcagggAfaCfuGfaAfgCfsc 362 UUCUUUCAGGGAACUGAAGCC 681 AM06722-AS usUfsusAfaCfggugcUfcCfaGfuAfgUfsc 363 UUUAACGGUGCUCCAGUAGUC 682 AM06724-AS usCfscsUfuAfacgguGfcUfcCfaGfuAfsg 364 UCCUUAACGGUGCUCCAGUAG 683 AM06726-AS usUfscsCfuUfaacggUfgCfuCfcAfgUfsa 365 UUCCUUAACGGUGCUCCAGUA 684 AM06728-AS usUfscsCfuUfaacggUfgCfuCfcAfgUfsc 366 UUCCUUAACGGUGCUCCAGUC 685 AM06730-AS usAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcUfsc 367 UACUUGUCCUUAACGGUGCUC 604 AM06732-AS asAfscsUfuGfuCfcUfuAfaCfgGfuGfcsUfsc 368 AACUUGUCCUUAACGGUGCUC 666 AM06734-AS usUfsgsAfgGfucucaGfgCfaGfcCfaCfsu 369 UUGAGGUCUCAGGCAGCCACU 686 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06736-AS usUfsasUfuGfaGfgUfcUfcAfgGfcAfgCfsc 370 UUAUUGAGGUCUCAGGCAGCC 687 AM06738-AS usGfsusAfuUfgAfgGfuCfuCfaGfgCfaGfsc 371 UGUAUUGAGGUCUCAGGCAGC 688 AM06740-AS usCfsasCfuGfaGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfsu 372 UCACUGAGAAUACUGUCCCUU 689 AM06741-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsu 373 UCACUGAGAAUACUGUCCCUU 689 AM06743-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu 4 UCACUGAGAAUACUGUCCCGU 5
100/223 AM06745-AS usCfsusUfuUfaAfgCfaAfcCfuAfcAfgGfsg 374 UCUUUUAAGCAACCUACAGGG 690 AM06780-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfucsc 375 UGAGAAUACUGUCCCUUUUCC 691 AM06783-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 2 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM06784-AS usUfsasUfuGfaggucUfcAfgGfcAfgCfsc 376 UUAUUGAGGUCUCAGGCAGCC 687 AM06786-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc 13 UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC 14 AM06862-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuCfsc 377 UGAGAAUACUGUCCCUUUUCC 691 AM06865-AS usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfucsu 378 UGAGAAUACUGUCCCUUUUCU 692 AM06868-AS usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsg 379 UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG 693 AM06870-AS usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc 7 UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC 8 AM06872-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaAfsg 380 UAGUCUUUCAGGGAACUGAAG 694 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM06874-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaAfsc 381 UAGUCUUUCAGGGAACUGAAC 695 AM06876-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc 11 AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC 12 AM06908-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcusu 382 UCACUGAGAAUACUGUCCCUU 689 AM06928-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfgusu 383 UCACUGAGAAUACUGUCCGUU 696 AM06951-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaCfsg 384 UAGUCUUUCAGGGAACUGACG 697
101/223 AM06953-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaGfsg 385 UAGUCUUUCAGGGAACUGAGG 698 AM06956-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaCfsc 386 UAGUCUUUCAGGGAACUGACC 699 AM06958-AS usAfsgsUfcUfuUfcAfgGfgAfaCfuGfaGfsc 387 UAGUCUUUCAGGGAACUGAGC 700 AM06961-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsc 388 AGAAUACUGUCCCUUUUAGGC 701 AM06963-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsg 389 AGAAUACUGUCCCUUUUAAGG 702 AM06988-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg 9 AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG 10 AM07179-AS usGfscsAfaCfAUNAacaaGfgAfgUfaCfccsu 390 UGCAACAACAAGGAGUACCCU 589 AM07182-AS usAfsgsUfcUfUUNAUfcAfgGfgAfaCfuGfaAfsg 391 UAGUCUUUCAGGGAACUGAAG 694 AM07185-AS asGfsasAfuAfCUNAUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc 392 AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC 12 AM07188-AS usGfsasGfaAfUUNAAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc 393 UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC 14 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM07190-AS usCfsasCfuGfAUNAgaauAfcUfgUfcCfcUfsc 394 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07193-AS usUfscsUfuGfUUNACfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc 395 UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC 8 AM07518-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsu 396 AGAAUACUGUCCCUUUUAGGU 707 AM07520-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfcGfsc 397 AGAAUACUGUCCCUUUUACGC 708 AM07522-AS asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgAfsc 398 AGAAUACUGUCCCUUUUAGAC 709
102/223 AM07524-AS usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 6 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07600-AS asGfsasauacugucCfcUfuUfuAfgGfsc 399 AGAAUACUGUCCCUUUUAGGC 701 AM07645-AS usUfscsuuguccagCfuUfuAfuUfgGfsc 400 UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC 8 AM07750-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsg 401 UCACUGAGAAUACUGUCCCUG 710 AM07753-AS usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcCfsu 402 UCACUGAGAAUACUGUCCCCU 711 AM07755-AS usCfsAUNAsCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 403 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07756-AS usCfsasCUNAuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 404 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07757-AS usCfsasCfUUNAGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 405 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07758-AS usCfsasCfuGUNAagaauAfcUfgUfcCfcUfsc 406 UCACUGAGAAUACUGUCCCUC 3 AM07760-AS asGfsusGfcAfuccuuGfgCfgGfuCfuusu 407 AGUGCAUCCUUGGCGGUCUUU 712 filamento an- filamento antissenso modificado SEQ ID Sequência de base subjacente SEQ ID tissenso ID: (5′ → 3′) NO. (5′ → 3′) NO. (mostrada como uma sequência nu- cleotídica modificada) AM07762-AS asGfsusGfcAfUUNAccuuGfgCfgGfuCfuusu 408 AGUGCAUCCUUGGCGGUCUUU 712 AM07764-AS asGfsusAfgUfcuuucAfgGfgAfaCfuGfsa 409 AGUAGUCUUUCAGGGAACUGA 713 AM07765-AS asGfsusAfgUfCUNAuuucAfgGfgAfaCfuGfsa 410 AGUAGUCUUUCAGGGAACUGA 713 AM07767-AS usGfsusAfgUfcuuucAfgGfgAfaCfuGfsa 411 UGUAGUCUUUCAGGGAACUGA 714 AM07769-AS usCfsusUfaAfcggugCfuCfcAfgUfaGfsu 412 UCUUAACGGUGCUCCAGUAGU 715
103/223 AM07771-AS usCfscsUfuUfuaagcAfaCfcUfaCfaGfsg 413 UCCUUUUAAGCAACCUACAGG 716 AM07773-AS usCfscsUfuUfuaagcAfaCfcUfaCfaGfsc 414 UCCUUUUAAGCAACCUACAGC 717 AM07775-AS usAfsgsUfcUfuucagGfgAfaCfuGfaCfsc 415 UAGUCUUUCAGGGAACUGACC 699
Tabela 5. Sequências do filamento senso do agente RNAi de APOC3 Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06206-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccgUfUfAfaggacaaguauus(invAb) 416 GCACCGUUAAGGACAAGUAUU 718 AM06207-SS (NAG37)s(invAb)sgagcaccgUfUfAfaggacaagus(invdA) 417 GAGCACCGUUAAGGACAAGUA 719 AM06208-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccgUfUfAfaggacaagus(invdA) 418 GCACCGUUAAGGACAAGUA 720 AM06209-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccgUfUfAfaggacaaguus(invAb) 419 GCACCGUUAAGGACAAGUU 721
104/223 AM06212-SS (NAG37)s(invAb)sccucaaUfAfCfcccaaguccs(invdA) 420 CCUCAAUACCCCAAGUCCA 722 AM06213-SS (NAG37)s(invAb)sgaccucaaUfAfCfcccaaguccs(invdA) 421 GACCUCAAUACCCCAAGUCCA 723 AM06216-SS (NAG37)s(invAb)sgcuucaGfUfUfcccugaaags(invdA) 422 GCUUCAGUUCCCUGAAAGA 724 AM06217-SS (NAG37)s(invAb)sggcuucaGfUfUfcccugaaags(invdA) 423 GGCUUCAGUUCCCUGAAAGA 725 AM06220-SS (NAG37)s(invAb)sgaccgaUfGfGfcuucaguucs(invdA) 424 GACCGAUGGCUUCAGUUCA 726 AM06221-SS (NAG37)s(invAb)sgugaccgaUfGfGfcuucaguucs(invdA) 425 GUGACCGAUGGCUUCAGUUCA 727 AM06264-SS (NAG37)s(invAb)sccaaaaggGfAfCfaguauucucs(invdA) 426 CCAAAAGGGACAGUAUUCUCA 728 AM06265-SS (NAG37)scsgcaaaaggGfAfCfaguauucucs(invdA) 427 CGCAAAAGGGACAGUAUUCUCA 729 AM06268-SS (NAG37)s(invAb)sgacuacUfGfGfagcaccguus(invdA) 428 GACUACUGGAGCACCGUUA 730 AM06269-SS (NAG37)s(invAb)sgacuacUfGfGfagcacuguus(invdA) 429 GACUACUGGAGCACUGUUA 731
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06270-SS (NAG37)s(invAb)scgacuacUfGfGfagcaccguus(invdA) 430 CGACUACUGGAGCACCGUUA 732 AM06271-SS (NAG37)s(invAb)sgacuacUfGfGfagcaucguus(invdA) 431 GACUACUGGAGCAUCGUUA 733 AM06274-SS (NAG37)s(invAb)sagggacAfGfUfauucucagus(invdA) 432 AGGGACAGUAUUCUCAGUA 734 AM06275-SS (NAG37)s(invAb)scagggacAfGfUfauucucagus(invdA) 433 CAGGGACAGUAUUCUCAGUA 735 AM06278-SS (NAG37)s(invAb)sgacuacuGfGfAfgcaccguuas(invdA) 434 GACUACUGGAGCACCGUUAA 736
105/223 AM06279-SS (NAG37)s(invAb)sgccuacuGfGfAfgcaccguuas(invdA) 435 GCCUACUGGAGCACCGUUAA 737 AM06280-SS (NAG37)s(invAb)sgccuacuGfGfAfgcacuguuas(invdA) 436 GCCUACUGGAGCACUGUUAA 738 AM06311-SS (NAG37)s(invAb)sgcugggUfGfAfccgauggcus(invdA) 437 GCUGGGUGACCGAUGGCUA 739 AM06312-SS (NAG37)s(invAb)sgcugggUfGfAfccgauggcuus(invAb) 438 GCUGGGUGACCGAUGGCUU 740 AM06313-SS (NAG37)s(invAb)sgcugggUfGfAfccgaugacus(invdA) 439 GCUGGGUGACCGAUGACUA 741 AM06316-SS (NAG37)s(invAb)sccguuaAfGfGfacaaguucus(invdA) 440 CCGUUAAGGACAAGUUCUA 742 AM06317-SS (NAG37)s(invAb)scaccguuaAfGfGfacaaguucus(invdA) 441 CACCGUUAAGGACAAGUUCUA 743 AM06321-SS (NAG37)s(invAb)saccguuAfAfGfgacaaguucs(invdA) 442 ACCGUUAAGGACAAGUUCA 744 AM06322-SS (NAG37)s(invAb)saccguuAfAfGfgacaaguucus(invAb) 443 ACCGUUAAGGACAAGUUCU 745 AM06323-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccguuAfAfGfgacaaguucs(invdA) 444 GCACCGUUAAGGACAAGUUCA 746
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06326-SS (NAG37)s(invAb)sgguacuCfCfUfuguuguugcs(invdA) 445 GGUACUCCUUGUUGUUGCA 747 AM06327-SS (NAG37)s(invAb)scggguacuCfCfUfuguuguugcs(invdA) 446 CGGGUACUCCUUGUUGUUGCA 748 AM06329-SS (NAG37)s(invAb)scggguaCfUfCfcuuguuguus(invdA) 447 CGGGUACUCCUUGUUGUUA 749 AM06332-SS (NAG37)s(invAb)sgggacagUfAfUfucucagugcs(invdA) 448 GGGACAGUAUUCUCAGUGCA 750 AM06333-SS (NAG37)s(invAb)sgggacagUfAfUfucucagugcus(invAb) 449 GGGACAGUAUUCUCAGUGCU 751 106/223 AM06470-SS (NAG37)sgscaccgUfUfAfaggacaaguuuus(invAb) 450 GCACCGUUAAGGACAAGUUUU 752 AM06473-SS (NAG37)sgsagcaccgUfUfAfaggacaagus(invdA) 451 GAGCACCGUUAAGGACAAGUA 719 AM06474-SS (NAG37)sgsgagcaccgUfUfAfaggacaagus(invdA) 452 GGAGCACCGUUAAGGACAA- 753
GUA AM06479-SS (NAG37)sgsagcaccgUfUfAfaggacaaguus(invAb) 453 GAGCACCGUUAAGGACAAGUU 754 AM06480-SS (NAG37)sgsgagcaccgUfUfAfaggacaaguus(invAb) 454 GGAGCACCGUUAAGGACAA- 755
GUU AM06506-SS (NAG37)s(invAb)saaaaggGfAfCfaguauucucauus(invAb) 455 AAAAGGGACAGUAUUCUCAUU 756 AM06508-SS (NAG37)s(invAb)scaaaaggGfAfCfaguauucucs(invdA) 456 CAAAAGGGACAGUAUUCUCA 757 AM06510-SS (NAG37)(invAb)ccaaaaggGfAfCfaguauucuc(invdA) 457 CCAAAAGGGACAGUAUUCUCA 728
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06512-SS (NAG37)s(invAb)sccaaaaggGfAfCfaguauucucus(invAb) 458 CCAAAAGGGACAGUAUUCUCU 758 AM06515-SS (NAG37)s(invAb)sgguacuCfCfUfuguuguugcauus(invAb) 459 GGUACUCCUUGUUGUUGCAUU 759 AM06516-SS (NAG37)s(invAb)sggguacuCfCfUfuguuguugcs(invdA) 460 GGGUACUCCUUGUUGUUGCA 760 AM06520-SS (NAG37)(invAb)gguacuCfCfUfuguuguugc(invdA) 461 GGUACUCCUUGUUGUUGCA 747 AM06522-SS (NAG37)s(invAb)sgguacuCfCfUfuguuguugcus(invAb) 462 GGUACUCCUUGUUGUUGCU 761
107/223 AM06711-SS (NAG37)s(invAb)sugggugacCfGfAfuggcuucagas(invAb) 463 UGGGUGACCGAUGGCUUCAGA 762 AM06713-SS (NAG37)s(invAb)sugggugacCfGfAfuggcuucagus(invAb) 464 UGGGUGACCGAUGGCUUCAGU 763 AM06715-SS (NAG37)s(invAb)sugaccgauGfGfCfuucaguuccas(invAb) 465 UGACCGAUGGCUUCAGUUCCA 764 AM06717-SS (NAG37)s(invAb)sggaccgauGfGfCfuucaguuccas(invAb) 466 GGACCGAUGGCUUCAGUUCCA 765 AM06719-SS (NAG37)s(invAb)sggcuucagUfUfCfccugaaagaas(invAb) 467 GGCUUCAGUUCCCUGAAAGAA 766 AM06721-SS (NAG37)s(invAb)sgacuacugGfAfGfcaccguuaaas(invAb) 468 GACUACUGGAGCACCGUUAAA 767 AM06723-SS (NAG37)s(invAb)scuacuggaGfCfAfccguuaaggas(invAb) 469 CUACUGGAGCACCGUUAAGGA 768 AM06725-SS (NAG37)s(invAb)suacuggagCfAfCfcguuaaggaas(invAb) 470 UACUGGAGCACCGUUAAGGAA 769 AM06727-SS (NAG37)s(invAb)sgacuggagCfAfCfcguuaaggaas(invAb) 471 GACUGGAGCACCGUUAAGGAA 770 AM06729-SS (NAG37)s(invAb)sgagcaccgUfUfAfaggacaaguas(invAb) 472 GAGCACCGUUAAGGACAAGUA 719
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06731-SS (NAG37)s(invAb)sgagcaccgUfUfAfaggacaaguus(invAb) 473 GAGCACCGUUAAGGACAAGUU 754 AM06733-SS (NAG37)s(invAb)saguggcugCfCfUfgagaccucaas(invAb) 474 AGUGGCUGCCUGAGACCUCAA 771 AM06735-SS (NAG37)s(invAb)sggcugccuGfAfGfaccucaauaas(invAb) 475 GGCUGCCUGAGACCUCAAUAA 772 AM06737-SS (NAG37)s(invAb)sgcugccugAfGfAfccucaauacas(invAb) 476 GCUGCCUGAGACCUCAAUACA 773 AM06739-SS (NAG37)s(invAb)saagggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 477 AAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 774
108/223 AM06742-SS (NAG37)s(invAb)sacgggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 478 ACGGGACAGUAUUCUCAGUGA 775 AM06744-SS (NAG37)s(invAb)scccuguagGfUfUfgcuuaaaagas(invAb) 479 CCCUGUAGGUUGCUUAAAAGA 776 AM06779-SS (NAG37)s(invAb)sggaaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 480 GGAAAAGGGACAGUAUUCUCA 777 AM06781-SS (NAG37)gsgaaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 481 GGAAAAGGGACAGUAUUCUCA 777 AM06782-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 482 GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 21 AM06785-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 483 GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA 31 AM06787-SS (NAG37)gsgcaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 484 GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA 31 AM06788-SS (NAG37)s(invAb)susgaccgauGfGfCfuucaiuuccas(invAb) 485 UGACCGAUGGCUUCAIUUCCA 780 AM06789-SS (NAG37)usgaccgauGfGfCfuucaguuccas(invAb) 486 UGACCGAUGGCUUCAGUUCCA 764 AM06790-SS (NAG37)usgaccgauGfGfCfuucaiuuccas(invAb) 487 UGACCGAUGGCUUCAIUUCCA 780
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06791-SS (NAG37)gsagggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 488 GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 21 AM06792-SS (NAG37)gsgcugccuGfAfGfaccucaauaas(invAb) 489 GGCUGCCUGAGACCUCAAUAA 772 AM06863-SS (NAG37)s(invAb)sgga_2NaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 490 GG(A2N)AAAGGGACAGUAUUCUCA 781 AM06864-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NgaaaaggGfAfCfaguauucucas(invAb) 491 (A2N)GAAAAGGGACAGUAUUCUCA 782 AM06866-SS (NAG37)s(invAb)sa_2Na_2NaaaaggGfAfCfaguauucucas(inv 492 (A2N)(A2N)AAAAGGGACAGUAUUCU 783
109/223 Ab) CA AM06867-SS (NAG37)s(invAb)scccaauaaAfGfCfuggacaagaas(invAb) 493 CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 784 AM06869-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfGfCfuggacaagaas(invAb) 494 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM06871-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 495 CUUCAGUUCCCUGAAAGACUA 786 AM06873-SS (NAG37)s(invAb)sguucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 496 GUUCAGUUCCCUGAAAGACUA 787 AM06875-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 497 GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU 29 AM06907-SS (NAG37)s(invAb)sgggacaGfUfAfuucucagugauus(invAb) 498 GGGACAGUAUUCUCAGUGAUU 789 AM06922-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NagggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 499 (A2N)AGGGACAGUAUUCUCAGUGA 790 AM06923-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfUfAfuucucaiugas(invAb) 500 GAGGGACAGUAUUCUCAIUGA 791 AM06924-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfUfAfuucucaguias(invAb) 501 GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA 16
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06925-SS (NAG37)ascgggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 502 ACGGGACAGUAUUCUCAGUGA 775 AM06926-SS (NAG37)gsggacaGfUfAfuucucagugauus(invAb) 503 GGGACAGUAUUCUCAGUGAUU 789 AM06927-SS (NAG37)s(invAb)scggacaGfUfAfuucucagugauus(invAb) 504 CGGACAGUAUUCUCAGUGAUU 793 AM06929-SS (NAG37)gsgcaaaggGfAfCfaGuauucucas(invAb) 505 GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA 31 AM06932-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaagiGfAfCfaguauucucas(invAb) 506 GGCAAAGIGACAGUAUUCUCA 794
110/223 AM06933-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaigGfAfCfaguauucucas(invAb) 507 GGCAAAIGGACAGUAUUCUCA 778 AM06934-SS (NAG37)s(invAb)saggguacuCfCfUfuguuguugcas(invAb) 508 AGGGUACUCCUUGUUGUUGCA 795 AM06948-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfUfCfugaaagacuas(invAb) 509 CUUCAGUUCUCUGAAAGACUA 796 AM06949-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuUfCfCfugaaagacuas(invAb) 510 CUUCAGUUUCCUGAAAGACUA 797 AM06950-SS (NAG37)s(invAb)scgucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 511 CGUCAGUUCCCUGAAAGACUA 798 AM06952-SS (NAG37)s(invAb)sccucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 512 CCUCAGUUCCCUGAAAGACUA 799 AM06954-SS (NAG37)s(invAb)scgucaguuCfUfCfugaaagacuas(invAb) 513 CGUCAGUUCUCUGAAAGACUA 800 AM06955-SS (NAG37)s(invAb)sggucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 514 GGUCAGUUCCCUGAAAGACUA 801 AM06957-SS (NAG37)s(invAb)sgcucaguuCfCfCfugaaagacuas(invAb) 515 GCUCAGUUCCCUGAAAGACUA 802 AM06960-SS (NAG37)s(invAb)sgccuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 516 GCCUAAAAGGGACAGUAUUCU 803
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM06962-SS (NAG37)s(invAb)sccuuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 517 CCUUAAAAGGGACAGUAUUCU 804 AM06964-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfGfiacaguauucus(invAb) 518 GCUUAAAAGGIACAGUAUUCU 805 AM06965-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfiGfacaguauucus(invAb) 519 GCUUAAAAGIGACAGUAUUCU 779 AM06966-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaiGfGfacaguauucus(invAb) 520 GCUUAAAAIGGACAGUAUUCU 785 AM06987-SS (NAG37)s(invAb)scccuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 521 CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU 27
111/223 AM07178-SS (NAG37)s(invAb)saggguacuCfCfUfuguuguuicas(invAb) 522 AGGGUACUCCUUGUUGUUICA 807 AM07180-SS (NAG37)s(invAb)saggguacuCfCfUfuGuuguugcas(invAb) 523 AGGGUACUCCUUGUUGUUGCA 795 AM07181-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfCfCfugaaagaiuas(invAb) 524 CUUCAGUUCCCUGAAAGAIUA 808 AM07183-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfCfCfuGaaagacuas(invAb) 525 CUUCAGUUCCCUGAAAGACUA 786 AM07184-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfGfGfacaguauuius(invAb) 526 GCUUAAAAGGGACAGUAUUIU 809 AM07186-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfGfGfaCaguauucus(invAb) 527 GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU 29 AM07187-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaggGfAfCfaguauucuias(invAb) 528 GGCAAAGGGACAGUAUUCUIA 810 AM07189-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaggGfAfCfaGuauucucas(invAb) 529 GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA 31 AM07191-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfUfAfuUcucaguias(invAb) 530 GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA 16 AM07192-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfGfCfuggacaaiaas(invAb) 531 GCCAAUAAAGCUGGACAAIAA 811
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM07194-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfGfCfuGgacaagaas(invAb) 532 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07309-SS (NAG37)s(invAb)saggguacuCfIfUfuguuguugcas(invAb) 533 AGGGUACUCIUUGUUGUUGCA 812 AM07310-SS (NAG37)s(invAb)saggguacuIfCfUfuguuguugcas(invAb) 534 AGGGUACUICUUGUUGUUGCA 788 AM07311-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfCfIfugaaagacuas(invAb) 535 CUUCAGUUCCIUGAAAGACUA 813 AM07312-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuCfIfCfugaaagacuas(invAb) 536 CUUCAGUUCICUGAAAGACUA 792
112/223 AM07313-SS (NAG37)s(invAb)scuucaguuIfCfCfugaaagacuas(invAb) 537 CUUCAGUUICCUGAAAGACUA 806 AM07314-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfGfIfacaguauucus(invAb) 538 GCUUAAAAGGIACAGUAUUCU 805 AM07315-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaGfIfGfacaguauucus(invAb) 539 GCUUAAAAGIGACAGUAUUCU 817 AM07316-SS (NAG37)s(invAb)sgcuuaaaaIfGfGfacaguauucus(invAb) 540 GCUUAAAAIGGACAGUAUUCU 824 AM07317-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaggGfAfIfaguauucucas(invAb) 541 GGCAAAGGGAIAGUAUUCUCA 814 AM07318-SS (NAG37)s(invAb)sggcaaaggIfAfCfaguauucucas(invAb) 542 GGCAAAGGIACAGUAUUCUCA 794 AM07319-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaIfUfAfuucucaguias(invAb) 543 GAGGGACAIUAUUCUCAGUIA 815 AM07320-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfGfIfuggacaagaas(invAb) 544 GCCAAUAAAGIUGGACAAGAA 816 AM07321-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfIfCfuggacaagaas(invAb) 545 GCCAAUAAAICUGGACAAGAA 25 AM07515-SS (NAG37)s(invAb)sgccuaaaaGfGfiacaguauucus(invAb) 546 GCCUAAAAGGIACAGUAUUCU 818
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM07516-SS (NAG37)s(invAb)sgccuaaaaGfGfIfacaguauucus(invAb) 547 GCCUAAAAGGIACAGUAUUCU 818 AM07517-SS (NAG37)s(invAb)saccuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 548 ACCUAAAAGGGACAGUAUUCU 819 AM07519-SS (NAG37)s(invAb)sgcguaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 549 GCGUAAAAGGGACAGUAUUCU 820 AM07521-SS (NAG37)s(invAb)sgucuaaaaGfGfGfacaguauucus(invAb) 550 GUCUAAAAGGGACAGUAUUCU 821 AM07523-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfUfAfuUcucagugas(invAb) 551 GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 21
