CN114480382A - 用于抑制SURF4基因表达的RNAi试剂和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明为用于抑制SURF4基因表达的RNAi试剂和组合物，涉及能够抑制SURF4表达的短反义寡核苷酸和RNAi试剂。本发明还涉及包含一种或多种所述短反义寡核苷酸或RNAi试剂的组合物。本发明还涉及所述短反义寡核苷酸、RNAi试剂或组合物在受试者中降低血脂，或治疗或预防与血脂异常相关的疾病中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于抑制SURF4基因表达的短反义寡核苷酸和RNAi试剂， 以及包含一种或多种所述短反义寡核苷酸或RNAi试剂的组合物。本发明还 涉及所述短反义寡核苷酸、RNAi试剂或组合物在受试者中用于降低血脂， 或用于治疗或预防与血脂异常相关的疾病中的方法和用途。
背景技术
SURF4是一种内质网上的跨膜货物受体(cargo receptor)。通常认为跨膜 货物受体(cargo receptor)介导了包膜复合体对选定货物(如蛋白质或脂质)的 识别(Dancourt,J.,and Barlowe,C.(2010).Annual review of biochemistry 79,777- 802)。SURF4的酵母同源物Erv29p介导了α-因子的转运，其中通过将待运 送的蛋白质集中到COPII囊泡加速了这些货物的ER运出(Belden,W.J.,and Barlowe,C.(2001).Science 294,1528-1531；和Otte,S.,and Barlowe,C.(2004). Nature cell biology 6,1189-1194)。然而，在哺乳动物中得到表征的跨膜受体 非常少，更不用说阐明其体内的生理学功能。相反，本领域有研究认为，这 种受体可能不足以递送足够数量的主要分泌物，从而在需要大量分泌的生理转运程序中发挥作用(Warren,G.,and Mellman,I.(1999).Cell 98,125-127)。
脂质是重要的能量来源、结构组分，也承担着信号传导等生理功能。脂 质有别于其他生物分子，因为脂质具有疏水性，所以脂质的批量运输需要借 由专门的脂蛋白来进行。如何将携带脂质的脂蛋白与一般蛋白质加以区分并 使其选择性地进入分泌通路的机制尚不清晰。血脂异常可导致多种心血管疾 病和代谢疾病。例如，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)被认为与动脉粥样硬化 密切相关。动脉硬化会进一步引起脑卒中、冠心病等具有高致死率和致残率 的疾病，也与高血压、脂肪肝、糖尿病等疾病有关。随着生活水平的提高， 与血脂异常相关的疾病在人群中的发病率有升高的趋势。
尽管用于降低低密度脂蛋白(LDL)的主流药物包括MTP(微粒体甘油三 酯转移蛋白)抑制剂和抑制APOB(载脂蛋白B)的反义寡核苷酸(ASO)都取得 了成功，但是本领域对于降低血浆脂质的治疗药物仍然存在未被满足的需求 (Rader,D.J.(2016).Cell Metab 23,405-412)。
PCSK9抑制剂是近些年来备受瞩目的新型降血脂药物。包括安进公司 的依洛尤单抗(Evolocumab)、赛诺菲公司的Alirocumab单抗以及诺华公司的 小干扰RNA类降脂药Leqvio(inclisiran)在内的PCSK9抑制剂类降脂药都被 寄予厚望。PCSK9(前蛋白转化酶枯溶菌素Kexin 9型)与LDLR(低密度脂蛋 白受体)的结合促进了LDLR的溶酶体降解，使其无法重新回到细胞表面结 合LDL。PCSK9抑制剂通过阻止PSCK9对LDLR的降解来提高LDL这种“坏血脂”的清除，从而实现降低血脂的效果。但是，在患者本身存在LDLR 缺陷的情况下，例如对于因LDLR失活突变导致的严重家族性高血脂症患者 而言，PCSK9抑制剂则无法实现理想的LDL降低效果。
因此，本领域仍然需要开发新的靶点以及作用于该靶点的有效降血脂药 物。
发明内容
本发明的发明人揭示了一个专用于脂质载体的转运程序，其能够有效且 精准地响应于生理需求供应脂质，并且该转运程序的入口由分子开关SAR1B 和货物受体SURF4限定。本发明的发明人首次发现并确认了货物受体的编 码基因SURF4在肝脏中的失活完全阻止了病原性脂质异常和动脉粥样硬化， 甚至是在因缺乏LDL受体(LDLR)而导致脂质清除功能有缺陷的情况下，并 且没有引起肝脏的显著损伤或炎症。这些研究结果说明抑制SURF4基因的 表达能够从源头降低“坏血脂”LDL的产生和转运，这对于严重的家族性高血 脂症(例如由LDL受体(LDLR)失活突变造成的)等疾病而言，可以产生更好 的降血脂效果。
基于上述研究发现，发明人构建了能够抑制SURF4基因表达的反义寡 核苷酸分子，用于调节脂质异常(降低血脂)并进而治疗、预防与脂质异常相 关的疾病，由此完成了本发明。
因此，第一方面，本发明提供长度为8-30个核苷酸的短反义寡核苷酸， 其靶向编码SURF4的核苷酸。优选地，所述短反义寡核苷酸包含15-25个 核苷酸，更优选19-23个核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
在具体的实施方案中，所述短反义寡核苷酸其包含选自表1的反义链的 序列或与其相差1或2个核苷酸的序列，或由选自表1的反义链的序列或与 其相差1或2个核苷酸的序列组成。
第二方面，本发明提供用于抑制SURF4基因的表达的RNAi试剂，其 包含第一方面的短反义寡核苷酸，和与所述短反义寡核苷酸至少部分互补的 正义链。优选地，所述正义链在所述短反义寡核苷酸的长度范围内与所述短 反义寡核苷酸至少85％互补，至少90％互补，至少95％互补，或100％互补。 在具体的实施方案中，所述RNAi试剂包含选自表1的正义链和/或反义链。 更优选地，所述RNAi试剂选自表1所列的正义链和反义链的组合。
第三方面，本发明提供用于抑制SURF4基因的表达的组合物，其包含 (a)第一方面的短反义寡核苷酸或第二方面的RNAi试剂，和(b)药学上可接受 的赋形剂。
第四方面，本发明提供第一方面的短反义寡核苷酸或第二方面的RNAi 试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与血脂异常相关的疾病 如心脑血管疾病或与血脂异常相关的代谢疾病。在具体的实施方案中，所述 疾病选自下组：高血脂症如家族性高血脂症、高甘油三酯血症、胆固醇代谢 异常、脂质代谢异常、高LDL-C血症、动脉粥样硬化性心脑血管疾病如心肌 梗死、脑卒中、动脉粥样硬化。
第五方面，本发明提供第一方面的短反义寡核苷酸或第二方面的RNAi 试剂在制备药物中的用途，所述药物用于降低受试者血液中的低密度脂蛋白 (LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和甘油三酯中的一种、两种或全部三种。在 具体的实施方案中，所述药物用于降低受试者血液中的低密度脂蛋白(LDL)。
第六方面，本发明提供在受试者中治疗或预防与血脂异常相关的疾病如 心血管代谢疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的第二方面的 RNAi试剂或第三方面的组合物。在具体的实施方案中，所述心血管代谢疾 病选自下组：高血脂症如家族性高血脂症、高甘油三酯血症、胆固醇代谢异 常、脂质代谢异常、高LDL-C血症、动脉粥样硬化性心血管疾病如动脉粥样 硬化。
第七方面，本发明提供在受试者中降低血液中的低密度脂蛋白(LDL)、 极低密度脂蛋白(VLDL)和甘油三酯中的一种、两种或全部三种的方法，包括 向所述受试者施用治疗有效量的第二方面的RNAi试剂或第三方面的组合物。 在具体的实施方案中，所述方法用于降低受试者血液中的低密度脂蛋白 (LDL)。
在第四、第五、第六、第七方面的具体实施方案中，所述受试者存在 LDLR表达缺陷。在具体的实施方案中，所述受试者是存在基因缺陷，如遗 传性LDLR缺陷的家族性高血脂症患者。
附图说明
图1是显示发明人揭示的SURF4和SAR1B共同作用机制的示意图，二 者识别脂蛋白并介导它们包装进入转运囊泡从而进行ER运出。
图2是显示SURF4的跨膜结构和序列的示意图。
图3是利用邻位依赖性蛋白质组学研究鉴定出SURF4肽作为新的COPII 因子的质谱图。使用SAR1B-BirA*生物素化的蛋白质，然后用链霉亲和素珠 进行纯化，在通过SDS-PAGE分离后，使用亲和素-HRP进行显像。星号： SAR1B-BirA*融合蛋白。显示了三个独立的实验作为代表。右侧：通过质谱 鉴定出SURF4肽。
图4是说明SURF4以SAR1B依赖性方式包装到重构的COPII囊泡中 的示意图和实验证据。左：COPII囊泡的体外重组测定示意图。右：用所示 抗体对囊泡标志性蛋白进行的免疫印迹。
图5显示实施例2中组织特异性敲除Surf4的过程的示意图。
图6A-B显示了通过CRISPR介导的基因编辑敲除SURF4的结果，其中 使用了三种不同的靶向Surf4的gRNA和对照gRNA来敲除小鼠肝脏中的 Surf4蛋白和mRNA，(A)对来自小鼠的肝总蛋白进行的免疫印迹的结果，(B) 使用qPCR分析从小鼠提取的肝脏总mRNA的结果(***:P<0.001，双尾 Student’s t检验)。
图7A-B显示了通过CRISPR介导的基因编辑敲除SURF4后小鼠血浆 中总胆固醇(A)和总甘油三酯(B)水平的降低。结果显示了使用三种针对Surf4 的gRNA进行CRISPR基因编辑的小鼠和对照组的数据，每组n＝5。时间 点(x轴)表示AAV注射后的时间。数据表示为平均值±SEM。***:P<0.001 (双尾Student’s t检验)。
图8A-B显示了图7A的对照小鼠和Surf4 CRISPR小鼠中不同种类脂蛋 白的胆固醇和甘油三酯含量，(A)通过FPLC将血浆中的脂蛋白分馏为VLDL、 LDL和HDL后进行胆固醇测量，(B)通过FPLC将血浆中的脂蛋白分馏为 VLDL、LDL和HDL后进行甘油三酯测量。
图9的点线图显示了肝脏Surf4的缺乏抑制了甘油三酯向血浆的分泌， 数据使用了作为对照的WT(n＝3)和Surf4 LKO(n＝3)小鼠。
图10是小鼠肝脏切片组织学染色结果图，显示了肝Surf4的缺乏导致肝 脏中的脂质堆积。上部：H&E染色；下部：油红O染色。
