KR20220158011A - PNPLA3의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 이의 약제학적 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

PNPLA3의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 이의 약제학적 조성물, 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파타틴-유사 포스포리파제 도메인-함유 단백질 3(PNPLA3) 유전자 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제(agent), 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제에 관한 것이다. PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법이 또한 개시된다. 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 세포 - 간세포를 포함함 - 에 대한 전달을 용이하게 하기 위해 표적화 리간드에 접합될 수 있다. 생체내(in vivo)에서의 PNPLA3 RNAi 작용제의 전달은 PNNLA3 유전자 발현의 억제를 제공한다. RNAi 작용제는 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 간 섬유증, 및 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 을 포함한 PNPLA3-관련 질병 및 장애의 치료 방법에 사용될 수 있다.

Description

PNPLA3의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 이의 약제학적 조성물, 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 26일자로 출원된 미국 가출원 제63/000,137호의 이익을 주장하며, 이 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 3월 25일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 103693_002475_PCT_SL.txt이며, 크기가 248,025 바이트이다.
기술분야
본 발명은 파타틴-유사 포스포리파제 도메인-함유 단백질 3(PNPLA3)을 억제하기 위한 RNA 간섭(RNAi) 작용제(agent), 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
비알코올성 지방간 질병(NAFLD)은 전세계적으로 가장 흔한 만성 간 질병이고, 전세계 인구의 대략 20%가 이환된 것으로 추정된다. 일부 개체에서, 지방증으로 불리는 간에서의 이소성 지방의 축적은 염증 및 간세포 손상을 촉발시키며, 이는 비알코올성 지방성 간염(NASH)으로 불리는 더 진행된 질병 병기로 이어진다. NAFLD에 대한 치료는 종종 체중 감량 및 임의의 2차 질환, 예컨대 인슐린 저항성 또는 이상지질혈증의 치료를 향해 진행되고 있다.
II형 막관통 단백질인 파타틴-유사 포스포리파제 도메인-함유 3(PNPLA3)은 간을 포함한 다양한 세포에서 발현된다. 간세포에서, PNPLA3은 소포체 및 지질막 상에서 발현되고, 트라이아실글리세롤 가수분해효소 활성을 주로 나타낸다.
본 발명은, PNPLA3 수준을 감소시키고 NAFLD와 같은 간장병학적(hepatologic) 질병을 치료하는 신규한 접근법을 나타낸다.
PNPLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제가 본 명세서에 개시되며, 상기 RNAi 작용제는 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 18을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 서열 번호 2, 3, 4, 9 내지 20, 214, 219 및 220의 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 17개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 안티센스 가닥에 상보적인 영역이 적어도 85%이다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드간 결합을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′,3′-세코 뉴클레오티드 모방체, 고정된(locked) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2′-메톡시에틸 뉴클레오티드, 탈염기(abasic) 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2′-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 3′-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 변형된 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, RNAi 작용제는 표적화 리간드에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 표적화 리간드는 (NAG37) 또는 (NAG37)s의 구조를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 표적화 리간드는 센스 가닥에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된다.
일부 실시 형태에서, 표적화 센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시 형태에서, 표적화 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 18 내지 27개의 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시 형태에서, 표적화 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 18 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 21개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 2개의 블런트(blunt) 단부를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 1개 또는 2개의 말단 캡(terminal cap)을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 센스 가닥은 1개 또는 2개의 역전된 탈염기 잔기를 포함한다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 서열 번호 (176과 214); (90과 131); (181과 219); (95와 136); (188과 220) 및/또는 (102와 137)을 갖는 이중체 서열(duplex sequence)을 형성하는 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함한다.
일부 태양에서, 본 명세서에 제공된 RNAi 작용제는 서열 번호 90, 95 및 102의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 개시된 센스 가닥은 서열 번호 214, 219 및 256의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 a, c, g, i, 및 u는 각각 2′-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 이노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 안티센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시 형태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 표적화 리간드에 연결된다.
일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다.
추가의 실시 형태에서, 표적화 리간드는 하기를 포함한다:
Figure pct00001
, 또는
Figure pct00002
.
추가의 실시 형태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; (invAb)는 역전된 탈염기 데옥시리보스 잔기이고; (NAG37)s는 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00003
.
개시된 RNAi 작용제를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물이 본 명세서에 또한 개시된다.
세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 또한 제공되며, 상기 방법은 개시된 RNAi 작용제 또는 개시된 조성물의 유효량을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포는 대상체 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
다른 실시 형태에서, PNPLA3 유전자 발현은 적어도 약 30%만큼 억제된다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 유전자 발현은 간세포의 세포질에서 적어도 약 50%만큼 억제된다.
PNPLA3-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 방법은 상기 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 개시된 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 알코올성 지방간 질병, 또는 간경변증이다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여된다.
다른 실시 형태에서, RNAi 작용제는 2회 이상의 용량으로 투여된다.
PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한, 개시된 RNAi 작용제 또는 개시된 조성물의 용도가 본 명세서에 또한 제공된다.
일부 실시 형태에서, 증상은 간의 간경변증이다.
PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 개시된 RNAi 작용제 또는 개시된 조성물의 용도가 본 명세서에 추가로 제공된다.
일부 실시 형태에서, 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병, 예컨대 간경변증이다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여된다.
도 1은 RNAi 작용제-처리된 비인간 영장류(NHP)로부터의 PCR에 의거한, PNPLA3의 기저선 대비 전체 간 발현을 나타낸 그래프이다. 연구 #1: 데이터는 기하 평균 ± SD(n=4)이다.
도 2는 시험된 모든 동물들 사이의 정량적 ISH에 의거한 간세포의 세포질에서의 평균 PNPLA3 mRNA 녹다운을 나타낸 그래프이다(연구 #1 및 연구 #2). 연구 #2: 데이터는 평균 ± SD(n=14)이다.
예시적인 실시 형태의 상세한 설명
본 개시된 방법은 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면과 관련하여 취해지는 하기 상세한 설명을 참조하여 더욱 용이하게 이해될 수 있다. 본 개시된 방법은 본 명세서에 기재되고/되거나 보여준 구체적인 방법으로 제한되지 않으며, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시 형태를 단지 예로서 기술하기 위한 것이고 청구된 방법을 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
명료함을 위하여, 개별적인 실시 형태와 관련하여 본 명세서에 기재된, 개시된 방법의 소정 특징이 또한 단일 실시 형태에서 조합되어 제공될 수 있음이 인식되어야 한다. 역으로, 간결함을 위해서, 단일 실시 형태와 관련하여 기재된, 개시된 방법의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "RNAi 작용제"("RNAi 트리거"로도 지칭됨)는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA의 메신저 RNA(mRNA) 전사체의 번역을 분해하거나 억제할 수 있는(예를 들어, 적절한 조건 하에서 분해하거나 억제하는) RNA 또는 RNA-유사(예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, RNAi 작용제는 RNA 간섭 기전을 통해(즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구(RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex) 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함), 또는 임의의 대안적인 기전(들) 또는 경로(들)에 의해 작용할 수 있다. RNAi 작용제는, 이 용어가 본 명세서에 사용되는 바와 같이, RNA 간섭 기전을 통해 주로 작용하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정 경로 또는 작용 기전에 의해 구속되거나 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은(또는 작은) 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 다이서 기질(dicer substrate)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA(즉, PNPLA3 mRNA)에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 비-포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 주어진 유전자의 발현을 지칭하는 경우 용어 "침묵", "감소", "억제", "하향조절", 또는 "녹다운(knockdown)"은, 그 유전자로부터 전사되는 RNA의 수준 또는 그 유전자가 전사되는 세포, 세포군, 조직, 기관, 또는 대상체에서 mRNA로부터 번역되는 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 하위단위의 수준에 의해 측정되는 경우, 세포, 세포군, 조직, 기관, 또는 대상체가 본 명세서에 기재된 RNAi 작용제로 처리될 때 그렇게 처리되지 않은 제2 세포, 세포군, 조직, 기관, 또는 대상체와 비교하여 그 유전자의 발현이 감소함을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 표준 명명법을 사용하여 일련의 문자로 기재된, 일련의 또는 일정 순서의 핵염기 또는 뉴클레오티드를 의미한다. 핵산 분자는 비변형된 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비변형된 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "염기", "뉴클레오티드 염기", "뉴클레오티드", 또는 "핵염기"는 폴리뉴클레오티드의 성분인 헤테로사이클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이며, 1차 퓨린 염기인 아데닌 및 구아닌, 및 1차 피리미딘 염기인 시토신, 티민, 및 우라실을 포함한다. 뉴클레오티드는 비변형될 수 있다. 핵염기는, 제한 없이, 범용(universal) 염기, 소수성 염기, 무차별적(promiscuous) 염기, 크기 확대(size-expanded) 염기, 및 불소화 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008] 참조). 그러한 변형된 뉴클레오티드(변형된 뉴클레오티드를 포함하는 포스포르아미다이트 화합물을 포함함)의 합성은 당업계에 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 그리고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은, 제2 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, RNAi 작용제의 안티센스 가닥 또는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 제1 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 표적화된 mRNA)을 설명하기 위해 사용되는 경우, 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화되고(포유동물의 생리학적 조건(또는 그렇지 않으면, 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 적합한 조건) 하에서 염기쌍 수소 결합을 형성하고) 소정 표준 조건 하에서 이중체 또는 이중 나선 구조를 형성하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 의미한다. 당업자는 혼성화 시험에 가장 적절한 조건 세트를 선택할 수 있을 것이다. 상보적 서열은 왓슨-크릭 염기쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍을 포함하고, 적어도 상기 혼성화 요건이 충족되는 한에 있어서 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형과 무관하다. 예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같이, a 및 Af는 U(또는 T)에 상보적이고, 동일성 또는 상보성을 결정하기 위한 목적상 A와 동일하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완벽하게 상보적" 또는 "완전히 상보적"이란, 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 모든(100%) 염기가 제2 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화될 것이라는 것을 의미한다. 연속 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "부분적으로 상보적"이란, 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 염기의 전부는 아닌 적어도 70%가 제2 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화될 것이라는 것을 의미한다. 연속 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 상보적"이란, 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 염기의 전부는 아닌 적어도 85%가 제2 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화될 것이라는 것을 의미한다. 연속 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상보적", "완전히 상보적", "부분적으로 상보적", 및 "실질적으로 상보적"은 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 PNPLA3 mRNA의 서열 사이의 핵염기 또는 뉴클레오티드 매칭에 관하여 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 핵산 서열에 적용될 때, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"이란, 뉴클레오티드 서열(또는 뉴클레오티드 서열의 일부분)이 참조 서열과 대비하여 적어도 약 85% 또는 그 이상의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 가짐을 의미한다. 서열 동일성의 백분율은 비교창(comparison window)에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된다. 백분율은 양쪽 서열에서 동일한 유형의 핵산 염기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교의 창 내의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 명세서에 개시된 발명은 본 명세서에 개시된 것들과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "개체", "환자"및 "대상체"는 조류, 인간 및 다른 영장류, 및 상업적으로 관련된 포유동물 또는 동물 모델을 포함한 다른 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개를 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 동물종의 구성원을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상의 수, 중증도, 및/또는 빈도의 경감 또는 완화를 제공하기 위해 취해지는 방법 또는 단계를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상의 예방, 관리, 예방적 치료, 및/또는 수, 중증도, 및/또는 빈도의 억제 또는 감소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "세포 내로 도입하는"이란, RNAi 작용제에 대해 언급할 때, RNAi 작용제를 세포 내로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적 전달"이란, RNAi 작용제가 예측된 생물학적 활성, 예를 들어 유전자 발현의 서열 특이적 억제 활성을 가질 수 있게 하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포에 전달하는 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 기호
Figure pct00004
의 사용은 본 명세서에 기재된 본 발명의 범주에 따른 임의의 기(들)가 그에 연결될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 원자의 성질 또는 결합 순서가 상이하거나 원자의 공간 배열이 상이한 화합물들을 지칭한다. 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체들은 "입체이성질체"로 명명된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체 이성질체"로 명명되고, 겹쳐질 수 없는 거울상인 입체이성질체는 "거울상 이성질체", 또는 때때로 광학 이성질체로 명명된다. 4개의 동일하지 않은 치환체에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특정 입체형태를 갖는 것으로 구조에서 구체적으로 확인되지 않는 한, 비대칭 중심이 존재하여 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 또는 다른 입체이성질체 형태를 생성하는 각각의 구조에 대해, 본 명세서에 기재된 각각의 구조는 광학적으로 순수한 형태 및 라세미 형태를 비롯한 모든 그러한 가능한 이성질체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 구조는 부분입체 이성질체뿐만 아니라 단일 입체이성질체의 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는", "구비하는", "함유하는" 및 "특징으로 하는"은 상호교환 가능하며, 포괄적이며, 개방형이고, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서, 특히 조성물의 성분들의 설명에서 또는 디바이스의 요소들의 설명에서, 용어 "포함하는"에 대한 임의의 언급은 열거된 성분들 또는 요소들로 본질적으로 이루어지고 이로 이루어진 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 청구범위에 사용되는 바와 같이, 어구 "~로 이루어진"은 청구범위에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본 명세서에서 청구범위에 사용될 때, 어구 "~로 본질적으로 이루어진"은 명시된 재료 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 청구범위의 범주를 제한한다.