113/223 AM07525-SS (NAG37)s(invAb)sgggacaGfUfAfuucucaguiauus(invAb) 552 GGGACAGUAUUCUCAGUIAUU 822 AM07526-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfGfCfudGgacaagaas(invAb) 553 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07598-SS (NAG37)s(invAb)sgccuaaaaGfgGfaCfaguauucus(invAb) 554 GCCUAAAAGGGACAGUAUUCU 803 AM07599-SS (NAG37)s(invAb)sgccuaaaaGfgIfaCfaguauucus(invAb) 555 GCCUAAAAGGIACAGUAUUCU 818 AM07601-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfuAfuUfcucagugas(invAb) 556 GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 21 AM07602-SS (NAG37)s(invAb)sgagggacaGfuAfuUfcucaguias(invAb) 557 GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA 16 AM07644-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfuAfaAfGfCfuggacaagaas(invAb) 558 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07646-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfuAfaAfgCfuggacaagaas(invAb) 559 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07647-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfUfAfaAfGfCfuggacaagaas(invAb) 560 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07648-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaAMAfGfCfuggacaagaas(invAb) 561 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM07649-SS (NAG37)s(invAb)sgccAMauaaAfGfCfuggacaagaas(invAb) 562 GCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 23 AM07650-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfuAfaAfIfCfuggacaagaas(invAb) 563 GCCAAUAAAICUGGACAAGAA 25 AM07651-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfUfAfaAfIfCfuggacaagaas(invAb) 564 GCCAAUAAAICUGGACAAGAA 25 AM07652-SS (NAG37)s(invAb)sgccaauaaAfiCfuggacaagaas(invAb) 565 GCCAAUAAAICUGGACAAGAA 25 AM07653-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfuAfaAfGfCfuigacaagaas(invAb) 566 GCCAAUAAAGCUIGACAAGAA 823
114/223 AM07654-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfaAfuAfaAfGfCfugiacaagaas(invAb) 567 GCCAAUAAAGCUGIACAAGAA 836 AM07655-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfuAfaAfaGfGfGfacaguauucus(invAb) 568 GCCUAAAAGGGACAGUAUUCU 803 AM07656-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfuAfaAfaGfgGfacaguauucus(invAb) 569 GCCUAAAAGGGACAGUAUUCU 803 AM07657-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfuAfaAfaGfGfIfacaguauucus(invAb) 570 GCCUAAAAGGIACAGUAUUCU 818 AM07658-SS (NAG37)s(invAb)sgcCfuAfaAfaGfgIfacaguauucus(invAb) 571 GCCUAAAAGGIACAGUAUUCU 818 AM07748-SS (NAG37)s(invAb)sacgggacaGfUfAfuucucaguias(invAb) 572 ACGGGACAGUAUUCUCAGUIA 18 AM07749-SS (NAG37)s(invAb)scagggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 573 CAGGGACAGUAUUCUCAGUGA 825 AM07751-SS (NAG37)s(invAb)scagggacaGfUfAfuucucaguias(invAb) 574 CAGGGACAGUAUUCUCAGUIA 837 AM07752-SS (NAG37)s(invAb)saggggacaGfUfAfuucucagugas(invAb) 575 AGGGGACAGUAUUCUCAGUGA 826 AM07754-SS (NAG37)s(invAb)saggggacaGfUfAfuucucaguias(invAb) 576 AGGGGACAGUAUUCUCAGUIA 827
Filamento Filamento senso modificado SEQ Sequência de Base subjacente SEQ senso ID: (5′ → 3′) ID (5′ → 3′) ID NO. (mostrada como uma sequência NO. nucleotídica não modificada) AM07759-SS (NAG37)s(invAb)sagaccgCfCfAfaggaugcacuuus(invAb) 577 AGACCGCCAAGGAUGCACUUU 828 AM07761-SS (NAG37)s(invAb)sagaccgCfCfAfaggauicacuuus(invAb) 578 AGACCGCCAAGGAUICACUUU 829 AM07763-SS (NAG37)s(invAb)sucaguuccCfUfGfaaagacuacus(invAb) 579 UCAGUUCCCUGAAAGACUACU 830 AM07766-SS (NAG37)s(invAb)sucaguuccCfUfGfaaagacuacas(invAb) 580 UCAGUUCCCUGAAAGACUACA 831 AM07768-SS (NAG37)s(invAb)sacuacuggAfGfCfacciuuaagas(invAb) 581 ACUACUGGAGCACCIUUAAGA 832
115/223 AM07770-SS (NAG37)s(invAb)sccuguaggUfUfGfcuuaaaaggas(invAb) 582 CCUGUAGGUUGCUUAAAAGGA 833 AM07772-SS (NAG37)s(invAb)sgcuguaggUfUfGfcuuaaaaggas(invAb) 583 GCUGUAGGUUGCUUAAAAGGA 834 AM07774-SS (NAG37)s(invAb)sggucaguuCfUfCfugaaagacuas(invAb) 584 GGUCAGUUCUCUGAAAGACUA 835 (A2N) = nucleotídeo 2-aminoadenina
[00177] Os agentes RNAi APOC3 descritos no presente documento são formados pelo anelamento de um filamento antissenso com um filamento senso. Um filamento senso contendo uma sequência listada na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5 pode ser hibridizado em qualquer fi- lamento antissenso contendo uma sequência listada na tabela 2, tabe- la 3 ou tabela 4, contanto que as duas sequências tenham uma região de pelo menos 85% de complementariedade sobre uma sequência nu- cleotídica contígua 16, 17, 18, 19, 20 ou 21.
[00178] Em algumas modalidades, o filamento antissenso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos a partir de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 4. Em algumas modalidades, o filamen- to senso de um agente RNAi de APOC3 divulgado no presente docu- mento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das se- quências do filamento senso na tabela 5.
[00179] Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende uma sequência nucleotídica de qualquer uma das sequências na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4. Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5' – extremidade 3') 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2- 21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24 ou 2-24, 1-25, 2-25, 1-16 ou 2-16 de qualquer uma das sequências na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4. Em certas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 4. Em certas mo- dalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 com- preende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 3.
[00180] Em algumas modalidades, um filamento senso do agente
RNAi de APOC3 compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das sequências na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5. Em algumas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 compre- ende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5’ -> extremidade 3’) 1-17, 2-17, 3-17, 4-17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4- 19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21, 4-21, 1-22, 2-22, 3-22, 4- 22, 1-23, 2-23, 3-23, 4-23, 1-24, 2-24, 3-24, 4-24, 1-25, 2-25, 3-25, 4- 25, 1-26, 2-26, 3-26 ou 4-26, de qualquer uma das sequências na ta- bela 2, tabela 3 ou tabela 5. Em certas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 5. Em certas modalidades, um filamento senso do agente RNAi de APOC3 compreende ou consiste em uma sequência modifi- cada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 3.
[00181] Para os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente documento, o nucleotídeo na posição 1 do filamento antissenso (da extremidade 5’  extremidade 3’) pode ser perfeitamente complemen- tar a um gene APOC3, ou pode ser não complementar a um gene APOC3. Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 do fi- lamento antissenso (da extremidade 5’  extremidade 3’) é uma U, A ou dT (ou uma versão modificada da mesma). Em algumas modalida- des, o nucleotídeo na posição 1 do filamento antissenso (da extremi- dade 5’  extremidade 3’) forma um par de base A:U ou U:A com o filamento senso.
[00182] Em algumas modalidades, um filamento antissenso do agente RNAi de APOC3 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5'  extremidade 3') 2-18 ou 2-19 de qualquer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 2 ou tabela 4. Em algu- mas modalidades, um filamento senso de RNAi de APOC3 RNAi com- preende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5’  extremi-
dade 3’) 1-17 ou 1-18 de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2 ou tabela 5.
[00183] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 in- clui (i) um filamento antissenso compreendendo a sequência de nucle- otídeos (da extremidade 5’  extremidade 3’) 2-18 ou 2-19 de qual- quer uma das sequências do filamento antissenso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4, e (ii) um filamento senso compreendendo a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5' – extremidade 3') 1-17 ou 1-18 de qualquer uma das sequências do filamento senso na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5.
[00184] Um filamento senso contendo uma sequência listada na tabela 2, tabela 3 ou tabela 5 pode ser hibridizado a qualquer filamento antissenso contendo uma sequência listada na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4, contanto que as duas sequências tenham uma região de pelo menos 85% de complementariedade sobre uma sequência nucleotídi- ca contígua 16, 17, 18, 19, 20 ou 21. Em algumas modalidades, o agente RNAi APOC3 tem um filamento senso consistindo da sequên- cia modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 5, e um filamento antissenso consistindo da sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na tabela 4. Os pareamen- tos representativos da sequência são exemplificados pelo Dúplex ID Nos. mostrados na tabela 3 e tabela 6.
[00185] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende qualquer um dos dúplices representados por qualquer um dos Nos. de Dúplex ID apresentados no presente documento. Em al- gumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 consiste em qual- quer um dos dúplices representados por qualquer um dos Nos. de Dú- plex ID apresentados no presente documento. Em algumas modalida- des, um agente RNAi de APOC3 compreende as sequências nucleotí- dicas do filamento senso e o filamento antissenso de qualquer um dos dúplices representados por qualquer um dos Nos. de Dúplex ID apre- sentados no presente documento. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 inclui as sequências nucleotídicas do filamen- to senso e o filamento antissenso de qualquer um dos dúplices repre- sentados por qualquer um dos Nos. de Dúplex ID apresentados no presente documento e um grupo de direcionamento e/ou grupo de li- gação, em que o grupo de direcionamento e/ou grupo de ligação é co- valentemente ligado (isto é, conjugado) ao filamento senso ou ao fila- mento antissenso. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 inclui as sequências nucleotídicas do filamento senso e do fi- lamento antissenso modificadas de qualquer um dos dúplices repre- sentados por qualquer um dos Nos. Dúplex ID apresentados no pre- sente documento. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende as sequências nucleotídicas do filamento senso e do filamento antissenso modificadas de qualquer um dos dúplices re- presentados por qualquer um dos Nos. Dúplex ID apresentados no presente documento e um grupo de direcionamento e/ou grupo de li- gação, em que o grupo de direcionamento e/ou grupo de ligação é co- valentemente ligado ao filamento senso ou filamento antissenso.
[00186] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso e um filamento senso tendo se- quências nucleotídicas de qualquer um dos dúplices do filamento an- tissenso/ filamento senso da tabela 2, tabela 3 ou tabela 6, e compre- ende um grupo de direcionamento do ligante receptor de asialoglico- proteína.
[00187] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso e um filamento senso tendo se- quências nucleotídicas de qualquer um dos dúplices do filamento an- tissenso/ filamento senso da tabela 2, tabela 3 ou tabela 6, e ainda compreende um grupo de direcionamento selecionado a partir do gru-
po consistindo em (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s. Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento é (NAG25) ou (NAG25)s conforme definido na tabela 7. Em outras mo- dalidades, o grupo de direcionamento é (NAG37) ou (NAG37)s con- forme definido na tabela 7.
[00188] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso e um filamento senso tendo uma sequência nucleotídica modificada de qualquer uma das sequências nucleotídicas do filamento antissenso e/ou filamento senso de qual- quer um dos dúplices da tabela 2, tabela 3 ou tabela 6.
[00189] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende um filamento antissenso e um filamento senso tendo uma sequência nucleotídica modificada de qualquer uma das sequências nucleotídicas do filamento antissenso e/ou filamento senso de qual- quer um dos dúplices da tabela 2, tabela 3 ou tabela 6, e compreende um grupo de direcionamento do ligante receptor de asialoglicoproteína.
[00190] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 compreende qualquer um dos dúplices da tabela 2, tabela 3 ou tabela
6.
[00191] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 consiste em qualquer um dos dúplices da tabela 2, tabela 3 ou tabela
6.
Tabela 6. Agentes RNAi de APOC3 identificados pelo Dúplex ID NO. com os filamentos senso e antissenso correspondentes.
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD04812 AM06203-AS AM06206-SS AD04813 AM06204-AS AM06207-SS AD04814 AM06203-AS AM06208-SS AD04815 AM06205-AS AM06209-SS AD04816 AM06210-AS AM06212-SS AD04817 AM06211-AS AM06213-SS AD04818 AM06214-AS AM06216-SS AD04819 AM06215-AS AM06217-SS AD04820 AM06218-AS AM06220-SS AD04821 AM06219-AS AM06221-SS AD04860 AM06262-AS AM06264-SS AD04861 AM06263-AS AM06265-SS AD04862 AM06266-AS AM06268-SS AD04863 AM06266-AS AM06269-SS AD04864 AM06267-AS AM06270-SS AD04865 AM06266-AS AM06271-SS AD04866 AM06272-AS AM06274-SS AD04867 AM06273-AS AM06275-SS AD04868 AM06276-AS AM06278-SS AD04869 AM06277-AS AM06279-SS AD04870 AM06277-AS AM06280-SS AD04886 AM06309-AS AM06311-SS AD04887 AM06310-AS AM06312-SS AD04888 AM06309-AS AM06313-SS AD04889 AM06314-AS AM06316-SS AD04890 AM06315-AS AM06317-SS AD04891 AM06318-AS AM06321-SS AD04892 AM06319-AS AM06322-SS AD04893 AM06320-AS AM06323-SS AD04894 AM06324-AS AM06326-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD04895 AM06325-AS AM06327-SS AD04896 AM06328-AS AM06329-SS AD04897 AM06330-AS AM06332-SS AD04898 AM06331-AS AM06333-SS AD04987 AM06469-AS AM06206-SS AD04988 AM06469-AS AM06208-SS AD04989 AM06471-AS AM06470-SS AD04990 AM06205-AS AM06470-SS AD04991 AM06472-AS AM06208-SS AD04992 AM06204-AS AM06473-SS AD04993 AM06475-AS AM06474-SS AD04994 AM06476-AS AM06207-SS AD04995 AM06477-AS AM06207-SS AD04996 AM06478-AS AM06209-SS AD04997 AM06471-AS AM06479-SS AD04998 AM06481-AS AM06480-SS AD05007 AM06507-AS AM06506-SS AD05008 AM06509-AS AM06508-SS AD05009 AM06511-AS AM06510-SS AD05010 AM06513-AS AM06512-SS AD05011 AM06514-AS AM06326-SS AD05012 AM06324-AS AM06515-SS AD05013 AM06517-AS AM06516-SS AD05014 AM06518-AS AM06326-SS AD05015 AM06519-AS AM06326-SS AD05016 AM06521-AS AM06520-SS AD05017 AM06523-AS AM06522-SS AD05127 AM06712-AS AM06711-SS AD05128 AM06714-AS AM06713-SS AD05129 AM06716-AS AM06715-SS AD05130 AM06718-AS AM06717-SS AD05131 AM06720-AS AM06719-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD05132 AM06722-AS AM06721-SS AD05133 AM06724-AS AM06723-SS AD05134 AM06726-AS AM06725-SS AD05135 AM06728-AS AM06727-SS AD05136 AM06730-AS AM06729-SS AD05137 AM06732-AS AM06731-SS AD05138 AM06734-AS AM06733-SS AD05139 AM06736-AS AM06735-SS AD05140 AM06738-AS AM06737-SS AD05141 AM06740-AS AM06739-SS AD05142 AM06741-AS AM06739-SS AD05143 AM06743-AS AM06742-SS AD05144 AM06745-AS AM06744-SS AD05167 AM06780-AS AM06779-SS AD05168 AM06780-AS AM06781-SS AD05169 AM06783-AS AM06782-SS AD05170 AM06784-AS AM06735-SS AD05171 AM06786-AS AM06785-SS AD05172 AM06786-AS AM06787-SS AD05173 AM06716-AS AM06788-SS AD05174 AM06716-AS AM06789-SS AD05175 AM06716-AS AM06790-SS AD05176 AM06783-AS AM06791-SS AD05177 AM06784-AS AM06792-SS AD05215 AM06862-AS AM06779-SS AD05216 AM06780-AS AM06863-SS AD05217 AM06865-AS AM06864-SS AD05218 AM06507-AS AM06866-SS AD05219 AM06868-AS AM06867-SS AD05220 AM06870-AS AM06869-SS AD05221 AM06872-AS AM06871-SS AD05222 AM06874-AS AM06873-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD05223 AM06876-AS AM06875-SS AD05239 AM06908-AS AM06907-SS AD05249 AM06741-AS AM06922-SS AD05250 AM06783-AS AM06923-SS AD05251 AM06783-AS AM06924-SS AD05252 AM06743-AS AM06925-SS AD05253 AM06908-AS AM06926-SS AD05254 AM06928-AS AM06927-SS AD05255 AM06786-AS AM06929-SS AD05258 AM06786-AS AM06932-SS AD05259 AM06786-AS AM06933-SS AD05260 AM06517-AS AM06934-SS AD05275 AM06872-AS AM06948-SS AD05276 AM06872-AS AM06949-SS AD05277 AM06951-AS AM06950-SS AD05278 AM06953-AS AM06952-SS AD05279 AM06951-AS AM06954-SS AD05280 AM06956-AS AM06955-SS AD05281 AM06958-AS AM06957-SS AD05282 AM06959-AS AM06875-SS AD05283 AM06961-AS AM06960-SS AD05284 AM06963-AS AM06962-SS AD05285 AM06876-AS AM06964-SS AD05286 AM06876-AS AM06965-SS AD05287 AM06876-AS AM06966-SS AD05299 AM06988-AS AM06987-SS AD05431 AM06517-AS AM07178-SS AD05432 AM07179-AS AM06934-SS AD05433 AM06517-AS AM07180-SS AD05434 AM06872-AS AM07181-SS AD05435 AM07182-AS AM06871-SS AD05436 AM06872-AS AM07183-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD05437 AM06876-AS AM07184-SS AD05438 AM07185-AS AM06875-SS AD05439 AM06876-AS AM07186-SS AD05440 AM06786-AS AM07187-SS AD05441 AM07188-AS AM06785-SS AD05442 AM06786-AS AM07189-SS AD05443 AM07190-AS AM06924-SS AD05444 AM06783-AS AM07191-SS AD05445 AM06870-AS AM07192-SS AD05446 AM07193-AS AM06869-SS AD05447 AM06870-AS AM07194-SS AD05535 AM06517-AS AM07309-SS AD05536 AM06517-AS AM07310-SS AD05537 AM06872-AS AM07311-SS AD05538 AM06872-AS AM07312-SS AD05539 AM06872-AS AM07313-SS AD05540 AM06876-AS AM07314-SS AD05541 AM06876-AS AM07315-SS AD05542 AM06876-AS AM07316-SS AD05543 AM06786-AS AM07317-SS AD05544 AM06786-AS AM07318-SS AD05545 AM06783-AS AM07319-SS AD05546 AM06870-AS AM07320-SS AD05547 AM06870-AS AM07321-SS AD05705 AM06961-AS AM07515-SS AD05706 AM06961-AS AM07516-SS AD05707 AM07518-AS AM07517-SS AD05708 AM07520-AS AM07519-SS AD05709 AM07522-AS AM07521-SS AD05710 AM07190-AS AM06782-SS AD05711 AM06783-AS AM07523-SS AD05712 AM07524-AS AM06924-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD05713 AM06908-AS AM07525-SS AD05714 AM06870-AS AM07526-SS AD05761 AM06961-AS AM07598-SS AD05762 AM06961-AS AM07599-SS AD05763 AM07600-AS AM06960-SS AD05764 AM07600-AS AM07516-SS AD05765 AM07600-AS AM07598-SS AD05766 AM07600-AS AM07599-SS AD05767 AM07524-AS AM06782-SS AD05768 AM07524-AS AM07601-SS AD05769 AM07524-AS AM07602-SS AD05811 AM06870-AS AM07644-SS AD05812 AM07645-AS AM07644-SS AD05813 AM07645-AS AM07646-SS AD05814 AM07645-AS AM07647-SS AD05815 AM06870-AS AM07648-SS AD05816 AM06870-AS AM07649-SS AD05817 AM07645-AS AM07650-SS AD05818 AM07645-AS AM07651-SS AD05819 AM06870-AS AM07652-SS AD05820 AM07645-AS AM07653-SS AD05821 AM07645-AS AM07654-SS AD05822 AM07600-AS AM07655-SS AD05823 AM07600-AS AM07656-SS AD05824 AM07600-AS AM07657-SS AD05825 AM07600-AS AM07658-SS AD05876 AM06743-AS AM07748-SS AD05877 AM07750-AS AM07749-SS AD05878 AM07750-AS AM07751-SS AD05879 AM07753-AS AM07752-SS AD05880 AM07753-AS AM07754-SS AD05881 AM07755-AS AM06782-SS
Dúplex ID Filamento Antissenso ID Filamento Senso ID AD05882 AM07756-AS AM06782-SS AD05883 AM07757-AS AM06782-SS AD05884 AM07758-AS AM06782-SS AD05885 AM07755-AS AM06924-SS AD05886 AM07756-AS AM06924-SS AD05887 AM07757-AS AM06924-SS AD05888 AM07758-AS AM06924-SS AD05889 AM07760-AS AM07759-SS AD05890 AM07762-AS AM07761-SS AD05891 AM07764-AS AM07763-SS AD05892 AM07765-AS AM07763-SS AD05893 AM07767-AS AM07766-SS AD05894 AM07769-AS AM07768-SS AD05895 AM07771-AS AM07770-SS AD05896 AM07773-AS AM07772-SS AD05897 AM07775-AS AM07774-SS
[00192] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 está preparado ou provido como um sal, sal misto ou um ácido livre. Os agentes RNAi descritos no presente documento, mediante a liberação a uma célula expressando um gene APOC3, inibem ou knockdow a expressão de um ou mais genes APOC3 in vivo. Grupos de direcionamento, grupos de ligação e veículos de libe- ração
[00193] Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 é conjugado a um ou mais grupos não nucleotídicos incluindo, porém não limitado a um grupo de direcionamento, grupo de ligação, políme- ro de liberação ou um veículo de liberação. O grupo não nucleotídico pode aumentar o direcionamento, liberação ou ligação do agente RNAi. Os exemplos dos grupos de direcionamento e grupos de ligação são providos na Tabela 7. O grupo não nucleotídico pode ser covalen-
temente ligado à extremidade 3' e/ou 5' de nenhum dos filamentos senso e/ou dos filamentos antissenso. Em algumas modalidades, um agente RNAi de APOC3 contém um grupo não nucleotídico ligado à extremidade 3' e/ou 5' do filamento senso. Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico é ligado à extremidade 5’ do filamento sen- so de um agente RNAi de APOC3. Um grupo não nucleotídico pode ser ligado diretamente ou indiretamente ao agente RNAi através de um ligante/grupo de ligação. Em algumas modalidades, um grupo não nu- cleotídico é ligado ao agente RNAi através de uma ligação ou ligante lábil, clivável ou reversível.