图11A-B的柱状图比较了对照组(n＝6)和肝Surf4缺陷型小鼠(n＝6)的 肝脏TG(A)和胆固醇(B)含量。***:P<0.001(双尾Student’s t检验)。
图12比较了在三月龄的对照小鼠(n＝4)和肝Surf4缺陷型小鼠(n＝4)中 的血浆AST和ALT水平。n.s.＝不显著(双尾Student’s t检验)。
图13A-B比较了13月龄的对照小鼠(n＝5)和肝Surf4缺陷型小鼠(n＝5) 的(A)血浆AST和ALT水平，n.s.＝不显著(双尾Student’s t检验)；以及(B)肝 脏组织学染色结果。
图14是用果糖饮食喂养的对照小鼠(n＝6)和Surf4缺陷小鼠(n＝6)的血浆 TG，胆固醇和AST、ALT水平。***:P<0.001(双尾Student’s t检验)。
图15是展示loxP位点之间的Surf4(Surf4 flox)和缺失掉的等位基因的 示意图。
图16A-C是显示Surf4在脂质调节中的剂量依赖性作用的柱状图。在对 照组(n＝10)、Surf4flox/flox(n＝6)和Surf4flox/+(n＝11)小鼠肝脏中表达AAV介导的 Cre重组酶后，测得的血浆总胆固醇(A)、甘油三酯(B)和ApoB(C)水平。数据 表示为平均值±SEM。星号：***:P<0.001；****：P<0.0001(双尾Student’s t检验)。
图17A-B是显示在禁食24小时后再次接受高果糖饮食12小时的条件 下Surf4以剂量依赖性方式降低血脂的柱状图。在对照组(n＝11)、Surf4flox/flox (n＝6)和Surf4flox/+(n＝6)小鼠肝脏中表达AAV的Cre重组酶，测得的总血浆 胆固醇(A)和甘油三酯(B)水平。数据表示为平均值±SEM。星号：**:P<0.01； ****：P<0.0001(双尾Student’s t检验)。
图18A-B显示图17A-B的小鼠的肝脏胆固醇(A)和总甘油三酯(B)含量。 n.s.＝不显著。星号：P<0.001(双尾Student’s t检验)。
图19A-B是显示SURF4在细胞内的定位的照片。(A)Huh7细胞内SURF4 在稳态下局限于ER处，将Huh7细胞固定并与抗SURF4抗体以及抗SEC31A 抗体(COPII标志性蛋白)或抗GM130(高尔基体标志性蛋白)共染色，并进行 共聚焦显微镜检查，比例尺＝5μm；(B)在免疫染色中验证SURF4 mAb，用 甲醇固定从WT或Surf4 KO鼠肝分离的肝细胞，并用抗SURF4抗体染色， 然后进行共聚焦显微镜检查，比例尺＝5μm。
图20是证明SURF4的循环特性的细胞照片。通过SURF4的COPI分 拣基序的突变或持续激活形式的Arf1Q71I的表达使SURF4停滞在高尔基体 上。上部和中部小图：表达带有FLAG标签的野生型SURF4的Huh7细胞 (上)，或共表达持续激活形式的Arf1Q71I(中)；下部小图：表达SURF4-AAA 突变体的Huh7细胞。共聚焦显微镜检查之前，将细胞固定并用所示抗体染 色，比例尺＝5μm。
图21是描述SURF4在ER和高尔基体之间双向穿梭的模型的示意图。
图22是描述CRISPR抗性的SURF4 cDNA的设计的示意图。上部：小 鼠Surf4 cDNA序列(SEQ ID NO:5)和相应的蛋白质序列(SEQ ID NO:6)；下 部：用于回补实验的人SURF4cDNA序列(SEQ ID NO:7)和相应的蛋白质序 列(SEQ ID NO:8)。PAM区和gRNA靶向序列分别用深灰和浅灰表示。人 SURF4 cDNA中的突变消除了PAM基序，但没有改变蛋白质编码。
图23A-B是显示回补实验结果的柱状图，其证明了在回收方面有缺陷的 Surf4无法回补脂蛋白分泌。使用血浆样品测量了总胆固醇(A)和甘油三酯(B)， 血浆样品来自接受靶向Surf4的gRNA加EGFP cDNA(Surf4 LKO+EGFP)、 靶向Surf4的gRNA加CRISPR抗性Surf4cDNA(Surf4 LKO+Surf4 WT)或 Surf4-AAA突变cDNA(Surf4 LKO+Surf4 AAA)的小鼠(每组n＝5)。数据表 示为平均值±SEM。星号：***：P<0.001(双尾Student’s t检验)。
图24是免疫印迹结果，展示了Sar1b缺乏增加了Surf4-APOB相互作 用。通过AAV将带有FLAG标签的Surf4引入WT或Sar1b LKO(KO)小鼠 的肝脏，裂解肝脏样品并进行抗FLAGIP，在SDS-PAGE后通过免疫印迹检 测肝总裂解液(Inputs)或免疫复合物中(FLAG IP)存在的蛋白质。展示的为三 次独立实验中的代表性结果。
图25是显示Sar1b和Surf4单倍剂量不足在降低血脂方面的协同作用的 柱状图。在对照(CTL，n＝12)、Sar1b L-hets(n＝9)、Surf4 L-hets(n＝13)和 双重L-hets(n＝9)小鼠中测得的总血浆胆固醇水平。数据表示为平均值±SEM。**：P<0.01；****：P<0.0001，与CTL相比。统计方法为单向ANOVA检 验和Tukey posthoc检验。
图26是从与图25中相同的小鼠获得的肝脏样品的H&E和油红O染色 结果。
图27A-D是显示SAR1B和SURF4在脂质运输中的配合的柱状图。(A- B)肝表达Sar1b、Surf4或二者的组合(每组n＝7)不影响日常饮食的小鼠的血 浆胆固醇(A)和血浆TG(B)，n.s.＝不显著(通过单向ANOVA检验和Tukey posthoc检验)；(C)Surf4的肝表达增加了果糖饮食的小鼠的血浆胆固醇，在 脂质测量之前两周，为对照小鼠(GFP)或肝表达Sar1b、Surf4或二者的组合 的小鼠(每组n＝7)喂食果糖饮食，*：P<0.01，与GFP组相比(通过单向ANOVA 检验和Tukey posthoc检验)；(D)肝表达Sar1b、Surf4或二者的组合(每组 n＝7)不影响进食果糖饮食两周的小鼠的血浆TG，n.s.＝不显著(通过单向 ANOVA检验和Tukeyposthoc检验)。
图28A-B是显示Surf4的肝失活降低接受PCSK9 AAV和高胆固醇饮食 的小鼠(每组n＝8)的血浆胆固醇(A)和甘油三酯(B)的柱状图。数据表示为平 均值±SEM。*：P<0.05；****：P<10-4(双尾Student’s t检验)。
图29是图28中的小鼠用高胆固醇饮食喂养3个月后的血浆AST和ALT 水平的柱状图，三种小鼠的数据相似。
图30显示了Surf4的肝失活在接受PCSK9 AAV和高胆固醇饮食的小鼠 中预防了动脉粥样硬化，显示了来自WT(n＝8)、Surf4+/f(n＝8)和Surf4f/f(n ＝8)小鼠的动脉粥样硬化斑块的代表性图像。
图31是对来自图30中的WT(n＝8)、Surf4+/f(n＝8)和Surf4f/f(n＝8)小 鼠的动脉粥样硬化斑块进行定量的柱状图。
图32A-D显示了Surf4的肝失活对不同脂蛋白组分中胆固醇和甘油三酯 水平的影响。对照(CTL，圆形)、肝Surf4 KO(Surf4 LKO，三角形)和肝Surf 杂合(Surf4 LHets，方形)小鼠中通过FPLC分离的不同脂蛋白群体(VLDL、 LDL、HDL)中的血浆胆固醇水平(A)及其曲线下面积(B)，以及血浆甘油三酯 水平(C)及其曲线下面积(D)。B和D中的数字表明与对照相比肝Surf4杂合 小鼠降低的百分比。ApoB-L：含有AopB的脂蛋白，合并了VLDL和LDL。
图33A-D显示了RNAi试剂S4-1、S4-2、S4-3在体外细胞实验中的结 果。(A)SURF4mRNA水平；(B)SURF4蛋白的免疫印迹结果；(C)APOB蛋 白的免疫印迹结果；(D)培养基中的APOB的水平。
发明详述
定义
除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、 化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规 技术，这些技术在本领域的技术范围内。
术语“约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围 内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量***的局限性。例如， 根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。或者，“约” 可表示给定值的最多20％，最多10％，最多5％或最多1％的范围。或者，特 别是对于生物***或过程，该术语可以表示数值的一个数量级，优选地在5 倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
术语“核苷酸”通常是指碱-糖-磷酸盐组合。核苷酸可包含核苷酸的类似 物或衍生物以及合成核苷酸。核苷酸可以通过已知的技术进行标记以便检测。 可检测标记可包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光 标记和酶标记。
术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他 RNA转录物)和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的一个或多 个过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基 因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。表达的“上调”或“下调” 通常是指相对于其在野生型状态下的表达水平，多核苷酸(例如RNA，例如 mRNA)和/或多肽序列的表达水平增加或降低。
涉及表达或活性的术语“调节”是指改变表达或活性水平。调节可以在转 录水平和/或翻译水平发生。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优 选哺乳动物，例如人。还包括体内获得的或体外培养的生物实体的组织，细 胞及其后代。
术语“治疗”在本文指用于获得有益或所需结果(包括但不限于治疗益处 和/或预防益处)的方法。例如，治疗可包括施用治疗有效量的本发明的针对SURF4的短反义寡核苷酸、RNAi试剂或组合物。治疗益处是指被治疗的一 种或多种疾病或症状存在任何与治疗相关的改善。