당업자는 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물이, 화합물 또는 조성물이 배치되는 환경에 따라 양성자화된 또는 탈양성자화된 상태로 특정 원자(예를 들어, N, O, 또는 S 원자)를 가질 수 있음을 쉽게 이해하고 인지할 것이다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 구조는, 예를 들어 OH, SH, 또는 NH와 같은 특정 작용기가 양성자화되거나 탈양성자화될 수 있음을 고려한다. 본 명세서의 개시내용은, 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 환경(예를 들어, pH)에 기초한 양성자화 상태에 관계없이 개시된 화합물 및 조성물을 포함하도록 의도된다. 이에 상응하여, 불안정한 양성자 또는 기본 원자를 갖는 것으로 본 명세서에 기재된 화합물은 또한 상응하는 화합물의 염 형태를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 기재된 화합물은 유리 산, 유리 염기 또는 염 형태일 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 2개의 화합물 또는 분자 사이의 연결에 관해 언급할 때, 용어 "연결된" 또는 "접합된"은 2개의 화합물 또는 분자가 공유 결합에 의해 결합됨을 의미한다. 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "연결된" 및 "접합된"은 어떠한 개재 원자 또는 원자단을 사용하거나 또는 이것 없이 행해지는 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연결을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 본 명세서에서 어구 "을 포함하지만 이로 한정되지 않는"을 의미하는 데 사용되고, 이와 상호교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서, 용어 "또는"은, 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 데 사용되고, 그와 상호교환 가능하게 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 전체적으로 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 게다가, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 태양, 및 이점은 하기 상세한 설명, 첨부 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
RNAi 작용제
PNPLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제(본 명세서에서 PNPLA3 RNAi 작용제 또는 PNPLA3 RNAi 트리거로 지칭됨)가 본 명세서에 기재된다. 각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 16 내지 49개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 18 내지 27개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두는 각각 21 내지 26개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 21 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 약 19개의 뉴클레오티드 길이인 한편, 안티센스 가닥은 약 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 약 21개의 뉴클레오티드 길이인 한편, 안티센스 가닥은 약 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 23개의 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 또는 39개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 뉴클레오티드의 이중체 길이를 갖는다.
PNPLA3 RNAi 작용제를 형성하는 데 사용되는 뉴클레오티드 서열의 예가 표 2, 표 3, 및 표 4에 제공되어 있다. 표 2, 표 3, 및 표 4의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는 RNAi 작용제 이중체의 예가 표 5A 및 표 5B에 제시되어 있다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 완벽한, 실질적인, 또는 부분적인 상보성 영역은 16 내지 26개(예를 들어, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 26개)의 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥의 5' 단부에 또는 이 부근에 존재한다(예를 들어, 이러한 영역은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 완벽하게, 실질적으로, 또는 부분적으로 상보적이지 않은 0개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있음).
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 PNPLA3 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열(본 명세서에서 "코어 스트레치"또는 "코어 서열"로도 지칭됨)과 적어도 85% 동일성을 갖는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열에 100%(완벽하게) 상보적이거나 적어도 약 85%(실질적으로) 상보적이고, 이에 따라 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 전형적으로 PNPLA3 mRNA 표적에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열(때때로, 예를 들어 표적 서열로 지칭됨)과 완벽하게 동일하거나 적어도 약 85% 동일하다. 일부 실시 형태에서, 이 센스 가닥의 코어 스트레치는 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 또는 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 이 센스 가닥의 코어 스트레치는 17개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 이 센스 가닥의 코어 스트레치는 19개의 뉴클레오티드 길이이다.
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 PNPLA3 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 그리고 상응하는 센스 가닥 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 적어도 85%의 상보성을 갖는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치는 PNPLA3 mRNA 표적에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표적 서열)에 100%(완벽하게) 상보적이거나 적어도 약 85%(실질적으로) 상보적이다. 일부 실시 형태에서, 이 안티센스 가닥의 코어 스트레치는 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 또는 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 이 안티센스 가닥의 코어 스트레치는 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 이 안티센스 가닥의 코어 스트레치는 17개의 뉴클레오티드 길이이다. 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 상응하는 안티센스 코어 서열과 동일한 길이일 수 있거나 상이한 길이일 수 있다.
PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 어닐링(annealing)되어 이중체를 형성한다. PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적일 수 있다. 상보적 이중체 영역 내에서, 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 안티센스의 코어 스트레치 서열에 적어도 85% 상보적이거나 100% 상보적이다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥의 코어 스트레치 서열의 상응하는 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 또는 23개의 뉴클레오티드 서열에 적어도 85% 또는 100% 상보적인 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개의 뉴클레오티드의 서열을 함유한다(즉, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스와 안티센스의 코어 스트레치 서열은 적어도 85%가 염기쌍을 이루거나 100%가 염기쌍을 이룬 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개의 뉴클레오티드의 영역을 가짐).
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 안티센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 선택적으로 그리고 독립적으로 코어 스트레치 서열의 3' 단부, 5' 단부, 또는 3' 및 5' 단부 둘 모두에 추가의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 뉴클레오티드(연장부(extension))를 함유할 수 있다. 존재하는 경우, 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 PNPLA3 mRNA 내의 상응하는 서열에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 존재하는 경우, 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 PNPLA3 mRNA 내의 상응하는 서열과 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 존재하는 경우, 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는, 존재하는 경우, 상응하는 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 연장부는 센스 가닥의 코어 스트레치 서열 및/또는 안티센스 가닥의 코어 스트레치 서열의 5' 및/또는 3' 단부에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 반대로, 안티센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 센스 가닥 내의 코어 스트레치 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두는 3' 및 5' 연장부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 한쪽 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 한쪽 가닥의 하나 이상의 5' 연장부 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룬다. 다른 실시 형태에서, 한쪽 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 한쪽 가닥의 하나 이상의 5' 연장부 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥과 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 가진다. 일부 실시 형태에서, 연장부 뉴클레오티드(들)는 쌍을 이루지 않고 오버행(overhang)을 형성한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "오버행"은 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제의 혼성화된 또는 이중화된 부분의 일부를 형성하지 않는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단 단부에 위치한 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 스트레치를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 상응하는 PNPLA3 mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 상응하는 PNPLA3 mRNA 서열에 상보적이지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 아데노신, 우라실, 또는 티미딘 뉴클레오티드, AT 다이뉴클레오티드, 또는 PNPLA3 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3' 센스 가닥의 연장부는 다음 서열들 중 하나를 포함하거나 이로 이루어지지만 이로 한정되지 않는다: T, UT, TT, UU, UUT, TTT, 또는 TTTT(각각은 5'에서 3' 방향으로 나열됨).
센스 가닥은 3' 연장부 및/또는 5' 연장부를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 뉴클레오티드 길이인 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 PNPLA3 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다.
PNPLA3 RNAi 작용제를 형성하는 데 사용되는 서열의 예가 표 2, 표 3, 및 표 4에 제공되어 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 1 내지 17, 2 내지 15, 2 내지 17, 1 내지 18, 2 내지 18, 1 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 21, 또는 2 내지 21의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 서열의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 1 내지 18, 1 내지 19, 1 내지 20, 1 내지 21, 2 내지 19, 2 내지 20, 2 내지 21, 3 내지 20, 3 내지 21, 또는 4 내지 21의 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부와 안티센스 가닥의 3' 단부는 블런트 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 3' 단부와 안티센스 가닥의 5' 단부는 블런트 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 양쪽 단부는 블런트 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 어느 단부도 블런트 단부가 아니다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "블런트 단부"는 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인(상보적 염기쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 단부를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부와 안티센스 가닥의 3' 단부는 프레이드(frayed) 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 3' 단부와 안티센스 가닥의 5' 단부는 프레이드 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 양쪽 단부는 프레이드 단부를 형성한다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 어느 단부도 프레이드 단부가 아니다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 프레이드 단부는 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지만(즉, 오버행을 형성하지 않지만) 상보적이지 않은(즉, 비상보적인 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 단부를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 한쪽 가닥의 단부에 있는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 오버행을 형성한다. 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 존재하여, 3' 또는 5' 오버행을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 다음을 함유한다: 블런트 단부와 프레이드 단부, 블런트 단부와 5' 오버행 단부, 블런트 단부와 3' 오버행 단부, 프레이드 단부와 5' 오버행 단부, 프레이드 단부와 3' 오버행 단부, 2개의 5' 오버행 단부, 2개의 3' 오버행 단부, 5' 오버행 단부와 3' 오버행 단부, 2개의 프레이드 단부, 또는 2개의 블런트 단부. 전형적으로, 존재하는 경우, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 양쪽 모두의 3' 말단 단부에 위치한다.
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 또한 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 결합, 예를 들어 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합으로 추가로 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 2'-변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 결합과 조합된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 염, 혼합 염, 또는 유리 산으로서 제조되거나 제공된다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 나트륨 염으로서 제조된다. 당업계에 잘 알려진 그러한 형태는 본 명세서에 개시된 본 발명의 범주 내에 있다.
변형된 뉴클레오티드
변형된 뉴클레오티드는, 다양한 올리고뉴클레오티드 작제물에 사용될 때, 세포에서 화합물의 활성을 보존함과 동시에 이들 화합물의 혈청 안정성을 증가시킬 수 있고, 또한 올리고뉴클레오티드 작제물의 투여 시에 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드(2'-하이드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 탈염기 뉴클레오티드, 2′-변형된 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드, 변형된 핵염기-포함 뉴클레오티드, 가교(bridged) 뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 2′,3′-세코 뉴클레오티드 모방체(비고정된 핵염기 유사체), 고정된 뉴클레오티드, 3′-O-메톡시 (2′ 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 2′-변형된 뉴클레오티드(즉, 5원 당 고리의 2′ 위치에 하이드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드(본 명세서에서 2′-데옥시-2′-플루오로 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′-메톡시에틸 (2′-O-2-메톡실에틸) 뉴클레오티드(2′-MOE로도 지칭됨), 2′-아미노 뉴클레오티드, 및 2′-알킬 뉴클레오티드를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 하나 초과의 변형이 단일 PNPLA3 RNAi 작용제 내에 또는 심지어 이의 단일 뉴클레오티드 내에 도입될 수 있다. PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 당업계에 알려진 방법에 의해 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 하나의 뉴클레오티드에서의 변형은 다른 뉴클레오티드에서의 변형과 무관하다.
변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예를 들어 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬(예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-아이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬(예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-아이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-설프하이드릴, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로(예를 들어, 5-브로모), 5-트라이플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3′ 단부는 탈염기 잔기(Ab)들을 포함할 수 있으며, 이들은 "탈염기 부위" 또는 "탈염기 뉴클레오티드"로도 지칭될 수 있다. 탈염기 잔기(Ab)는 당 모이어티(moiety)의 1' 위치에 핵염기가 결여되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다. (예를 들어, 미국 특허 제5,998,203호 참조). 일부 실시 형태에서, 탈염기 잔기는 뉴클레오티드 서열 내에 내부적으로 위치될 수 있다. 일부 실시 형태에서, Ab 또는 AbAb는 안티센스 가닥의 3' 단부에 부가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 5' 단부는 하나 이상의 추가의 탈염기 잔기(예를 들어, (Ab) 또는 (AbAb))를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, UUAb, UAb, 또는 Ab는 센스 가닥의 3' 단부에 부가된다. 일부 실시 형태에서, 탈염기(데옥시리보스) 잔기는 리비톨(탈염기 리보스) 잔기로 대체될 수 있다.
일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두에서 4개 이하(즉, 0개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인(즉, 비변형된) RNAi 작용제이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 센스 가닥은 센스 가닥 내의 2개 이하(즉, 0개, 1개, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 센스 가닥이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 센스 가닥 내의 2개 이하(즉, 0개, 1개, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 안티센스 가닥이다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 하나 이상의 뉴클레오티드는 비변형된 리보뉴클레오티드이다.
변형된 뉴클레오시드간 결합
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 하나 이상의 뉴클레오티드는 비표준 결합 또는 골격(즉, 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 변형된 골격)에 의해 연결된다. 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 골격은 포스포로티오에이트 기(본 명세서에서 소문자 "s"로 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스테르, 아미노알킬-포스포트라이에스테르, 알킬 포스포네이트(예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트(예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스테르, 모르폴리노 결합, 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'으로 또는 2'-5'에서 5'-2'으로 연결되는 역전된 극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 골격은 인 원자가 결여되어 있다. 인 원자가 결여되어 있는 변형된 뉴클레오시드간 결합은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합, 혼합 헤테로 원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 당간 결합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드간 골격은 실록산 골격, 설파이드 골격, 설폭사이드 골격, 설폰 골격, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 알켄 함유 골격, 설파메이트 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 아미드 골격, 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분을 갖는 다른 골격을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두는 독립적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두는 독립적으로 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 3' 단부로부터 위치 1 내지 3에 있는 뉴클레오티드들 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 있고, 다른 포스포로티오에이트 결합은 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 3' 단부에 있다. 일부 실시 형태에서, 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 5' 단부에 위치하고, 다른 포스포로티오에이트 결합은 센스 가닥의 3' 단부에 있다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드들 사이에 어떠한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합도 포함하지 않지만, 5' 단부 및 3' 단부 양쪽 모두에서 말단 뉴클레오티드들 사이에 1개, 2개, 또는 3개의 포스포로티오에이트 결합을 함유하고, 선택적으로 존재하는 역전된 탈염기 잔기 말단 캡을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 포스포로티오에이트 결합을 통해 센스 가닥에 연결된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 1 내지 3에 있는 뉴클레오티드들 사이에 그리고 5' 단부로부터 위치 19 내지 21, 20 내지 22, 21 내지 23, 22 내지 24, 23 내지 25, 또는 24 내지 26에 있는 뉴클레오티드들 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 1 내지 4 사이에 위치하고, 제4 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 20 내지 21 사이에 위치한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 내에 적어도 3개 또는 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유한다.