[00194] Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico au- menta as propriedades farmacocinéticas ou de biodistribuição de um agente RNAi ou conjugado ao qual ele está ligado para melhorar a dis- tribuição específica à célula ou tecido e a captação específica da célu- la do agente RNAi ou conjugado. Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico aumenta a endocitose do agente RNAi.
[00195] Os grupos de direcionamento ou porções de direcionamen- to podem aumentar as propriedades farmacocinéticas ou de biodistri- buição de um conjugado ou agente RNAi aos quais eles são ligados para melhorar a distribuição específica da célula e captação específica da célula do conjugado ou agente RNAi. Um grupo de direcionamento pode ser monovalente, divalente, trivalente, tetravalente ou ter maior valência para o alvo ao qual ele é direcionado. Os grupos de direcio- namento representativos incluem, sem limitação, compostos com afi- nidade a moléculas de superfície celular, ligantes do receptor celular, haptenos, anticorpos, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticor- po e imitadores de anticorpo com moléculas de superfície celular. Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento é ligado a um agente RNAi usando um ligante, tal como um ligante PEG ou um, dois ou três resíduos abásicos e/ou de ribitol (ribose abásica), que em al-
guns casos podem servir como ligantes. Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento compreende um grupamento derivado de ga- lactose.
[00196] Os agentes RNAi APOC3 descritos no presente documento podem ser sintetizados tendo um grupo reativo, tal como um grupo amina, no terminal 5’. O grupo reativo pode ser usado para ligar sub- sequentemente um grupo de direcionamento usando métodos típicos na técnica.
[00197] Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento compreende um ligante receptor de asialoglicoproteína. Conforme usado no presente documento, um ligante receptor de asialoglicoprote- ína é um ligante que contém um composto tendo afinidade pelo recep- tor de asialoglicoproteína, o qual é altamente expressado em hepatóci- tos. Em algumas modalidades, um ligante receptor de asialoglicoprote- ína inclui ou consiste em um ou mais derivados de galactose. Confor- me usado no presente documento, o termo derivado de galactose in- clui ambos a galactose e derivados de galactose tendo afinidade pelo receptor de asialoglicoproteína que é igual ou maior do que aquele da galactose. Os derivados de galactose incluem, porém não se limitam a: galactose, galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetil- galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoil-galactosamina e N-iso-butanoilgalactosamina (vide por exemplo: S.T. Iobst and K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686). Os derivados de galactose e gru- pamentos de derivados de galactose, que são úteis no direcionamento in vivo de oligonucleotídeos e outras moléculas ao fígado são conheci- dos na técnica (vide, por exemplo, Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem, 257, 939-945).
[00198] Os derivados de galactose foram usados para direcionar moléculas aos hepatócitos in vivo através da sua ligação ao receptor de asialoglicoproteína expressado na superfície dos hepatócitos. A li-
gação dos ligantes do receptor de asialoglicoproteína ao(s) recep- tor(es) de asialoglicoproteína facilita o direcionamento específico da célula aos hepatócitos e a endocitose da molécula nos hepatócitos. Os ligantes do receptor de asialoglicoproteína podem ser monoméricos (por exemplo, ter um derivado único de galactose) ou multiméricos (por exemplo, ter múltiplos derivados de galactose). O derivado de ga- lactose ou grupamento do derivado de galactose pode ser ligado à ex- tremidade 3’ ou 5’ do filamento senso ou antissenso do agente RNAi usando métodos conhecidos na técnica. A preparação dos grupos de direcionamento, tais como grupamentos do derivado de galactose, é descrita em, por exemplo, Publicação do pedido de patente internacio- nal No. WO 2018/044350 para Arrowhead Pharmaceuticals, Inc., e Publicação do pedido de patente internacional No. WO 2017/156012 para Arrowhead Pharmaceuticals, Inc., cujos conteúdos são incorpo- rados a título de referência no presente documento em sua totalidade.
[00199] Conforme usado no presente documento, um grupamento derivado de galactose compreende uma molécula tendo dois a quatro derivados terminais de galactose. Um derivado terminal de galactose está ligado a uma molécula através do seu carbono C-l. Em algumas modalidades, o grupamento do derivado de galactose é um trímero do derivado de galactose (também referido como um derivado de galacto- se triantenário ou derivado de galactose trivalente). Em algumas mo- dalidades, o grupamento do derivado de galactose compreende N- acetil-galactosaminas. Em algumas modalidades, o grupamento do derivado de galactose compreende três N-acetil-galactosaminas. Em algumas modalidades, o grupamento do derivado de galactose é um tetrâmero derivado de galactose (também referido como um derivado de galactose tetra-antenário ou derivado de galactose tetravalente). Em algumas modalidades, o grupamento do derivado de galactose compreende quatro N-acetil-galactosaminas.
[00200] Conforme usado no presente documento, um derivado de galactose trímero contém três derivados de galactose, cada ligado a um ponto de ramificação central. Conforme usado no presente docu- mento, um derivado de galactose tetrâmero contém quatro derivados de galactose, cada ligado a um ponto de ramificação central. Os deri- vados de galactoses podem ser ligados ao ponto de ramificação cen- tral através de carbonos C-l dos sacarídeos. Em algumas modalida- des, os derivados de galactose são ligados ao ponto de ramificação através de ligantes ou espaçadores. Em algumas modalidades, o li- gante ou espaçador é um espaçador hidrofílico flexível, tal como um grupo PEG (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5,885,968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Em algumas modalidades, o espaçador de PEG é um espaçador PEG3. O ponto de ramificação pode ser qualquer molécula pequena que permite a ligação de três derivados de galactoses e ainda permite a ligação do ponto de ramificação ao agente RNAi. Um exemplo do grupo do ponto de ramificação é uma di-lisina ou di-glutamato. A liga- ção do ponto de ramificação ao agente RNAi pode ocorrer através de um ligante ou espaçador. Em algumas modalidades, o ligante ou es- paçador compreende um espaçador hidrofílico flexível, tal como, po- rém não limitado a, um espaçador PEG. Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante rígido, tal como um grupo cíclico. Em algumas modalidades, um derivado de galactose compreende ou con- siste em N-acetil-galactosamina. Em algumas modalidades, o grupa- mento do derivado de galactose está compreendido de um derivado de galactose tetrâmero, que pode ser, por exemplo, uma N-acetil- galactosamina tetrâmera.
[00201] As modalidades da presente divulgação incluem composi- ções farmacêuticas para liberar um agente RNAi de APOC3 a uma cé- lula hepática in vivo. As referidas composições farmacêuticas podem incluir, por exemplo, um agente RNAi de APOC3 conjugado a um gru- pamento derivado de galactose.
[00202] Em algumas modalidades, o grupamento do derivado de galactose é compreendido de um derivado de galactose trímero, que pode ser, por exemplo, uma N-acetil-galactosamina trímera, ou deriva- do de galactose tetrâmero, que pode ser, por exemplo, uma N-acetil- galactosamina tetrâmera.
[00203] Os grupos de direcionamento incluem, porém não se limi- tam a, (PAZ), (NAG 13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39) e (NAG39)s conforme definidos na tabela 7. Outros grupos de direcio- namento, incluindo ligantes de direcionamento do grupamento de ga- lactose, são conhecidos na técnica.
[00204] Em algumas modalidades, um grupo de ligação é conjuga- do ao agente RNAi. O grupo de ligação facilita a ligação covalente do agente a um grupo de direcionamento ou polímero de liberação ou ve- ículo de liberação. O grupo de ligação pode ser ligado à extremidade 3' ou extremidade 5' do filamento senso ou antissenso do agente RNAi. Em algumas modalidades, o grupo de ligação é ligado ao filamento senso do agente RNAi. Em algumas modalidades, o grupo de ligação é conjugado à extremidade 5' ou 3' de um filamento senso do agente RNAi. Em algumas modalidades, um grupo de ligação é conjugado à extremidade 5’ de um filamento senso do agente RNAi. Os exemplos de grupos de ligação, podem incluir, porém não se limitam a: grupos reativos tais como aminas primárias e alquinas, grupos alquila, nucleo- tídeos abásicos, ribitol (ribose abásica), e/ou grupos PEG.
[00205] Um ligante ou grupo de ligação é uma conexão entre dois átomos que ligam um grupo químico (tal como um agente RNAi) ou segmento de interesse a um outro grupo químico (tal como um grupo de direcionamento ou polímero de liberação) ou segmento de interes- se através de uma ou mais ligações covalentes. Uma ligação lábil con- tém um ligante lábil. Uma ligação pode opcionalmente incluir um espa- çador que aumenta a distância entre os dois átomos unidos. Um espa- çador pode ainda adicionar flexibilidade e/ou comprimento à ligação. Os espaçadores podem incluir, porém não se limitam a, grupos alquila, grupos alquenila, grupos alquinila, grupos arila, grupos aralquila, gru- pos aralquenila e grupos aralquinila; cada um dos quais pode conter um ou mais heteroátomos, heterociclos, aminoácidos, nucleotídeos e sacarídeos. Os grupos espaçadores são bem conhecidos na técnica e a lista precedente não pretende limitar o escopo da descrição.
[00206] Qualquer uma das sequências nucleotídicas do agente RNAi de APOC3 listadas nas tabelas 2, 3, 4 ou 5, sejam modificadas ou não modificadas, podem conter grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3’ ou 5’. Qualquer uma das sequências do agente RNAi de APOC3 listadas na tabela 4 ou 5 que contêm um grupo de direciona- mento ou grupo de ligação 3’ ou 5’, podem alternadamente conter ne- nhum grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3’ ou 5’, ou podem conter um grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3’ ou 5’ dife- rente incluindo, porém sem se limitar àqueles apresentados na tabela
7. Qualquer um dos dúplices do agente RNAi APOC3 listados na tabe- la 2, tabela 3 ou tabela 6, sejam modificados ou não modificados, po- dem ainda compreender um grupo de direcionamento ou grupo de li- gação, incluindo, porém sem se limitar, àqueles apresentados na tabe- la 7, e o grupo de direcionamento ou grupo de ligação podem ser liga- dos ao terminal 3' ou 5' de qualquer um dos filamento senso ou fila- mento antissenso do agente RNAi APOC3 dúplex.
[00207] Exemplos de grupos de direcionamento e grupos de ligação são providos na Tabela 7. A tabela 5 provê várias modalidades dos filamentos senso do agente RNAi APOC3 tendo um grupo de direcio- namento ou grupo de ligação ligado à extremidade 5' ou 3'. Tabela 7. Estruturas representando vários nucleotídeos modificados, grupos de direcionamento e grupos de ligação.
O - O O N O N NH P O NH
O - O CH3 O P O N N NH2 -
O O O O P -
O F vpdT 5Me-Gf
O O HN O HO P O N O HN OH O HO P O N OH O O O O P - O O O O O P -
O cPrpTM (cPrp)u
O O HN HO P O N OH O O O HO P SH O O P -
S cPrpus sp
O O NH NH D D D D HO N O HO N O O O O O O O O O P P O - O -
O S D2u D2us
O O NH NH O D O D D D HO P O N O O N O O HO P O OH OH O O O O O O P P O - O -
O S pD2u pD2us NH2 NH2 N
N N
N N N NH2
N O N NH2
O O O O O O O P P O - O -
O S a_2N a_2Ns
N N
N N N N NH2 N N NH2
O O O O O O O O P P O - O -
O S pu_2N pu_2Ns NH2 NH2
N N N O N O O O O O O O O O P O P O O - O -
O S mCM mCMs NH2 NH2
N N
N N N N NH2 N N NH2
O O O O O O O O P P O - O -
O S a_2N a_2Ns
N N
N N N N NH2 N N NH2
O O O O O O O O P P O - O -
O S pu_2N pu_2Ns
O O NH NH O HO
P NH N O H2N N O
HO O O O O O O O O P P
SH SH Npus Nus
O O O HN O HN HO P O N HO P O O N OH OH O O O O O P O O - P O -
O O epTM epTcPr
Quando posicionado internamente no oligonucleotídeo:
(invAb) Quando posicionado internamente no oligonucleotídeo:
(invAb)s Quando posicionado na extremidade terminal 3′ do oligonucleotídeo:
(invAb)
OH N - O O O P O N H O (PAZ) O NAG O O H O O N - O P O O H O H O NAG O O N N OH
O O N N 9
O H O H O O N NAG O O H
O (NAG13)
O NAG O O H O O N - O P S O H O H O NAG O O N N OH
O O N N 9
O H O H O O N NAG O O H
O (NAG13)s
O H H O NAG O O N N N O P O - H O O H H N O N NAG O O O O N H
NAG O O (NAG18)
O H H O NAG O O N N N O P O - H O S H H N O N NAG O O O O N H
NAG O O (NAG18)s
O O NAG O NH O P O O - O O N NH NAG O NH O HN O O
NAG O (NAG24)
O O NAG O NH O P O O - S O N NH NAG O NH O HN O O
NAG O (NAG24)s
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 6 O
O (NAG25)
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 6 S
O (NAG25)s
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 8 O
O (NAG26)
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 8 S
O (NAG26)s
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O O NH O O NAG O NH O O O P O -
O (NAG27)
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O O NH O O NAG O NH O O O P O -
S (NAG27)s
O NAG O NH O O O N NAG O NH O HN O NH O O P O - O
NAG O (NAG28)
O NAG O NH O O O N NAG O NH O HN O NH O O P O - S
NAG O (NAG28)s
NAG O O O NH O O NAG O NH O O NH NH O NAG O NH O O -
O P O (NAG29)
NAG O O O NH O O NAG O NH O O NH NH O NAG O NH O O -
S P O (NAG29)s
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - O O NH
NAG O (NAG30)
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - S O NH
NAG O (NAG30)s
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - O O NH
NAG O (NAG31)
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - S O NH
NAG O (NAG31)s
H NAG O N O O O O O O N O H O O N NAG O N O P H - O NAG O N O
O O H (NAG32)
H NAG O N O O O O O O N O H O O N NAG O N O P H - S NAG O N O
O O H (NAG32)s
N A G O O O N H O O O O O N N H O O N A G O P - O N H O O N A G
O (NAG33)
N A G O O O N H O O O O O N N H O O N A G O P - S N H O O N A G
O (NAG33)s
H O O N NAG O O O O P O N - O O O NAG O O N HN H O O
NAG O (NAG34)
H O O N NAG O O O O P O N - S O O NAG O O N HN H O O
NAG O (NAG34)s
H NAG O N O O O O O O N O N H O O NAG O N O P H - N O O O O
NAG O H (NAG35)
H NAG O N O O O O O O N O N H O O NAG O N O P H - N O S O O
NAG O H (NAG35)s
H NAG O N O O NH O O P H O O H - O NAG O N N N O N O H O HN O H NAG O N O
O (NAG36)
H NAG O N O O NH O O P H O O H - S NAG O N N N O N O H O HN O H NAG O N O
O (NAG36)s
NAG O NH O O NAG O NH O NH O O O NAG O NH O NH O - O O P
O (NAG37)
NAG O NH O O NAG O NH O NH O O O NAG O NH O NH O - S O P
O (NAG37)s
NAG O O O HN O O P - O O NH NAG O N O O O NH
NAG O (NAG 38)
NAG O O O HN O O P - S O NH NAG O N O O O NH
NAG O (NAG 38)s
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O NH NAG O NH O O O P -
O (NAG39)
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O NH NAG O NH O O O P -
S (NAG39)s
[00208] Em cada uma das estruturas acima na tabela 7, NAG com- preende uma N-acetil-galactosamina ou um outro derivado de galacto- se, como seria compreendido por um versado na técnica a ser ligado em vista das estruturas acima e descrição providas no presente docu-
mento. Por exemplo, em algumas modalidades, NAG nas estruturas providas na tabela 7 é representado pela seguinte estrutura: (N-acetil-galactosamina)
[00209] Cada (NAGx) pode ser ligado a um agente RNAi de APOC3 através de um grupo fosfato (como em (NAG25), (NAG30) e (NAG31)), ou um grupo fosforotioato (como é (NAG25)s, (NAG29)s, (NAG30)s, (NAG31)s ou (NAG37)s) ou um outro grupo de ligação.
O O O P O P - -
O S Grupo fosfato grupo fosforotioato
[00210] Outros grupos de ligação conhecidos na técnica podem ser usados.
[00211] Em algumas modalidades, um veículo de liberação pode ser usado para liberar um agente RNAi a uma célula ou tecido. Um veículo de liberação é um composto que melhora a liberação do agen- te RNAi a uma célula ou tecido. Um veículo de liberação pode incluir, ou consistir de, porém sem se limitar a: um polímero, tal como um po- límero anfipático, um polímero ativo na membrana, um peptídeo, um peptídeo melitina, um peptídeo do tipo melitina (MLP), um lipídio, um polímero ou peptídeo reversivelmente modificado ou uma poliamina ativa de membrana reversivelmente modificada. Em algumas modali- dades, os agentes RNAi podem ser combinados com lipídios, nanopar- tículas, polímeros, lipossomos, micelas, DPCs ou outros sistemas de liberação disponíveis na técnica. Os agentes RNAi também podem ser quimicamente conjugados aos grupos de direcionamento, lipídios (in- cluindo, porém sem se limitar aos derivados de colesterol e colesteri-
la), nanopartículas, polímeros, lipossomos, micelas, DPCs (vide, por exemplo, publicações internacionais WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 e WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141, cada uma delas é incorporada no presente documento a título de referência), ou outros sistemas de libe- ração disponíveis na técnica. Composições farmacêuticas e formulações
[00212] Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente docu- mento podem ser preparados como composições farmacêuticas ou formulações. Em algumas modalidades, as composições farmacêuti- cas incluem pelo menos um agente RNAi de APOC3. Essas composi- ções farmacêuticas são particularmente úteis na inibição da expressão do mRNA alvo em uma célula alvo, um grupo de células, um tecido ou um organismo. As composições farmacêuticas podem ser usadas para tratar um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio que se beneficia- ria da redução no nível do mRNA alvo ou inibição na expressão do ge- ne alvo. As composições farmacêuticas podem ser usadas para tratar um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, distúrbio, ou con- dição que se beneficiaria da redução do nível do mRNA alvo ou uma inibição na expressão do gene alvo. Em uma modalidade, o método inclui administrar um agente RNAi de APOC3 ligado a um ligante de direcionamento conforme descrito no presente documento, a um indi- víduo a ser tratado. Em algumas modalidades, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis (incluindo veículos, carreadores, diluen- tes e/ou polímeros de liberação) são adicionados às composições far- macêuticas incluindo um agente RNAi de APOC3, formando com isso uma formulação farmacêutica adequada para a liberação in vivo a um indivíduo, incluindo um ser humano.
[00213] As composições farmacêuticas que incluem um agente RNAi de APOC3 e métodos divulgados no presente documento podem reduzir o nível do mRNA alvo em uma célula, grupo de células, grupo de células, tecido ou indivíduo, incluindo: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente RNAi de APOC3 descrito no presente documento, inibindo com isso a expressão do mRNA de APOC3 no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi anteriormente identificado como tendo uma suprarregulação pato- gênica do gene alvo na célula ou tecido direcionado.
[00214] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas incluindo um agente RNAi de APOC3 são usadas para tratar ou administrar as apresentações clínicas associadas com níveis ele- vados de TG e/ou superexpressam de mRNA de APOC3 em um indi- víduo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz (incluindo profilaticamente) de uma ou mais das composições farmacêuticas é administrada a um indivíduo que necessita do referido tratamento (incluindo a prevenção ou administração dos sintomas, do- enças ou distúrbios). Em algumas modalidades, a administração de qualquer um dos agentes RNAi de APOC3 divulgados pode ser usada para reduzir o número, gravidade e/ou frequência de sintomas de uma doença em um indivíduo.
[00215] As composições farmacêuticas descritas incluindo um agente RNAi de APOC3 podem ser usadas para tratar pelo menos um sintoma em um indivíduo tendo uma doença ou distúrbio que se bene- ficiaria da redução ou inibição de mRNA de APOC3. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo é administrado com uma quantidade terapeuti- camente eficaz de uma ou mais composições farmacêuticas incluindo um agente RNAi de APOC3 tratando assim o sintoma. Em outras mo- dalidades, o indivíduo é administrado com uma quantidade profilatica- mente eficaz de um ou mais agentes RNAi de APOC3, prevenindo com isso pelo menos um sintoma.
[00216] A forma de administração é a via pela qual um agente RNAi de APOC3 é colocado em contato com o corpo. Em geral, os métodos de administração de fármacos e oligonucleotídeos e ácidos nucleicos para o tratamento de um mamífero são bem conhecidos na técnica e podem ser aplicados para a administração das composições descritas no presente documento. Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente documento podem ser administrados através de qualquer forma adequada em uma preparação apropriadamente adaptada para a via específica. Sendo assim, as composições farmacêuticas descri- tas no presente documento podem ser administradas através de inje- ção, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intracutânea, subcutâ- nea, intraarticular ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são ad- ministradas através de injeção subcutânea.
[00217] As composições farmacêuticas incluindo um agente RNAi de APOC3 descritas no presente documento podem ser liberadas a uma célula, grupo de células, tecido ou indivíduo usando tecnologias de liberação de oligonucleotídeo conhecidas na técnica. Em geral, qualquer método adequado reconhecido na técnica para liberar uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com as composições descritas no presente documento. Por exemplo, a liberação pode ser através de administração local (por exemplo, injeção direta, implante ou administração tópica), administra- ção sistêmica ou vias subcutâneas, intravenosas, intraperitoneais ou parenterais, incluindo administração intracraniana (por exemplo, intra- ventricular, intraparenquimal e intratecal), intramuscular, transdérmica, vias aéreas (aerossol), nasal, oral, retal ou tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administra- das através de infusão ou injeção subcutânea ou intravenosa.
[00218] Consequentemente, em algumas modalidades, as compo- sições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composi- ções farmacêuticas descritas no presente documento são formuladas para administração a um indivíduo.