术语“预防”在本文指在特定疾病形成前，可以向有风险形成特定疾病或 症状的受试者，或向存在疾病的一种或多种生理征兆的受试者，施用本发明 的针对SURF4的短反义寡核苷酸、RNAi试剂或组合物，从而产生预防益处， 即使疾病或症状可能还没有表现出来。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指组合物的量，例如包含本发明的反义 寡核苷酸或RNAi试剂的组合物的量，在以该量给予有需要的受试者时足以 产生所需的活性或效果，例如降低血脂的效果。
脂蛋白
脂蛋白是包含蛋白质和脂质的复合物。存在于人血液内的脂蛋白按照脂 质含量和超速离心密度分类，主要包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、 低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。在这之中，LDL负责将胆固醇 从肝脏运往人体细胞，是动脉粥样硬化的主要危险因素，也被称作“坏胆固醇 脂蛋白”或“坏血脂”。
本发明的RNAi试剂能够降低血脂，特别是血浆中的LDL、VLDL和甘 油三酯。
SURF4
人SURF4是一个269个氨基酸的蛋白质，与其小鼠同源物具有约99％ 的一致性。人SURF4具有六个预测的跨膜结构域和一个短胞质尾部，其中 胞质尾部含有三赖氨酸分拣基序用于COPI相互作用和ER回收(Jackson,L.P. 等(2012)Dev Cell 23,1255-1262)，如图2所示。
新合成的蛋白质和脂质通过COPII包被的囊泡进入分泌途径，在内质网 (ER)上通过GTPase SAR1组装，但是在内质网中如何将携带脂质的脂蛋白 与普通蛋白质货物区别开来并选择性分泌这些脂蛋白的机制在本发明前尚 不清晰。
本发明的发明人证明了这个过程由GTPase SAR1B和SURF4定量控制。 具体的实验和结果在下文的具体实施方式部分提供。
首先，发明人惊讶地发现Sar1b的肝脏特异性敲除有效且有选择性地阻 断了脂质分泌，但不影响其它主要分泌性蛋白的转运。基于这种发现，发明 人证明了SAR1B的搭档SURF4与血浆脂质水平变化相关。SURF4是一种 多次跨膜的高效COPII货物受体。全基因组关联分析(GWAS)和功能表征研 究还发现人类的血浆LDL-胆固醇与SURF4密切相关，并且Surf4的急性失 活导致小鼠中血浆脂质和脂蛋白几乎完全消失，并因此保护小鼠免于患上由 PCSK9和饮食挑战诱发的动脉粥样硬化。主动重复循环使得SUFR4能够作 为一种限制性的、剂量依赖型因子发挥支持脂质载体稳健转运的作用。这些 发现表明，SURF4与SAR1B配对可以协同操作一种专门化的、剂量敏感型 转运程序用于使脂质进入循环，同时也表明其可用于治疗血脂异常、动脉粥 样硬化症和相关的心脏代谢疾病等应用。
本领域从未确认过货物受体如SURF4在脂质转运中的功能，也没有验 证过抑制SURF4能够将血脂抑制到何种程度，以及SURF4对血脂的调节作 用是否依赖于其他参与者如LDL受体等的协助。本领域技术人员能够理解， 这些内容为本发明带来了创造性。
RNAi试剂和组合物
基于对货物受体SURF4在脂质转运中的功能的研究结果，发明人提出 通过RNA干扰(RNAi)试剂抑制SURF4从而在脂质转运流程的上游进行调 节，实现降低最终分泌到循环中的脂质的效果，用于治疗或预防与脂质异常 特别是脂质异常升高有关的疾病和症状。
因此，本发明提供靶向SURF4基因的反义寡核苷酸，以及靶向SURF4 基因的双链RNAi试剂。
本发明的反义寡核苷酸和双链RNAi试剂能够通过作用于SURF4 mRNA诱发SURF4mRNA的降解。表1中详细列出了双链RNAi试剂的具 体实例，但本领域技术人员能够理解的是，本发明的范围不限于这些具体的 RNAi试剂，而是涵盖了靶向SURF4 mRNA并且能够作用于SURF4 mRNA 以产生降低SURF4 mRNA水平的效果的任何RNAi试剂。
针对已知序列设计反义寡核苷酸以及双链RNAi试剂的基本方法是本 领域已知的。人SURF4基因的序列以及转录后的mRNA序列是已知的。现 有技术中记载了人SURF4基因的7种不同的转录本，其序列可以通过 GenBank登录号从NCBI的公开数据库获得(SURF4_Homo sapiens_转录本1，NM_033161；SURF4_Homo sapiens_转录本2，NM_001280788；SURF4_Homo sapiens_转录本3，NM_001280789；SURF4_Homo sapiens_转录本4， NM_001280790；SURF4_Homo sapiens_转录本5，NM_001280791；SURF4_ Homo sapiens_转录本6，NM_001280792；SURF4_Homo sapiens_转录本7， NM_001280793)。转录本1(SEQ ID NO:10)为最经典、最常的转录本，优选 将其用作反义寡核苷酸和RNAi试剂的序列设计基础。也可以基于其它转录 本来设计本发明的反义寡核苷酸和RNAi试剂。
现有技术已知可以通过对RNA分子进行修饰(例如修饰核苷酸或与其 他基团连接)来赋予反义寡核苷酸和RNAi试剂某些性质，如提高对靶基因的 沉默效率、赋予组织/细胞特异性等，但只要经过修饰的RNA分子仍然包含 如本文限定的8-30个核苷酸并且具有靶向SURF4基因的能力，就落入了本 发明保护的范围。
治疗用途
本发明的针对SURF4的反义寡核苷酸、RNAi试剂和组合物可以用于预 防或治疗与脂质代谢有关疾病或症状，特别是心血管代谢疾病，更特别是动 脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)。所述疾病或症状与脂质异常特别是脂质 异常升高有关的，比如因脂质的异常升高如甘油三酯和/或胆固醇的异常升高 引起的疾病或症状。
优选地所述心血管代谢疾病选自下组：高血脂症如家族性高血脂症、高 甘油三酯血症、胆固醇代谢异常、脂质代谢异常、高LDL-C血症、动脉粥样 硬化性心血管疾病如动脉粥样硬化。
本发明的针对SURF4的反义寡核苷酸、RNAi试剂和组合物特别适合于 高LDL-C血症患者。本发明的反义寡核苷酸、RNAi试剂和组合物还特别适 合于LDLR有缺陷如遗传缺陷，并因此对于改善LDLR机能或作用于LDLR 抑制剂的药物(如PCSK9抑制剂)响应不明显或无响应的患者，例如，家族性 高血脂症患者。在优选的实施方案中，对于严重的家族性高血脂症患者，通 过施用本发明的RNAi试剂能够将该患者循环中的LDL-C降低30％，40％，50％，甚至更多。
递送方式
可以通过多种方式将本发明的RNAi试剂或包含所述RNAi试剂的组合 物递送到受试者中。
在优选的实施方案中，将本发明的RNAi试剂或组合物以组织特异性的 方式递送至受试者，优选以肝脏特异性的方式递送至受试者。
组织特异性递送可以依赖于多种形式实现。例如，可以使用带有组织特 异性抗体的脂质体，或者将非核苷酸基团与RNAi试剂连接从而赋予组织特 异性分布和摄取。例如，US9370582B2中公开了将RNAi分子与GalNAc(N- 乙酰半乳糖胺)偶联从而实现肝脏靶向性递送的方法，GalNAc是肝细胞上表 达的去唾液酸糖蛋白受体的高效配体，因而能够赋予与其偶联的分子的肝脏 靶向特异性。
在具体的实施方案中，使用脂质纳米粒(LNP)来递送所述RNAi试剂或 组合物。目前的研究发现，LNP在体内会优先达到肝脏细胞，使其特别适合 于递送本发明的RNAi试剂盒组合物。因此，使用LNP可以实现对本发明的 RNAi分子高效并相对特异地肝脏递送。
具体实施方式
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本 发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。 本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例中使用的实验材料和方法描述如下。
小鼠模型
动物圈养和所有实验程序均经北京大学实验动物管理与使用委员会批 准，该委员会是AAALAC认证的动物机构。使用的所有小鼠均在C57BL6/J 背景基础上进行培育。小鼠的饲养条件为22℃、12小时的明/暗周期，可以 自由进食正常的食物和水，除非另行说明。用于实验的所有小鼠均来自实验 室内交配(in-housing mating)。根据AAALAC指南监控动物的整体发育和健 康状况，并将同窝动物用作实验中的对照，除非另行说明。
Sar1b肝特异性敲除小鼠通过将Sar1bfl/fl小鼠(KOMP：061774，RRID： MMRRC_061774-UCD)与白蛋白启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠(JAX： 016833，RRID：IMSR_JAX：016833)杂交产生。
Surf4fl/fl小鼠使用野生型C57BL6/J小鼠通过基于CRISPR/Cas9的方案产 生。简言之，将Cas9 mRNA、sgRNA和供体质粒注射到受精卵中。显微注 射由BIOCYTOGEN公司进行。Founder Surf4fl/+小鼠与C57BL6/J一起回交 两轮。Surf4fl/fl小鼠通过Surf4fl/+小鼠后代产生。Cre依赖性spCas9敲入(KI) 小鼠购自Jackson Lab(RRID:IMSR_JAX:026556)(Platt等，(2014).Cell 159, 440-455)。
除非另有说明，否则所有实验均使用8～16周龄的雄性小鼠。根据基因 型将小鼠分入不同的组或随机分配。对于采用特定饮食的研究，8周龄的小 鼠接受高胆固醇饮食共12周的时间，或8周龄的小鼠接受高果糖饮食共2 周的时间。
细胞培养
HEK293A细胞(Thermo Fisher,R70507)获得自Thermo Fisher。293T细胞 (ATCC,CRL-3216,RRID:CVCL_0063)和HepG2(ATCC,HB-8065, RRID:CVCL_0027)获得自ATCC。Huh7细胞(JCRB Cell Ban,JCRB0403, RRID:CVCL_0336)获得自JCRB。细胞系的性别信息可以在相关供应商的网 站上获得。小鼠的原代肝细胞分离自具有指定基因型的雄性小鼠的肝脏。
全部细胞均培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)中，培养条件为37℃、5％CO2大 气。