캡핑 잔기 또는 모이어티
일부 실시 형태에서, 센스 가닥은, 때때로 당업계에서 "캡", "말단 캡", 또는 "캡핑 잔기"로 지칭되는, 하나 이상의 캡핑 잔기 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "캡핑 잔기"는 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제의 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 말단에 도입될 수 있는 비-뉴클레오티드 화합물 또는 다른 모이어티이다. 캡핑 잔기는 RNAi 작용제에, 일부 경우에, 예를 들어 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호와 같은 소정의 유익한 특성을 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 역전된 탈염기 잔기(invAb)(당업계에서 "역전된 탈염기 부위"로도 지칭됨)가 캡핑 잔기로서 부가된다. (예를 들어, 문헌[F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16] 참조). 캡핑 잔기는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 역전된 탈염기 잔기뿐만 아니라 탄소 사슬, 예컨대 말단 C3H7(프로필), C6H13(헥실), 또는 C12H25(도데실) 기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 캡핑 잔기는 센스 가닥의 5′ 말단 단부, 3′ 말단 단부, 또는 5′ 말단 단부 및 3′ 말단 단부 양쪽 모두에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥의 5' 단부 및/또는 3′ 단부는 캡핑 잔기로서 하나 초과의 역전된 탈염기 데옥시리보스 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기(invAb)가 센스 가닥의 3′ 단부에 부가된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기(invAb)가 센스 가닥의 5′ 단부에 부가된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기 또는 역전된 탈염기 부위가 RNAi 작용제의 센스 가닥의 표적화 리간드와 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에 또는 그 부근에 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기 또는 역전된 탈염기 부위를 포함시키는 것은 RNAi 작용제의 활성 또는 다른 원하는 특성을 향상시킬 수 있게 한다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기(invAb)가 센스 가닥의 5′ 단부에 부가된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 표적화 리간드와 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 역전된 탈염기 잔기는 포스페이트, 포스포로티오에이트(예를 들어, 본 명세서에서 (invAb)s로 표기됨), 또는 다른 뉴클레오시드간 결합을 통해 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에 또는 그 부근에 하나 이상의 역전된 탈염기 잔기를 포함시키는 것은 RNAi 작용제의 활성 또는 다른 원하는 특성을 향상시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 역전된 탈염기(데옥시리보스) 잔기는 역전된 리비톨(탈염기 리보스) 잔기로 대체될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 3′ 단부, 또는 안티센스 가닥 서열의 3′ 단부는 역전된 탈염기 잔기를 포함할 수 있다. 역전된 탈염기 데옥시리보스 잔기에 대한 화학 구조는 하기 표 6에 제시되어 있다.
PNPLA3 RNAi 작용제
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 PNPLA3 유전자(예를 들어, 서열 번호 1) 상의 특정 위치를 표적화하도록 설계된다.
NM_025225.2 호모 사피엔스(Homo sapiens) 파타틴-유사 포스포리파제 도메인-함유 3(PNPLA3), mRNA(서열 번호 1):
Figure pct00005
Figure pct00006
본 명세서에 정의된 바와 같이, 안티센스 가닥 서열은, 안티센스 가닥의 5′ 말단 핵염기가, 유전자와 염기쌍을 형성할 때의 유전자 상의 위치로부터 (3′ 단부를 향해) 19개의 뉴클레오티드 하류에 있는 위치와 정렬될 때, 유전자 상의 주어진 위치에서 PNPLA3 유전자를 표적화하도록 설계된다. 예를 들어, 본 명세서의 표 1 및 표 2에 예시된 바와 같이, 위치 2180에 있는 PNPLA3 유전자를 표적화하도록 설계된 안티센스 가닥 서열은, 유전자와 염기쌍을 형성할 때, 안티센스 가닥의 5′ 말단 핵염기가 PNPLA3 유전자의 위치 2198과 정렬될 것을 필요로 한다.
본 명세서에 제공되는 바와 같이, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 위치 1(5′ → 3′)의 핵염기가 유전자에 상보적일 것을 필요로 하지 않되, 단, 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥과 유전자의 적어도 85%의 상보성(예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재한다. 예를 들어, PNPLA3 유전자의 위치 2180을 표적화하도록 설계된 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 경우, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5′ 말단 핵염기는 유전자의 위치 2198과 정렬되어야 하지만; 안티센스 가닥의 5′ 말단 핵염기는 PNPLA3 유전자의 위치 2200과 상보적일 수 있지만 그럴 것을 필요로 하지 않되, 단, 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥과 유전자의 적어도 85%의 상보성(예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재한다. 무엇보다도, 본 명세서에 개시된 다양한 실시예에 의해 보여주는 바와 같이, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥에 의한 유전자의 결합의 특정 부위(예를 들어, PNPLA3 RNAi 작용제가 위치 2180에서, 위치 1586에서, 위치 1179에서, 또는 어떤 다른 위치에서 PNPLA3 유전자를 표적화하도록 설계될지)는 PNPLA3 RNAi 작용제에 의해 달성되는 억제 수준에 중요하다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 표 1에 제시된 PNPLA3 유전자 서열의 위치에 있거나 그 부근에 있는 PNPLA3 유전자를 표적화한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 1에 개시된 표적 PNPLA3 19량체 서열에 완전히, 실질적으로, 또는 적어도 부분적으로 상보적인 코어 스트레치 서열을 포함한다.
[표 1]
Figure pct00007
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥(5' →3')의 위치 19는 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 1과 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥(5' →3')의 위치 1은 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 19와 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥(5' →3')의 위치 2는 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18과 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥(5' →3')의 위치 2 내지 18은 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18 내지 2에 위치한 각각의 상보적 염기와 각각 염기쌍을 형성할 수 있다.
본 명세서에 개시된 RNAi 작용제의 경우, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 PNPLA3 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, PNPLA3 유전자에 비상보적일 수 있다. 일부 실시 형태에서, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT이다. 일부 실시 형태에서, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 함께 A:U 또는 U:A 염기쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 안티센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 또는 2 내지 21의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 3 내지 21, 2 내지 21, 1 내지 21, 3 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 20, 3 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 19, 3 내지 18, 2 내지 18, 또는 1 내지 18의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 임의의 안티센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 또는 2 내지 21의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 센스 가닥은 서열 번호 2, 3, 4, 9 내지 20, 214, 219 및 220의 임의의 센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 3 내지 21, 2 내지 21, 1 내지 21, 3 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 20, 3 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 19, 3 내지 18, 2 내지 18, 또는 1 내지 18의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 임의의 안티센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 2 내지 18 또는 2 내지 19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2 또는 표 4의 임의의 센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 3 내지 21, 2 내지 21, 1 내지 21, 3 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 20, 3 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 19, 3 내지 18, 2 내지 18, 또는 1 내지 18의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 (i) 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 임의의 안티센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 2 내지 18 또는 2 내지 19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 서열 번호 2, 3, 4, 9 내지 20, 214, 219 및 220의 임의의 센스 가닥 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 3 내지 21, 2 내지 21, 1 내지 21, 3 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 20, 3 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 19, 3 내지 18, 2 내지 18, 또는 1 내지 18 의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 하기 표 2에 나타낸 코어 19량체 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
[표 2]
Figure pct00008
Figure pct00009
표 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 PNPLA3 RNAi 작용제는 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2의 임의의 안티센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 임의의 안티센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2의 임의의 센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 서열 번호 2, 3, 4, 9 내지 20, 214, 219 및 220의 임의의 센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 표 2에 개시된 서열에 나열된 각각의 N은 (변형된 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드 둘 모두 상에서 발견되는 것들을 포함한) 임의의 및 모든 핵염기로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표 2에 개시된 서열 내에 나열된 N 뉴클레오티드는 다른 한쪽 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적인 핵염기를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 표 2에 개시된 서열 내에 나열된 N 뉴클레오티드는 다른 한쪽 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적이지 않은 핵염기를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 표 2에 개시된 서열 내에 나열된 N 뉴클레오티드는 다른 한쪽 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 동일한 핵염기를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 표 2에 개시된 서열 내에 나열된 N 뉴클레오티드는 다른 한쪽 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 상이한 핵염기를 갖는다.
소정의 변형된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥뿐만 아니라 이들의 기초가 되는 비변형된 핵염기 서열이 표 3에 제공되어 있다. 소정의 변형된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥뿐만 아니라 이들의 기초가 되는 비변형된 핵염기 서열이 표 4에 제공되어 있다. PNPLA3 RNAi 작용제를 형성함에 있어서, 표 3 및 표 4에, 이뿐만 아니라 상기 표 2에 나열된 각각의 기초가 되는 염기 서열 내의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는 센스 가닥과 함께 안티센스 가닥을 어닐링함으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4에 나열된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 나열된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단, 두 서열은 연속적인 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개의 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85%의 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 2, 표 3 또는 표 4의 임의의 서열의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 핵염기 서열을 갖는 이중체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 서열 번호 (176과 214); (90과 131); (181과 219); (95와 136); (188과 220) 및/또는 (102와 137)을 갖는 이중체 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 서열 번호 (176과 214); (90과 131); (181과 219); (95와 136); (188과 220) 또는 (102와 137)을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제의 이중체 서열은 나트륨 염, 혼합 염, 또는 유리 산으로서 제조되거나 제공된다.
변형된 뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥의 예가 표 3에 제공되어 있다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 센스 가닥의 예가 표 4에 제공되어 있다.
표 3 및 표 4에 사용되는 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드 및 연결기를 나타내는 데 하기 표기가 사용된다.
A = 아데노신-3′-포스페이트;
C = 시티딘-3′-포스페이트;
G = 구아노신-3′-포스페이트;
U = 우리딘-3′-포스페이트
I = 이노신-3′-포스페이트
a = 2′-O-메틸아데노신-3′-포스페이트
as = 2′-O-메틸아데노신-3′-포스포로티오에이트
c = 2′-O-메틸시티딘-3′-포스페이트
cs = 2′-O-메틸시티딘-3′-포스포로티오에이트
g = 2′-O-메틸구아노신-3′-포스페이트
gs = 2′-O-메틸구아노신-3′-포스포로티오에이트
t = 2′-O-메틸-5-메틸우리딘-3′-포스페이트
ts = 2′-O-메틸-5-메틸우리딘-3′-포스포로티오에이트
u = 2′-O-메틸우리딘-3′-포스페이트
us = 2′-O-메틸우리딘-3′-포스포로티오에이트
i = 2′-O-메틸이노신-3′-포스페이트
is = 2′-O-메틸이노신-3′-포스포로티오에이트
Af = 2′-플루오로아데노신-3′-포스페이트
Afs = 2′-플루오로아데노신-3′-포스포로티오에이트
Cf = 2′-플루오로시티딘-3′-포스페이트
Cfs = 2′-플루오로시티딘-3′-포스포로티오에이트
Gf = 2′-플루오로구아노신-3′-포스페이트
Gfs = 2′-플루오로구아노신-3′-포스포로티오에이트
Tf = 2′-플루오로-5′-메틸우리딘-3′-포스페이트
Tfs = 2′-플루오로-5′-메틸우리딘-3′-포스포로티오에이트
Uf = 2′-플루오로우리딘-3′-포스페이트
Ufs = 2′-플루오로우리딘-3′-포스포로티오에이트
AUNA = 2′,3′-세코-아데노신-3′-포스페이트, 표 6 참조
AUNAs = 2′,3′-세코-아데노신-3′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
CUNA = 2′,3′-세코-시티딘-3′-포스페이트, 표 6 참조
CUNAs = 2′,3′-세코-시티딘-3′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
GUNA = 2′,3′-세코-구아노신-3′-포스페이트, 표 6 참조
GUNAs = 2′,3′-세코-구아노신-3′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
UUNA = 2′,3′-세코-우리딘-3′-포스페이트, 표 6 참조
UUNAs = 2′,3′-세코-우리딘-3′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
a_2N = 2′-O-메틸-2-아미노아데노신-3′-포스페이트, 표 6 참조
a_2Ns = 2′-O-메틸-2-아미노아데노신-3′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
(invAb) = 역전된 탈염기 데옥시리보뉴클레오티드, 표 6 참조
(invAb)s = 역전된 탈염기 데옥시리보뉴클레오티드-5′-포스포로티오에이트, 표 6 참조
당업자는, (예를 들어, 포스포로티오에이트 결합 "s"와 같이) 서열에 의해 달리 지시되지 않는 한, 올리고뉴클레오티드에 존재할 때, 뉴클레오티드 단량체들은 5'-3'-포스포다이에스테르 결합에 의해 상호 연결됨을 용이하게 이해할 것이다. 당업자가 명확하게 이해하는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 결합의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포다이에스테르 결합을 대체한다. 또한, 당업자는 주어진 올리고뉴클레오티드 서열의 3' →단부에 있는 말단 뉴클레오티드가 전형적으로 생체외에서 주어진 단량체의 각각의 3' →위치에 포스페이트 모이어티 대신 하이드록실(-OH) 기를 가질 것임을 용이하게 이해할 것이다. 추가적으로, 본 명세서에 개시된 실시 형태에 대해, 5' → 3'으로 각각의 가닥을 볼 때, 역전된 탈염기 잔기는 데옥시리보스의 3' 위치가 각각의 가닥 상의 선행하는 단량체의 3' 단부에서 연결되도록 삽입된다(예를 들어, 표 6 참조). 더욱이, 당업자가 용이하게 이해하고 인식하는 바와 같이, 본 명세서에 도시된 포스포로티오에이트 화학 구조는 전형적으로 황 원자 상에서 음이온을 나타내지만, 본 명세서에 개시된 본 발명은 모든 포스포로티오에이트 호변이성질체(예를 들어, 황 원자가 이중 결합을 가지며 음이온이 산소 원자 상에 있는 경우)를 포함한다. 본 명세서에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제 및 PNPLA3 RNAi 작용제의 조성물을 설명할 때 당업자의 그러한 이해가 사용된다.