[00219] Conforme usado no presente documento, a composição farmacêutica ou medicamento inclui uma quantidade farmacologica- mente eficaz de pelo menos um dos compostos terapêuticos descritos e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis (excipientes) são substâncias dife- rentes do ingrediente farmacêutico ativo (API, produto terapêutico, por exemplo, agente RNAi de APOC3) que são intencionalmente incluídos no sistema de liberação de fármacos. Os excipientes não exercem ou não pretendem exercer um efeito terapêutico na dosagem pretendida. Os excipientes podem agir para a) auxiliar no processamento do sis- tema de liberação de fármacos durante a fabricação, b) proteger, sus- tentar ou aumentar a estabilidade, biodisponibilidade ou aceitabilidade pelo paciente do API, c) assistir na identificação do produto, e/ou d) aumentar qualquer outro atributo da segurança total, eficácia da libe- ração do API durante armazenagem ou uso. Um excipiente farmaceu- ticamente aceitável pode ou não ser uma substância inerte.
[00220] Os excipientes incluem, porém não se limitam a: melhora- dores de absorção, antiaderentes, agentes antiespumantes, antioxi- dantes, aglutinantes, agentes tampão, carreadores, agentes de reves- timento, cores, melhoradores de liberação, polímeros de liberação, dextrana, dextrose, diluentes, desintegrantes, emulsificadores, exten- sores, cargas, flavorizantes, deslizantes, umectantes, lubrificantes, óleos, polímeros, conservantes, solução salina, sais, solventes, açúca- res, agentes de suspensão, matrizes de liberação continuada, edulco- rantes, agentes espessantes, agentes de tonicidade, veículos, agentes hidro-repelentes e agentes umectantes.
[00221] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá-
vel incluem soluções aquosas estéreis (sejam hidrossolúveis) ou dis- persões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para a administração intravenosa, carreadores adequados incluem solução fisiológica salina, água bacte- riostática, Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou tampão fos- fato salino (PBS). Os carreadores adequados devem ser estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem e devem ser conservadas contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, pro- pileno glicol e polietileno glicol líquido), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, com o uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e com o uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotôni- cos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das compo- sições injetáveis pode ser causada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00222] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas atra- vés da incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido pela esterilização do filtro. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril, o qual contém um meio de dis- persão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem seca- gem a vácuo e liofilização que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução estéril anteri- ormente filtrada da mesma.
[00223] As formulações adequadas para a administração intra- articular podem estar na forma de uma preparação aquosa estéril do fármaco que pode estar na forma microcristalina, por exemplo, na for- ma de uma suspensão aquosa microcristalina. As formulações lipos- somais ou sistemas de polímero biodegradável também podem ser usados para apresentar o fármaco para ambas a administração intra- articular e oftálmica.
[00224] Os compostos ativos podem ser preparados com carreado- res que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulada. Os polímeros biodegradá- veis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, poli anidridas, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido po- lilático. Os métodos para a preparação das referidas formulações fica- rão aparentes àqueles versados na técnica. As suspensões liposso- mais também podem ser usadas como carreadores farmaceuticamen- te aceitáveis. Essas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-americana No. 4,522,811.
[00225] Os agentes RNAi APOC3 podem ser formulados em com- posições na forma farmacêutica unitária para facilidade de administra- ção e uniformidade da dosagem. A forma farmacêutica unitária se refe- re a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitá- rias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quan- tidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêu- tico necessário. A especificação para as formas farmacêuticas unitá- rias da divulgação é ditada por e diretamente dependente das caracte-
rísticas únicas do composto ativo e do efeito terapêutico a ser alcan- çado, e as limitações inerentes na técnica da formação de um referido composto ativo para o tratamento de indivíduos.
[00226] A composição farmacêutica pode conter outros componen- tes adicionais comumente encontrados nas composições farmacêuti- cas. Os referidos componentes adicionais incluem, porém não se limi- tam a: antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais, analgésicos, anti-histaminas ou agentes anti-inflamatórios (por exemplo, acetamino- feno, NSAIDs, difenidramina, etc). Também é previsto que células, te- cidos ou órgãos isolados que expressam ou compreendem os agentes RNAi definidos no presente documento podem ser usados como "composições farmacêuticas." Conforme usado no presente documen- to, "quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidade terapeutica- mente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" se refere àquela quantidade de um agente RNAi para produzir um resultado farmacoló- gico, terapêutico ou preventivo.
[00227] Em algumas modalidades, os métodos divulgados no pre- sente documento ainda compreendem a etapa de administração de um segundo produto terapêutico ou tratamento além da administração de um agente RNAi divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, o segundo produto terapêutico é um outro agente RNAi de APOC3 (por exemplo, um agente RNAi de APOC3 que direciona uma sequência diferente dentro do alvo de APOC3). Em outras moda- lidades, o segundo produto terapêutico pode ser um fármaco de molé- cula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um aptâ- mero.
[00228] Em geral, uma quantidade eficaz de um composto ativo es- tará na faixa de cerca de 0,1 até cerca de 100 mg/kg de peso corpo- ral/dia, por exemplo, de cerca de 1,0 até cerca de 50 mg/kg de peso corporal/dia. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um composto ativo estará na faixa de cerca de 0,25 até cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo estará na faixa de cerca de 0,5 até cer- ca de 4 mg/kg de peso corporal por dose. A quantidade administrada também dependerá provavelmente das referidas variáveis como o es- tado de saúde geral do paciente, a relativa eficácia biológica do com- posto liberado, a formulação do fármaco, a presença e tipos de excipi- entes na formulação, e a forma de administração. Além disso, deve ser compreendido que a dose inicial administrada pode, em alguns casos, ser aumentada além do nível acima superior de modo a alcançar rapi- damente o nível sanguíneo ou tecidual desejado, ou a dosagem inicial pode, em alguns casos, ser menor do que a ideal.
[00229] Para o tratamento de doença ou para a formação de um medicamento ou composição para o tratamento de uma doença, as composições farmacêuticas descritas no presente documento incluin- do um agente RNAi de APOC3 podem ser combinadas com um exci- piente ou com um segundo agente terapêutico ou tratamento incluindo, porém não limitado a: um segundo ou outro agente RNAi, um fármaco de molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, pep- tídeo e/ou um aptâmero.
[00230] Os agentes RNAi de AP0C3 descritos, quando adicionados aos excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis podem ser acondicionados em kits, recipientes, embalagens ou dispensado- res. As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser acondicionadas em seringas preenchidas ou frascos. Métodos de tratamento e inibição da expressão
[00231] Os agentes RNAi de APOC3 divulgados no presente docu- mento podem ser usados para tratar um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou outro mamífero) que tem uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da administração do composto. Em algumas modalida-
des, os agentes RNAi divulgados no presente documento podem ser usados para tratar um indivíduo (por exemplo, um ser humano) que tem uma doença ou distúrbio que se beneficiaria de uma redução ou uma inibição na expressão de mRNA de APOC3, por exemplo, um in- divíduo que foi diagnosticado com ou tem o risco de desenvolver sin- tomas relacionados à obesidade, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, metabolismo anormal do lipídio e/ou colesterol, aterosclerose, doença cardiovascular, doença arterial coronariana, pancreatite mediada por hipertrigliceridemia, síndrome metabólica, diabetes mellitus do tipo II, síndrome de quilomicronemia familiar, lipodistrofia parcial familiar, e/ou distúrbios e doenças relacionados a problemas metabólicos.
[00232] O indivíduo é administrado uma quantidade terapeutica- mente eficaz de qualquer um ou mais agentes RNAi. O indivíduo pode ser um ser humano, paciente ou paciente humano. O indivíduo pode ser um adulto, adolescente, criança ou infante. A administração da composição farmacêutica descrita no presente documento pode ser a um ser ser humano ou animal.
[00233] Em algumas modalidades, os agentes RNAi APOC3 descri- tos no presente documento são usados para tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio relacionado a APOC3. Em algumas modali- dades, os agentes RNAi de APOC3 descritos no presente documento são usados para tratar um indivíduo que se beneficiaria de uma redu- ção ou inibição da expressão genética de APOC3. Em algumas moda- lidades, os agentes RNAi de APOC3 descritos são usados para tratar (incluindo profilaticamente) pelo menos um sintoma ou estado patoló- gico mediado pelo menos em parte pela expressão genética de APOC3. O indivíduo é administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos agentes RNAi descritos. Em algu- mas modalidades, o indivíduo é administrado uma quantidade profilati- camente eficaz de qualquer um ou mais dos agentes RNAi descritos,
prevenindo assim pelo menos um sintoma.
[00234] Em certas modalidades, a presente invenção provê méto- dos para tratamento de doenças, distúrbios, condições ou estados pa- tológicos mediados pelo menos em parte pela expressão de APOC3, em um paciente que necessita do mesmo, em que os métodos incluem administrar ao paciente qualquer um dos agentes RNAi APOC3 descri- tos no presente documento.
[00235] Em algumas modalidades, os agentes RNAi APOC3 são usados para tratar ou administrar uma apresentação clínica de um in- divíduo com uma doença ou distúrbio relacionado a APOC3. O indiví- duo é administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos agentes RNAi APOC3 ou composições contendo agente RNAi de APOC3 descritos no presente documento. Em algumas mo- dalidades, o método compreende administrar uma composição com- preendendo um agente RNAi de APOC3 descrito no presente docu- mento a um indivíduo a ser tratado.
[00236] Em algumas modalidades, o nível de expressão genética e/ou nível de mRNA de um gene APOC3 em um indivíduo ao qual um agente RNAi APOC3 descrito é administrado é reduzido em pelo me- nos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais do que 99% relativo ao indivíduo antes de ser administrado o agente RNAi APOC3 ou a um indivíduo que não está recebendo o agente RNAi de APOC3. O nível de expressão genética e/ou nível de mRNA no indivíduo é reduzido em uma célula, grupo de células e/ou tecido do indivíduo.
[00237] Em algumas modalidades, o nível de proteína de APOC3 em um indivíduo ao qual um agente RNAi de APOC3 descrito foi ad- ministrado em pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% relativo ao indivíduo antes de ser administrado o agente RNAi de APOC3 ou a um indivíduo que não recebe o agente RNAi de APOC3. O nível de proteína no indivíduo é reduzido em uma célula, grupo de células, tecido, sangue e/ou outro fluido do indivíduo.
[00238] Em algumas modalidades, os níveis de triglicerídeo (TG) em um indivíduo ao qual um agente RNA de APOC3 foi administrado em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% relativo ao indivíduo antes de ser administrado o agente RNAi de APOC3 ou a um indivíduo que não recebe o agente RNA de APOC3. O nível de TG no indivíduo pode ser reduzido em uma célula, grupo de células, tecido, sangue e/ou outro fluido do indi- víduo.
[00239] Em algumas modalidades, os níveis de colesterol total em um indivíduo ao qual um agente RNAi de APOC3 descrito foi adminis- trado em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% relativo ao indivíduo antes de ser adminis- trado o agente RNAi de APOC3 ou a um indivíduo que não recebe o agente RNAi de APOC3. Em algumas modalidades, os níveis de co- lesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL) em um indivíduo ao qual um agente RNAi de APOC3 foi administrado em pelo menos cer- ca de 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% relativo ao indivíduo antes de ser administrado o agente RNAi de APOC3 ou a um indivíduo que não recebe o agente RNAi de APOC3. Os níveis de colesterol total e/ou níveis de colesterol LDL no indivíduo podem ser reduzidos em uma célula, grupo de células, tecido, sangue e/ou outro fluido do indivíduo.
[00240] Uma redução na expressão genética, mRNA, níveis de pro- teína APOC3, níveis de TG, níveis de colesterol e níveis de colesterol
LDL pode ser avaliada por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Conforme usado no presente documento, uma redução ou di- minuição no nível de mRNA de APOC3 e/ou nível de proteína são co- letivamente referidos no presente documento como uma redução ou diminuição em APOC3 ou inibição ou redução ou inativação da ex- pressão de APOC3. Os exemplos apresentados no presente docu- mento ilustram métodos conhecidos para avaliar a inibição da expres- são genética de APOC3. Células, tecidos, órgãos e organismos não humanos
[00241] As células, tecidos, órgãos e organismos não humanos que incluem pelo menos um dos agentes RNAi de APOC3 descritos no presente documento estão contemplados. A célula, tecido, órgão ou organismo não humano é feito ao se liberar o agente RNAi na célula, tecido, órgão ou organismo não humano.
[00242] As modalidades e itens providos acima são ilustrados agora com os seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLOS Exemplo 1. Síntese dos agentes RNAi de APOC3.
[00243] Os dúplices do agente RNAi de APOC3 mostrados na tabe- la 3 e tabela 6, acima, foram sintetizados de acordo com os seguintes procedimentos gerais:
[00244] A. Síntese. Os filamentos senso e antissenso dos agentes RNAi de APOC3 foram sintetizados de acordo com a tecnologia de fosforamidita na fase sólida na síntese de oligonucleotídeo. Depen- dendo da escala, qualquer um entre um MerMade96E® (Bioautoma- tion), aMerMadel2® (Bioautomation), ou um OP Pilot 100 (GE Heal- thcare) foi usado. As sínteses foram realizadas em um suporte sólido feito de vidro poroso controlado (CPG, 500 A ou 600A, obtido da Prime Synthesis, Aston, PA, USA). Todos os RNA e fosforamiditas de RNA 2'-modificado foram adquiridas da Thermo Fisher Scientific (Milwau-
kee, WI, USA). De forma específica, as seguintes 2'-0-metil fosforami- ditas foram usadas: (5'-0-dimetoxitritil-N6-(benzoyl)-2'-0-metil- adenosina-3'-0-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita, 5 '-0- dimetoxi-tritil-N4-(acetil)-2'-0-metil-citidina-3'-0-(2-cianoetil-N,N- diisopropil-amino) fosforamidita, (5'-0-dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2'-0- metil-guanosina-3'-0-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita, e 5'-0-dimetoxitritil-2'-0-metil-uridina-3'-0-(2-cianoetil-N,N- diisopropilamino) fosforamidita. As 2'-desoxi-2'-fluoro-fosforamiditas carregaram os mesmos grupos de proteção como as 2'-0-metil amidi- tas. As 5'-dimetoxitritil-2'-0-metil-inosina-3'-0-(2-cianoetil-N,N- diisopropilamino) fosforamiditas foram adquiridas da Glen Research (Virginia) ou Hongene Biotech. As (3'-0-dimetoxitritil-2'-desoxirribose- 5'-0-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamiditas abásicas inverti- das foram adquiridas da ChemGenes (Wilmington, MA, USA). A 5'- (4,4'-dimetoxitritil)-2',3'-seco-uridina, 2'-benzoil-3'-[(2-cianoetil)-(N,N- diisopropil)] -fosforamidita também foi adquirida da Thermo Fisher Sci- entific ou Hongene Biotech. A 5'-0-dimetoxitritil-N2,N6-(fenoxiacetato)- 2'-0-metil-diaminopurina-3'-0-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosfo- ramidita foi obtida da ChemGenes ou Hongene Biotech.
[00245] As fosforamiditas contendo ligante de direcionamento foram dissolvidas em diclorometano anidro ou acetonitrila anidra (50 mM), enquanto todas as outras amiditas foram dissolvidas em acetonitrila anidra (50 mM), ou dimetilformamida anidra e peneiras moleculares (3A) foram adicionadas. 5-Benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM em ace- tonitrila) ou 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT, 250 mM em acetonitrila) foi usa- do como solução ativadora. Os tempos de acoplamento foram de 12 min (RNA), 15 min (ligante de direcionamento), 90 segundos (2'OMe) e 60 segundos (2'F). Para introduzir as ligações de fosforotioato, uma solução 100 mM de 3-fenil 1,2,4-ditiazolina-5-ona (POS, obtida da PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA) em acetonitrila anidra foi empre-
gada. A menos que identificado especificamente como um agente RNAi "puro" tendo nenhum ligante de direcionamento presente, cada um dos dúplices do agente RNAi de APOC3 sintetizados e testados nos exemplos seguintes utilizou N-acetil-galactosamina como "NAG" nas estruturas químicas do ligante de direcionamento representado na tabela 7.
[00246] B. Clivagem e desproteção do oligômero ligado de su- porte. Depois da finalização da síntese de fase sólida, o suporte sólido seco foi tratado como uma solução 1:1 de metil amina 40% em peso em água e 28% de solução de hidróxido de amônio (Aldrich) por 1,5 horas a 30°C. A solução foi evaporada e o resíduo sólido foi reconstitu- ído em água (vide abaixo).
[00247] C. Purificação. Os oligômeros brutos foram purificados através de HPLC de troca iônica usando uma coluna TSKgel SuperQ- 5PW 13µm e sistema Shimadzu LC-8. O tampão A foi de 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 9,0 e continha 20% de acetonitrila e o tampão B foi o mesmo que o tampão A com a adição de cloreto de sódio 1,5 M. Os traços de UV em 260 nm foram registrados. As frações apropriadas foram agrupadas e depois executadas em HPLC de exclusão de ta- manho usando uma coluna GE Healthcare XK 26/40 com Sephadex G-25 fine com um tampão de execução de água DI filtrada ou bicarbo- nato de amônio 100mM, pH 6,7 e 20% de acetonitrila.
[00248] D. Anelamento. Os filamentos complementares foram mis- turados ao se combinar soluções equimolares de RNA (senso e antis- senso) em tampão fosfato salino 1 x (Coming, Cellgro) para formar os agentes RNAi. Alguns agentes RNAi foram liofilizados e armazenados em -15 a -25°C. A concentração dúplex foi determinada pela medição da absorvência de solução em um espectrômetro UV-Vis em tampão fosfato salino 1x. A absorvência da solução em 260 nm foi então multi- plicada por um fator de conversão e o fator de diluição para determinar a concentração de dúplex. A menos que declarado de outra forma, to- do o fator de conversão foi de 0,037 mg/(mL-cm). Para alguns experi- mentos, um fator de conversão foi calculado a partir de um coeficiente de extinção experimentalmente determinado. Exemplo 2. Teste in vitro dos agentes RNAi de APOC3.
[00249] Os dúplices de sequência candidato mostrados na tabela 3, acima, foram testados in vitro. Os agentes RNAi de APOC3 foram pre- parados de acordo com os procedimentos apresentados no Exemplo
1.
[00250] A avaliação dos agentes RNAi de APOC3 in vitro foi reali- zada através de transfecção das células HuH7, uma linhagem de car- cinoma hepatocelular humano. As células foram colocadas em -7,500 células por poço em um formato de 96 poços, e cada um dos 65 dúpli- ces do agente RNAi de APOC3 mostrado na tabela 3 foi transfectados em três concentrações (10 nM; 1 nM e 0,1 nM), usando reagente de transfecção LipoFectamine RNAiMax (Thermo Fisher). A expressão relativa de cada um dos agentes RNAi APOC3 foi determinada por qRT-PCR ao comparar os níveis de expressão de mRNA de APOC3 a um controle endógeno, e normalizada para células HuH7 não tratasas (análise ΔΔCT), conforme mostrado na tabela 8. Sendo assim, para Dúplex ID No. 56_1, a expressão média relativa em 1 nM de 0,126 mostra knockdown do gene APOC3 de 87,4%.
Tabela 8. Teste in vitro dos agentes RNAi de APOC3 Dúplex ID Exp.
Rel. alto (erro) Baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- No. médio 10 ro) médio 1 ro) médio 0.1 ro) nM nM nM 56_1 0,081 0,013 0,016 0,126 0,033 0,045 0,249 0,083 0,125 56_2 0,076 0,014 0,017 0,116 0,027 0,035 0,190 0,060 0,088 56_3 0,084 0,016 0,020 0,124 0,028 0,036 0,313 0,114 0,179 56_4 0,098 0,023 0,031 0,155 0,045 0,063 0,534 0,122 0,157 56_5 0,100 0,026 0,034 0,138 0,029 0,036 0,511 0,161 0,236
166/223 58_1 0,130 0,028 0,035 0,237 0,021 0,023 0,713 0,177 0,235 58_2 0,118 0,018 0,021 0,319 0,039 0,045 0,602 0,058 0,064 58_3 0,070 0,011 0,013 0,152 0,018 0,020 0,383 0,025 0,026 58_4 0,069 0,012 0,015 0,168 0,022 0,025 0,453 0,031 0,034 58_5 0,062 0,009 0,011 0,189 0,047 0,062 0,557 0,045 0,049 228_1 0,055 0,011 0,014 0,377 0,039 0,043 0,684 0,043 0,046 228_2 0,096 0,011 0,013 0,472 0,040 0,043 0,720 0,074 0,083 228_3 0,143 0,023 0,027 0,525 0,021 0,022 0,804 0,035 0,036 228_4 0,115 0,018 0,022 0,518 0,036 0,038 0,740 0,029 0,030 228_5 0,165 0,029 0,035 0,547 0,040 0,043 0,721 0,036 0,038 235_1 0,142 0,025 0,030 0,566 0,045 0,049 0,737 0,035 0,036
Dúplex ID Exp.
Rel. alto (erro) Baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- No. médio 10 ro) médio 1 ro) médio 0.1 ro) nM nM nM 235_2 0,064 0,013 0,016 0,370 0,030 0,033 0,713 0,042 0,045 235_3 0,029 0,008 0,011 0,085 0,015 0,018 0,535 0,048 0,053 235_4 0,050 0,010 0,012 0,197 0,018 0,019 0,652 0,045 0,048 235_5 0,079 0,019 0,025 0,328 0,043 0,050 0,719 0,113 0,134 243_1 0,044 0,012 0,017 0,222 0,046 0,058 0,671 0,114 0,137 243_2 0,035 0,008 0,011 0,358 0,041 0,047 0,701 0,068 0,076
167/223 243_3 0,022 0,007 0,009 0,142 0,033 0,042 0,567 0,070 0,080 243_4 0,016 0,007 0,013 0,115 0,018 0,021 0,502 0,073 0,086 243_5 0,039 0,011 0,016 0,123 0,019 0,022 0,597 0,050 0,055 260_1 0,021 0,007 0,011 0,390 0,062 0,074 0,719 0,034 0,035 260_2 0,042 0,008 0,010 0,728 0,062 0,068 0,719 0,042 0,045 260_3 0,026 0,008 0,012 0,747 0,067 0,073 0,685 0,044 0,047 260_4 0,021 0,009 0,015 0,507 0,064 0,073 0,749 0,064 0,070 260_5 0,057 0,014 0,019 0,572 0,040 0,043 0,745 0,051 0,054 261_1 0,046 0,007 0,008 0,295 0,039 0,045 0,766 0,044 0,046 261_2 0,052 0,017 0,024 0,611 0,037 0,039 0,823 0,050 0,053 261_3 0,032 0,007 0,009 0,303 0,025 0,028 0,727 0,024 0,025
Dúplex ID Exp.
Rel. alto (erro) Baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- No. médio 10 ro) médio 1 ro) médio 0.1 ro) nM nM nM 261_4 0,027 0,005 0,007 0,756 0,031 0,032 0,690 0,032 0,033 261_5 0,041 0,005 0,006 0,868 0,099 0,112 0,737 0,031 0,032 270_1 0,031 0,006 0,008 0,294 0,052 0,063 0,719 0,046 0,049 270_2 0,055 0,015 0,020 0,344 0,066 0,082 0,738 0,036 0,038 270_3 0,047 0,014 0,019 0,359 0,019 0,020 0,811 0,028 0,029 270_4 0,023 0,005 0,006 0,212 0,019 0,021 0,706 0,034 0,035
168/223 270_5 0,027 0,007 0,010 0,615 0,030 0,032 0,685 0,036 0,038 272_1 0,046 0,011 0,015 0,398 0,024 0,025 0,696 0,015 0,015 272_2 0,057 0,012 0,015 0,343 0,030 0,033 0,719 0,059 0,064 272_3 0,071 0,010 0,012 0,269 0,034 0,039 0,736 0,034 0,036 272_4 0,061 0,018 0,026 0,135 0,016 0,018 0,747 0,041 0,044 272_5 0,089 0,023 0,031 0,322 0,025 0,027 0,793 0,029 0,030 273_1 0,014 0,004 0,006 0,066 0,019 0,026 0,665 0,043 0,046 273_2 0,016 0,004 0,005 0,064 0,012 0,015 0,676 0,040 0,042 273_3 0,012 0,003 0,005 0,041 0,007 0,008 0,606 0,041 0,044 273_4 0,016 0,003 0,004 0,060 0,009 0,011 0,687 0,036 0,038 273_5 0,024 0,004 0,004 0,101 0,008 0,009 0,736 0,055 0,059
Dúplex ID Exp.