对于质粒转染，根据制造商的方案使用了聚乙烯亚胺(PEI)。为了在Huh7 细胞中进行基因编辑，使用包装有CRISPR元件的慢病毒在8μg/ml聚丙 烯的辅助下感染细胞。
脂质分析
除非另有说明，小鼠禁食16小时后，使用肝素毛细管从尾尖采血，并 在6000rpm、4℃下离心5分钟，由此获得血浆。甘油三酸酯和总胆固醇水 平使用商购的试剂盒(中生北控和Sigma)根据说明书进行测量。
对于快速蛋白液相色谱(FPLC)分析，将相同基因型的血浆样品进行合并 然后使用Superose 6色谱柱进行FPLC。将样品以0.5ml/min的流速洗脱，并 收集每管500μl的组分用于胆固醇和甘油三酯的测量。
对于脂质组学分析，通过Bligh-Dyer脂质提取方法来提取血清脂质，在 提取过程中加入脂质内标混合物(SPLASHTM Lipidomix)。如之前的报道所 述，对提取的脂质进行LC-MS分析。脂质分离在配备CSH C18色谱柱，内 径100×2.1mm，1.7μm(Waters，Milford，MA)的AQUITY UPLC***(Waters， Milford，MA)上进行。以0.4ml/min的流速进行梯度洗脱，并将色谱柱恒温 在55℃。流动相A由补充有10mM甲酸铵和0.1％甲酸的水-ACN(40:60, v/v)组成，流动相B由补充有10mM甲酸铵和0.1％甲酸的ACN-IPA(10:90, v/v)组成。初始条件从40％B开始，并在2分钟内立即启动从40％到43％ B的线性梯度(曲线6)。在接下来的0.1分钟内，流动相B的百分比增加到 50％。在接下来的9.9分钟内，梯度进一步增加到54％B，流动相B的量在 0.1分钟内增加到70％。在梯度的最后部分，流动相B在5.9分钟内增加到99％。洗脱液组合物在0.1分钟内恢复到初始状态，并且在下一次进样前将 柱子在初始条件下平衡1.9分钟，因此总运行时间为20分钟。进样为2μl， 自动进样器温度设置为4℃。对于所有实验，使用相同的色谱条件。
将UPLC***与配备的SYNAPT G2-S qTOF HDMS质谱仪(SYNAPT G2-S HDMS，WatersCorporation)联合用于分析。使用电喷雾(ESI源)正电离 和负电离模式。通过MassLynx4.1软件在50-1,200Da的m/z范围内以全扫 描模式采集数据。未碎片化离子数据和碎片化离子数据通过交替碰撞能量运 行的交替采集功能收集。通过Progenesis QI版本分析数据比对和离子色谱图 提取。使用LIPID MAPS数据库进行脂质鉴定。R3.5.1用于生成热图。
小鼠中的VLDL分泌测定
小鼠禁食16小时，并静脉内注射剂量为500mg/kg体重的泰洛沙泊。在 指定的时间点采集血样，并通过离心分离血浆。如上所述测定甘油三酯。
组织学和油红O染色
为了进行组织学分析，将肝组织固定在4％PFA中，然后进行石蜡包 埋。在5μm石蜡切片上进行苏木精和曙红(H&E)染色和天狼星红(Sirius red) 染色。对于油红O(Oil RedO)染色，将肝脏样品包埋在OCT胶中，然后快 速冷冻。将冷冻的组织以8μm进行冷冻切片，并按照制造商的说明用油红 O染色。通过F4/80的免疫组织化学染色观察肝脏巨噬细胞。
肝脏甘油三酯和胆固醇的定量
称量快速冷冻的肝脏样品的重量，并在PBS中匀浆，用Bligh-Dyer法提 取脂质。简而言之，通过充分涡旋将匀浆物与氯仿-甲醇(2:1)混合。离心后， 收集有机相，并在旋转蒸发仪中，然后重悬于15％tritonX-100的水溶液中。 如上所述测量甘油三酯和胆固醇。
定量蛋白质组学
使用100mM TEAB将样品的蛋白质浓度调整为3mg/mL。将富集的蛋 白质在6M尿素/TEAB中变性，在35℃下用10mM二硫苏糖醇(DTT，J& K Scientific)还原35分钟，并在35℃下用20mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich) 伴随搅拌在黑暗中封闭30分钟。将反应混合物稀释至2M尿素/TEAB并在 37℃伴随搅拌用0.6μg胰蛋白酶消化过夜。将消化的样品进行还原二甲基化。简而言之，将4μL的4％(v/v)CH2O或13CD2O(SigmaAldrich)分别添加 到消化的样品中，并在室温下用4μL的0.6M NaBH3CN还原1小时。用 16μL的1％(v/v)氨溶液和8μL甲酸淬灭反应。合并轻质和重质样品对，用 C18离心柱脱盐并通过真空离心干燥。最后将干燥的样品在15μL缓冲液A (95％水，5％乙腈，0.1％甲酸)中重悬，用于LC-MS/MS分析。
免疫层析、免疫印迹和Blue Native PAGE
免疫(共)沉淀实验在4℃下用缓冲液A(50mM Tris，pH 7.5，150mM氯 化钠，1％Nonidet P-40，和10％甘油，补充以蛋白酶抑制剂片剂(Roche))提 取自小鼠血浆、培养的细胞或小鼠肝脏的蛋白质。将细胞提取物在4℃下于 13000g离心15分钟，收集上清液并取60ul细胞裂解物。将剩余的裂解物与 15μl M2或抗-HA琼脂糖珠(Sigma-Aldrich)在4℃下温育3h，然后用缓冲液 A洗涤4至8次(用于质谱分析)。然后将免疫复合物用1.5x SDS/PAGE样品 缓冲液溶解并用3-15％Tris-乙酸SDS/PAGE凝胶分离。SDS/PAGE后，将 凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，并用IB分析。针对SURF4的C端 表位(SEQ ID NO:9)的兔多克隆抗体和小鼠单克隆抗体由Proteintech集团制 备(www.ptglab.com)。
对于Blue Native-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，用FLAG-SURF4转染HEK293A细胞，并用缓冲液A提取蛋白质，然后在13000g离心。溶解上清 液，然后在IB前使用4％-16％BlueNative-PAGE分离。
通过LC-MS/MS鉴定蛋白质
为了鉴定蛋白质，将每个样品的银染蛋白从凝胶上切下，并用100mM 碳酸氢铵的50％乙腈溶液脱色。二硫苏糖醇还原和碘乙酰胺烷基化后，将蛋 白用猪胰蛋白酶(测序级改良；Promega，Madison，WI)在37℃过夜消化 (Olsen JV等，2004)。用包含0.1％甲酸(FA)的乙腈从凝胶条中提取所得的胰 蛋白酶处理的肽。将样品在真空离心浓缩器中于30℃干燥，然后重悬于10ul 0.1％FA中。
使用Easy-nLC 1200***，以0.3ul/min的速度在0.1％FA中将5ul样品 上样到捕集柱(C18，Acclaim PepMapTM 100 75um x 2cm nanoViper Thermo)上 并通过无熔结解析柱(C18，Acclaim PepMapTM 75um x15cm nanoViper RSLC Thermo)洗脱，其中75-min梯度为4％至30％LC-MS缓冲液B(LC-MS缓 冲液A包含0.1％甲酸；LC-MS缓冲液B包含0.1％甲酸和80％乙腈)，流 速为300nl/min。
使用电喷雾电压为2.2kV的纳米电喷雾离子源将肽直接注入Thermo OrbitrapFusion Lumos中。全扫描质谱图在Orbitrap质量分析仪(m/z范围： 300–1500Da)中获得，分辨率设置为m/z 200Da下的70,000(FWHM)。全 扫描目标为1e6，最大填充时间为50毫秒。所有数据均使用正极性以概貌模 式(profile mode)采集。MS/MS谱数据也在Orbitrap中获得，其中分辨率为 15,000(FWHM)，m/z 200Da，高碰撞解离(HCD)MS/MS碎片。隔离宽度为1.6m/z。MS数据与Proteome Discoverer 2.2软件通过Mouse Review Swiss- Port数据库进行了比对。
使用半完整细胞的体外萌芽测定(Budding Assay)
通过在B88(20mM Hepes，pH 7.2，250mM山梨糖醇，150mM乙酸钾 和2mM乙酸镁)中用40ug/ml洋地黄素透化Huh7细胞来新鲜制备半完整细 胞。每个反应的最终体积为100μL，包含ATP再生体系(1mM ATP，40mM 磷酸肌酸和0.2mg/mL肌酸磷酸激酶)、GTP(0.2mM)、含100μg蛋白质的 鼠肝胞质溶胶和含有50μg蛋白质的半完整细胞。将反应混合物在硅化的1.5mL微量离心管中于30℃孵育60分钟，然后在冰上冷却以终止反应。在 14,000g离心10分钟以除去中速沉淀物(供体膜)后，取75μL上清液并在 Beckman TLA100转子中于4℃以55,000RPM离心30分钟。将沉淀物(囊 泡组分)用于免疫印迹分析。
细胞固定、免疫染色和共聚焦显微观察
将玻璃盖玻片上培养的细胞用预热的(37℃)PBS洗涤，然后继续用甲醇 固定5分钟。将细胞在PBS中重新水化，然后用2％BSA封闭30分钟。将 细胞与稀释于封闭缓冲液中的一抗在4℃温育过夜，然后在室温与二抗温育 2小时。对于脂质液滴染色，将玻璃盖玻片上培养的鼠原代肝细胞用4％PFA 固定，并与BODIPY 493/503一起温育30分钟。用抗淬灭(anti-fade)培养基 固定细胞，并通过蔡司旋转圆盘显微镜以双盲方式获取图像。
LocusZoom数据库关联分析
SURF4基因与脂质代谢的全基因组关联数据分析使用LocusZoom (http:// csg.sph.umich.edu/locuszoom/)进行。
AAV DNA载体的生成
用于CRISPR介导的肝脏急性KO的AAV DNA载体(pX602-AAV-Cre- sgRNA)包含肝脏特异性的TBG启动子、Myc标记的Cre重组酶(用于重组侧 翼为loxP的终止密码子)以及用于非编码sgRNA转录的人U6启动子。使用 pX602-AAV-TBG::NLS-SaCas9-NLS-HAOLLAS-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA (PX602，Addgene，61593-)生成了载体pX602-Cre-sgRNA。简而言之，将Myc标记的Cre重组酶克隆到AgeI和EcoRI限制酶位点之间(Platt等人，2014)。 通过用相应的cDNA替换GFP序列，从AAV-TBG-GFP(Addgene，105535) 生成AAV-TBG-CRE、AAV-TBG-FLAG-hSURF4和AAV-TBG-FLAG-hSURF4 AAA。为了进行回补实验，将hSURF4(CGG)中的PAM序列突变为CTT， 如图22所示，然后通过标准诱变程序克隆到pAAV-TBG-hSURF4中。