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제와 함께 사용되는 표적화 리간드, 표적화 기, 및 연결기의 소정의 예가 하기 표 6에 제공된다. 더 구체적으로는, 표적화 기 및 연결기(이들은 함께 표적화 리간드를 형성할 수 있음)는 (NAG37) 및 (NAG37)s를 포함하며, 이들에 대해 이들의 화학 구조가 하기 표 6에 제공된다. 각각의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 본 명세서에 나열된 임의의 표적화 리간드, 표적화 기, 또는 연결기뿐만 아니라, 서열의 5′ 및/또는 3′ 단부에 접합된 다른 기를 가질 수 있다.
[표 3]
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 4]
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는 센스 가닥과 함께 안티센스 가닥을 어닐링함으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4에 나열된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 나열된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단, 두 서열은 연속적인 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개의 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85%의 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3의 임의의 안티센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4의 임의의 센스 가닥 서열과 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 1 내지 17, 2 내지 17, 1 내지 18, 2 내지 18, 1 내지 19, 2 내지 19, 1 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 21, 또는 2 내지 21의 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 임의의 서열의 (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 뉴클레오티드 1 내지 17, 2 내지 17, 3 내지 17, 4 내지 17, 1 내지 18, 2 내지 18, 3 내지 18, 4 내지 18, 1 내지 19, 2 내지 19, 3 내지 19, 4 내지 19, 1 내지 20, 2 내지 20, 3 내지 20, 4 내지 20, 1 내지 21, 2 내지 21, 3 내지 21, 또는 4 내지 21의 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 경우, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 PNPLA3 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, PNPLA3 유전자에 비상보적일 수 있다. 일부 실시 형태에서, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT(또는 이들의 변형된 버전)이다. 일부 실시 형태에서, (5' 단부 → 3' 단부 방향으로) 안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 함께 A:U 또는 U:A 염기쌍을 형성한다.
표 2 또는 표 4에 나열된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 나열된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단, 두 서열은 연속적인 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개의 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85%의 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 4의 임의의 변형된 서열의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥 및 표 3의 임의의 변형된 서열의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖는다. 소정의 대표적인 서열 쌍은 표 5A 및 표 5B에 제시된 이중체 ID 번호에 의해 예시된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 본 명세서에 제시된 이중체 ID 번호 중 어느 하나에 의해 나타낸 이중체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 본 명세서에 제시된 임의의 이중체 ID 번호로 나타낸 임의의 이중체의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 본 명세서에 제시된 임의의 이중체 ID 번호로 나타낸 임의의 이중체의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 및 표적화 기 및/또는 연결기를 포함하며, 표적화 기 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유적으로 연결(즉, 접합)된다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 본 명세서에 제시된 임의의 이중체 ID 번호의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 본 명세서에 제시된 임의의 이중체 ID 번호의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열 및 표적화 기 및/또는 연결기를 포함하며, 표적화 기 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유적으로 연결된다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 2 또는 표 5A 및 표 5B의 임의의 안티센스 가닥/센스 가닥 이중체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 표적화 기 또는 표적화 리간드를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 2 또는 표 5A 및 표 5B의 임의의 안티센스 가닥/센스 가닥 이중체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 아시알로당단백질 수용체 리간드 표적화 기를 추가로 포함한다.
표적화 기는, 링커(linker)와 함께 또는 링커 없이, 표 2, 표 3, 및 표 4에 개시된 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 가닥의 5' 또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 링커는, 표적화 기와 함께 또는 표적화 기 없이, 표 2, 표 3, 및 표 4에 개시된 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 가닥의 5' 또는 3' 단부에 부착될 수 있다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 2 또는 표 5A 및 표 5B의 임의의 안티센스 가닥/센스 가닥 이중체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각 표 6에 정의된 바와 같은 (NAG37) 및 (NAG37)s로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 3 또는 표 4의 임의의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 5A 및 표 5B의 임의의 이중체의 임의의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 아시알로당단백질 수용체 리간드 표적화 기를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표 5A 및 표 5B의 임의의 이중체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
[표 5A]
Figure pct00015
[표 5B]
Figure pct00016
Figure pct00017
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 염, 혼합 염, 또는 유리 산으로서 제조되거나 제공된다. 본 명세서에 기재된 RNAi 작용제는, PNPLA3 유전자를 발현하는 세포로의 전달시에, 생체내 및/또는 시험관내에서 하나 이상의 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하거나 녹다운시킨다.
표적화 리간드 또는 표적화 기, 연결기, 및 전달 비히클
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 표적화 기, 연결기, 표적화 리간드, 전달 중합체, 또는 전달 비히클을 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 이상의 비-뉴클레오티드 기에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 표적화, 전달 또는 부착을 향상시킬 수 있다. 표적화 기 및 연결기의 예가 표 6에 제공되어 있다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 비-뉴클레오티드 기는 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 연결된다. 비-뉴클레오티드 기는 링커/연결기를 통해 RNAi 작용제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비-뉴클레오티드 기는 불안정한, 절단가능한, 또는 가역적인 결합 또는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
일부 실시 형태에서, 비-뉴클레오티드 기는 이것이 부착되는 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 향상시켜서 RNAi 작용제 또는 접합체의 세포 또는 조직 특이적 분포 및 세포 특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시 형태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 향상시킨다.
표적화 기 또는 표적화 모이어티는 이들이 부착되는 접합체 또는 RNAi 작용제의 약동학적 또는 생체분포 특성을 향상시켜서 접합체 또는 RNAi 작용제의 세포-특이적(일부 경우에, 기관-특이적을 포함함) 분포 및 세포-특이적(기관-특이적) 흡수를 개선한다. 표적화 기는 그것이 지향되는 표적에 대해 1가, 2가, 3가, 4가일 수 있거나, 더 높은 결합가(valency)를 가질 수 있다. 대표적인 표적화 기는, 제한 없이, 세포 표면 분자에 대해 친화성을 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 단일클론 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대해 친화성을 갖는 항체 모방체를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표적화 기는 PEG 링커와 같은 링커 또는 1개, 2개, 또는 3개의 탈염기 및/또는 리비톨(탈염기 리보스) 잔기 - 이는 일부 경우에 링커로서의 역할을 할 수 있음 - 를 사용하여 RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 표적화 리간드는 갈락토스-유도체 클러스터를 포함한다.
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는 5′-말단 및/또는 3′-말단에서 반응성 기, 예컨대 아미노 기(본 명세서에서 아민으로도 지칭됨)를 갖도록 합성될 수 있다. 반응성 기는 후속으로 당업계에서 전형적인 방법을 사용하여 표적화 모이어티를 부착하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 표적화 기는 아시알로당단백질 수용체 리간드를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 아시알로당단백질 수용체 리간드는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는 모이어티를 함유하는 리간드이다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 아시알로당단백질 수용체는 간세포 상에서 고도로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 아시알로당단백질 수용체 리간드는 하나 이상의 갈락토스 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 갈락토스 유도체라는 용어는 갈락토스, 및 갈락토스와 동일하거나 그보다 큰 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는 갈락토스의 유도체 둘 모두를 포함한다. 갈락토스 유도체는 다음을 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, 및 N-아이소-부타노일갈락토사민(예를 들어, 문헌[S.T. Iobst and K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686] 참조). 간으로의 올리고뉴클레오티드 및 다른 분자의 생체내 표적화에 유용한 갈락토스 유도체, 및 갈락토스 유도체의 클러스터는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620]; 문헌[Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945] 참조).
갈락토스 유도체는 간세포의 표면 상에 발현된 아시알로당단백질 수용체에 대한 결합을 통해 생체내에서 분자를 간세포로 표적화하는 데 사용되어 왔다. 아시알로당단백질 수용체(들)에 대한 아시알로당단백질 수용체 리간드의 결합은 간세포로의 세포-특이적 표적화 및 간세포 내로의 분자의 세포내이입을 용이하게 한다. 아시알로당단백질 수용체 리간드는 단량체성(예를 들어, 단일 갈락토스 유도체를 가짐; 1가 또는 한자리(monodentate)로도 지칭됨) 또는 다량체성(예를 들어, 다수의 갈락토스 유도체를 가짐)일 수 있다. 갈락토스 유도체 또는 갈락토스 유도체 클러스터는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 단부에 부착될 수 있다. 표적화 리간드, 예컨대 갈락토스 유도체 클러스터의 제조는, 예를 들어 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.에게 허여된 국제 특허 출원 공개 WO 2018/044350호, 및 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.에게 허여된 국제 특허 출원 공개 WO 2017/156012호에 기재되어 있으며, 이들 둘 모두의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 갈락토스 유도체 클러스터는 2 내지 4개의 말단 갈락토스 유도체를 갖는 분자를 포함한다. 말단 갈락토스 유도체는 이의 C-1 탄소를 통해 분자에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 갈락토스 유도체 삼량체(트라이안테나리(tri-antennary) 갈락토스 유도체 또는 3가 갈락토스 유도체로도 지칭됨)이다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 3개의 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 갈락토스 유도체 사량체(테트라안테나리(tetra-antennary) 갈락토스 유도체 또는 4가 갈락토스 유도체로도 지칭됨)이다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 4개의 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 갈락토스 유도체 삼량체는 각각 중심 분지점에 연결된 3개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 갈락토스 유도체 사량체는 각각 중심 분지점에 연결된 4개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 갈락토스 유도체는 당류의 C-1 탄소를 통해 중심 분지점에 부착될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체는 링커 또는 스페이서를 통해 분지점에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커 또는 스페이서는 PEG 기와 같은 가요성 친수성 스페이서이다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,968호; 문헌[Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546] 참조). 일부 실시 형태에서, PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분지점은, 3개의 갈락토스 유도체의 부착을 가능하게 하고 RNAi 작용제에 대한 그 분지점의 부착을 추가로 가능하게 하는 임의의 소분자일 수 있다. 분지점 기의 예는 다이-라이신 또는 다이-글루타메이트이다. RNAi 작용제에 대한 분지점의 부착은 링커 또는 스페이서를 통해 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커 또는 스페이서는 PEG 스페이서와 같은 그러나 이로 한정되지 않는 가요성 친수성 스페이서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 강성 링커, 예컨대 사이클릭 기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는, 예를 들어 N-아세틸-갈락토사민 사량체일 수 있는 갈락토스 유도체 사량체로 구성된다.
본 발명의 실시 형태는 생체내에서 PNPLA3 RNAi 작용제를 간 세포에 전달하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 그러한 약제학적 조성물은, 예를 들어, 갈락토스 유도체 클러스터에 접합된 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 갈락토스 유도체 클러스터는, 예를 들어 N-아세틸-갈락토사민 삼량체일 수 있는 갈락토스 유도체 삼량체, 또는 예를 들어 N-아세틸-갈락토사민 사량체일 수 있는 갈락토스 유도체 사량체로 구성된다.
표적화 리간드 또는 표적화 기는 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 단부에 연결될 수 있다.
표적화 리간드는 표 6에 정의된 바와 같은 (NAG37) 및 (NAG37)s를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 갈락토스 클러스터 표적화 리간드를 포함하여, 다른 표적화 기 및 표적화 리간드가 당업계에 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 연결기는 RNAi 작용제에 접합된다. 연결기는 표적화 기, 전달 중합체 또는 전달 비히클에 대한 작용제의 공유 결합을 용이하게 한다. 연결기는 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 연결기는 RNAi 작용제의 센스 가닥에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 연결기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 또는 3' 단부에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 연결기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 접합된다. 연결기의 예에는 다음이 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 반응성 기, 예를 들어 1차 아민 및 알킨, 알킬 기, 탈염기 뉴클레오티드, 리비톨(탈염기 리보스), 및/또는 PEG 기.