Rel. alto (erro) Baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- Exp.
Rel. alto (erro) baixo (er- No. médio 10 ro) médio 1 ro) médio 0.1 ro) nM nM nM 349_1 0,044 0,007 0,009 0,196 0,017 0,018 0,711 0,091 0,104 349_2 0,054 0,017 0,025 0,226 0,015 0,016 0,820 0,058 0,063 349_3 0,031 0,012 0,020 0,157 0,019 0,021 0,761 0,073 0,081 349_4 0,033 0,013 0,022 0,148 0,015 0,017 0,810 0,096 0,108 349_5 0,043 0,016 0,024 0,214 0,013 0,014 0,853 0,077 0,084 434_1 0,074 0,008 0,009 0,147 0,019 0,021 0,860 0,044 0,047
169/223 434_2 0,031 0,004 0,005 0,055 0,012 0,016 0,390 0,080 0,101 434_3 0,026 0,003 0,004 0,053 0,011 0,015 0,418 0,015 0,016 434_4 0,020 0,004 0,005 0,085 0,023 0,032 0,488 0,018 0,019 434_5 0,024 0,002 0,002 0,096 0,024 0,032 0,661 0,039 0,042 437_1 0,028 0,005 0,006 0,073 0,022 0,031 0,689 0,033 0,034 437_2 0,046 0,006 0,006 0,150 0,037 0,049 0,798 0,030 0,031 437_3 0,044 0,005 0,005 0,043 0,006 0,007 0,591 0,023 0,024 437_4 0,023 0,004 0,006 0,030 0,005 0,006 0,759 0,033 0,035 437_5 0,024 0,002 0,003 0,061 0,006 0,006 0,750 0,048 0,051
Exemplo 3. Modelo de camundongo APOC3-SEAP
[00251] Os camundongos albinos fêmea C57BL/6 de seis a oito semanas foram transitoriamente transfectados in vivo com plasmídeo através de injeção hidrodinâmica na veia da cauda, administrada pelo menos 15 dias antes da administração de um agente RNAi de APOC3 ou controle. O plasmídeo contém a sequência de cDNA de APOC3 (GenBank NM_000040.1 (SEQ ID NO: 1)) inserida na 3' UTR do gene repórter da SEAP (fosfatase alcalina placentária humana secretada). 50 μg do plasmídeo contendo a sequência de cDNA de APOC3 em solução de Ringer em um volume total de 10% do peso corporal do animal foram injetados nos camundongos pela veia da cauda para cri- ar os camundongos modelo APOC3-SEAP. A solução foi injetada atra- vés de uma agulha de 27-gauge em 5-7 segundos conforme descrito anteriormente (Zhang G et al. , "High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA." Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, pl735-1737.). A inibição da expressão de APOC3 por um agente RNAi de APOC3 resulta na inibição concomi- tante da expressão de SEAP, que é medida. No dia -1, os níveis de expressão de SEAP no soro foram medidos pelo sistema de ensaio do gene repórter Phospha-Light™ SEAP (Invitrogen), e os camundongos foram agrupados de acordo com os níveis médios de SEAP.
[00252] Análises: Os níveis de SEAP podem ser medidos em vários momentos, tanto antes quanto depois da administração dos agentes RNAi de APOC3.
[00253] i) Coleta do soro: Os camundongos foram anestesiados com 2-3% de isoflurano e amostras de sangue foram coletadas da área submandibular nos tubos de separação de soro (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany). O sangue foi deixado coagular em tempe- ratura ambiente por 20 min. Os tubos foram centrifugados em 8,000 xg por 3 min para separar o soro e armazenados a 4°C.
[00254] ii) Níveis de SEAP no soro: O soro foi coletado e medido pelo sistema de ensaio de gene repórter Phospha-Light™ SEAP (Invi- trogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de SEAP no soro para cada animal foram normalizados até o grupo controle de camundongos injetados com solução salina de modo a contabilizar o declínio relacionado ao não tratamento na expressão de APOC3 com este modelo. Em primeiro lugar, o nível de SEAP para cada animal em um momento foi dividido pelo nível de expressão do pré-tratamento naquele animal (dia -1) de modo a determinar a razão de expressão "normalizada ao pré-tratamento". A expressão em um momento espe- cífico foi então normalizada até o grupo controle ao se dividir a razão de "normalizada ao pré-tratamento" para um animal individual pela ra- zão média "normalizada ao pré-tratamento" de todos os camundongos no grupo controle de solução fisiológica salina normal. Alternadamen- te, em alguns exemplos apresentados no presente documento, os ní- veis de SEAP no soro para cada animal foram avaliados ao normalizar apenas os níveis de pré-tratamento. Exemplo 4. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em camun- dongos APOC3-SEAP.
[00255] O modelo de camundongo APOC3-SEAP descrito no Exemplo 3, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma administração subcutânea única de 200 μl contendo tanto 5 mg/kg (mpk) de um agente RNAi de APOC3, 3 mg/kg de um agente RNAi de APOC3 ou 200 μl do tampão fosfato salino sem um agente RNAi de APOC3 a ser usado como um controle, de acordo com a ta- bela 9 que segue.
Tabela 9. Grupos de dosagem dos camundongos APOC3-SEAP do Exemplo 4. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de Dosagem A Solução salina (nenhum agente RNAi) Injeção única no dia 1 B 5,0 mg/kg de AD04812 Injeção única no dia 1 C 5,0 mg/kg de AD04813 Injeção única no dia 1 D 5,0 mg/kg de AD04814 Injeção única no dia 1 E 3,0 mg/kg de AD04814 Injeção única no dia 1 F 5,0 mg/kg de AD04815 Injeção única no dia 1 G 5,0 mg/kg de AD04816 Injeção única no dia 1 H 3,0 mg/kg de AD04816 Injeção única no dia 1 I 5,0 mg/kg de AD04817 Injeção única no dia 1 J 5,0 mg/kg de AD04818 Injeção única no dia 1 K 5,0 mg/kg de AD04819 Injeção única no dia 1 L 5,0 mg/kg de AD04820 Injeção única no dia 1 M 5,0 mg/kg de AD04821 Injeção única no dia 1
[00256] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do fila- mento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos de N-acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modi- ficadas conforme apresentadas nas estruturas dúplex no presente do- cumento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificações específicas e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00257] As injeções foram realizadas entre a pele e músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e ombro. Três (3) camundongos em cada grupo foram testados (n=3). O soro foi coletado no dia 8, dia 15, dia 22 e dia 29 e os níveis de expressão de SEAP foram determinados em relação ao procedimento apresentado no exemplo 3, acima. Os dados a partir do experimento são mostrados na tabela 10 que segue, com SEAP médio refletindo o valor médio normalizado de SEAP:
Tabela 10. SEAP médio normalizado ao pré-tratamento e controle de salina em camundongos APOC3-SEAP a partir do exemplo 4. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio SEAP padrão SEAP padrão SEAP padrão SEAP padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo A (Solução salina) 1,000 0,157 1,000 0,603 1,000 0,864 1,000 0,701 Grupo B (5,0 mg/kg AD04812) 0,112 0,009 0,112 0,009 0,047 0,014 0,089 0,032 Grupo C (5,0 mg/kg AD04813) 0,091 0,009 0,046 0,015 0,052 0,019 0,102 0,045
173/223 Grupo D (5,0 mg/kg AD04814) 0,065 0,023 0,045 0,016 0,039 0,017 0,073 0,027 Grupo E (3,0 mg/kg AD04814) 0,075 0,021 0,041 0,037 0,047 0,046 0,059 0,053 Grupo F (5,0 mg/kg AD04815) 0,090 0,005 0,032 0,015 0,026 0,012 0,046 0,018 Grupo G (5,0 mg/kg AD04816) 0,401 0,122 0,399 0,136 0,274 0,053 0,331 0,094 Grupo H (3,0 mg/kg AD04816) 0,389 0,129 0,292 0,090 0,218 0,070 0,185 0,039 Grupo I (5,0 mg/kg AD04817) 0,371 0,210 0,266 0,091 0,098 0,014 0,144 0,033 Grupo J (5,0 mg/kg AD04818) 0,373 0,028 0,467 0,190 0,218 0,153 0,323 0,232 Grupo K (5,0 mg/kg AD04819) 0,216 0,123 0,334 0,034 0,407 0,053 0,408 0,042 Grupo L (5,0 mg/kg AD04820) 0,164 0,085 0,226 0,206 0,219 0,165 0,252 0,157 Grupo M (5,0 mg/kg AD04821) 0,169 0,097 0,128 0,061 0,150 0,105 0,191 0,143
[00258] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, grupos B até M) mostrou redução substan- cial em SEAP conforme comparado com o controle de salina (Grupo A) em torno de todos os momentos medidos. Por exemplo, o agente RNAi de APOC3 AD04815 exibiu aproximadamente uma redução de 97,4% em SEAP no dia 22 depois de uma única injeção de 5,0 mg/kg (0,026). Exemplo 5. Modelo de camundongo transgênico APOC3
[00259] Para acessar e avaliar o efeito de certos outros agentes RNAi de APOC3 in vivo, os camundongos transgênicos APOC3 foram adquiridos comercialmente e usados (The Jackson Laboratory, 006907 -B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J). Para os camundongos transgêni- cos APOC3, os níveis de proteína APOC3 humana em soro foram me- didos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00260] Para a normalização, o nível de APOC3 para cada animal em um momento foi dividido pelo nível de expressão do pré-tratamento em que o animal a determinar a razão de expressão "normalizada até pré-dose". Em alguns exemplos reportados no presente documento, a expressão em um momento específico também foi então normalizada ao grupo controle de veículo pela divisão a razão "normalizada até pré- dose" para um animal individual pela razão média "normalizada até pré-dose" de todos os camundongos no grupo controle de veículo. Isto resultou na expressão para cada momento normalizado para aquele no grupo de controle.
[00261] Os níveis de APOC3 podem ser medidos em vários mo- mentos, tanto antes quanto depois da administração dos agentes RNAi de APOC3. A menos que notado de outra forma no presente docu- mento, os camundongos foram anestesiados com 2-3% de isoflurano e as amostras de sangue foram coletadas da área submandibular nos tubos de separação do soro (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Ger- many). O sangue foi deixado coagular em temperatura ambiente por 20 min. Os tubos foram centrifugados em 8,000 xg por 3 min para se- parar o soro e armazenados a 4°C. Exemplo 6. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em camun- dongos transgênicos APOC3.
[00262] O modelo de camundongo transgênico de APOC3 descrito no exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma administração subcutânea única de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou controle (D5W), que incluiu os grupos de dosagem mostrados na tabela 11 que segue. Tabela 11. Grupos de dosagem dos camundongos transgênicos APOC3 do exemplo 6. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem A D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 B 4,0 mg/kg de AD05172 Injeção única no dia 1 C 2,0 mg/kg de AD05172 Injeção única no dia 1 D 1,0 mg/kg de AD05172 Injeção única no dia 1 E 0,5 mg/kg de AD05172 Injeção única no dia 1 F 1,0 mg/kg de AD05215 Injeção única no dia 1 G 1,0 mg/kg de AD05216 Injeção única no dia 1 H 1,0 mg/kg de AD05217 Injeção única no dia 1 I 1,0 mg/kg de AD05218 Injeção única no dia 1 J 1,0 mg/kg de AD05171 Injeção única no dia 1 K 2,0 mg/kg de AD05219 Injeção única no dia 1 L 2,0 mg/kg de AD05222 Injeção única no dia 1 M 2,0 mg/kg de AD05221 Injeção única no dia 1 N 2,0 mg/kg de AD05223 Injeção única no dia 1
[00263] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 foi conjugado a um ligante de direcionamento que inclui três N-acetil-galactosaminas (isto é, um ligante NAG tridentado), tendo as sequências modificadas e as estruturas NAG conforme apresentadas no presente documento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificações específicas e informação da estrutura para os agentes RNAi de APOC3 usados no Exemplo 6).
[00264] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Três (3) camundongos em cada grupo foi testado (n=3). O soro foi coletado dos camundongos, incluindo no dia -1 (pré-dose sangrada com um jejum de uma hora), e os dias 8, 15, 22 e 29. Os camundon- gos foram jejuados por quatro horas para cada coleta. Os níveis de expressão de APOC3 foram determinados em relação ao procedimen- to apresentado no Exemplo 5, acima. Os dados são mostrados na ta- bela 12 que segue, com APOC3 médio refletindo o valor normalizado médio da proteína APOC3 expressada no soro:
Tabela 12. Proteína APOC3 média normalizada até o pré-tratamento e controle veículo (D5W) em camundongos transgênicos APOC3 do exemplo 6. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo A (D5W) 1,000 0,038 1,000 0,177 1,000 0,154 1,000 0,152 Grupo B (4,0 mg/kg AD05172) 0,074 0,018 0,067 0,018 0,083 0,008 0,105 0,019 Grupo C (2,0 mg/kg AD05172) 0,094 0,022 0,084 0,017 0,101 0,013 0,126 0,029
177/223 Grupo D (1,0 mg/kg AD05172) 0,113 0,039 0,115 0,038 0,150 0,050 0,212 0,095 Grupo E (0,5 mg/kg AD05172) 0,153 0,050 0,191 0,087 0,245 0,102 0,461 0,169 Grupo F (1,0 mg/kg AD05215) 0,114 0,003 0,124 0,016 0,173 0,037 0,550 0,119 Grupo G (1,0 mg/kg AD05216) 0,148 0,042 0,136 0,016 0,185 0,031 0,342 0,034 Grupo H (1,0 mg/kg AD05217) 0,161 0,020 0,179 0,025 0,241 0,048 0,464 0,306 Grupo I (1,0 mg/kg AD05218) 0,168 0,064 0,210 0,127 0,517 0,248 0,779 0,418 Grupo J (1,0 mg/kg AD05171) 0,125 0,039 0,126 0,043 0,165 0,050 0,302 0,117 Grupo K (2,0 mg/kg AD05219) 0,091 0,044 0,070 0,018 0,084 0,025 0,095 0,034 Grupo L (2,0 mg/kg AD05222) 0,130 0,054 0,230 0,114 0,265 0,147 0,484 0,047 Grupo M (2,0 mg/kg AD05221) 0,131 0,026 0,148 0,041 0,289 0,126 0,410 0,098 Grupo N (2,0 mg/kg AD05223) 0,082 0,047 0,062 0,019 0,073 0,021 0,080 0,022
[00265] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, grupos B até M) mostrou uma redução em APOC3 quando comparado ao controle (grupo A) em torno dos tem- pos medidos. Por exemplo, depois de uma única dose de 2,0 mg/kg no dia 1, o agente RNAi de APOC3 AD05223 mostrou uma redução de aproximadamente 94% (0,062) no dia 15. Exemplo 7. Teste in vivo de agentes RNAi de APOC3 em camun- dongos transgênicos APOC3.
[00266] O modelo de camundongo transgênico APOC3 descrito no Exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma única administração subcutânea de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou controle (D5W) de acordo com os grupos de dosagem mostrados na tabela 13 que segue. Tabela 13. Grupos de dosagem de camundongos transgênicos APOC3 do exemplo 7. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 1 D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 2 1,0 mg/kg de AD05172 Injeção única no dia 1 3 1,0 mg/kg de AD05255 Injeção única no dia 1 4 1,0 mg/kg de AD05169 Injeção única no dia 1 5 1,0 mg/kg de AD05249 Injeção única no dia 1 6 1,0 mg/kg de AD05250 Injeção única no dia 1 7 1,0 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 8 1,0 mg/kg de AD05252 Injeção única no dia 1 9 1,0 mg/kg de AD05253 Injeção única no dia 1 10 1,0 mg/kg de AD05254 Injeção única no dia 1 11 1,0 mg/kg de AD05220 Injeção única no dia 1
[00267] Cada um dos agentes RNAi APOC3 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do fila- mento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos N-
acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modifi- cadas conforme apresentado nas estruturas dúplex no presente do- cumento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificações específicas e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00268] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Três (3) camundongos em cada grupo foram testados (n=3). O soro foi coletado dos camundongos, incluindo no dia -1 (pré-dose san- grada com um jejum de quatro horas), e dias 8, 15, 22 e 29. Os ca- mundongos foram jejuados por quatro horas antes de cada coleta. Os níveis de expressão de APOC3 foram determinados em relação ao procedimento apresentado no exemplo 5, acima. Os dados do dia 8 do experimento são mostrados na tabela 14 que segue, com APOC3 mé- dio refletindo o valor médio normalizado da proteína APOC3 expres- sada no soro:
Tabela 14. Proteína APOC3 média normalizada ao pré-tratamento e controle veículo (D5W) em camundongos trans- gênicos APOC3 do exemplo 7. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,092 1,000 0,096 1,000 0,089 1,000 0,103 Grupo 2 (1,0 mg/kg AD05172) 0,125 0,033 0,133 0,040 0,175 0,050 0,198 0,061 Grupo 3 (1,0 mg/kg AD05255) N/A* N/A* 0,279 0,394 0,969 0,050 1,103 0,216
180/223 Grupo 4 (1,0 mg/kg AD05169) 0,179 0,056 0,185 0,067 0,206 0,058 0,245 0,084 Grupo 5 (1,0 mg/kg AD05249) 0,212 0,045 0,263 0,055 0,460 0,083 0,863 0,586 Grupo 6 (1,0 mg/kg AD05250) 0,167 0,070 0,146 0,048 0,169 0,062 0,203 0,051 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05251) 0,140 0,071 0,121 0,077 0,170 0,094 0,181 0,103 Grupo 8 (1,0 mg/kg AD05252) 0,143 0,045 0,167 0,050 0,184 0,048 0,296 0,088 Grupo 9 (1,0 mg/kg AD05253) 0,192 0,068 0,202 0,063 0,238 0,096 0,473 0,220 Grupo 10 (1,0 mg/kg AD05254) 0,184 0,075 0,225 0,075 0,296 0,124 0,294 0,137 Grupo 11 (1,0 mg/kg AD05220) 0,089 0,012 0,109 0,014 0,107 0,018 0,118 0,027 * amostras para o grupo 3, dia 8 foram perdidas devido à falha no equipamento
[00269] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, grupos 2 até 11) mostrou uma redução em níveis de proteína APOC3 conforme comparado ao controle (grupo 1) nos dias 8 e 15. Em particular, os agentes RNAi de APOC3 AD05251 e AD05169 (cada um tendo uma sequência do filamento antissenso designada para direcionar a posição 438 de um gene APOC3 (isto é, SEQ ID NO: 1), assim como o agente RNA de APOC3 AD05220 (ten- do uma sequência do filamento antissenso designada para direcionar a posição 506 de um gene APOC3), mostrou o efeito inibidor particu- larmente potente. (vide, por exemplo, grupos 4, 7 e 11 na tabela 14, acima). Exemplo 8. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em camun- dongos transgênicos APOC3.
[00270] O modelo camundongo transgênico APOC3 descrito no exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma única administração subcutânea de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou controle (D5W) de acordo com os grupos de dosagem mostrados na tabela 13 que se- gue. Tabela 15. Grupos de dosagem do exemplo 8. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 1 D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 2 0,5 mg/kg de AD05540 Injeção única no dia 1 3 0,5 mg/kg de AD05283 Injeção única no dia 1 4 0,5 mg/kg de AD05705 Injeção única no dia 1 5 0,5 mg/kg de AD05706 Injeção única no dia 1 6 0,5 mg/kg de AD05707 Injeção única no dia 1 7 0,5 mg/kg de AD05708 Injeção única no dia 1 8 0,5 mg/kg de AD05709 Injeção única no dia 1 9 0,5 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 10 0,5 mg/kg de AD05169 Injeção única no dia 1
Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 11 0,5 mg/kg de AD05710 Injeção única no dia 1 12 0,5 mg/kg de AD05711 Injeção única no dia 1 13 0,5 mg/kg de AD05712 Injeção única no dia 1 14 0,5 mg/kg de AD05713 Injeção única no dia 1 15 0,5 mg/kg de AD05220 Injeção única no dia 1 16 0,5 mg/kg de AD05714 Injeção única no dia 1
[00271] Cada um dos agentes RNAi APOC3 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do fila- mento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos de N-acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modi- ficadas conforme apresentado nas estruturas dúplex no presente do- cumento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificações específicas e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00272] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Três (3) camundongos em cada grupo foram testados (n=3), exce- to para o grupo 1 (veículo D5W) onde quatro (4) camundongos foram testados (n=4). O soro foi coletado no dia -1 (pré-dose sangrada com um jejum de 4 horas), e dias 8, e 15, 22 e 29. Os camundongos foram jejuados por quatro horas antes de cada coleta. Os níveis de expres- são de APOC3 foram determinados em relação ao procedimento apre- sentado no exemplo 5, acima. Triglicerídeos, lipoproteína de alta den- sidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL) e colesterol total no soro também foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00273] Os níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de HDL e níveis de colesterol total para cada animal foram normaliza- dos. Para a normalização, o nível da proteína APOC3, triglicerídeo, HDL, LDL e colesterol total, respectivamente, para cada animal em um momento, foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expressão na- quele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de ex- pressão "normalizada ao pré-tratamento". A expressão em um tempo específico foi então normalizada ao grupo veículo de controle dividindo a razão "normalizada ao pré-tratamento" para um animal individual pe- la razão média "normalizada ao pré-tratamento" de todos os camun- dongos no grupo veículo de controle.
Isto resultou na expressão para cada tempo normalizado para aquele no grupo controle.