sgRNA设计和靶引导序列克隆
sgRNA使用Benching平台(https://benchling.com/)设计，以最大程度地提 高编辑效率并最大程度地减少脱靶效应。sgRNA序列如SEQ ID Nos:1-4所 示。对于引导序列的克隆，将合成的寡核苷酸***pX602-AAV-Cre-sgRNA骨 架中，用于在鼠肝中进行基因组编辑，或者***pLenti-CRISPR V2 Cas9 D10A 中以根据之前公开的方法在细胞系中进行基因组编辑(Platt等，2014)。
基因组DNA提取和SURVEYOR核酸酶分析
使用TIANamp基因组DNA试剂盒(Tiangen)按照制造商的规程从细胞 和组织二者中提取基因组DNA。然后将分离的基因组DNA用作PCR的模 板，用于使用高保真聚合酶进行测序和SURVEYOR核酸酶测定，如之前文 章所述(Platt等，2014)。
AAV生产和递送
AAV在HEK293T细胞中包装并产生。简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI) 用AAV转移质粒(7μg/5cm皿)、Rep/Cap(2/8)质粒(7μg/15cm皿)和辅助质粒 (20μg/15cm皿)转染细胞。转染后60小时，将细胞移出并收集。如之前文章 所述(Platt等，2014)进行病毒纯化和滴度定量。使用定制的SYBR Green分 析(Tiangen)通过qPCR滴定病毒。通过尾静脉注射进行AAV递送。为了通 过CRISPR/Cas9使鼠肝中的Surf4基因急性失活，对8周龄的spCas9 KI小 鼠施用2×1011病毒基因组拷贝的AAV-Cre-sgRNA。对于回补实验，与带有 靶向sgRNA的2×1011病毒基因组拷贝一起，同时将1×1011GFP表达或人 SURF4表达病毒拷贝注入每只spCas9 KI小鼠中。
基因表达分析
将组织在TRIzol试剂(Thermo Fisher)中匀浆，并根据制造商的方案提取 RNA。通过M-MLV逆转录酶试剂盒(invitrogen)，将总共1μg RNA用于产生 20μl反应体积的互补cDNA。使用SYBR green在7500FAST***(Applied Biosystems)上进行定量PCR反应。将感兴趣的基因相对于β-肌动蛋白标准 化。RT-qPCR引物的设计按照本领域常规方法进行。
葡萄糖耐受测试(GTT)和胰岛素耐受测试(ITT)
GTT和ITT分析在4月龄的WT和急性KO小鼠中进行(每种基因型n ＝7)。对于GTT，使小鼠禁食过夜，并自由饮水。腹膜内注射葡萄糖(1g/kg 体重)。在葡萄糖注射后0、15、30、45、60和120分钟，使用血糖仪通过尾 部采血测量血糖。对于ITT，将小鼠禁食4小时，然后腹膜内注射胰岛素(0.75 U/kg体重)。在与GTT分析的相同的时间点测量血糖。
电子显微镜观察
将小鼠安乐死并用磷酸钠缓冲液(PB，100mM，pH7.4)和预固定溶液(PB 中2.5％(vol/vol)戊二醛，0.8％多聚甲醛)灌注。切割肝脏组织样品，并在室 温下在预固定溶液中固定2小时。然后将肝组织样品切成小块(0.2x0.3x0.5 mm3)，并在相同的预固定溶液中于4℃固定过夜。用PB冲洗后，将组织浸 入PB中的0.1M咪唑中30分钟，然后用PB中的2％四氧化锇进行后固定。 用高纯水冲洗后，将样品在4℃下用1％乙酸铀染色过夜。梯度脱水通过逐步增加丙酮的浓度并包埋入环氧树脂(60℃，24小时)完成。使用Leica EM UC7(约60nm厚)对样品进行切片，并将其放在铜栅上。在配备有EagleTM4k CCD数码相机的FEI Tecnai G220Twin电子显微镜(美国FEI)上以双盲方式 拍摄图像。
小鼠肝脏的细胞器分离
将野生型或去除Surf4的小鼠肝脏在HES缓冲液(20mM Hepes，pH 7.4， 1mM EDTA，250mM蔗糖)中匀浆，并3,000g离心5分钟以去除细胞核或 未破裂的细胞。在离心管中将1.5ml上清液与1.5ml 60％碘克沙醇混合，然 后依次逐层加入1.3ml 20％碘克沙醇和1.2ml 10％碘克沙醇。将梯度混合物 在350,000g下于4℃离心4小时，并从梯度顶部开始分成25个组分。
动脉粥样硬化分析
接受或不接受AAV-TBG-Cre的接受AAV-HCRApoE/hAAT-hPCSK9 D374Y的Surf4fl/fl和Surf4fl/+小鼠用西方饮食喂养3个月。将小鼠麻醉并处 死，然后依次用磷酸盐缓冲液(PBS)和4％多聚甲醛(PFA)灌注。分离主动脉 并用油红O染色，用配有SCMOS相机的奥林巴斯体视显微镜拍照。用Image J量化胸主动脉的病变区域。
定量和统计学分析
免疫印迹和动脉粥样硬化斑块面积的定量由Image J进行。没有使用统 计方法来预先确定样本量。具体而言，对于任何统计分析至少包括一式三份 重复，而对于生理学测定，包括血浆脂质测量，通常至少包括6-8只小鼠。 数据如附图中所示以平均值±SEM表示。统计分析由GraphPad Prism7进行。 统计学显著性是通过双尾Student’s t检验或单向ANOVA检验与Tukey事后 检验来计算的，如在附图中所示。当P<0.05时，结果被认为显著。星号表 示相应的统计学显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。 对于小鼠实验，“n”对应于使用的小鼠数。对于使用细胞培养的实验，“n” 对应于独立重复的次数。涉及测量小鼠血脂、血糖和体重的实验以盲法进行， 其中根据耳部标签识别号随机分组小鼠。在解码样品身份之前，还以盲法进 行了成像、组织学和动脉粥样硬化斑块的分析。没有数据点被排除在研究之 外。假定数据为连续正态分布。
实施例1.作为SAR1B配偶体的SURF4与人体内血脂变化的关系鉴定
通过在小鼠中使用Cre-loxP重组酶***肝脏特异性地敲除Sar1b，惊讶 地发现Sar1b LKO小鼠在禁食条件下展现出显著低于同窝对照的血脂水平， 且未观察到死亡征兆(数据未示出)。然后通过分泌组学研究发现，肝脏Sar1b 缺陷只对与脂蛋白循环相关的蛋白质如载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白E (APOE)、载脂蛋白A1(APOA1)、SAA4、SAA1的分泌有影响，对血浆中的 其他常见分泌蛋白如白蛋白、转铁蛋白和α1抗胰蛋白酶几乎没有影响。换言之，脂质载体的分泌与一般蛋白质的分泌是分开进行的，这一出乎预料的 结果提示可能存在调节因子作用于SAR1B，否则无法将这些非常规的货物 引导至横跨内质网膜的胞质COPII结构。
发明人在先前的研究中采用了一种BioID方法来捕捉COPII复合物及 其辅助因子的动态(Nie等，(2018).Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 115,E3155-E3162)，其中使用了一种 SAR1B和生物素连接酶BirA*的融合蛋白进行研究。利用类似的方法，使用 SAR1B-BirA*进行了邻位依赖性蛋白质组学研究，并聚焦于以高分子量寡聚 体存在的跨膜蛋白质作为货物受体的潜在特征。质谱鉴定出了SURF4(图3)。 与邻位依赖性蛋白组学数据一致，SURF4在体外以SAR1B依赖性方式被高 效地包装到重构的COPII包被的转运囊泡中(图4)。
实施例2.CRISPR/Cas9介导的肝脏Surf4失活的血脂清除效果
为了研究SURF4在体内的功能，采用最近在成年小鼠中建立的基因编 辑***(Platt等，2014，同上)选择性地失活肝脏的Surf4。该***通过“沉默” 的spCas9敲入等位基因实现，spCas9通过Cre重组酶以组织特异性方式启 动(图5)。
设计了三种靶向Surf4基因不同区域的gRNA(SEQ ID NOs:1-3)以避免 任何单个基因编辑事件的潜在“脱靶”效应。使用AAV共同递送肝细胞特异 性Cre和靶向小鼠Surf4基因的不同外显子的三种gRNA，并使用靶向LacZ 的gRNA(SEQ ID NO:4)作为对照。通过对肝脏裂解物进行的免疫印迹实验 (图6A)和Surf4 mRNA的定量PCR实验(图6B)确认了肝脏Surf4的高效失 活，而对照的肝脏Surf4则未被失活。
令人惊讶地发现，与LacZ gRNA处理的对照小鼠相比，通过三种gRNA 失活成年小鼠体内的肝脏Surf4都在AAV递送后4周内在空腹条件下导致 了血浆胆固醇和甘油三酯二者几乎完全清除(图7A-B)。脂质降低效果在 gRNA引入后约2周开始变得明显，并且一直持续至gRNA递送后8周小鼠 被处死之时。
通过尺寸排阻层析对血浆样品进行分级，结果确认了与对照相比，在肝 脏Surf4缺陷型小鼠的VLDL、LDL和HDL组分中几乎不存在胆固醇(图 8A)，并且在VLDL和LDL组分中观察到了类似的甘油三酯清除效果(图8B)。 血脂的这种降低归因于Surf4缺失对肝脏总甘油三酯(TG)分泌的显著抑制 (图9)。与分泌阻断结果一致，油红O染色揭示出脂质积累在肝脏Surf4缺 陷型小鼠的肝脏中(图10)。生化实验也确认了肝脏中积累的TG和胆固醇(图11)。因此，也可以考虑将Surf4部分而非全部敲除(例如半敲低)，由此在实 现降低血脂效果的同时，仍保留了Surf4的一部分能力，使得脂质不会在肝 脏中积累，这种效果的实现也正是依赖于本发明发现的Surf4的“剂量依赖” 特性。
尽管血脂水平接近于零，肝脏Surf4缺陷型小鼠整体上表现正常，在整 个实验期间没有死亡征兆。另外，它们的血浆转氨酶(AST和ALT)水平也与 对照小鼠相似(图12)，并且直到13月龄时都没有在Surf4缺陷型肝脏中观察 到显著的肝损伤、纤维化或炎症的征兆(图13)。
当用生脂果糖饮食挑战时，Surf4缺陷型小鼠仍然保持了耗竭的血浆胆 固醇和TG水平，尽管与对照小鼠相比观察到了血浆AST和ALT的中度增 加(图14)。与对照LacZ gRNA处理的小鼠相比，肝脏Surf4缺陷型小鼠在体 重、葡萄糖耐受和胰岛素应答方面均具有类似的表现。
这些体内实验的结果说明，Surf4的敲除能够显著降低血脂至几乎完全 清除的水平，并且没有观察到死亡或严重副作用的征兆。
实施例3.SURF4的剂量依赖性效应