일부 실시 형태에서, 표적화 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드에 내부적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 표적화 기는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
링커 또는 연결기는 하나 이상의 공유 결합을 통해 하나의 화학적 기(예를 들어, RNAi 작용제) 또는 관심 세그먼트를 다른 화학적 기(예를 들어, 표적화 기 또는 전달 중합체) 또는 관심 세그먼트에 연결하는 2개의 원자 사이의 연결부이다. 불안정한 결합부(labile linkage)는 불안정한 결합(labile bond)을 함유한다. 결합부는 2개의 연결된 원자들 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 선택적으로 포함할 수 있다. 스페이서는 그 결합부에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 및 아르알키닐 기를 포함하지만 이로 한정되지 않으며; 이들 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 당업계에 잘 알려져 있고, 전술한 목록은 설명의 범주를 제한하는 것으로 의미되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 2개 이상의 RNAi 작용제가 단일 조성물 내에 포함되는 경우, 각각의 RNAi 작용제는 동일한 표적화 기 또는 2개의 상이한 표적화 기(즉, 상이한 화학 구조를 갖는 표적화 기)에 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적화 기는 추가의 링커의 사용 없이 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 표적화 기 그 자체는 접합의 용이한 제시를 촉진시키기 위해 링커 또는 다른 부위를 갖도록 설계된다. 일부 실시 형태에서, 2개 이상의 PNPLA3 RNAi 작용제가 단일 분자 내에 포함되는 경우, 각각의 RNAi 작용제는 동일한 링커 또는 상이한 링커(즉, 상이한 화학 구조를 갖는 링커)를 이용할 수 있다.
표 2, 표 3, 또는 표 4에 나열된 임의의 PNPLA3 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열은, 변형되든지 비변형되든지 간에, 3' 및/또는 5' 표적화 기(들) 또는 연결기(들)를 함유할 수 있다. 3' 또는 5' 표적화 기 또는 연결기를 함유하는 표 3 또는 표 4에 나열되거나, 또는 달리 본 명세서에 기재된 임의의 PNPLA3 RNAi 작용제 서열은 대안적으로 3' 또는 5' 표적화 기 및/또는 연결기를 함유하지 않을 수 있거나, 표 6에 나타낸 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 상이한 3' 또는 5' 표적화 기 및/또는 연결기를 함유할 수 있다. 표 5A 및 표 5B에 나열된 임의의 PNPLA3 RNAi 작용제 이중체는, 변형되든지 비변형되든지 간에, 표 6에 나타낸 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는 표적화 기 또는 연결기를 추가로 포함할 수 있고, 표적화 기 또는 연결기는 PNPLA3 RNAi 작용제 이중체의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
(조합될 때 표적화 리간드를 형성할 수 있는) 표적화 기 및 연결기의 예가 표 6에 제공된다. 표 4는 5' 또는 3' 단부에 연결된 표적화 기 또는 연결기를 갖는 PNPLA3 RNAi 작용제의 센스 가닥의 몇몇 실시 형태를 제공한다.
[표 6]
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
표 6의 각각의 상기 구조에서, NAG는 N-아세틸-갈락토사민 또는 다른 갈락토스 유도체를 포함하고, 이는 상기 구조 및 본 명세서에 제공된 설명을 고려하여 부착되는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
각각의 (NAGx)는 ((NAG37)에서와 같이) 포스페이트 기, 또는 ((NAG37)s에서와 같이) 포스포로티오에이트 기, 또는 다른 연결기를 통해 PNPLA3 RNAi 작용제에 부착될 수 있다.
Figure pct00022
당업계에 알려진 다른 연결기가 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 전달 비히클은 세포 또는 조직에 RNAi 작용제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 전달 비히클은 세포 또는 조직으로의 RNAi 작용제의 전달을 개선하는 화합물이다. 전달 비히클은 다음을 포함하거나 이로 이루어질 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 중합체, 예를 들어 양친매성 중합체, 막 활성 중합체, 펩티드, 멜리틴 펩티드(melittin peptide), 멜리틴-유사 펩티드(melittin-like peptide, MLP), 지질, 가역적으로 변형된 중합체 또는 펩티드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포좀, 미셀, DPC 또는 당업계에서 이용가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi 작용제는 또한 표적화 기, 지질(콜레스테롤 및 콜레스테릴 유도체를 포함하지만 이로 한정되지 않음), 나노입자, 중합체, 리포좀, 미셀, DPC(예를 들어, 각각 본 명세서에 참고로 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO 2000/053722호, WO 2008/0022309호, WO 2011/104169호, 및 WO 2012/083185호, WO 2013/032829호, WO 2013/158141호 참조), 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생체접착성 미소구체, 단백질성 벡터, 또는 당업계에 알려져 있고 이용가능한 핵산 또는 올리고뉴클레오티드 전달에 적합한 다른 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수 있다.
약제학적 조성물 및 제형
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 약제학적 조성물 또는 제형(본 명세서에서 "약제(medicament)"로도 지칭됨)으로서 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함한다. 이들 약제학적 조성물은 표적 세포, 세포군, 조직, 또는 유기체에서 표적 mRNA의 발현의 억제에 특히 유용하다.
약제학적 조성물은 표적 PNPLA3 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익이 얻어지는 질병, 장애, 또는 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 표적 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익이 얻어지는 질병, 장애, 또는 질환이 발생될 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 방법은 치료하려는 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화 리간드에 연결된 PNPLA3 RNAi 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(비히클, 담체, 희석제, 및/또는 전달 중합체를 포함함)가 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물에 첨가되어, 인간을 포함한 대상체로의 생체내 전달에 적합한 약제학적 제형 또는 약제를 형성한다.
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물 및 방법은, 본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함에 의한 것을 포함하여, 세포, 세포군, 세포군, 조직, 기관, 또는 대상체에서 표적 mRNA의 수준을 감소시켜, 대상체에서 PNPLA3 mRNA의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 표적화된 세포 또는 조직 내의 표적 유전자의 병원성 상향조절을 갖는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병, 예컨대 간경변증을 갖는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병, 예컨대 간경변증과 관련된 증상을 앓고 있었다.
일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 기재된 약제학적 조성물은 대상체에서 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 과 관련된 임상 제시, 및/또는 PNPLA3의 과발현을 치료하거나 관리하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 약제학적 조성물의 치료적(예방적 포함) 유효량이 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 개시된 임의의 PNPLA3 RNAi 작용제의 투여가 대상체에서 질병의 증상의 수, 중증도, 및/또는 빈도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 기재된 약제학적 조성물은 PNPLA3 mRNA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익이 얻어지는 질병 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체에게 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 증상을 치료한다. 다른 실시 형태에서, 대상체에게 하나 이상의 PNPLA3 RNAi 작용제의 예방적 유효량을 투여함으로써 적어도 하나의 증상을 예방 또는 억제한다.
투여 경로는 PNPLA3 RNAi 작용제가 신체와 접촉하게 되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위해 약물 및 올리고뉴클레오티드 및 핵산을 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 특정 경로에 맞게 적절하게 조정된 제제로 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 관절내, 또는 복막내 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 피하 주사를 통해 투여된다.
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물은 당업계에 알려진 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 이용하여 세포, 세포군, 조직, 또는 대상체에게 전달될 수 있다. 일반적으로, (시험관내에서 또는 생체내에서) 핵산 분자를 전달하기 위한 당업계에서 인식되는 임의의 적합한 방법은 본 명세서에 기재된 조성물과 함께 사용되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전달은 국부 투여(예를 들어, 직접 주사, 이식, 또는 국소 투여), 전신 투여, 또는 두개내(예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 수강내), 근육내, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 구강, 직장, 또는 국소(협측 및 설하를 포함함) 투여를 비롯한 피하, 정맥내, 복막내, 또는 비경구 경로에 의해 이루어질 수 있다. 소정 실시 형태에서, 조성물은 피하 또는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제형화된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 약제학적 조성물 또는 약제는 기재된 치료용 화합물 중 적어도 하나의 약리학적 유효량 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제(부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는 활성 약제 구성성분(Active Pharmaceutical ingredient, API, 치료용 생성물, 예를 들어 PNPLA3 RNAi 작용제) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 치료 효과를 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공에 있어서 도움을 주고, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 수용성을 보호하거나, 지지하거나, 향상시키고, c) 제품 식별을 보조하고/하거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전달의 전반적인 안전성, 유효성의 임의의 다른 속성을 향상시키도록 작용할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 불활성 물질이거나 불활성 물질이 아닐 수 있다.
부형제는 다음을 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 흡수 향상제, 부착방지제, 소포제, 산화방지제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 향상제, 전달 중합체, 세제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 보습제, 윤활제, 오일, 중합체, 방부제, 식염수, 염, 용매, 당, 계면활성제, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 장성제(tonicity agent), 비히클, 발수제, 및 습윤제.
주사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수성 용액(여기서는, 수용성) 또는 분산물, 및 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정세균수, Cremophor® ELTM(미국 뉴저지주 파시패니 소재의 BASF) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 적합한 담체는 제조 및 저장의 조건 하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 분산물의 경우에는 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 필요한 입자 크기의 유지에 의해 유지될 수 있고, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 가져올 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 구성성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 도입시킨 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 베이스 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공-건조 및 냉동-건조를 포함하는데, 이들은 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가의 필요한 성분의 분말을 생성한다.
일부 실시 형태에서, 피하 투여에 적합한 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 제형은 수성 인산나트륨 완충액 중에서 제조될 수 있다(예를 들어, PNPLA3 RNAi 작용제가 물 중 0.5 mM 일염기성 인산나트륨, 0.5 mM 이염기성 인산나트륨 중에 제형화됨).
관절내 투여에 적합한 제형은 미세결정질 형태로 존재할 수 있는 약물의 멸균 수성 제제의 형태, 예를 들어, 수성 미세결정질 현탁액의 형태일 수 있다. 리포좀 제형 또는 생분해성 중합체 시스템이 또한 관절내 투여 및 안과적 투여 둘 모두를 위한 약물을 제시하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제의 경구 투여에 적합한 제형이 또한 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 경구 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 경구 투여용 캡슐로 제형화된다.
활성 화합물은, 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터 급속한 제거에 대해 화합물을 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 리포좀 현탁액이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.
PNPLA3 RNAi 작용제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여 단위 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 투여 단위 형태는 치료하려는 대상체에 대한 단일 투여량(unitary dosage)으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 규격(specification)은 활성 화합물의 특유의 특성 및 달성하려는 치료적 효과, 및 개체의 치료를 위한 그러한 활성 화합물의 배합에 관한 당업계에서의 고유의 제한에 의해 영향을 받고 또한 이들에 직접적으로 좌우된다.
약제학적 조성물은 약제학적 조성물에서 흔히 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 그러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제, 진통제, 항히스타민, 또는 항염증제(예를 들어, 아세트아미노펜, NSAID, 다이펜하이드라민 등)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 정의된 RNAi 작용제를 발현하거나 포함하는 세포, 조직, 또는 단리된 기관이 "약제학적 조성물"로서 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약리학적 유효량", "치료적 유효량", 또는 간단히 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 RNAi 작용제의 양을 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제를 투여하는 단계에 더하여, 제2 치료제 또는 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 다른 PNPLA3 RNAi 작용제(예를 들어, PNPLA3 표적 내의 상이한 서열을 표적화하는 PNPLA3 RNAi 작용제)이다. 다른 실시 형태에서, 제2 치료제는 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 또는 압타머일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제(들)는 선택적으로 하나 이상의 추가의 치료제와 병용된다. PNPLA3 RNAi 작용제 및 추가의 치료제(들)는 단일 조성물로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 별개로 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 RNAi 작용제와 별개의 투여 형태로 별개로 투여된다(예를 들어, PNPLA3 RNAi 작용제는 피하 주사에 의해 투여되는 반면, 치료 투여 계획(treatment dosing regimen)의 방법에 가해지는 추가의 치료제는 경구 투여된다). 일부 실시 형태에서, 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제(들)는 피하 주사를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 하나 이상의 선택적인 추가의 치료제는 경구 투여되며, 이들은 함께 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 과 관련된 질병 및 질환에 대한 치료 계획을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제(들)는 피하 주사를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 하나 이상의 선택적인 추가의 치료제는 별도의 피하 주사를 통해 투여된다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제와 하나 이상의 추가의 치료제를 병용하여 단일 투여 형태(예를 들어, 피하 주사용 단일 조성물로 제형화된 "칵테일")를 얻는다. PNPLA3 RNAi 작용제는, 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 하나 이상의 부형제와 조합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
일반적으로, PNPLA3 RNAi 작용제의 유효량은 약 0.1 내지 약 100 mg/㎏ 체중/용량, 예를 들어 약 1.0 내지 약 50 mg/㎏ 체중/용량의 범위일 것이다. 일부 실시 형태에서, 활성 화합물의 유효량은 용량당 약 0.25 내지 약 5 mg/㎏ 체중의 범위일 것이다. 일부 실시 형태에서, 활성 성분의 유효량은 용량당 약 0.5 내지 약 4 mg/㎏ 체중의 범위일 것이다. 투여되는 PNPLA3 RNAi 작용제의 용량, 특정 PNPLA3 RNAi 작용제의 활성 수준, 및 특정 대상체에 대해 원하는 억제 수준에 따라 매주, 격주, 매월, 또는 임의의 다른 간격으로 투여가 행해질 수 있다. 본 명세서에서의 실시예는 소정 동물종에서의 억제에 적합한 수준을 보여준다. 투여되는 양은 환자의 전반적인 건강 상태, 전달되는 화합물의 상대적 생물학적 효능, 약물의 제형, 제형 내 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 것이다. 또한, 투여되는 초기 투여량은 원하는 혈액 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위하여 상기 상위 수준을 넘어 증가될 수 있거나, 초기 투여량은 최적보다 작을 수 있음이 이해되어야 한다.