Os dados do experimento são mostrados nas tabelas 16 até 20 que seguem:
Tabela 16. Proteína APOC3 média normalizada ao pré-tratamento e veículo de controle (D5W) do exemplo 8. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,104 1,000 0,297 1,000 0,343 1,000 0,354 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05540) 0,196 0,020 0,203 0,044 0,254 0,079 0,370 0,128 Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05283) 0,178 0,077 0,195 0,080 0,282 0,070 0,331 0,038 Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05705) 0,146 0,053 0,150 0,050 0,239 0,080 0,330 0,111 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05706) 0,153 0,067 0,156 0,076 0,206 0,068 0,309 0,065 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05707) 0,102 0,030 0,158 0,023 0,227 0,035 0,441 0,160
184/223 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05708) 0,203 0,091 0,211 0,079 0,264 0,098 0,504 0,237 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05709) 0,213 0,086 0,190 0,078 0,299 0,143 0,467 0,250 Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05251) 0,170 0,062 0,142 0,062 0,138 0,073 0,184 0,061 Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05169) 0,290 0,131 0,320 0,054 0,309 0,039 0,433 0,060 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05710) 0,379 0,024 0,481 0,146 0,696 0,116 0,790 0,171 Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05711) 0,331 0,028 0,325 0,036 0,334 0,037 0,545 0,238 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05712) 0,208 0,058 0,223 0,130 0,247 0,132 0,419 0,227 Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05713) 0,216 0,092 0,305 0,131 0,453 0,070 0,646 0,053 Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05220) 0,232 0,104 0,125 0,071 0,205 0,129 0,333 0,192 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05714) 0,338 0,025 0,259 0,069 0,422 0,012 0,550 0,092
Tabela 17. Triglicerídeos médios normalizados ao pré-tratamento e veículo de controle (D5W) do exemplo 8. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio TG padrão Avg padrão TG padrão TG padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,279 1,000 0,454 1,000 0,423 1,000 0,440 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05540) 0,232 0,041 0,218 0,072 0,264 0,111 0,370 0,192 Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05283) 0,222 0,154 0,225 0,153 0,319 0,188 0,358 0,117 Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05705) 0,141 0,036 0,123 0,033 0,237 0,088 0,338 0,098 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05706) 0,154 0,073 0,145 0,093 0,218 0,124 0,316 0,121 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05707) 0,109 0,049 0,156 0,069 0,184 0,030 0,433 0,267
185/223 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05708) 0,279 0,154 0,259 0,139 0,229 0,118 0,674 0,426 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05709) 0,283 0,155 0,221 0,134 0,274 0,154 0,606 0,393 Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05251) 0,340 0,248 0,322 0,232 0,294 0,203 0,372 0,262 Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05169) 0,274 0,202 0,306 0,078 0,276 0,062 0,341 0,118 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05710) 0,360 0,087 0,409 0,197 0,700 0,155 0,707 0,276 Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05711) 0,268 0,096 0,288 0,061 0,293 0,054 0,488 0,248 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05712) 0,170 0,068 0,171 0,100 0,213 0,127 0,448 0,264 Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05713) 0,183 0,088 0,262 0,148 0,399 0,083 0,581 0,135 Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05220) 0,208 0,121 0,081 0,048 0,280 0,135 0,351 0,263 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05714) 0,319 0,082 0,242 0,101 0,461 0,059 0,596 0,150
Tabela 18. Colesterol total médio normalizado ao pré-tratamento e veículo de controle (D5W) do exemplo 8. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,063 1,000 0,370 1,000 0,386 1,000 0,335 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05540) 0,414 0,103 0,464 0,144 0,483 0,179 0,583 0,214 Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05283) 0,488 0,215 0,498 0,203 0,573 0,197 0,597 0,155 Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05705) 0,377 0,230 0,359 0,205 0,401 0,198 0,429 0,199 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05706) 0,342 0,108 0,357 0,099 0,360 0,098 0,437 0,091
186/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05707) 0,271 0,196 0,294 0,176 0,322 0,176 0,441 0,235 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05708) 0,435 0,203 0,457 0,203 0,523 0,230 0,629 0,290 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05709) 0,455 0,233 0,436 0,197 0,454 0,216 0,590 0,321 Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05251) 0,504 0,313 0,554 0,345 0,533 0,327 0,636 0,398 Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05169) 0,544 0,240 0,595 0,285 0,538 0,235 0,578 0,155 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05710) 0,686 0,138 0,810 0,240 0,916 0,185 0,987 0,242 Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05711) 0,493 0,105 0,457 0,094 0,483 0,076 0,658 0,222 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05712) 0,414 0,214 0,440 0,258 0,416 0,227 0,556 0,322 Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05713) 0,354 0,148 0,441 0,187 0,557 0,108 0,658 0,014 Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05220) 0,393 0,227 0,418 0,273 0,427 0,288 0,526 0,271 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05714) 0,632 0,014 0,706 0,011 0,797 0,030 0,932 0,070
Tabela 19. HDL médio normalizado ao pré-tratamento e veículo de controle (D5W) do exemplo 8. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio HDL padrão HDL padrão HDL padrão HDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,365 1,000 0,141 1,000 0,100 1,000 0,338 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05540) 1,489 0,197 1,676 0,305 2,040 0,388 1,629 0,375 Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05283) 2,192 1,116 2,227 1,009 2,859 1,499 1,982 0,785 Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05705) 1,558 0,433 1,531 0,260 1,772 0,334 0,953 0,316 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05706) 2,248 0,626 2,556 0,938 2,736 0,875 1,878 0,629
187/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05707) 1,179 0,038 1,221 0,162 1,352 0,204 1,100 0,266 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05708) 1,086 0,158 1,187 0,252 1,670 0,203 0,972 0,400 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05709) 1,251 0,187 1,308 0,280 1,519 0,299 1,000 0,346 Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05251) 1,337 0,326 1,369 0,372 1,961 0,901 1,426 0,438 Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05169) 1,239 0,023 1,050 0,436 1,180 0,633 1,242 0,416 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05710) 1,169 0,089 1,417 0,356 1,359 0,149 1,244 0,290 Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05711) 1,666 0,481 1,360 0,314 1,607 0,627 1,486 0,824 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05712) 1,255 0,577 1,214 0,560 1,344 0,587 0,939 0,427 Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05713) 1,324 0,264 1,347 0,402 1,519 0,673 1,047 0,507 Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05220) 0,763 0,345 0,954 0,539 1,042 0,533 0,963 0,093 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05714) 0,960 0,145 1,099 0,151 1,382 0,108 1,124 0,022
Tabela 20. LDL médio normalizado ao pré-tratamento e veículo de controle (D5W) do exemplo 8. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio LDL padrão LDL padrão LDL padrão LDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,000 0,314 1,000 0,350 1,000 0,448 1,000 0,268 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05540) 0,265 0,076 0,318 0,100 0,340 0,104 0,517 0,199 Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05283) 0,404 0,201 0,426 0,209 0,560 0,292 0,596 0,166 Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05705) 0,303 0,245 0,271 0,209 0,315 0,191 0,378 0,224 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05706) 0,226 0,101 0,272 0,056 0,266 0,052 0,367 0,067
188/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05707) 0,160 0,128 0,204 0,146 0,259 0,159 0,337 0,164 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05708) 0,251 0,130 0,281 0,100 0,459 0,214 0,445 0,137 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05709) 0,242 0,135 0,230 0,077 0,389 0,209 0,371 0,166 Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05251) 0,467 0,338 0,542 0,351 0,688 0,478 0,836 0,547 Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05169) 0,341 0,064 0,495 0,395 0,396 0,197 0,459 0,106 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05710) 0,742 0,257 0,997 0,398 0,944 0,357 1,228 0,474 Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05711) 0,526 0,135 0,401 0,116 0,737 0,388 0,919 0,367 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05712) 0,373 0,156 0,423 0,182 0,440 0,193 0,477 0,294 Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05713) 0,312 0,159 0,370 0,144 0,736 0,194 1,007 0,242 Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05220) 0,369 0,164 0,337 0,204 0,401 0,278 0,465 0,191 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05714) 0,440 0,062 0,500 0,055 0,710 0,114 0,842 0,229
[00274] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, grupos 2 até 16) mostrou uma redução nos níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de colesterol total e níveis de LDL conforme comparado ao controle (grupo 1). Por exemplo, uma única dose de 0,5 mg/kg do agente RNAi de APOC3 AD05251 (Grupo 7) mostrou no dia 22 uma redução de aproximada- mente 86% dos níveis de proteína APOC3 (0,138), uma redução de aproximadamente 70% nos níveis de triglicerídeo (0,294), uma redu- ção de aproximadamente 47% dos níveis de colesterol total (0,533) e uma redução de aproximadamente 31% nos níveis de LDL (0,688). Além disso, conforme antecipado, no dia 22 a administração de AD05251 mostrou um aumento nos níveis de HDL (vide, por exemplo, Tabela 19 acima). Exemplo 9. Teste da resposta de dose in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em camundongos transgênicos APOC3.
[00275] O modelo de camundongo transgênico APOC3 descrito no exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma única administração subcutânea de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou controle (D5W) de acordo com os grupos de dosagem mostrados na tabela 21 que se- gue: Tabela 21. Grupos de dosagem do exemplo 9. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 1 D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 2 0,01 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 3 0,05 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 4 0,1 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 5 0,25 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 6 0,5 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 7 1,0 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 8 3,0 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 9 0,01 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1
Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 10 0,05 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 11 0,1 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 12 0,25 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 13 0,5 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 14 1,0 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 15 3,0 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1
[00276] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do fila- mento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos N- acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo a estrutura de (NAG37)s. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificação específica e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00277] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Quatro (4) camundongos em cada grupo foram testados. O soro foi coletado no dia-1 (pré-dose sangrada com um jejum de 4 horas), e dias 8, 15, 22, 29 e 36. Os camundongos foram jejuados por quatro horas antes de cada coleta. Os níveis de expressão de APOC3, trigli- cerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), e colesterol total no soro foram medidos em um Co- bas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomenda- ções do fabricante.
[00278] Os níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de HDL, e níveis de colesterol total para cada animal foram normaliza- dos. Para a normalização, o nível de proteína APOC3, triglicerídeo, HDL, LDL, e colesterol total, respectivamente, para cada animal em um momento, foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de ex- pressão "normalizada até pré-dose”. Os dados do experimento são mostrados nas tabelas 22 até 26 que seguem:
Tabela 22. Proteína APOC3 média normalizada até pré-dose do exemplo 9. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio de padrão de padrão de padrão de padrão de padrão APOC3 (+/-) APOC3 (+/-) APOC3 (+/-) APOC3 (+/-) APOC3 (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,205 0,162 1,224 0,145 1,102 0,257 1,011 0,148 1,103 0,133 Grupo 2 (0,01 mg/kg AD05876) 0,859 0,255 0,970 0,231 1,050 0,101 1,001 0,091 0,990 0,121 Grupo 3 (0,05 mg/kg AD05876) 0,835 0,048 0,933 0,154 0,919 0,166 1,094 0,259 1,111 0,244 Grupo 4 (0,1 mg/kg AD05876) 0,472 0,053 0,630 0,047 0,742 0,100 0,798 0,117 0,937 0,064
191/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05876) 0,342 0,049 0,423 0,045 0,495 0,056 0,734 0,066 0,812 0,097 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05876) 0,188 0,030 0,211 0,045 0,289 0,029 0,386 0,047 0,504 0,050 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05876) 0,164 0,033 0,207 0,036 0,250 0,045 0,332 0,097 0,446 0,152 Grupo 8 (3,0 mg/kg AD05876) 0,086 0,015 0,110 0,024 0,128 0,037 0,141 0,023 0,157 0,031 Grupo 9 (0,01 mg/kg AD05251) 1,165 0,101 1,051 0,040 0,955 0,105 1,038 0,033 0,968 0,079 Grupo 10 (0,05 mg/kg AD05251) 0,675 0,051 0,694 0,056 0,692 0,046 0,836 0,139 0,921 0,087 Grupo 11 (0,1 mg/kg AD05251) 0,590 0,098 0,478 0,073 0,562 0,067 0,625 0,054 0,686 0,084 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05251) 0,273 0,067 0,295 0,039 0,354 0,055 0,479 0,137 0,580 0,071 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05251) 0,219 0,066 0,211 0,045 0,283 0,070 0,291 0,090 0,338 0,085 Grupo 14 (1,0 mg/kg AD05251) 0,157 0,026 0,143 0,034 0,230 0,067 0,280 0,093 0,310 0,072 Grupo 15 (3,0 mg/kg AD05251) 0,135 0,033 0,131 0,022 0,164 0,036 0,157 0,048 0,191 0,056
Tabela 23. Média de Triglicerídeos normalizada até pré-dose do exemplo 9. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio de TG padrão de TG padrão de TG padrão de TG padrão de TG padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,441 0,335 1,723 0,177 1,253 0,377 1,151 0,301 1,304 0,221 Grupo 2 (0,01 mg/kg AD05876) 0,988 0,436 1,139 0,421 1,177 0,271 1,209 0,242 1,259 0,325 Grupo 3 (0,05 mg/kg AD05876) 1,146 0,303 1,321 0,459 0,964 0,355 1,428 0,613 1,275 0,456 Grupo 4 (0,1 mg/kg AD05876) 0,671 0,176 0,700 0,131 0,912 0,204 0,918 0,265 1,073 0,175
192/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05876) 0,391 0,081 0,581 0,174 0,608 0,141 0,960 0,205 0,989 0,196 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05876) 0,216 0,060 0,202 0,054 0,306 0,092 0,465 0,147 0,493 0,066 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05876) 0,227 0,099 0,326 0,147 0,366 0,096 0,427 0,150 0,600 0,261 Grupo 8 (3,0 mg/kg AD05876) 0,090 0,024 0,166 0,037 0,165 0,044 0,184 0,048 0,222 0,037 Grupo 9 (0,01 mg/kg AD05251) 1,357 0,266 1,197 0,099 1,024 0,129 1,197 0,101 1,118 0,215 Grupo 10 (0,05 mg/kg AD05251) 0,784 0,137 0,950 0,278 0,725 0,137 1,013 0,270 1,108 0,257 Grupo 11 (0,1 mg/kg AD05251) 0,634 0,182 0,583 0,110 0,587 0,160 0,641 0,123 0,702 0,172 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05251) 0,330 0,119 0,397 0,076 0,393 0,042 0,583 0,236 0,614 0,057 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05251) 0,250 0,084 0,197 0,040 0,283 0,034 0,309 0,102 0,355 0,118 Grupo 14 (1,0 mg/kg AD05251) 0,213 0,054 0,171 0,073 0,273 0,059 0,384 0,135 0,347 0,079 Grupo 15 (3,0 mg/kg AD05251) 0,210 0,067 0,172 0,024 0,235 0,089 0,213 0,032 0,263 0,106
Tabela 24. Média de colesterol total normalizada até pré-dose do exemplo 9. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio de co- padrão de co- padrão de co- padrão de co- padrão de co- padrão lesterol (+/-) lesterol (+/-) lesterol (+/-) lesterol (+/-) lesterol (+/-) total total total total total Grupo 1 (D5W) 1,177 0,079 1,261 0,169 1,161 0,297 1,049 0,188 1,151 0,167 Grupo 2 (0,01 mg/kg AD05876) 1,020 0,231 1,099 0,186 1,193 0,147 1,132 0,087 1,141 0,157 Grupo 3 (0,05 mg/kg AD05876) 0,975 0,105 1,003 0,193 1,010 0,192 1,169 0,296 1,160 0,265 Grupo 4 (0,1 mg/kg AD05876) 0,694 0,115 0,749 0,101 0,851 0,122 0,876 0,155 1,005 0,063
193/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05876) 0,670 0,188 0,744 0,229 0,792 0,190 0,953 0,116 0,928 0,157 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05876) 0,556 0,146 0,600 0,178 0,628 0,127 0,672 0,126 0,768 0,107 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05876) 0,596 0,081 0,634 0,145 0,664 0,134 0,710 0,101 0,760 0,083 Grupo 8 (3,0 mg/kg AD05876) 0,547 0,057 0,556 0,104 0,589 0,130 0,564 0,098 0,572 0,101 Grupo 9 (0,01 mg/kg AD05251) 1,236 0,107 1,142 0,063 1,023 0,139 1,099 0,107 1,106 0,115 Grupo 10 (0,05 mg/kg AD05251) 0,785 0,083 0,813 0,107 0,784 0,106 0,944 0,147 0,995 0,135 Grupo 11 (0,1 mg/kg AD05251) 0,721 0,080 0,691 0,068 0,706 0,065 0,737 0,028 0,814 0,060 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05251) 0,562 0,115 0,617 0,104 0,632 0,081 0,705 0,076 0,777 0,044 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05251) 0,479 0,055 0,492 0,037 0,540 0,073 0,543 0,098 0,564 0,095 Grupo 14 (1,0 mg/kg AD05251) 0,634 0,137 0,687 0,163 0,634 0,172 0,669 0,163 0,700 0,174 Grupo 15 (3,0 mg/kg AD05251) 0,602 0,106 0,611 0,101 0,632 0,121 0,627 0,167 0,594 0,121
Tabela 25. Média de HDL normalizada até pré-dose do exemplo 9. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio de HDL padrão de HDL padrão de HDL padrão de HDL padrão de HDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,883 0,115 0,855 0,013 0,919 0,081 1,070 0,128 0,905 0,109 Grupo 2 (0,01 mg/kg AD05876) 1,029 0,087 1,086 0,209 0,987 0,191 1,096 0,088 0,969 0,100 Grupo 3 (0,05 mg/kg AD05876) 0,786 0,184 0,968 0,121 1,052 0,130 0,951 0,252 0,886 0,221 Grupo 4 (0,1 mg/kg AD05876) 1,129 0,133 1,147 0,098 1,022 0,213 1,109 0,106 0,911 0,177
194/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05876) 1,280 0,238 1,336 0,253 1,244 0,172 1,083 0,083 0,992 0,082 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05876) 1,516 0,241 1,574 0,182 1,368 0,185 1,327 0,172 1,350 0,237 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05876) 1,361 0,243 1,327 0,318 1,298 0,173 1,330 0,208 1,206 0,262 Grupo 8 (3,0 mg/kg AD05876) 1,620 0,459 1,452 0,347 1,542 0,371 1,477 0,227 1,417 0,322 Grupo 9 (0,01 mg/kg AD05251) 0,833 0,143 0,808 0,133 0,856 0,154 0,936 0,127 1,041 0,193 Grupo 10 (0,05 mg/kg AD05251) 1,036 0,111 0,913 0,017 1,027 0,030 0,974 0,168 0,976 0,142 Grupo 11 (0,1 mg/kg AD05251) 1,075 0,087 1,087 0,065 1,033 0,116 1,021 0,114 1,074 0,074 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05251) 1,118 0,094 1,175 0,062 1,100 0,051 1,142 0,146 1,152 0,113 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05251) 1,344 0,178 1,455 0,124 1,329 0,190 1,347 0,156 1,279 0,188 Grupo 14 (1,0 mg/kg AD05251) 1,338 0,143 1,501 0,175 1,179 0,221 1,218 0,247 1,282 0,179 Grupo 15 (3,0 mg/kg AD05251) 1,332 0,150 1,426 0,264 1,348 0,133 1,431 0,339 1,265 0,184
Tabela 26. Média de LDL normalizada até pré-dose do exemplo 9. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio de LDL padrão de LDL padrão de LDL padrão de LDL padrão de LDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,060 0,159 0,990 0,210 1,078 0,325 0,989 0,365 0,881 0,135 Grupo 2 (0,01 mg/kg AD05876) 1,031 0,068 1,071 0,181 1,077 0,082 0,992 0,154 0,958 0,081 Grupo 3 (0,05 mg/kg AD05876) 0,799 0,179 0,682 0,223 0,859 0,177 0,959 0,289 0,954 0,176 Grupo 4 (0,1 mg/kg AD05876) 0,535 0,019 0,593 0,071 0,636 0,145 0,692 0,100 0,840 0,089
195/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05876) 0,645 0,153 0,570 0,152 0,660 0,158 0,783 0,083 0,676 0,096 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05876) 0,624 0,238 0,645 0,192 0,620 0,067 0,581 0,086 0,893 0,088 Grupo 7 (1,0 mg/kg AD05876) 0,481 0,124 0,464 0,201 0,396 0,127 0,524 0,181 0,588 0,174 Grupo 8 (3,0 mg/kg AD05876) 0,455 0,161 0,465 0,154 0,428 0,159 0,359 0,099 0,382 0,140 Grupo 9 (0,01 mg/kg AD05251) 1,260 0,097 1,237 0,202 1,091 0,244 1,162 0,209 1,356 0,249 Grupo 10 (0,05 mg/kg AD05251) 0,682 0,048 0,641 0,127 0,715 0,032 0,792 0,123 0,847 0,223 Grupo 11 (0,1 mg/kg AD05251) 0,717 0,293 0,635 0,146 0,693 0,260 0,679 0,234 0,845 0,128 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05251) 0,439 0,151 0,502 0,147 0,614 0,190 0,552 0,037 0,716 0,205 Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05251) 0,413 0,086 0,474 0,048 0,508 0,149 0,542 0,209 0,514 0,162 Grupo 14 (1,0 mg/kg AD05251) 0,614 0,268 0,747 0,292 0,601 0,266 0,633 0,282 0,669 0,271 Grupo 15 (3,0 mg/kg AD05251) 0,488 0,162 0,469 0,099 0,498 0,176 0,445 0,230 0,405 0,142
[00279] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 testados exibiu uma dose-resposta na redução dos níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de colesterol total e níveis de LDL. Exemplo 10. Teste da dose-resposta in vivo de agentes RNAi de APOC3 em camundongos transgênicos APOC3.
[00280] O modelo de camundongo transgênico APOC3 descrito no exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma única administração subcutânea de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou veículo controle (D5W) de acordo com os grupos de dosagem mostrados na tabela 27 que segue: Tabela 27. Grupos de dosagem do exemplo 10. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 1 D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 2 0,25 mg/kg de AD05891 Injeção única no dia 1 3 0,25 mg/kg de AD05892 Injeção única no dia 1 4 0,25 mg/kg de AD05893 Injeção única no dia 1 5 0,25 mg/kg de AD05894 Injeção única no dia 1 6 0,25 mg/kg de AD05895 Injeção única no dia 1 7 0,25 mg/kg de AD05896 Injeção única no dia 1 8 0,25 mg/kg de AD05897 Injeção única no dia 1 9 0,25 mg/kg de AD05889 Injeção única no dia 1 10 0,25 mg/kg de AD05890 Injeção única no dia 1 11 0,25 mg/kg de AD05876 Injeção única no dia 1 12 0,25 mg/kg de AD05877 Injeção única no dia 1 13 0,25 mg/kg de AD05878 Injeção única no dia 1 14 0,25 mg/kg de AD05879 Injeção única no dia 1 15 0,25 mg/kg de AD05880 Injeção única no dia 1 16 0,25 mg/kg de AD05882 Injeção única no dia 1 17 0,25 mg/kg de AD05884 Injeção única no dia 1 18 0,25 mg/kg de AD05885 Injeção única no dia 1 19 0,25 mg/kg de AD05886 Injeção única no dia 1
Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 20 0,25 mg/kg de AD05887 Injeção única no dia 1 21 0,25 mg/kg de AD05888 Injeção única no dia 1 22 0,25 mg/kg de AD05769 Injeção única no dia 1
[00281] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do fila- mento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos N- acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modifi- cadas conforme apresentadas nas estruturas dúplex no presente do- cumento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificação específica e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00282] Os agentes RNAi APOC3 testados no exemplo 10 incluíram sequências nucleotídicas que foram designadas para direcionar as po- sições diferentes no gene de APOC3 (isto é, SEQ ID NO: 1). Mais es- pecificamente, os grupos 2-4 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05891, AD05892 e AD05893) incluíram sequências de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 248 de um gene APOC3; Grupo 5 (isto é, agente RNAi de APOC3 AD05894) incluíram uma sequência de filamento antissenso designada para direcionar a posição 263 de um gene APOC3; Grupos 6-7 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05895 e AD05896) incluíram sequências de filamento an- tissenso designadas para direcionar a posição 422 de um gene APOC3; Grupo 8 (isto é, agente RNAi de APOC3 AD05897) incluíram uma sequência de filamento antissenso designada para direcionar a posição 246 de um gene APOC3; Grupos 9-10 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05889 e AD05890) incluíram sequências de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 168 de um gene APOC3; e Grupos 11-22 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05876, AD05877, AD05878, AD05878, AD05880, AD05882, AD05884, AD05885, AD05886, AD05887, AD05888 e AD05769) incluíram se-
quências de filamento antissenso designadas para direcionar a posi- ção 438 de um gene APOC3.