为了进一步确认SURF4的功能，发明人构建了两侧含有lox位点的Surf4 等位基因(图15)，并使用AAV介导的Cre递送至肝脏用于失活小鼠的该基 因。与对照小鼠(Surf4+/+，TBG-Cre)相比，在肝脏中Surf4等位基因的完全缺 失清除了血浆胆固醇、甘油三酯或ApoB水平，与实施例2中使用CRISPR 介导的Surf4失活所观察到的结果一致(图16A-C)。重点在于，肝脏Surf4为 杂合状态的小鼠与对照小鼠相比也展现出血脂20-25％的显著降低(图16A-C 每个小图最右侧的数据)。
当在禁食后喂食(re-fed)条件下测量时，相比于对照，肝脏Surf4缺陷引 起了约80％的血浆胆固醇和总甘油三酯降低，说明在这个实验设置中从小肠 摄取的脂质可能对循环中的脂质有贡献(图17)。与对照小鼠相比，在再次喂 食条件下肝脏Surf4杂合性仍然降低了血脂(图17两个小图最右侧的数据)， 但是没有导致脂质在肝脏中的显著积累(图18)。
这种剂量效应提示SURF4是脂质调节的一种限制性因子，进一步支持 了人类遗传学研究中观察到的结果，即SURF4水平的数量性变化会影响血 脂水平。可以利用这种数量依赖效应，部分而非完全抑制受试者中的SURF4 水平，从而实现对血脂的降低。
实施例4.SURF4在ER和高尔基体之间的穿梭能力
如前文所述，之前的研究通常认为货物受体能够实现的运输过程没有强 大到足以转运含量丰富的货物，如脂蛋白(Warren,G.和Mellman,I.(1999)， 同上)。
发明人通过共聚焦显微镜发现，在Huh7细胞和小鼠原代肝细胞内，在 稳态下内源SURF4呈现出一种基本上局限在ER处的点状、浓缩的定位(图 19A-B)。SURF4斑点与COPII亚基SEC31A呈现出明显的共定位(图19A)， 集中在被称为ER出口位点的地方，也就是COPII囊泡产生之处。与之相反， 稳态下的SURF4呈现出极少的高尔基体定位(图19A)，而高尔基体是COPII 囊泡的终点。
这种现象让发明人考虑SURF4作为货物受体是否有可能主动循环回到 ER处，以备下一轮的脂蛋白运出。通过表达组成型活性的ARF1Q71I突变体 (图20，中间三幅小图)，或者通过突变SURF4尾部的三赖氨酸COPI分拣基 序(KKK变为AAA)(图20，下部三幅小图)，阻断从高尔基体回收货物受体， 这会使得SURF4基本上从ER重新定位至高尔基体。另一方面，困在高尔基 体处的SURF4与ER蛋白如SEC31A的定位也有所不同(图21)。
为了直接测试脂质转运中SURF4回收的必要性，使用Cas9抗性Surf4 cDNA进行了回补实验(图22)。将野生型Surf4重新引入很长大程度逆转了 因CRISPR介导的肝Surf4失活导致的血浆甘油三酯和胆固醇的清除(图23， Surf4-WT)，进一步证明了图6-8中显示的基因编辑效果的特异性。然而，回 收缺陷型突变体Surf4-AAA，尽管能够转运至高尔基体(图20，下部三幅小 图)，仍然无法实现回补效果(图23，Surf4-AAA)。这些数据说明SURF4在ER和高尔基体之间进行高效的双向穿梭，由此保持对脂质货物的高容量转 运，同时也作为这一过程的限制性因子。
实施例5.与Sar1b的协同作用
为了研究SAR1B和SURF4在生理上的关系，进行了如下实验。
首先通过AAV将FLAG-Surf4引入到对照或Sar1b LKO小鼠的肝脏中。 Sar1b缺陷引起了肝脏中的APOB积累，还引起了APOB和SURF4之间相 互作用的增加(通过抗FLAG免疫沉淀测定)(图24)，由此证明了SURF4和 SAR1B在识别脂蛋白和介导脂蛋白包装到转运囊泡中进行ER运出的连续 合作(图1)。
还观察到了Sar1b和Surf4单倍不足(haploinsufficiency)在降脂方面的协 同效果(图25)。与WT同窝小鼠相比，肝脏Sar1b和Surf4杂合分别引起了 约15％和25％的血浆胆固醇降低。Sar1b和Surf4的肝脏双杂合引起了协同 性的约55％的血浆胆固醇降低。同时，与同窝对照相比，在双杂合小鼠中通 过H&E染色在肝脏中几乎没有观察到变化，尽管观察到了轻度的脂肪变性 (图26)。
与之相反，尽管Sar1b和/或Surf4在肝脏中的异位表达没有增加日常饮 食(chowdiet)小鼠的血脂，但是喂食生脂果糖饮食却导致了过表达Surf4或 Surf4/Sar1b小鼠相比于对照(过表达GFP小鼠)在血浆胆固醇方面小幅上升 (图27)。这些数据证明了一种稳健且灵活的体内脂质专有运出程序，并且 SAR1B/SURF4的配合以一种定量、剂量依赖性的方式把控着位于ER的入 口。
实施例6.SURF4的降脂作用独立于LDL受体功能
脂质货物ER运出的定量特性启发发明人研究靶向SURF4来预防病理 性血脂异常和动脉粥样硬化的可能性，具体是通过在接受PSCK9 AAV来降 解LDL受体的小鼠中急性失活Surf4。
用西式饮食(western diet；WD)喂食这些表达PCSK9的野生型小鼠引起 血浆胆固醇浓度超出正常值约10倍的升高，这与先前报道的一致(Goettsch, C.等(2016).Atherosclerosis 251,109-118)，原因是缺乏由LDL受体介导的脂 质清除。尽管在这些对照小鼠中出现病理性高脂血症，Cre-loxP介导的肝脏 Surf4等位基因纯合失活仍然使血浆胆固醇和甘油三酯几乎完全被清除(图 28A-B)。这些数据说明SURF4将脂质选择性地转运到循环之中，而不依赖 于LDLR介导的脂质摄取。值得注意的是，Surf4的单倍缺失与对照小鼠相 比，也在血脂异常的情况下降低了血脂水平(图28A-B，最右侧的数据)。
与之相对，Surf4突变体小鼠与对照小鼠相比没有观察到对血浆AST或 ALT的诱导(图29)。通过对照小鼠中动脉区域事先油红O染色进行评估，观 察到了病理水平的血脂异常引起的动脉粥样硬化。然而，在去除了肝脏Surf4 的小鼠中则完全预防了动脉粥样硬化的形成(图30和图31)。
值得注意的是，肝脏Surf4杂合性也产生了显著的针对动脉粥样硬化的 保护效果(病灶面积2.32±0.51％，对照中为11.95±1.28％，n＝8，P<0.0001， 图30和图31，最后一列)，这很可能是因为血脂异常状况中与导致动脉粥样 硬化的含ApoB的脂蛋白相关的循环胆固醇降低了接近50％(图32A-D)。
以上结果说明，通过抑制Surf4的降脂效果独立于LDL受体发挥作用， 因为Surf4位于脂质运出更上游的位置，这对于某些LDL受体先天存在缺陷 的人群而言是特别有益的，因为这些人群无法受益于PCSK9抑制剂。
实施例7.用于抑制SURF4的RNAi分子的制备
以人源SURF4 mRNA为靶点，基于人SURF4的转录本1的序列(SEQ ID NO:10)通过siDESIGN Center挑选潜在的有功能且脱靶效应小的siRNA 序列，形成如下列表1所示的候选SURF4 RNAi试剂(SEQ ID Nos:11-214)。 通过擎科生物科技公司合成下表1中的序列的RNA双链作为候选SURF4 RNAi试剂。以擎科生物科技公司提供的RNAi对照试剂(该对照试剂不靶向 任何哺乳动物细胞内的mRNA)作为所有RNAi评估实验中的对照。
表1.SURF4 RNAi试剂
实施例8.SURF4 RNAi的效果鉴定
体外测试
在人源肝脏细胞系Huh7中进行SURF4 RNAi的体外评估。将细胞接种 在6孔板中，用转染试剂LipoFectamine RNAiMax(Thermo Fisher)分别转染 表1中的候选SURF4 RNAi试剂和对照RNAi试剂。转染48小时后，用RT- PCR比较转染不同的SURF RNAi试剂的细胞和转染对照RNAi试剂的细胞 的内源性SURF4 mRNA水平，用免疫印迹比较转染不同的SURFRNAi试剂 的细胞和转染对照RNAi试剂的细胞的内源性SURF4蛋白水平，评估不同 的SURF4RNAi试剂降低SURF4的效果。收集转染不同的SURF RNAi试 剂的细胞和转染对照RNAi试剂的细胞的上清，比较上清中APOB蛋白的多 少来评估SURF RNAi试剂在细胞水平上降低脂质分泌的效果。
图33中显示了SURF4 RNAi试剂S4-1、S4-2和S4-3的结果。根据图 33的结果可知，三种SURF4 RNAi试剂均显著降低了SURF4 mRNA的水平 (图33A-B)，并且降低了培养基中的APOB水平(图33C-D)。这些结果说明 靶向SURF4的RNAi试剂降低了SURF4的表达，减少了脂质分泌，进而实 现了降低血脂的效果。
动物实验
在肝脏特异Surf4敲除小鼠的肝脏中回补AAV介导的人源SURF4 cDNA， 用于SURF4RNAi试剂的动物水平测试。将表达人源SURF4的小鼠随机分 组，每组5只或以上，通过尾静脉分别注射脂质纳米粒包裹的表1中的候选 SURF4 RNAi试剂，对照组注射对照RNAi试剂。在第1周、第2周和第4 周，收集血清，测量LDL-C、HDL-C。第四周后，注射不同RNAi试剂的小鼠肝脏取材，检测小鼠肝脏中SURF4的mRNA水平和蛋白水平。结合肝脏 SURF4的表达水平和血清中LDL-C、HDL-C水平，评估SURF4 RNAi试剂 降低SURF4表达水平和降低血脂的效果。同时将取材的肝脏进行包括H/E、 油红O和天狼星红染色等在内的染色，评估注射不同SURF4RNAi试剂的 肝脏健康状况。
通过动物实验能够进一步验证SURF4 RNAi试剂的效果以及安全性。预 期抑制SURF4表达带来的有益效果将超过因脂质积累而对肝脏造成的潜在 负担的意义。
以上实验揭示现并确认了SURF4在脂质转运中扮演的角色，并且通过 实验验证了对SURF4进行抑制能够有效降低血脂，包括胆固醇和甘油三酯， 也验证了针对SURF4 RNAi试剂能够有效降低SURF4的mRNA水平，进而 实现降脂功能。
序列表
<110> 北京大学
<120> 用于抑制SURF4基因表达的RNAi试剂和组合物
<130> PR12863PKU33CN
<160> 214
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagaacgac ctgatgggca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatccgcat gtggttccag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcaggttg aggaacacga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgaatacg cccacgcgat 20