질병의 치료를 위하여 또는 질병의 치료를 위한 약제 또는 조성물의 형성을 위하여, PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 부형제와 조합되거나, 또는 다음을 포함하지만 이로 한정되지 않는 제2 치료제 또는 치료와 병용될 수 있다: 제2 또는 다른 RNAi 작용제, 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 펩티드 및/또는 압타머.
기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 애쥬번트(adjuvant)에 첨가될 때, 키트, 용기, 팩, 또는 디스펜서 내로 포장될 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 사전충전된 주사기, 펜 주사기(pen injector), 자동주사기(autoinjector), 주입 백/디바이스, 또는 바이알 내에 포장될 수 있다.
치료 방법 및 발현의 억제
본 명세서에 개시된 PNPLA3 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 투여로부터 이익이 얻어지는 질병 또는 장애를 갖는 대상체(예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제는 PNPLA3 mRNA 및/또는 PNPLA3 단백질 수준의 발현의 감소 및/또는 억제로부터 이익을 얻게 될 대상체(예를 들어, 인간), 예를 들어 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 과 관련된 증상으로 진단받았거나 이를 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체에게 임의의 하나 이상의 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량이 투여된다. 대상체의 치료는 치료적 및/또는 예방적 치료를 포함할 수 있다. 대상체에게 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량이 투여된다. 대상체는 인간, 환자, 또는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 성인, 청소년, 어린이, 또는 영아일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 인간 또는 동물에게 행해질 수 있다.
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는 PNPLA3-관련 질병 또는 장애를 갖거나, PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 RNAi 작용제는 PNPLA3 mRNA의 감소로부터 이익을 얻게 되거나 이의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개될 질병 또는 장애를 갖는 대상체의 임상 제시를 치료하거나 관리하는 데 사용된다. 대상체에게 하나 이상의 본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제 또는 PNPLA3 RNAi 작용제-함유 조성물의 치료적 유효량이 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 치료하려는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체에게 임의의 하나 이상의 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제의 예방적 유효량을 투여함으로써, 적어도 하나의 증상을 예방 또는 억제하여 대상체를 치료한다.
소정 실시 형태에서, 본 발명은 PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 질환, 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 명세서에 기재된 임의의 PNPLA3 RNAi 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제가 투여되는 대상체에서의 PNPLA3 유전자의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 PNPLA3 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 PNPLA3 RNAi 작용제를 제공받지 않은 대상체와 대비하여 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포군, 및/또는 조직에서 감소될 수 있다. 일부 실시 형태에서, PNPLA3 유전자 발현은 간세포의 세포질에서, PNPLA3 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 PNPLA3 RNAi 작용제를 제공받지 않은 대상체와 대비하여 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 또는 70% 초과만큼 억제된다.
일부 실시 형태에서, 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제가 투여된 대상체에서의 PNPLA3 단백질 수준은 PNPLA3 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 PNPLA3 RNAi 작용제를 제공받지 않은 대상체와 대비하여 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 단백질 수준은 대상체의 세포, 세포군, 조직, 혈액, 및/또는 다른 체액에서 감소될 수 있다.
PNPLA3 mRNA 수준 및 PNPLA3 단백질 수준의 감소는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, PNPLA3 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준의 감소 또는 저하는 본 명세서에서 PNPLA3의 감소 또는 저하로 또는 PNPLA3의 발현의 억제 또는 감소로 총칭된다. 본 명세서에 제시된 실시예는 PNPLA3 유전자 발현의 억제를 평가하기 위한 것으로 알려진 방법을 예시한다. 당업자는 생체내 및/또는 시험관내에서 PNPLA3 유전자 발현의 억제를 평가하기에 적합한 방법을 추가로 알고 있을 것이다.
일부 실시 형태에서, NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 에 의해 야기되는 질병, 장애, 또는 증상의 치료(예방학적 또는 예방적 치료를 포함함) 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 표 1의 서열을 갖는 PNPLA3 mRNA의 일부분에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 에 의해 야기되는 질병 또는 증상의 치료(예방학적 또는 예방적 치료를 포함함) 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 상기 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 표 4의 임의의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 에 의해 야기되는 질병 또는 증상의 치료(예방학적 또는 예방적 치료를 포함함) 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 표 2 또는 표 4의 임의의 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 상기 센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 표 1의 서열을 갖는 PNPLA3 mRNA의 일부분에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제를 상기 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 상기 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 표 4의 임의의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제를 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 표 2 또는 표 4의 임의의 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 상기 센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 표 3의 임의의 서열의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 PNPLA3 RNAi 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.
PNPLA3 RNAi 작용제의 사용은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 -, 및/또는 향상된 또는 상승된 PNPLA3 발현과 관련된 질병/장애의 치료적(예방적 포함) 치료를 위한 방법을 제공한다. 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제는 RNA 간섭을 매개하여, PNPLA3 단백질을 생성하는 데 필요한 하나 이상의 유전자의 발현을 억제한다. PNPLA3 RNAi 작용제는 또한, NAFLD, NASH, 간 섬유증, 및/또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병 - 간경변증을 포함함 - 을 포함한 다양한 질병, 장애, 또는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 생체내에서 PNPLA3 RNAi 작용제를 간 세포에 전달하기 위한 조성물이 기재된다.
세포, 조직, 기관, 및 비인간 유기체
본 명세서에 기재된 PNPLA3 RNAi 작용제 중 적어도 하나를 포함하는 세포, 조직, 기관, 및 비인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직, 기관, 또는 비인간 유기체는 RNAi 작용제를 세포, 조직, 기관, 또는 비인간 유기체에 전달함으로써 제조된다.
예시적인 실시 형태
개시된 기술의 예시적인 실시 형태가 여기에 제공된다. 이들 실시 형태는 단지 예시적이며 본 발명의 범주 또는 본 발명에 첨부된 청구범위를 제한하지 않는다.
실시 형태 1. PNRLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
서열 번호 46 내지 87, 174 내지 211, 및 257 및 258의 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 2. 실시 형태 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 46 내지 87, 174 내지 211, 및 257 및 258의 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 18을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 3. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 2 내지 45 및 212 내지 256의 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 상기 17개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 상기 안티센스 가닥에 상보적인 영역이 적어도 85%인, RNAi 작용제.
실시 형태 4. 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 5. 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
실시 형태 6. 실시 형태 4 또는 실시 형태 5에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′,3′-세코 뉴클레오티드 모방체, 고정된 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2′-메톡시에틸 뉴클레오티드, 탈염기 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2′-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 3′-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNAi 작용제.
실시 형태 7. 실시 형태 5에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 상기 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인, RNAi 작용제.
실시 형태 8. 실시 형태 1 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 88 내지 128의 상기 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 9. 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 129 내지 173의 상기 변형된 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 10. 실시 형태 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 88 내지 128의 상기 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 서열 번호 129 내지 173의 상기 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 11. 실시 형태 1 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 표적화 리간드에 연결되는, RNAi 작용제.
실시 형태 12. 실시 형태 11에 있어서, 상기 표적화 리간드는 n-아세틸-갈락토사민을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 13. 실시 형태 11 또는 실시 형태 12에 있어서, 상기 표적화 리간드는 (NAG37) 또는 (NAG37)s의 구조를 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 14. 실시 형태 11 내지 실시 형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 리간드는 상기 센스 가닥에 연결되는, RNAi 작용제.
실시 형태 15. 실시 형태 15에 있어서, 상기 표적화 리간드는 상기 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되는, RNAi 작용제.
실시 형태 16. 실시 형태 11 내지 실시 형태 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이고, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
실시 형태 17. 실시 형태 17에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 18 내지 27개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
실시 형태 18. 실시 형태 18에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 18 내지 24개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
실시 형태 19. 실시 형태 19에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 21개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
실시 형태 20. 실시 형태 17 내지 실시 형태 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 2개의 블런트 단부를 갖는, RNAi 작용제.
실시 형태 21. 실시 형태 1 내지 실시 형태 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 1개 또는 2개의 말단 캡을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 22. 실시 형태 1 내지 실시 형태 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 1개 또는 2개의 역전된 탈염기 잔기를 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 23. 실시 형태 1에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 표 5B에 나열된 바와 같은 서열 번호를 갖는 이중체 중 어느 하나의 이중체 서열을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되는, RNAi 작용제.
실시 형태 24. 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 상기 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 상기 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 25. 실시 형태 1에 있어서, 서열 번호 88 내지 128의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
실시 형태 26. 실시 형태 1에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 129 내지 173의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 a, c, g, i, 및 u는 각각 2′-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 이노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 안티센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
실시 형태 27. 실시 형태 24 내지 실시 형태 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥은 상기 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 상기 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 28. 실시 형태 24 내지 실시 형태 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표적화 리간드에 연결되는, RNAi 작용제.
실시 형태 29. 실시 형태 28에 있어서, 상기 표적화 리간드는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는, RNAi 작용제.
실시 형태 30. 실시 형태 29에 있어서, 상기 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는, RNAi 작용제.
실시 형태 31. 실시 형태 1에 있어서, 상기 표적화 리간드는 하기를 포함하는, RNAi 작용제:
Figure pct00023
, 또는
Figure pct00024
실시 형태 32. 실시 형태 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 88 내지 128의 상기 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 서열 번호 129 내지 173의 상기 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; (invAb)는 역전된 탈염기 데옥시리보스 잔기이고; (NAG37)s는 하기 화학 구조를 갖는, RNAi 작용제:
Figure pct00025
실시 형태 33. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나의 RNAi 작용제를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
실시 형태 34. 세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시 형태 33의 조성물의 유효량을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 35. 실시 형태 34에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 존재하는, 방법.
실시 형태 36. 실시 형태 35에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
실시 형태 37. 실시 형태 34 내지 실시 형태 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 PNPLA3 유전자 발현은 적어도 약 30%만큼 억제되는, 방법.
실시 형태 38. PNPLA3-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 실시 형태 33의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 39. 실시 형태 38에 있어서, 상기 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 알코올성 지방간 질병, 또는 간경변증인, 방법.
실시 형태 40. 실시 형태 34 내지 실시 형태 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여되는, 방법.
실시 형태 41. 실시 형태 34 내지 실시 형태 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 방법.
실시 형태 42. PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시 형태 33에 따른 조성물의 용도.
실시 형태 43. 실시 형태 42에 있어서, 상기 증상은 간의 간경변증인, 용도.
실시 형태 44. PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시 형태 33에 따른 조성물의 용도.
실시 형태 45. 실시 형태 42 내지 실시 형태 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병, 예컨대 간경변증인, RNAi 작용제의 용도.
실시 형태 46. 실시 형태 33의 조성물의 용도로서, 상기 RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여되는, 용도.
이제, 상기 제공된 실시 형태 및 항목이 하기의 비제한적인 예로 예시된다.
실시예
실시예 1. PNPLA3 RNAi 작용제의 합성.
상기 표 5A 및 표 5B에 제시된 PNPLA3 RNAi 작용제 이중체를 하기의 일반적인 절차에 따라 합성하였다:
A. 합성.
올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 고체상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 합성하였다. 그러한 표준 합성은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 규모에 따라, MerMade96E®(Bioautomation), MerMade12®(Bioautomation), 또는 OP Pilot 100(GE Healthcare)을 사용하였다. 제어된 기공 유리(CPG, 500 ㅕ 또는 600ㅕ, 미국 펜실베이니아주 애스톤 소재의 Prime Synthesis로부터 입수함)로 제조된 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다. 각각의 가닥의 3' 단부에 위치된 단량체를 합성을 위한 출발 지점으로서 고체 지지체에 부착하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 Thermo Fisher Scientific(미국 위스콘신주 밀워키 소재) 또는 Hongene Biotech(중국 상하이 소재)으로부터 구매하였다. 2'-O-메틸 포스포르아미다이트는 하기를 포함하였다: (5'-O-다이메톡시트라이틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-다이메톡시-트라이틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 -N, N-다이아이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-다이메톡시트라이틸-N2-(아이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N, N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-다이메톡시트라이틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 아미다이트와 동일한 보호기를 지녔다. 5′-(4,4′-다이메톡시트라이틸)-2′,3′-세코-우리딘, 2′-벤조일-3′-[(2-시아노에틸)-(N,N- 다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트를 또한 Thermo Fisher Scientific 또는 Hongene Biotech로부터 구매하였다. 5′-다이메톡시트라이틸-2′-O-메틸-이노신-3′-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 Glen Research(미국 버지니아주 소재) 또는 Hongene Biotech로부터 구매하였다. 역전된 탈염기 (3′-O-다이메톡시트라이틸-2′-데옥시리보스-5′-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 ChemGenes(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재) 또는 SAFC(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구매하였다. 5'-O-다이메톡시트라이틸-N2,N6-(페녹시아세테이트)-2'-O-메틸-다이아미노퓨린-3′-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 ChemGenes 또는 Hongene Biotech로부터 입수하였다.