[00283] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Três (3) camundongos em cada grupo foram testados (n=3). O soro foi coletado no dia-1 (pré-dose sangrada com um jejum de 4 ho- ras), e dias 8, 15. Para os camundongos testados com os certos agen- tes RNAi que exibiram atividade inibidora relativamente alta e para os camundongos dosados com o veículo controle, amostras adicionais de soro foram coletadas nos dias 22 e 29. Os camundongos foram jejua- dos por quatro horas antes de cada coleta. Os níveis de expressão de APOC3, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoprote- ína de baixa densidade (LDL), e colesterol total no soro foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00284] Os níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de HDL, e níveis de colesterol total para cada animal foram normaliza- dos. Para a normalização, o nível de proteína APOC3, triglicerídeo, HDL, LDL, e colesterol total, respectivamente, para cada animal em um momento, foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de ex- pressão "normalizada até a pré-dose". Os dados do experimento são mostrados nas tabelas 28 até 32 que seguem:
Tabela 28. Proteína APOC3 média normalizada até a pré-dose do exemplo 10 Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,130 0,131 0,892 0,155 1,182 0,272 1,126 0,174 Grupo 2 (0,25 mg/kg AD05891) 0,944 0,060 0,874 0,037 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,25 mg/kg AD05892) 0,831 0,101 0,840 0,116 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,25 mg/kg AD05893) 1,030 0,030 1,020 0,137 N/A N/A N/A N/A
199/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05894) 0,835 0,136 0,774 0,134 N/A N/A N/A N/A Grupo 6 (0,25 mg/kg AD05895) 0,771 0,186 0,632 0,157 N/A N/A N/A N/A Grupo 7 (0,25 mg/kg AD05896) 0,912 0,109 0,836 0,218 N/A N/A N/A N/A Grupo 8 (0,25 mg/kg AD05897) 0,726 0,102 0,777 0,134 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,25 mg/kg AD05889) 1,059 0,187 0,987 0,123 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,25 mg/kg AD05890) 0,984 0,091 1,119 0,145 N/A N/A N/A N/A Grupo 11 (0,25 mg/kg AD05876) 0,222 0,021 0,258 0,034 0,361 0,027 0,523 0,126 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05877) 0,457 0,034 0,392 0,065 0,492 0,134 N/A N/A Grupo 13 (0,25 mg/kg AD05878) 0,366 0,115 0,406 0,134 0,567 0,232 N/A N/A Grupo 14 (0,25 mg/kg AD05879) 0,560 0,082 0,493 0,121 0,679 0,085 N/A N/A Grupo 15 (0,25 mg/kg AD05880) 0,572 0,205 0,652 0,274 N/A N/A N/A N/A
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 16 (0,25 mg/kg AD05882) 1,117 0,230 1,160 0,188 N/A N/A N/A N/A Grupo 17 (0,25 mg/kg AD05884) 0,425 0,103 0,444 0,158 0,580 0,180 N/A N/A Grupo 18 (0,25 mg/kg AD05885) 0,629 0,024 0,782 0,109 N/A N/A N/A N/A Grupo 19 (0,25 mg/kg AD05886) 1,041 0,474 1,256 0,634 N/A N/A N/A N/A Grupo 20 (0,25 mg/kg AD05887) 0,390 0,106 0,608 0,159 N/A N/A N/A N/A
200/223 Grupo 21 (0,25 mg/kg AD05888) 0,429 0,107 0,591 0,105 N/A N/A N/A N/A Grupo 22 (0,25 mg/kg AD05769) 0,229 0,039 0,346 0,078 0,325 0,061 0,407 0,017
Tabela 29. Média de triglicerídeos normalizada até a pré-dose do exemplo 10. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio TG padrão TG padrão TG padrão TG padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,357 0,213 0,942 0,220 1,389 0,468 1,225 0,268 Grupo 2 (0,25 mg/kg AD05891) 1,123 0,127 0,908 0,057 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,25 mg/kg AD05892) 0,924 0,039 0,859 0,202 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,25 mg/kg AD05893) 1,262 0,056 1,168 0,189 N/A N/A N/A N/A
201/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05894) 0,903 0,297 0,834 0,239 N/A N/A N/A N/A Grupo 6 (0,25 mg/kg AD05895) 0,728 0,300 0,632 0,207 N/A N/A N/A N/A Grupo 7 (0,25 mg/kg AD05896) 0,929 0,107 0,907 0,268 N/A N/A N/A N/A Grupo 8 (0,25 mg/kg AD05897) 0,836 0,178 0,936 0,212 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,25 mg/kg AD05889) 1,162 0,270 1,096 0,270 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,25 mg/kg AD05890) 0,992 0,341 1,486 0,505 N/A N/A N/A N/A Grupo 11 (0,25 mg/kg AD05876) 0,234 0,054 0,316 0,091 0,333 0,026 0,581 0,203 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05877) 0,496 0,096 0,530 0,175 0,653 0,215 N/A N/A Grupo 13 (0,25 mg/kg AD05878) 0,450 0,214 0,619 0,314 0,781 0,434 N/A N/A Grupo 14 (0,25 mg/kg AD05879) 0,664 0,033 0,664 0,072 0,905 0,030 N/A N/A Grupo 15 (0,25 mg/kg AD05880) 0,726 0,384 0,790 0,399 N/A N/A N/A N/A
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio TG padrão TG padrão TG padrão TG padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 16 (0,25 mg/kg AD05882) 1,289 0,436 1,695 0,408 N/A N/A N/A N/A Grupo 17 (0,25 mg/kg AD05884) 0,376 0,132 0,554 0,283 0,605 0,296 N/A N/A Grupo 18 (0,25 mg/kg AD05885) 0,620 0,064 0,998 0,219 N/A N/A N/A N/A Grupo 19 (0,25 mg/kg AD05886) 1,315 0,665 1,941 1,267 N/A N/A N/A N/A Grupo 20 (0,25 mg/kg AD05887) 0,445 0,193 0,867 0,335 N/A N/A N/A N/A
202/223 Grupo 21 (0,25 mg/kg AD05888) 0,467 0,227 0,700 0,190 N/A N/A N/A N/A Grupo 22 (0,25 mg/kg AD05769) 0,204 0,033 0,377 0,068 0,373 0,097 0,370 0,071
Tabela 30. Média de colesterol total normalizada até a pré-dose do exemplo 10. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,186 0,199 0,761 0,107 1,131 0,325 1,203 0,267 Grupo 2 (0,25 mg/kg AD05891) 1,056 0,104 0,947 0,161 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,25 mg/kg AD05892) 0,860 0,111 0,856 0,142 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,25 mg/kg AD05893) 1,132 0,037 1,137 0,163 N/A N/A N/A N/A
203/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05894) 0,776 0,145 0,795 0,144 N/A N/A N/A N/A Grupo 6 (0,25 mg/kg AD05895) 0,852 0,275 0,808 0,220 N/A N/A N/A N/A Grupo 7 (0,25 mg/kg AD05896) 0,995 0,080 0,943 0,114 N/A N/A N/A N/A Grupo 8 (0,25 mg/kg AD05897) 0,978 0,160 1,015 0,136 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,25 mg/kg AD05889) 1,094 0,205 1,018 0,166 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,25 mg/kg AD05890) 1,032 0,055 1,015 0,196 N/A N/A N/A N/A Grupo 11 (0,25 mg/kg AD05876) 0,573 0,180 0,565 0,117 0,657 0,107 0,782 0,052 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05877) 0,673 0,141 0,595 0,156 0,688 0,235 N/A N/A Grupo 13 (0,25 mg/kg AD05878) 0,598 0,231 0,609 0,227 0,689 0,293 N/A N/A Grupo 14 (0,25 mg/kg AD05879) 0,705 0,052 0,655 0,041 0,848 0,111 N/A N/A Grupo 15 (0,25 mg/kg AD05880) 0,596 0,230 0,635 0,235 N/A N/A N/A N/A
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 16 (0,25 mg/kg AD05882) 1,169 0,241 1,268 0,327 N/A N/A N/A N/A Grupo 17 (0,25 mg/kg AD05884) 0,597 0,290 0,574 0,254 0,668 0,284 N/A N/A Grupo 18 (0,25 mg/kg AD05885) 0,765 0,192 0,837 0,089 N/A N/A N/A N/A Grupo 19 (0,25 mg/kg AD05886) 1,043 0,285 1,336 0,497 N/A N/A N/A N/A Grupo 20 (0,25 mg/kg AD05887) 0,679 0,087 0,843 0,174 N/A N/A N/A N/A
204/223 Grupo 21 (0,25 mg/kg AD05888) 0,674 0,292 0,807 0,302 N/A N/A N/A N/A Grupo 22 (0,25 mg/kg AD05769) 0,479 0,094 0,551 0,122 0,537 0,075 0,583 0,125
Tabela 31. Média de HDL normalizada até a pré-dose do exemplo 10. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio HDL padrão HDL padrão HDL padrão HDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,837 0,062 0,761 0,079 0,697 0,019 0,910 0,079 Grupo 2 (0,25 mg/kg AD05891) 0,668 0,206 0,809 0,267 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,25 mg/kg AD05892) 0,612 0,231 0,833 0,182 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,25 mg/kg AD05893) 0,779 0,343 0,820 0,331 N/A N/A N/A N/A
205/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05894) 0,856 0,148 0,942 0,212 N/A N/A N/A N/A Grupo 6 (0,25 mg/kg AD05895) 1,235 0,117 1,241 0,079 N/A N/A N/A N/A Grupo 7 (0,25 mg/kg AD05896) 1,279 0,792 1,248 0,740 N/A N/A N/A N/A Grupo 8 (0,25 mg/kg AD05897) 1,122 0,285 0,992 0,298 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,25 mg/kg AD05889) 0,783 0,278 0,718 0,203 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,25 mg/kg AD05890) 0,885 0,294 0,661 0,131 N/A N/A N/A N/A Grupo 11 (0,25 mg/kg AD05876) 2,059 0,818 1,747 0,597 1,981 0,319 1,748 0,825 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05877) 1,317 0,148 1,295 0,273 1,176 0,130 N/A N/A Grupo 13 (0,25 mg/kg AD05878) 1,421 0,294 1,273 0,262 0,999 0,328 N/A N/A Grupo 14 (0,25 mg/kg AD05879) 1,037 0,074 0,945 0,125 0,924 0,141 N/A N/A Grupo 15 (0,25 mg/kg AD05880) 0,905 0,266 0,855 0,051 N/A N/A N/A N/A
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio HDL padrão HDL padrão HDL padrão HDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 16 (0,25 mg/kg AD05882) 0,784 0,098 0,621 0,103 N/A N/A N/A N/A Grupo 17 (0,25 mg/kg AD05884) 1,529 0,486 1,228 0,309 1,149 0,257 N/A N/A Grupo 18 (0,25 mg/kg AD05885) 1,123 0,323 0,651 0,143 N/A N/A N/A N/A Grupo 19 (0,25 mg/kg AD05886) 1,047 0,343 0,675 0,181 N/A N/A N/A N/A Grupo 20 (0,25 mg/kg AD05887) 2,093 1,089 1,487 0,748 N/A N/A N/A N/A
206/223 Grupo 21 (0,25 mg/kg AD05888) 1,452 0,065 1,245 0,177 N/A N/A N/A N/A Grupo 22 (0,25 mg/kg AD05769) 1,289 0,219 1,186 0,202 1,125 0,231 1,325 0,044
Tabela 32. Média de LDL normalizada até a pré-dose do exemplo 10. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio LDL padrão LDL padrão LDL padrão LDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 1,456 0,391 1,107 0,243 1,506 0,751 1,568 0,650 Grupo 2 (0,25 mg/kg AD05891) 1,417 0,351 1,593 0,488 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,25 mg/kg AD05892) 0,875 0,398 0,951 0,170 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,25 mg/kg AD05893) 1,243 0,217 1,400 0,311 N/A N/A N/A N/A
207/223 Grupo 5 (0,25 mg/kg AD05894) 0,776 0,175 0,934 0,244 N/A N/A N/A N/A Grupo 6 (0,25 mg/kg AD05895) 1,223 0,413 1,208 0,361 N/A N/A N/A N/A Grupo 7 (0,25 mg/kg AD05896) 1,347 0,475 1,224 0,331 N/A N/A N/A N/A Grupo 8 (0,25 mg/kg AD05897) 1,206 0,398 1,255 0,137 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,25 mg/kg AD05889) 1,291 0,294 1,329 0,267 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,25 mg/kg AD05890) 1,171 0,363 1,091 0,284 N/A N/A N/A N/A Grupo 11 (0,25 mg/kg AD05876) 0,679 0,457 0,703 0,329 0,881 0,237 0,896 0,252 Grupo 12 (0,25 mg/kg AD05877) 0,575 0,162 0,531 0,187 0,624 0,304 N/A N/A Grupo 13 (0,25 mg/kg AD05878) 0,534 0,191 0,532 0,163 0,666 0,321 N/A N/A Grupo 14 (0,25 mg/kg AD05879) 0,602 0,043 0,671 0,060 0,939 0,171 N/A N/A Grupo 15 (0,25 mg/kg AD05880) 0,527 0,098 0,525 0,122 N/A N/A N/A N/A
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio LDL padrão LDL padrão LDL padrão LDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 16 (0,25 mg/kg AD05882) 1,252 0,279 1,568 0,525 N/A N/A N/A N/A Grupo 17 (0,25 mg/kg AD05884) 0,814 0,591 0,590 0,363 0,850 0,453 N/A N/A Grupo 18 (0,25 mg/kg AD05885) 0,827 0,171 0,798 0,043 N/A N/A N/A N/A Grupo 19 (0,25 mg/kg AD05886) 1,045 0,206 1,180 0,134 N/A N/A N/A N/A Grupo 20 (0,25 mg/kg AD05887) 0,756 0,118 0,794 0,156 N/A N/A N/A N/A
208/223 Grupo 21 (0,25 mg/kg AD05888) 0,745 0,460 0,945 0,499 N/A N/A N/A N/A Grupo 22 (0,25 mg/kg AD05769) 0,634 0,293 0,568 0,243 0,625 0,189 0,644 0,136
[00285] Conforme mostrado nas tabelas 28-32 acima, os agentes RNAi nos grupos 2 até 10 (isto é, agentes RNAi com filamentos antis- senso designados para direcionar um gene de APOC3 nas posições 248, 263, 422, 246 e 168) mostraram efeito inibidor relativamente limi- tado, particularmente quando comparado com os agentes RNAi nos grupos 11 até 22, os quais todos incluíram sequências nucleotídicas de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 438 de um gene APOC3. Além disso, daqueles agentes RNAi que incluem sequências direcionando a posição 438 do gene de APOC3, grupo 11 (AD05876) e grupo 22 (AD05769) mostraram o maior nível de efeito inibidor com relação aos níveis da proteína APOC3, triglicerídeos, e níveis de colesterol total. Exemplo 11. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em ca- mundongos transgênicos APOC3.
[00286] O modelo de camundongo transgênico APOC3 descrito no exemplo 5, acima, foi usado. No dia 1, cada camundongo foi dado uma única administração subcutânea de 200 μl do respectivo agente RNAi dissolvido em D5W (dextrose em 5% de água) ou veículo controle (D5W) de acordo com os grupos de dosagem mostrados na tabela 33 que segue: Tabela 33. Grupos de dosagem do exemplo 11. Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 1 D5W (sem agente RNAi) Injeção única no dia 1 2 0,5 mg/kg de AD05260 Injeção única no dia 1 3 0,5 mg/kg de AD05221 Injeção única no dia 1 4 0,5 mg/kg de AD05223 Injeção única no dia 1 5 0,5 mg/kg de AD05299 Injeção única no dia 1 6 0,5 mg/kg de AD05283 Injeção única no dia 1 7 0,5 mg/kg de AD05284 Injeção única no dia 1 8 0,5 mg/kg de AD05167 Injeção única no dia 1 9 0,5 mg/kg de AD05168 Injeção única no dia 1
Grupo Agente RNAi e Dose Regime de dosagem 10 0,5 mg/kg de AD05171 Injeção única no dia 1 11 0,5 mg/kg de AD05258 Injeção única no dia 1 12 0,5 mg/kg de AD05259 Injeção única no dia 1 13 0,5 mg/kg de AD05169 Injeção única no dia 1 14 0,5 mg/kg de AD05239 Injeção única no dia 1 15 0,5 mg/kg de AD05251 Injeção única no dia 1 16 0,5 mg/kg de AD05220 Injeção única no dia 1
[00287] Cada um dos agentes RNAi de APOC3 incluíram nucleotí- deos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ do filamento senso a um ligante de direcionamento que inclui três grupos N-acetil-galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modi- ficadas conforme apresentadas nas estruturas dúplex no presente do- cumento. (Vide as tabelas 4, 5, 6 e 7 para modificação específica e informação estrutural relacionada aos agentes RNAi de APOC3).
[00288] Os agentes RNAi de APOC3 testados no exemplo 11 incluí- ram as sequências nucleotídicas que foram designadas para direcio- nar posições diferentes no gene de APOC3 (isto é, SEQ ID NO: 1). Mais especificamente, o grupo 2 (isto é, agente RNAi de APOC3 AD05260) incluiu uma sequência de filamento antissenso designada para direcionar a posição 58 de um gene APOC3; Grupo 3 (isto é, agente RNAi de APOC3 AD05221) incluiu uma sequência de filamento antissenso designada para direcionar a posição 246 de um gene APOC3; grupos 4-7 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05223, AD05299, AD05283 e AD05284) incluíram sequências de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 432 de um gene APOC3; Grupos 8-12 (isto é, agentes RNAi de APOC3 AD05167, AD05168, AD05171, AD05258 e AD05259) incluíram sequências de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 434 de um gene APOC3; Grupos 13-15 (isto é, agentes RNAi de APOC3
AD05169, AD05239 e AD05251) incluíram sequências de filamento antissenso designadas para direcionar a posição 438 de um gene APOC3; e Grupo 16 (isto é, agente RNAi de APOC3 AD05220) incluiu uma sequência de filamento antissenso designada para direcionar a posição 506 de um gene APOC3.
[00289] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (isto é, injeções subcutâneas) na pele solta sobre a área do pescoço e om- bro. Três (3) camundongos em cada grupo foram testados (n=3). O soro foi coletado no dia-1 (pré-dose sangrada com um jejum de 4 ho- ras), e dias 8, 15. Para os camundongos dosados com os certos agen- tes RNAi que exibiram atividade inibidora relativamente alta e para os camundongos dosados com o veículo controle, amostras adicionais de soro foram coletadas nos dias 22 e 29. Os camundongos foram jejua- dos por quatro horas antes de cada coleta. Níveis de expressão de APOC3, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoprote- ína de baixa densidade (LDL), e colesterol total no soro foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00290] Os níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de HDL, e níveis de colesterol total para cada animal foram normaliza- dos. Para a normalização, o nível de proteína APOC3, triglicerídeo, HDL, LDL, e colesterol total, respectivamente, para cada animal em um momento, foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de ex- pressão "normalizada até a pré-dose". Os dados do experimento são mostrados nas tabelas 34 até 38 que seguem:
Tabela 34. Proteína APOC3 média normalizada até pré-dose do exemplo 11. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,854 0,102 0,866 0,140 0,881 0,079 0,857 0,140 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05260) 0,297 0,031 0,352 0,042 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05221) 0,483 0,060 0,619 0,046 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05223) 0,123 0,048 0,242 0,101 0,311 0,099 0,424 0,152 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05299) 0,272 0,047 0,589 0,016 N/A N/A N/A N/A
212/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05283) 0,108 0,014 0,121 0,011 0,163 0,009 0,201 0,032 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05284) 0,174 0,111 0,208 0,123 0,313 0,124 0,405 0,144 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05167) 0,466 0,093 0,656 0,286 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05168) 0,146 0,046 0,452 0,098 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05171) 0,191 0,088 0,199 0,095 0,419 0,070 0,548 0,087 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05258) 0,545 0,147 0,624 0,142 N/A N/A N/A N/A Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05259) 0,236 0,047 0,300 0,115 N/A N/A N/A N/A Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05169) 0,643 0,172 0,613 0,161 N/A N/A N/A N/A Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05239) 0,438 0,065 0,542 0,014 N/A N/A N/A N/A Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05251) 0,125 0,013 0,132 0,037 0,157 0,033 0,188 0,049 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05220) 0,211 0,012 0,201 0,087 0,230 0,045 0,342 0,166
Tabela 35. Média de triglicerídeos normalizada até pré-dose do exemplo 11. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média Desvio pa- Média Desvio pa- Média Desvio pa- Média Desvio pa- de TG drão (+/-) de TG drão (+/-) de TG drão (+/-) de TG drão (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,939 0,217 0,835 0,235 0,965 0,215 1,051 0,136 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05260) 0,259 0,085 0,324 0,124 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05221) 0,352 0,134 0,481 0,077 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05223) 0,133 0,034 0,228 0,057 0,327 0,060 0,451 0,105 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05299) 0,352 0,134 0,481 0,086 N/A N/A N/A N/A
213/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05283) 0,130 0,022 0,150 0,026 0,245 0,056 0,286 0,023 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05284) 0,203 0,162 0,275 0,231 0,350 0,199 0,477 0,260 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05167) 0,318 0,126 0,483 0,330 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05168) 0,188 0,014 0,330 0,010 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05171) 0,183 0,092 0,282 0,150 0,423 0,124 0,549 0,138 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05258) 0,479 0,167 0,622 0,187 N/A N/A N/A N/A Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05259) 0,294 0,015 0,360 0,190 N/A N/A N/A N/A Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05169) 0,728 0,253 0,561 0,163 N/A N/A N/A N/A Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05239) 0,381 0,038 0,422 0,057 N/A N/A N/A N/A Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05251) 0,110 0,032 0,092 0,019 0,134 0,051 0,186 0,072 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05220) 0,161 0,045 0,216 0,029 0,184 0,075 0,358 0,141
Tabela 36. Média de colesterol total normalizada até pré-dose do exemplo 11. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Coleste- padrão Coleste- padrão Coleste- padrão Coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,769 0,127 0,684 0,182 0,835 0,167 0,796 0,180 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05260) 0,320 0,081 0,367 0,072 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05221) 0,397 0,078 0,456 0,050 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05223) 0,393 0,176 0,450 0,189 0,476 0,186 0,606 0,193 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05299) 0,522 0,092 0,611 0,031 N/A N/A N/A N/A
214/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05283) 0,413 0,058 0,372 0,053 0,450 0,100 0,501 0,040 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05284) 0,430 0,270 0,444 0,241 0,519 0,252 0,604 0,315 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05167) 0,464 0,231 0,557 0,382 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05168) 0,298 0,034 0,388 0,012 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05171) 0,360 0,179 0,391 0,180 0,473 0,147 0,538 0,141 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05258) 0,619 0,094 0,668 0,135 N/A N/A N/A N/A Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05259) 0,643 0,053 0,511 0,187 N/A N/A N/A N/A Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05169) 0,731 0,089 0,636 0,013 N/A N/A N/A N/A Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05239) 0,571 0,106 0,561 0,085 N/A N/A N/A N/A Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05251) 0,248 0,065 0,287 0,147 0,260 0,074 0,305 0,114 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05220) 0,400 0,081 0,438 0,048 0,422 0,065 0,524 0,080
Tabela 37. Média de HDL normalizada até pré-dose do exemplo 11. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio HDL padrão HDL padrão HDL padrão HDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,825 0,119 0,893 0,217 0,912 0,179 0,886 0,262 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05260) 1,356 0,337 1,331 0,435 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05221) 1,483 0,266 0,953 0,166 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05223) 1,058 0,198 1,032 0,300 0,856 0,209 0,868 0,349 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05299) 1,456 0,345 1,137 0,460 N/A N/A N/A N/A
215/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05283) 2,494 0,174 2,150 0,465 1,731 0,397 1,738 0,156 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05284) 1,559 0,237 1,791 0,849 1,598 0,448 1,605 0,131 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05167) 1,239 0,287 1,310 0,108 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05168) 1,666 0,551 1,425 0,251 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05171) 1,514 0,286 1,435 0,248 0,941 0,005 0,827 0,111 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05258) 1,170 0,082 1,081 0,212 N/A N/A N/A N/A Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05259) 1,964 0,955 1,221 0,228 N/A N/A N/A N/A Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05169) 1,059 0,236 1,101 0,230 N/A N/A N/A N/A Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05239) 1,323 0,088 1,120 0,224 N/A N/A N/A N/A Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05251) 1,728 0,173 2,143 0,688 1,632 0,312 1,737 0,452 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05220) 1,660 0,391 1,797 0,384 1,803 0,637 1,479 0,333
Tabela 38. Média de LDL normalizada até pré-dose do exemplo 11. Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio LDL padrão LDL padrão LDL padrão LDL padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (D5W) 0,699 0,129 0,621 0,201 0,778 0,259 0,646 0,216 Grupo 2 (0,5 mg/kg AD05260) 0,398 0,108 0,317 0,046 N/A N/A N/A N/A Grupo 3 (0,5 mg/kg AD05221) 0,441 0,024 0,422 0,013 N/A N/A N/A N/A Grupo 4 (0,5 mg/kg AD05223) 0,441 0,280 0,437 0,219 0,514 0,264 0,589 0,219 Grupo 5 (0,5 mg/kg AD05299) 0,504 0,160 0,577 0,100 N/A N/A N/A N/A
216/223 Grupo 6 (0,5 mg/kg AD05283) 0,464 0,122 0,428 0,173 0,551 0,277 0,595 0,195 Grupo 7 (0,5 mg/kg AD05284) 0,394 0,258 0,404 0,179 0,398 0,214 0,471 0,290 Grupo 8 (0,5 mg/kg AD05167) 0,572 0,306 0,678 0,536 N/A N/A N/A N/A Grupo 9 (0,5 mg/kg AD05168) 0,329 0,067 0,374 0,017 N/A N/A N/A N/A Grupo 10 (0,5 mg/kg AD05171) 0,303 0,186 0,280 0,134 0,401 0,113 0,429 0,180 Grupo 11 (0,5 mg/kg AD05258) 0,669 0,105 0,702 0,140 N/A N/A N/A N/A Grupo 12 (0,5 mg/kg AD05259) 0,588 0,208 0,407 0,211 N/A N/A N/A N/A Grupo 13 (0,5 mg/kg AD05169) 0,626 0,116 0,672 0,057 N/A N/A N/A N/A Grupo 14 (0,5 mg/kg AD05239) 0,473 0,138 0,488 0,124 N/A N/A N/A N/A Grupo 15 (0,5 mg/kg AD05251) 0,254 0,147 0,344 0,257 0,234 0,063 0,306 0,166 Grupo 16 (0,5 mg/kg AD05220) 0,364 0,043 0,439 0,045 0,461 0,157 0,455 0,101
Exemplo 12. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em maca- cos cinomolgos.