<210> 5
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaccagca aacatgctct tcccttctga gcgggattct gccaa 45
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Val Gly Ala Phe Met Ser Lys Gly Glu Ser Arg Ser Glu Ala Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacgcccgca aacatgctct tcccttcaga tcttgattct gctag 45
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Val Gly Ala Phe Met Ser Lys Gly Glu Ser Arg Ser Glu Ala Leu
1 5 10 15
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gly Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Pro Gly Gly Val Ser Met Asp
1 5 10 15
Glu Lys Lys Lys Glu Trp
20
<210> 10
<211> 2929
<212> DNA/RNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
cttcctgtgg aggccgcagc gggtgcgggc gccgacgggc gagagccagc gagcgagcga 60
gcgagccgag ccgagcctcc cgccgtcgcc atgggccaga acgacctgat gggcacggcc 120
gaggacttcg ccgaccagtt cctccgtgtc acaaagcagt acctgcccca cgtggcgcgc 180
ctctgtctga tcagcacctt cctggaggac ggcatccgta tgtggttcca gtggagcgag 240
cagcgcgact acatcgacac cacctggaac tgcggctacc tgctggcctc gtccttcgtc 300
ttcctcaact tgctgggaca gctgactggc tgcgtcctgg tgttgagcag gaacttcgtg 360
cagtacgcct gcttcgggct ctttggaatc atagctctgc agacgattgc ctacagcatt 420
ttatgggact tgaagttttt gatgaggaac ctggccctgg gaggaggcct gttgctgctc 480
ctagcagaat cccgttctga agggaagagc atgtttgcgg gcgtccccac catgcgtgag 540
agctccccca aacagtacat gcagctcgga ggcagggtct tgctggttct gatgttcatg 600
accctccttc actttgacgc cagcttcttt tctattgtcc agaacatcgt gggcacagct 660
ctgatgattt tagtggccat tggttttaaa accaagctgg ctgctttgac tcttgttgtg 720
tggctctttg ccatcaacgt atatttcaac gccttctgga ccattccagt ctacaagccc 780
atgcatgact tcctgaaata cgacttcttc cagaccatgt cggtgattgg gggcttgctc 840
ctggtggtgg ccctgggccc tgggggtgtc tccatggatg agaagaagaa ggagtggtaa 900
cagtcacaga tccctacctg cctggctaag acccgtggcc gtcaaggact ggttcggggt 960
ggattcaaca aaactgccag cttttatgta tcctcttccc ttcccctccc ttggtaaagg 1020
cacagatgtt ttgagaactt tatttgcaga gacacctgag aatcgatggc tcagtctgct 1080
ctggagccac agtctggcgt ctgacccttc agtgcaggcc agcctggcag ctggaagcct 1140
cccccacgcc gaggctttgg agtgaacagc ccgcttggct gtggcatctc agtcctattt 1200
ttgagttttt ttgtgggggt acaggagggg gccttcaagc tgtactgtga gcagacgcat 1260
tggtattatc attcaaagca gtctccctct tatttgtaag tttacatttt tagcggaaac 1320
tactaaatta ttttgggtgg ttcagccaaa cctcaaaaca gttaatctcc ctggtttaaa 1380
atcacaccag tggctttgat gttgtttctg ccccgcattg tattttatag gaatagtgaa 1440
aacatttagg gacacccaaa gaatgatgca gtattaaagg ggtggtagaa gctgctgttt 1500
atgataaaag tcatcggtca gaaaatcagc ttggattggt gccaagtgtt ttattgggta 1560
acaccctggg agttttagta gcttgaggca aggtggaggg gcaagaagtc cttggggaag 1620
ctgctggtct gggtgctgct ggcctccaag ctggcagtgg gaagggctag tgagaccaca 1680
caggggtagc cccagcagca gcaccctgca agccagcctg gccagctgct cagaccagct 1740
tgcagagccg cagccgctgt gggcaggggg tgtggcagga gctcccagca ctggagaccc 1800
acggactcaa cccagttacc tcacatgggg ccttttctga gcaaggtctc gaaagcgcag 1860
gccgccctgg ctgagcagca ccgccctttc ccagctgcac tcgccctgtg gacagccccg 1920
acacaccact ttcctgaggc tgtcgctcac tcagattgtc cgtttgctat gccgaatgca 1980
gccaaaattc ctttttacaa tttgtgatgc cttaccgatt tgatcttaat cctgtattta 2040
aagttttcta acactgcctt atactgtgtt tctctttttg ggggagctta actgcttgtt 2100
gctccctgtc gtctgcacca tagtaaatgc cacaagggta gtcgaacacc tctctggccc 2160
ctagacctat ctggggacag gctggctcag cctgtctcca gggctgctgc ggcccagccc 2220
cgagcctgcc tccctcttgg cctctcatcc attggctctg cagggcaggg gtgaggcagg 2280
tttctgctca taagtgcttt tggaagtcac ctaccttttt aacacagccg aactagtccc 2340
aacgcgtttg caaatattcc cctggtagcc tacttcctta cccccgaata ttggtaagat 2400
cgagcaatgg cttcaggaca tgggttctct tctcctgtga tcattcaagt gctcactgca 2460
tgaagactgg cttgtctcag tgtttcaacc tcaccagggc tgtctcttgg tccacacctc 2520
gctccctgtt agtgccgtat gacagccccc atcaaatgac cttggccaag tcacggtttc 2580
tctgtggtca aggttggttg gctgattggt ggaaagtagg gtggaccaaa ggaggccacg 2640
tgagcagtca gcaccagttc tgcaccagca gcgcctccgt cctagtgggt gttcctgttt 2700
ctcctggccc tgggtgggct agggcctgat tcgggaagat gcctttgcag ggaggggagg 2760
ataagtggga tctaccaatt gattctggca aaacaatttc taagattttt ttgctttatg 2820
tgggaaacag atctaaatct cattttatgc tgtattttat atcttagttg tgtttgaaaa 2880
cgttttgatt tttggaaaca catcaaaata aataatggcg tttgttgta 2929
<210> 11
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ucauagcucu gcagacgau 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aucgucugca gagcuauga 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaccuggaa cugcggcua 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uagccgcagu uccaggugg 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