포스포르아미다이트를 함유하는 표적화 리간드를 무수 다이클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴(50 mM) 중에 용해시키는 한편, 모든 다른 아미다이트를 무수 아세토니트릴(50 mM) 또는 무수 다이메틸포름아미드 중에 용해시키고, 분자체(3ㅕ)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸(BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 12분(RNA), 15분(표적화 리간드), 90초(2'OMe), 및 60초(2'F)였다. 포스포로티오에이트 결합을 도입하기 위하여, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-다이티아졸린-5-온(POS, 미국 매사추세츠주 레오밍스터 소재의 PolyOrg, Inc.로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하였다. 표적화 리간드가 존재하지 않는 "외피 비보유(naked)" RNAi 작용제로 구체적으로 확인되지 않는 한, 하기 실시예에서 합성되고 시험된 각각의 PNPLA3 RNAi 작용제 이중체는 표 6에 나타낸 표적화 리간드 화학 구조 내의 "NAG"로서 N-아세틸-갈락토사민을 이용하였다.
B. 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호.
고체상 합성의 완료 후에, 건조된 고체 지지체를 30℃에서 1.5시간 동안 물 중 40 중량% 메틸아민의 1:1 부피 용액과 28% 수산화암모늄 용액(Aldrich)으로 처리하였다. 용액을 증발시키고 고체 잔류물을 물 중에 재구성하였다(하기 참조).
C. 정제
TSKgel SuperQ-5 PW 13 μm 컬럼 및 Shimadzu LC-8 시스템을 사용하여 음이온 교환 HPLC에 의해 조(crude) 올리고머를 정제하였다. 완충액 A는 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 9.0이며 20% 아세토니트릴을 함유하였고, 완충액 B는 완충액 A와 동일한 것으로 1.5 M 염화나트륨이 첨가되었다. 260 nm에서의 UV 트레이스(trace)를 기록하였다. 적절한 분획을 풀링하고, 이어서 여과된 탈이온수 또는 100 mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴의 전개 완충액(running buffer)과 함께 Sephadex G-25 Fine으로 패킹된 GE Healthcare XK 26/40 컬럼을 사용하는 크기 배제 HPLC 상에서 전개하였다.
D. 어닐링.
1× 인산염 완충 식염수(Corning, Cellgro) 중에서 등몰 RNA 용액(센스 및 안티센스)을 배합함으로써 상보적 가닥을 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조하고 -15℃ 내지 -25℃에서 저장하였다. 1× 인산염 완충 식염수 중에서 UV-Vis 분광계에서 용액 흡광도를 측정함으로써 이중체 농도를 결정하였다. 이어서, 260 nm에서의 용액 흡광도에 변환 인자 및 희석 인자를 곱하여 이중체 농도를 결정하였다. 사용된 변환 인자는 0.050 mg/(mL·cm)이거나 실험적으로 결정된 흡광 계수로부터 계산하였다.
실시예 2. PNPLA3-SEAP 마우스 모델.
소정 PNPLA3 RNAi 작용제를 평가하기 위해, PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 이용가능성에 따라 6 내지 8주령된 암컷 C57BL/6 알비노 마우스 또는 ICR 마우스를, PNPLA3 RNAi 작용제 또는 대조군을 투여하기 적어도 29일 전에 투여된, 유체동역학적 꼬리 정맥 주사에 의해 플라스미드로 생체내에서 일시적으로 형질감염시켰다. 2가지 유형의 SEAP 플라스미드를 제조하였다. 제1 플라스미드는 SEAP(secreted human placental alkaline phosphatase, 분비 인간 태반 알칼리성 포스파타제) 리포터 유전의 3' UTR 내로 삽입된 인간 PNPLA3 cDNA 서열(GenBank NM_025225.2(서열 번호 1))을 함유한다. 시간 경과에 따른 전장 전사체(full length transcript)의 인지된 불안정성으로 인해, 인간 PNPLA3 cDNA 서열의 절단된 버전(구체적으로는, GenBank NM_025225.2의 뉴클레오티드 501 내지 2210)을 포함하는 제2 플라스미드를 합성하였다. 2개의 플라스미드 중 하나를 선택하여 마우스 내로 형질감염시켰다. 동물의 체중의 10%의 총 부피의 링거 용액 중 50 ㎍의 각각의 플라스미드를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주사하여 PNPLA3-SEAP 모델 마우스를 생성하였다. 용액을 이전에 기재된 바와 같이 5 내지 7초만에 27-게이지 바늘을 통해 주사하였다(문헌[Zhang G et al., "High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA." Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, p1735-1737]). PNPLA3 RNAi 작용제에 의한 PNPLA3의 발현의 억제는 SEAP 발현 - 이는 측정됨 - 의 동시 억제를 가져온다. 치료제의 투여 전에(일수 -7과 투여 전 일수 1 사이), 혈청 중 SEAP 발현 수준을 Phospha-Light™ SEAP 리포터 유전자 검정 시스템(Reporter Gene Assay System)(Invitrogen)에 의해 측정하고, 평균 SEAP 수준에 따라 마우스를 군으로 나누었다.
마우스를 2 내지 3% 아이소플루란으로 마취시키고, 혈액 샘플을 하악골하 영역으로부터 혈청 분리 튜브(독일 뉨브레히트 소재의 Sarstedt AG & Co.) 내로 수집하였다. 혈액을 주위 온도에서 20분 동안 응고시켰다. 튜브를 8,000 × g에서 3분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하고, 4℃에서 저장하였다. 혈청을 수집하고, 제조자의 설명서에 따라 Phospha-Light™ SEAP 리포터 유전자 검정 시스템(Invitrogen)에 의해 측정하였다. 이 모델에 대해 PNPLA3 발현에서의 비처리 관련 감소를 설명하기 위하여, 각 동물에 대한 혈청 SEAP 수준을 비히클 대조군이 주사된 마우스의 대조군에 대해 정규화할 수 있다. 그렇게 하기 위하여, 먼저, 일정 시점에서의 각 동물에 대한 SEAP 수준을 그 동물에서의 처리 전 발현 수준(일수 -1)으로 나누어, "처리 전에 대해 정규화된" 발현의 비를 결정하였다. 이어서, 개별 동물에 대한 "처리 전에 대해 정규화된" 비를 정상 비히클 대조군에서의 모든 마우스의 "처리 전에 대해 정규화된" 평균 비로 나눔으로써 특정 시점에서의 발현을 대조군에 대해 정규화하였다. 대안적으로, 처리 전 수준에 대해서만 정규화함으로써 각 동물에 대한 혈청 SEAP 수준을 평가하였다.
실시예 3. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
전장 인간 PNPLA3 전사체를 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 7에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 3.0 mg/㎏(mpk)를 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 7]
Figure pct00026
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00001(군 2) 및 J1D00002(군 3)는 PNPLA3 유전자의 위치 688에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00004(군 4)는 PNPLA3 유전자의 위치 1586에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 5)은 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00010(군 6) 및 J1D00011(군 7)은 PNPLA3 유전자의 위치 1179에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00012(군 8)는 PNPLA3 유전자의 위치 571에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00016(군 9)은 PNPLA3 유전자의 위치 1745에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 8 및 표 9에 제시되어 있다:
[표 8]
Figure pct00027
[표 9]
Figure pct00028
실시예 4. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
전장 인간 PNPLA3 전사체를 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 10에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 3.0 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 10]
Figure pct00029
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 2)은 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00014(군 3)는 PNPLA3 유전자의 위치 886에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00015(군 4)는 PNPLA3 유전자의 위치 1584에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00021(군 5)은 PNPLA3 유전자의 위치 553에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00022(군 6)는 PNPLA3 유전자의 위치 680에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00005(군 7)는 PNPLA3 유전자의 위치 1182에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00024(군 8)는 PNPLA3 유전자의 위치 746에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 11 및 표 12에 제시되어 있다:
[표 11]
Figure pct00030
[표 12]
Figure pct00031
실시예 5. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
인간 PNPLA3 전사체의 절단된 버전을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 13에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 3.0 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 13]
Figure pct00032
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00012(군 2), J1D00027(군 3), J1D00028(군 4), J1D00029(군 5)는 각각 PNPLA3 유전자의 위치 571에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00011(군 6) 및 J1D00017(군 7)은 PNPLA3 유전자의 위치 1179에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00004(군 8), J1D00003(군 9), 및 J1D00041(군 10)은 PNPLA3 유전자의 위치 1586에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 11)는 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 14 및 표 15에 제시되어 있다:
[표 14]
Figure pct00033
[표 15]
Figure pct00034
각 투여군(즉, 군 2 내지 군 11)에서의 각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는 모든 측정된 시점에서 비히클 대조군(군 1)과 대비하여 SEAP의 감소를 나타내었다.
실시예 6. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
인간 PNPLA3 전사체의 절단된 버전을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 16에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 3.0 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 16]
Figure pct00035
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 2), J1D00046(군 3), J1D00047(군 4), 및 J1D00048(군 5)은 각각 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00011(군 6), J1D00043(군 7), J1D00044(군 8), 및 J1D00045(군 9)는 PNPLA3 유전자의 위치 1179에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00020(군 10)은 PNPLA3 유전자의 위치 544에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00026(군 11)은 PNPLA3 유전자의 위치 1195에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 17 및 표 18에 제시되어 있다:
[표 17]
Figure pct00036
[표 18]
Figure pct00037
실시예 7. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
인간 PNPLA3 전사체의 절단된 버전을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 19에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 1.5 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 19]
Figure pct00038
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 2)은 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D000018(군 3) 및 J1D00019(군 4)는 PNPLA3 유전자의 위치 538에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00013(군 5)은 PNPLA3 유전자의 위치 687에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D000006(군 6) 및 J1D00007(군 7)은 PNPLA3 유전자의 위치 751에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00035(군 8)는 PNPLA3 유전자의 위치 1181에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00033(군 9)은 PNPLA3 유전자의 위치 685에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00032(군 10)는 PNPLA3 유전자의 위치 373에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00040(군 11)은 PNPLA3 유전자의 위치 1837에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 20 및 표 21에 제시되어 있다:
[표 20]
Figure pct00039
[표 21]
Figure pct00040
실시예 8. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
인간 PNPLA3 전사체의 절단된 버전을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 하기 표 22에 따라, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 1.5 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였다.
[표 22]
Figure pct00041
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). 각 군(즉, 군 2 내지 군 10)에서의 PNPLA3 RNAi 작용제는 각각 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 23 및 표 24에 제시되어 있다:
[표 23]
Figure pct00042
[표 24]
Figure pct00043
각 투여군(즉, 군 2 내지 군 10)에서의 각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는 모든 측정된 시점에서 비히클 대조군(군 1)과 대비하여 SEAP의 감소를 나타내었다.
실시예 9. PNPLA3-SEAP 마우스에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
인간 PNPLA3 전사체의 절단된 버전을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PNPLA3-SEAP 마우스 모델을 사용하였다. 일수 1에서, 각 마우스에게, 비히클 대조군(RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수) 또는 식염수 중에 제형화된 PNPLA3 RNAi 작용제 1.5 mg/㎏(mpk)을 함유하는 200 μl/20 g 동물 체중의 단회 피하 투여를 제공하였으며, 이는 하기 표 25에 따른 투여군을 포함하였다.
[표 25]
Figure pct00044
각각의 PNPLA3 RNAi 작용제는, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서, 본 명세서의 이중체 구조에 제시된 바와 같은 변형된 서열을 갖는 3개의 N-아세틸-갈락토사민 기(세자리 리간드)를 포함한 표적화 리간드에 접합된 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다. ((NAG37)s 리간드를 포함한, PNPLA3 RNAi 작용제와 관련된 특정 변형 및 구조 정보에 대해서는 표 3 내지 표 5를 참조한다). PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 2)은 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00081(군 3)은 PNPLA3 유전자의 위치 887에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00083(군 4)은 PNPLA3 유전자의 위치 1185에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00084(군 5) 및 J1D00085(군 6)는 각각 PNPLA3 유전자의 위치 1191에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00087(군 7)은 PNPLA3 유전자의 위치 1746에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00082(군 8)는 PNPLA3 유전자의 위치 1173에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. (예를 들어, 언급된 PNPLA3 유전자에 대해서는 서열 번호 1 및 표 2를 참조한다).
주사는 목과 어깨에 걸쳐 있는 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이에서(즉, 피하 주사로) 수행하였다. 각 군에서 4 마리의 마우스를 시험하였다(n=4). 혈청을 일수 -1(처리 전), 일수 8, 일수 15, 일수 22, 및 일수 29에서 수집하고, SEAP 발현 수준을 상기 실시예 2에 기재된 절차에 따라 결정하였다. 실험으로부터의 데이터가 하기 표 26 및 표 27에 제시되어 있다:
[표 26]
Figure pct00045
[표 27]
Figure pct00046
실시예 10. 사이노몰거스 원숭이에서 PNPLA3 RNAi 작용제의 생체내 시험.
PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00003, J1D00008, 및 J1D00017을 사이노몰거스 원숭이(사이노)에서 평가하였다. 일수 1 및 일수 43에서, 각 군에 대해 4 마리의 사이노(n=4)에게, 대조군으로서의 역할을 하는 RNAi 작용제를 함유하지 않는 식염수 비히클 단독, 또는 식염수 중에 제형화된 각각의 PNPLA3 RNAi 작용제 4.0 mg/㎏(10 mg/mL)을 함유하는 0.4 mL/㎏(동물 질량에 따라, 대략 1.5 mL 부피)의 피하 주사액을 투여하였다(하기 표 28 참조).