[00291] Os agentes RNAi de APOC3 foram avaliados em macacos cinomolgos. No dia 1, os primatas macacos cinomolgos (Macaca fas- cicularis) (também referidos no presente documento como "cinos") fo- ram administrados uma única injeção subcutânea de 0,3 mL/kg (apro- ximadamente 2-3 mL de volume, dependendo da massa animal) con- tendo 3,0 mg/kg do agente RNAi de APOC3 AD05876, formulado em solução fisiológica salina. O agente RNAi de APOC3 AD05876 incluiu nucleotídeos modificados e um ligante direcionando N-acetil- galactosamina tridentada ((NAG37)s) conjugada à extremidade 5'- terminal do filamento senso, conforme mostrado nas tabelas 4, 5, 6 e
7.
[00292] Dois (2) cinos foram testados (n=2). Nos dias -8 (pré-dose), 29 e 50, as biópsias de fígado foram tomadas. Para um dos macacos, amostras adicionais de biópsia de fígado foram tomadas no dia 15. Na data de cada coleta de biópsia, os cinos foram anestesiados e as bi- ópsias de fígado orientadas por ultrassom foram realizadas para extra- ir duas ou três amostras de tecido do fígado de aproximadamente 1 mm x 4 mm de tamanho. As amostras da biópsia foram então homo- geneizadas e os níveis de mRNA de APOC3 nos fígados dos cinos foram medidos por RT-qPCR. Os valores resultantes foram então nor- malizados até as medições de mRNA de APOC3 da pré-dose (neste caso, no dia -8). Os dados de mRNA resultantes são refletidos nas ta- belas 39 e 40 que seguem:
Tabela 39. Níveis de mRNA de APOC3 normalizados até pré-dose do exemplo 12 do cino #1 (cy0713). Dia 29 Dia 50 Expressão rela- Baixo Alto Er- Expressão rela- Baixo Alto Er- tiva do mRNA Erro ro tiva do mRNA Erro ro de APOC3 de APOC3 0,125 0,003 0,003 0,167 0,002 0,002 Tabela 40. Níveis do mRNA de APOC3 normalizados até pré-dose do exemplo 12 do cino #2 (cy0716). Dia 15 Dia 29 Expressão rela- Baixo Alto er- Expressão rela- Baixo Alto er- tiva do mRNA erro ro tiva do mRNA erro ro de APOC3 de APOC3 0,250 0,007 0,007 0,112 0,005 0,00 Dia 50 Expressão rela- Baixo Alto er- tiva do mRNA erro ro de APOC3 0,239 0,003 0,003
[00293] Ambos os cinos dosados com AD05876 mostraram uma redução significativa no mRNA de APOC3 específico do fígado compa- rado às medições de pré-tratamento em todos os momentos de medi- ção. No dia 29, por exemplo, o primeiro cino teve uma redução de mRNA de APOC3 de aproximadamente 87,5% (0,125), enquanto o segundo cino teve uma redução de aproximadamente 88,8% (0,112), comparado aos níveis de pré-dose. Exemplo 13. Teste in vivo dos agentes RNAi de APOC3 em maca- cos Rhesus alimentados com dieta com xarope de milho rico em frutose (HFCS).
[00294] O agente RNAi de APOC3 AD05876 foi ainda avaliado nos macacos Rhesus alimentados com dieta com xarope de milho rico em frutose (HFCS). Os macacos Rhesus foram colocados em uma dieta HFCS 37 dias antes da dosagem. Esses animais foram conhecidos por desenvolver triglicerídeos no plasma aumentados maiores do que 180 mg/dL na dieta HFCS. No dia 1 e novamente no dia 29, quatro (4) macacos Rhesus foram administrados com uma injeção subcutânea contendo 4,0 mg/kg do agente RNAi de APOC3 AD05876 formulado em solução fisiológica salina (n=4). Dois macacos Rhesus adicionais foram administrados controle com solução fisiológica salina normal. O agente RNAi de APOC3 AD05876 continha nucleotídeos modificados e incluiu ligantes que direcionam N-acetil-galactosamina conjugados à extremidade 5'-terminal do filamento senso, conforme mostrado nas tabelas 4, 5, 6 e 7.
[00295] Ambas as amostras de alimentados e jejuados foram retira- das para análise, e as amostras de jejum no soro foram analisadas nos dias -8 (pré-dose), 8 e 15. Os macacos foram jejuados de um dia para o outro antes de cada coleta. Os níveis de proteína APOC3 no soro foram medidos pelo ensaio ELISA (R&D Systems), de acordo com as recomendações do fabricante. Triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densida- de (LDL) no soro foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00296] Os níveis de proteína APOC3, níveis de triglicerídeo, níveis de colesterol total, níveis de HDL e níveis de LDL para cada animal foram normalizados. Para a normalização, o nível da proteína APC03, triglicerídeo, HDL e colesterol total, respectivamente, para cada animal em um momento, foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expres- são naquele animal (neste caso no dia -8) para determinar a razão de expressão "normalizada até o pré-tratamento".
[00297] Os dados do estudo apresentado neste exemplo são mos- trados nas tabelas 41-45 que seguem:
Tabela 41. Proteína APOC3 média normalizada até o pré-tratamento do exemplo 13 (jejuado) Dia 8 Dia 15 Dia 21 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão APOC3 padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (solução 0,921 0,007 0,902 0,009 0,922 0,026 0,905 0,025 0,922 0,006 salina de controle) Grupo 2 (4,0 mg/kg 0,509 0,150 0,388 0,159 0,347 0,114 0,358 0,086 0,335 0,100 AD05876) Tabela 42. Média de TG normalizada até o pré-tratamento do exemplo 13 (jejuado)
220/223 Dia 8 Dia 15 Dia 21 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio TG padrão TG padrão TG padrão TG padrão TG padrão (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 (solução 0,743 0,055 0,717 0,054 1,017 0,155 0,758 0,263 0,659 0,111 salina de controle) Grupo 2 (4,0 mg/kg 0,599 0,338 0,433 0,286 0,395 0,247 0,435 0,212 0,408 0,269 AD05876)
Tabela 43. Média de colesterol total normalizada até pré-tratamento do exemplo 13 (jejuado) Dia 8 Dia 15 Dia 21 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (solu- 0,972 0,050 0,944 0,079 0,957 0,018 0,882 0,021 0,894 0,038 ção salina de controle) Grupo 2 (4,0 0,860 0,177 0,826 0,1119 0,825 0,084 0,780 0,162 0,751 0,203 mg/kg
221/223 AD05876) Tabela 44. Média de HDL normalizada até pré-tratamento do exemplo 13 (jejuado) Dia 8 Dia 15 Dia 21 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (solu- 1,082 0,098 1,071 0,111 1,003 0,158 1,025 0,131 1,027 0,071 ção salina de controle) Grupo 2 (4,0 1,370 0,267 1,445 0,479 1,465 0,537 1,316 0,294 1,370 0,425 mg/kg AD05876)
Tabela 45. Média de LDL normalizada até pré-tratamento do exemplo 13 (jejuado) Dia 8 Dia 15 Dia 21 Dia 29 Dia 36 Grupo ID Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio Média de Desvio coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão coleste- padrão rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) rol total (+/-) Grupo 1 (solu- 0,892 0,060 0,928 0,046 0,823 0,034 0,804 0,076 0,804 0,172 ção salina de controle) Grupo 2 (4,0 0,777 0,129 0,856 0,136 0,842 0,186 0,755 0,144 0,716 0,228 mg/kg
222/223 AD05876)
[00298] Os macacos Rhesus dosados com AD05876 em níveis de dosagem de 4,0 mg/kg mostraram uma redução na proteína APOC3 comparado com as medições de pré-tratamento em torno de cada momento medido. Além disso, as reduções substanciais em ambos os níveis de triglicerídeo e níveis de colesterol total também são mostra- das. Por exemplo, em um animal, os triglicerídeos foram reduzidos em aproximadamente 89% no dia 22, e conforme mostrados na tabela 42 acima, a média dos níveis de triglicerídeo foi reduzida em aproxima- damente 60% (0,395) no dia 22. De forma adicional, a média dos ní- veis de HDL aumentou em aproximadamente 47% no dia 22 (vide a tabela 44 (1.465)), com um animal tendo um aumento na razão de 2,2 vezes nos níveis de HDL.
OUTRAS MODALIDADES
[00299] Deve ser compreendido que enquanto a invenção foi des- crita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente pretende ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definida pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, van- tagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindi- cações.

Claims (63)

REIVINDICAÇÕES
1. Agente RNAi para inibir a expressão de um gene APOC3, caracterizado pelo fato de que compreende: um filamento antissenso compreendendo pelo menos 17 nucleotídeos contíguos diferindo em 0 ou 1 nucleotídeo de qualquer uma das sequências providas na tabela 2, tabela 3 ou tabela 4; e um filamento senso compreendendo uma sequência nucle- otídica que é pelo menos parcialmente complementar ao filamento an- tissenso.
2. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o filamento antissenso compreende nucleotí- deos 2-18 de qualquer uma das sequências providas na tabela 2, tabe- la 3 ou tabela 4.
3. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o filamento senso compreende uma se- quência nucleotídica de pelo menos 17 nucleotídeos contíguos diferin- do em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das sequências do filamento senso providas na tabela 2, tabela 3, ou tabela 5, e em que o filamento senso tem uma região de pelo menos 85% de complementariedade sobre os 17 nucleotídeos contíguos ao filamento antissenso.
4. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleo- tídeo do agente RNAi é um nucleotídeo modificado ou inclui uma liga- ção internucleosídica modificada.
5. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que todos ou substancial- mente todos os nucleotídeos do filamento senso e/ou antissenso do agente RNAi são nucleotídeos modificados.
6. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 4 a 5, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo modifica-
do é selecionado do grupo consistindo em: 2'-0-metil nucleotídeo, 2'- fluoro nucleotídeo, 2'-desóxi nucleotídeo, imitador 2',3'-seco nucleotí- deo, nucleotídeo preso, 2'-F-arabino nucleotídeo, 2'-metoxietil nucleo- tídeo, nucleotídeo abásico, ribitol, nucleotídeo invertido, 2'-0-metil nu- cleotídeo invertido, 2'-desóxi nucleotídeo invertido, 2'-amino- nucleotídeo modificado, 2'-alquil-nucleotídeo modificado, morfolino nu- cleotídeo, vinil fosfonato desoxirribonucleotídeo, ciclopropil fosfonato desoxirribonucleotídeo e 3'-0-metil nucleotídeo.
7. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 5, carac- terizado pelo fato de que todos ou substancialmente todos os nucleotí- deos modificados são tanto 2'-0-metil nucleotídeos ou 2'-fluoro nucleo- tídeos.
8. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o filamento antissenso compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das sequên- cias de filamento antissenso modificado providas na tabela 3 ou tabela
4.
9. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 8, carac- terizado pelo fato de que o filamento antissenso compreende a se- quência nucleotídica de qualquer uma das sequências de filamento antissenso modificado providas na tabela 4.
10. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o filamento senso com- preende a sequência nucleotídica de qualquer uma das sequências de filamento senso modificado providas na tabela 3 ou tabela 5.
11. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o filamento antissenso compreende a se- quência nucleotídica de qualquer uma das sequências modificadas providas na tabela 4 e o filamento senso compreende a sequência nu- cleotídica de qualquer uma das sequências modificadas providas na tabela 5.
12. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente RNAi é ligado a um ligante de direcionamento.
13. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 12, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende N- acetil-galactosamina.
14. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o ligante de direcionamento compreen- de uma estrutura selecionada a partir do grupo consistindo em: (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s.
15. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 14, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende a estrutura de (NAG37) ou (NAG37)s.
16. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o ligante de direcio- namento é conjugado ao filamento senso.
17. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 16, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento é conjugado na extremidade 5' terminal do filamento senso.
18. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o filamento senso está entre 18 e 30 nucleotídeos de comprimento, e o filamento antissenso está entre 18 e 30 nucleotídeos de comprimento.
19. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 18, carac-
terizado pelo fato de que o filamento senso e o filamento antissenso são cada entre 18 e 27 nucleotídeos de comprimento.
20. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 19, carac- terizado pelo fato de que o filamento senso e o filamento antissenso são cada entre 18 e 24 nucleotídeos de comprimento.
21. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 20, carac- terizado pelo fato de que o filamento senso e o filamento antissenso são cada 21 nucleotídeos de comprimento.
22. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 21, carac- terizado pelo fato de que o agente RNAi tem duas extremidades ce- gas.
23. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o filamento senso compreende um ou dois caps terminais.
24. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o filamento senso compreende um ou dois resíduos abásicos invertidos.
25. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o agente RNAi está compreendido de um fi- lamento senso e um filamento antissenso que forma um dúplex tendo a estrutura de qualquer um dos dúplices na tabela 3 ou tabela 6.
26. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que compreende um filamento antissenso que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma se- quência nucleotídica que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5'  3'): UCACUGAGAAUACUGUCCCUC (SEQ ID NO:3); UCACUGAGAAUACUGUCCCGU (SEQ ID NO:5); UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGC (SEQ ID NO: 8); AGAAUACUGUCCCUUUUAGGG (SEQ ID NO: 10);
AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC (SEQ ID NO: 12); ou UGAGAAUACUGUCCCUUUGCC (SEQ ID NO: 14).
27. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 26, carac- terizado pelo fato de que o filamento senso consiste em, consiste es- sencialmente em, ou compreende uma sequência nucleotídica que di- fere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5'  3'): GAGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 16); ACGGGACAGUAUUCUCAGUIA (SEQ ID NO: 18); GAGGGACAGUAUUCUCAGUGA (SEQ ID NO:21); GC C AAU AAAGCUGGAC AAGAA (SEQ ID NO:23); GCCAAUAAAICUGGACAAGAA (SEQ ID NO:25); CCCUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:27); GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU (SEQ ID NO:29); ou GGCAAAGGGACAGUAUUCUCA (SEQ ID NO:31); em que I representa um nucleotídeo inosina.
28. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que todos ou substancialmente todos os nu- cleotídeos em ambos o filamento antissenso e o filamento senso são nucleotídeos modificados.
29. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que o filamento senso ainda inclui resíduos invertidos abásicos na extremidade terminal 3’ e na extremidade 5’ da sequência nucleotídica.
30. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que o filamento senso do agente RNAi está ligado a um ligante de direcionamento.
31. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento tem afinidade pelo receptor de asialoglicoproteína.
32. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 31, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende N- acetil-galactosamina.
33. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que compreende um filamento antissenso que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma se- quência nucleotídica modificada que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes sequências nucleotídicas (5'  3'): usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:2); usCfsasCfuGfagaauAfcUfgUfcCfcGfsu (SEQ ID NO:4); usCfsascugagaauAfcUfgUfcCfcUfsc (SEQ ID NO:6); usUfscsUfuGfuCfcAfgCfuUfuAfuUfgGfsc (SEQ ID NO: 7); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfgGfsg (SEQ ID NO:9); asGfsasAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfsc (SEQ ID NO: 11); e usGfsasGfaAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfgcsc (SEQ ID NO: 13); em que a, c, g e u representam 2'-0-metil adenosina, citidi- na, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fiuoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s representa uma ligação fosforotioato; e em que todos ou substancial- mente todos os nucleotídeos no filamento senso são nucleotídeos mo- dificados.
34. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 33, carac- terizado pelo fato de que o filamento senso compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência nucleotídica modifica- da que difere em 0 ou 1 nucleotídeo a partir de uma das seguintes se- quências nucleotídicas (5'  3'): gagggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 15); acgggacaGfUfAfuucucaguia (SEQ ID NO: 17); gagggacaGfuAfuUfcucaguia (SEQ ID NO: 19);
gagggacaGfUfAfuucucaguga (SEQ ID NO: 20); gccaauaaAfGfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:22); gccaauaaAflfCfuggacaagaa (SEQ ID NO:24); cccuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO:26); gcuuaaaaGfGfGfacaguauucu (SEQ ID NO:28); e ggcaaaggGfAfCfaguauucuca (SEQ ID NO:30); em que a, c, g, i e u representam 2'-0-metil adenosina, citi- dina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf, If e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridi- na, respectivamente; e s representa uma ligação fosforotioato.
35. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o filamento senso ainda inclui um resí- duo abásico invertido na extremidade 3' terminal e/ou na extremidade 5’ da sequência nucleotídica.
36. Agente RNAi de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que o filamento senso do agente RNAi é ligado a um ligante de direcionamento.
37. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 36, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento tem afinidade pelo receptor de asialoglicoproteína.
38. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 37, carac- terizado pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende N- acetil-galactosamina.
39. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o agente RNAi tem a estrutura dúplex seleci- onada a partir do grupo consistindo em: AD05251 (SEQ ID NOs: 2 e 501); AD05876 (SEQ ID NOs: 4 e 572); AD05769 (SEQ ID NOs: 6 e 557); AD05169 (SEQ ID NOs: 2 e 482); AD05220 (SEQ ID NOs: 7 e 494); AD05547 (SEQ ID NOs: 7 e 545); AD05299 (SEQ ID NOs:
9 e 521); AD05223 (SEQ ID NOs: 11 e 497); e AD05171 (SEQ ID NOs: 13 e 483).
40. Agente RNAi de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o agente RNAi tem a estrutura dúplex seleci- onada a partir do grupo consistindo em: AD05251 (SEQ ID NOs: 2 e 501) e AD05876 (SEQ ID NOs: 4 e 572).
41. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende o agente RNAi como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, em que a composição compreende um excipiente farma- ceuticamente aceitável.
42. Composição de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que o agente RNAi é conjugado a um ligante de direcionamento.
43. Composição de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende n- acetil-galactosamina.
44. Composição de acordo com a reivindicação 43, carac- terizada pelo fato de que o ligante de direcionamento é selecionado a partir do ligante de direcionamentos na tabela 7.
45. Composição de acordo de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que a composi- ção ainda compreende um segundo agente RNAi para inibir a expres- são de APOC3.
46. Composição de acordo de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizada pelo fato de que a composi- ção ainda compreende um ou mais terapêuticos adicionais.
47. Método para inibir a expressão de um gene APOC3 em uma célula, o método caracterizado por compreender a introdução em uma célula de uma quantidade eficaz do agente RNAi como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 40 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que a célula está dentro de um indivíduo.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 49, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene APOC3 é inibida em pelo menos cerca de 30%.
51. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio re- lacionado a APOC3, o método caracterizado por compreender admi- nistrar a um indivíduo humano que necessita do mesmo de uma quan- tidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qual- quer uma das reivindicações 41 a 46.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracteri- zado pelo fato de que a doença é uma doença cardiometabólica.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado pelo fato de que a doença hipertrigliceridemia, obesidade, hiper- lipidemia, metabolismo anormal do lipídio e/ou colesterol, aterosclero- se, doença cardiovascular, doença arterial coronariana, pancreatite induzida por hipertrigliceridemia, síndrome metabólica, diabetes melli- tus do tipo II, síndrome de quilomicronemia familiar ou Lipodistrofia parcial familiar.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 53, caracterizado pelo fato de que o agente RNAi é adminis- trado em uma dose de cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 5,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo humano.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 53, caracterizado pelo fato de que o agente RNAi é adminis- trado em duas ou mais doses.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 51 a 53, caracterizado pelo fato de que a dose é administrada através de injeção subcutânea.
57. Método de redução dos níveis de triglicerídeo em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender adminis- trar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.
58. Método de redução dos níveis de colesterol em um in- divíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.
59. Método de redução dos níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da com- posição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.
60. Uso do agente RNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que é para o tra- tamento de uma doença, distúrbio ou sintoma que é mediado pelo me- nos em parte pela expressão do gene APOC3.
61. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença, distúrbio ou sintoma que é mediado pelo menos em parte pela expressão do gene APOC3, níveis elevados de triglicerídeo ou níveis elevados de colesterol.
62. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença, dis- túrbio ou sintoma que é mediado pelo menos em parte pela expressão do gene APOC3.
63. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que a doença é hipertrigliceridemia,
obesidade, hiperlipidemia, metabolismo anormal do lipídio e/ou coles- terol, aterosclerose, doença cardiovascular, doença arterial coronaria- na, pancreatite induzida por hipertrigliceridemia, síndrome metabólica, diabetes mellitus do tipo II, síndrome de quilomicronemia familiar ou Lipodistrofia parcial familiar.
Filamento senso
Petição 870200016977, de 05/02/2020, pág. 244/523 Filamento antissenso
Filamento senso
Filamento antissenso 1/27
Filamento senso
Filamento antissenso
Filamento senso
Petição 870200016977, de 05/02/2020, pág. 245/523 Filamento antissenso
Filamento senso
Filamento antissenso 2/27
Filamento senso
Filamento antissenso
Filamento senso
Petição 870200016977, de 05/02/2020, pág. 246/523 Filamento antissenso
Filamento senso
Filamento antissenso 3/27
Filamento senso
Filamento antissenso
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