[표 28]
Figure pct00047
PNPLA3 RNAi 작용제는, 표 3 내지 표 6에 나타낸 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드, 및 센스 가닥의 5′-말단 단부에 접합된 세자리 N-아세틸-갈락토사민-함유 표적화 리간드((NAG37)s)를 포함하였다. PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00003(군 2)은 PNPLA3 유전자의 위치 1586에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008(군 3)은 PNPLA3 유전자의 위치 2180에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였고; PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00017(군 4)은 PNPLA3 유전자의 위치 1179에서 그 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
일수 -13(투여 전), 15, 29, 57, 및 76에서, 간 생검을 채취하였다. 매 생검 수집 날짜마다, 사이노를 마취시키고, 복강경 검사를 사용하여 2개의 간 조직 샘플을 각각 대략 80 mg 내지 120 mg씩 추출하였다. 이어서, 생검 샘플을 균질화하고, 사이노 간 중의 PNPLA3 mRNA의 수준을 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 이어서, 얻어진 값을 투여 전(이 경우, 일수 -13에서) PNPLA3 mRNA 측정치에 대해 정규화하였다. 얻어진 mRNA 데이터는 하기 표 29에 반영되어 있다:
[표 29]
Figure pct00048
실시예 11. 사이노몰거스 원숭이에서 PNPLA3 RNAi 작용제 J1D00008의 생체내 시험
이 연구의 목적은 사이노몰거스 원숭이(사이노)의 간에서의 WT PNPLA3 mRNA의 녹다운의 깊이 및 지속시간 둘 모두에 대해 RNAi 작용제 J1D00008을 평가하는 것이었다. 녹다운을, 투여 전에 수행된 간 생검으로부터 얻어진 기저선 측정치에 대해 동물당 정규화하였다.
재료 및 방법
연구 1: 시아노를 체중(2 내지 5 ㎏)에 따라 식염수군(군 1) 또는 RNA 처리군(군 2 내지 군 4)으로 나누었다(군당 n=4). 시아노에 0.4 ml/㎏ 식염수로 4 mg/㎏으로 일수 1 및 일수 43에서 2회 피하 투여하였다. 사이노는 생검 및 채혈 전 적어도 12시간 동안 하룻밤 절식하였다. 간 생검 샘플을 투여 전 및 시험 일수 15, 29, 57, 및 76에서 모든 동물로부터 수집하였다. 각각의 동물에 대해, 간 생검 샘플(2x, 매회마다 대략 100 mg씩)을 qPCR 및 동소 혼성화(in situ hybridization, ISH)에 의한 PNPLA3 mRNA 정량화를 위해 수집하였다. 투여 전 및 투여 후 일수 15, 29, 57, 및 76에서 각 동물의 대퇴 정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 모든 동물, 군, 및 시점에 대해, 좌외 간엽으로부터 RNA를 단리하여 qRT-PCR을 수행하였으며, 데이터를 하우스키핑(house-keeping) 유전자(ARFGAP2)에 대해 정규화하고, 기저선/투여 전 생검과 대비하여 상대 발현을 나타내었다. 연구의 종료 시점에서, 군 1과 군 3으로부터의 좌외 간엽 및 우외 간엽과 정중 간엽에서 PNPLA3 발현을 측정하여, 발현이 엽에 따라 달라지지 않았음을 그리고 좌외엽이 대표적이었음을 확인하였다. 사이노몰거스 원숭이 간 생검의 RNAscope®-기반 동소 혼성화 검정(ACDbio, 미국 캘리포니아주 뉴워크 소재)을 수행하였다. 이미지-기반 정량적 소프트웨어 분석(HALO™ 소프트웨어 시스템, Indica Labs, 미국 뉴멕시코주 앨버커키 소재)을 이용하여, 주어진 간 세포 집단 내의 총 PNPLA3 mRNA 카피수를 정량화하였다.
연구 2: 하기와 같이 변경하거나 추가하여, 연구 1에 기재된 바와 같이 두 번째 비인간 영장류 연구를 수행하였다. 시아노를 체중(2 내지 5 ㎏)에 따라 2개의 RNAi 처리군으로 나누었다(군당 n=10). 동물들에 식염수 중 4 mg/㎏으로 일수 1 및 일수 29에서 피하 투여하고, 57일 동안 추적하였다.
결과
연구 1로부터, PCR에 의한 PNPLA3 발현의 측정이 RNAi 작용제 J1D00008에 대해 도 1에 나타나 있다. PNPLA3 mRNA는 기저선 및 하우스키핑 유전자에 대해 정규화된 각각의 시점에서 51%, 55%, 47%, 및 37%만큼 감소하였다. 이들 결과에 후속하여, 동소 혼성화(ISH)를 수행하여 PNPLA3 mRNA의 세포내(세포질 vs. 핵) 분포를 평가하였다. 전세포(whole cell) PNPLA3 mRNA의 대략 50%가 핵 내에 분배된 것으로 관찰되었다. 이는, RNAi 작용제 J1D00008이 단백질 번역의 부위(즉, 간세포 세포질)에서는 PNPLA3 mRNA를 유의하게 감소시키고 있었지만, 전세포 수준에서의 녹다운은 교란성 잔류 핵 PNPLA3 mRNA 풀(pool)로 인해 qPCR에 의해 과소평가되었음을 시사한다. 따라서, 세포질 PNPLA3 mRNA 녹다운을 정량화하였다.
RNAi 작용제 J1D00008로 처리된 시아노로부터의 간 생검에 대해 수행된 ISH는 유의한 잔류 PNPLA3 mRNA가 세포의 핵 내에 남아 있었음을 밝혀내었는데, 이는, 이 풀이 qPCR에 의해 평가된 바와 같이 전체 간에서의 녹다운 결과를 교란시키고 있었다는 주장을 뒷받침한다.
ISH 이미지의 정량화는, RNAi 작용제 J1D00008 치료제에 의해, PNPLA3 mRNA가 세포질에서 76일 전체에 걸쳐 44 내지 63%만큼 감소되었음을 보여주었다(표 30). GalNAc-RNAi 작용제, 예컨대 RNAi 작용제 J1D00008은 특이적으로 간세포의 세포질에서 표적 mRNA의 분해를 매개하기 때문에, PNPLA3 녹다운의 전체 간 정량화가 비표적화된 세포 유형(예를 들어, 성상 세포(stellate cell) 및 쿠퍼 세포(Kupffer cell))으로부터의 PNPLA3 mRNA의 상대적 기여에 의해 희석된다. 따라서, 모델-기반 분석을 수행하여, 가외의 간세포 PNPLA3 mRNA 발현에 대해 보정하면서, 특이적으로 간세포의 세포질에서의 PNPLA3 mRNA의 감소를 평가하였다. 표 31은 모델링에 사용된 간 생리학과 관련된 가정을 나열한다.
[표 30]
Figure pct00049
[표 31]
Figure pct00050
이 모델을 사용하여, PNPLA3 mRNA는 RNAi 작용제 J1D00008의 단회 4 mg/㎏ SC 용량을 투여한 후 간세포의 세포질에서 일수 15에서 81% 그리고 일수 29에서 78%만큼 감소되었다. 이 모델링을 연구 2에서 반복하였을 때, 일수 15 및 일수 29에서 각각 PNPLA3 mRNA의 66% 및 65% 감소가 달성되었다. RNAi 작용제 J1D00008로 시험된 모든 NHP(n=14)에 걸쳐 평균하였을 때, PNPLA3 mRNA는 일수 15 및 일수 29에서 간세포의 세포질에서 70%만큼 감소되었다(도 2).
실시예 12. 안전성
최대 3개월 동안의 RNAi 작용제 J1D00008 투여의 비임상 안전성을 래트 및 원숭이에서 각각 최대 500 mg/㎏ 및 300 mg/㎏의 용량으로 평가하였다. 두 종 모두에서, RNAi 작용제 J1D00008은 우수한 내약성을 나타내었으며, 평가된 최고 용량에 이르기까지 독성의 유해 징후는 관찰되지 않았다.
기타 실시 형태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 예시하고자 하는 것이고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 태양, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARROWHEAD PHARMACEUTICALS, INC. <120> RNAI AGENTS FOR INHIBITING EXPRESSION OF PNPLA3, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF, AND METHODS OF USE <130> 103693.002475 PCT <140> <141> <150> 63/000,137 <151> 2020-03-26 <160> 258 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2805 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtccgag gggggcgggg ctgacgtcgc gctgggaatg ccctggccga gacactgagg 60 cagggtagag agcgcttgcg ggcgccgggc ggagctgctg cggatcagga cccgagccga 120 ttcccgatcc cgacccagat cctaacccgc gcccccgccc cgccgccgcc gccatgtacg 180 acgcagagcg cggctggagc ttgtccttcg cgggctgcgg cttcctgggc ttctaccacg 240 tcggggcgac ccgctgcctg agcgagcacg ccccgcacct cctccgcgac gcgcgcatgt 300 tgttcggcgc ttcggccggg gcgttgcact gcgtcggcgt cctctccggt atcccgctgg 360 agcagactct gcaggtcctc tcagatcttg tgcggaaggc caggagtcgg aacattggca 420 tcttccatcc atccttcaac ttaagcaagt tcctccgaca gggtctctgc aaatgcctcc 480 cggccaatgt ccaccagctc atctccggca aaataggcat ctctcttacc agagtgtctg 540 atggggaaaa cgttctggtg tctgactttc 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Claims (46)

  1. PNRLA3 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
    서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
    상기 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는, RNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 46 내지 60, 176, 181 및 188의 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 18을 포함하는, RNAi 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 2, 3, 4, 9 내지 20, 214, 219 및 220의 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 상기 17개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 상기 안티센스 가닥에 상보적인 영역이 적어도 85%인, RNAi 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, RNAi 작용제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′,3′-세코 뉴클레오티드 모방체, 고정된(locked) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2′-메톡시에틸 뉴클레오티드, 탈염기(abasic) 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2′-데옥시 뉴클레오티드, 2′-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2′-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 3′-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNAi 작용제.
  7. 제5항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 상기 변형된 뉴클레오티드는 2′-O-메틸 뉴클레오티드, 2′-플루오로 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인, RNAi 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 상기 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, RNAi 작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 상기 변형된 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, RNAi 작용제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 상기 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 상기 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 표적화 리간드에 연결되는, RNAi 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는, RNAi 작용제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 (NAG37) 또는 (NAG37)s의 구조를 포함하는, RNAi 작용제.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 상기 센스 가닥에 연결되는, RNAi 작용제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 상기 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되는, RNAi 작용제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이고, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 18 내지 27개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 18 내지 24개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 21개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작용제.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 2개의 블런트(blunt) 단부를 갖는, RNAi 작용제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 1개 또는 2개의 말단 캡(terminal cap)을 포함하는, RNAi 작용제.
  22. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 1개 또는 2개의 역전된 탈염기 잔기를 포함하는, RNAi 작용제.
  23. 제1항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 서열 번호 (176과 214); (90과 131); (181과 219); (95와 136); (188과 220) 및/또는 (102와 137)을 갖는 이중체 서열(duplex sequence)을 형성하는 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 구성되는, RNAi 작용제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 상기 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 상기 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함하는, RNAi 작용제.
  25. 제1항에 있어서, 서열 번호 90, 95 및 102의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하며,
    여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 상기 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
  26. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 214, 219 및 256의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한, 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지며,
    여기서 a, c, g, i, 및 u는 각각 2′-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 이노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 상기 안티센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작용제.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 상기 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부에, 상기 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에, 또는 양쪽 모두에 역전된 탈염기 잔기를 추가로 포함하는, RNAi 작용제.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표적화 리간드에 연결되는, RNAi 작용제.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는, RNAi 작용제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는, RNAi 작용제.
  31. 제1항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 하기를 포함하는, RNAi 작용제:
    Figure pct00051
    , 또는
    Figure pct00052
    .
  32. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 90, 95 및 102의 상기 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 서열 번호 131, 136 및 137의 상기 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지며,
    여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; (invAb)는 역전된 탈염기 데옥시리보스 잔기이고; (NAG37)s는 하기 화학 구조를 갖는, RNAi 작용제:
    Figure pct00053
    .
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  34. 세포에서 PNPLA3 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서,
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제33항의 조성물의 유효량을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 존재하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PNPLA3 유전자 발현은 적어도 약 30%만큼 억제되는, 방법.
  38. PNPLA3-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
    상기 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 제33항의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 알코올성 지방간 질병, 또는 간경변증인, 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여되는, 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 방법.
  42. PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제33항에 따른 조성물의 용도.
  43. 제42항에 있어서, 상기 증상은 간의 간경변증인, 용도.
  44. PNPLA3 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제33항에 따른 조성물의 용도.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 또는 알코올성 또는 비알코올성 간 질병, 예컨대 간경변증인, 용도.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 약 0.05 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중(여기서, 체중은 상기 인간 대상체의 체중임)의 용량으로 투여되는, 용도.
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