uggccucguc cuucgucuu 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagacgaagg acgaggcca 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agaagaagaa ggaguggua 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uaccacuccu ucuucuucu 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaggaacuu cgugcagua 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uacugcacga aguuccugc 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccauggauga gaagaagaa 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
uucuucuucu cauccaugg 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ugcaugacuu ccugaaaua 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
uauuucagga agucaugca 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaugagaaga agaaggagu 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acuccuucuu cuucucauc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcgagagcc agcgagcga 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ucgcucgcug gcucucgcc 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccagcgagcg agcgagcga 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ucgcucgcuc gcucgcugg 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccgccgucgc caugggcca 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
uggcccaugg cgacggcgg 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ucgccauggg ccagaacga 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ucguucuggc ccauggcga 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagaacgacc ugaugggca 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ugcccaucag gucguucug 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agaacgaccu gaugggcac 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gugcccauca ggucguucu 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ugggcacggc cgaggacuu 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaguccucgg ccgugccca 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccgaggacuu cgccgacca 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
uggucggcga aguccucgg 19
<210> 43
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggagcgagca gcgcgacua 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
uagucgcgcu gcucgcucc 19
<210> 45
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcgagcagcg cgacuacau 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
auguagucgc gcugcucgc 19
<210> 47
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cagcgcgacu acaucgaca 19
<210> 48
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ugucgaugua gucgcgcug 19
<210> 49
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcgacuacau cgacaccac 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
guggugucga uguagucgc 19
<210> 51
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ccaccuggaa cugcggcua 19
<210> 52
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
uagccgcagu uccaggugg 19
<210> 53
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cguccuucgu cuuccucaa 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
uugaggaaga cgaaggacg 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
uccucaacuu gcugggaca 19
<210> 56
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ugucccagca aguugagga 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gcuucgggcu cuuuggaau 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
auuccaaaga gcccgaagc 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cgggcucuuu ggaaucaua 19
<210> 60
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
uaugauucca aagagcccg 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ucauagcucu gcagacgau 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aucgucugca gagcuauga 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
agacgauugc cuacagcau 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
augcuguagg caaucgucu 19
<210> 65
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgauugccu acagcauuu 19
<210> 66
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaaugcugua ggcaaucgu 19
<210> 67
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gaaccuggcc cugggagga 19
<210> 68
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
uccucccagg gccagguuc 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cguucugaag ggaagagca 19
<210> 70
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ugcucuuccc uucagaacg 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
guucugaagg gaagagcau 19
<210> 72
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
augcucuucc cuucagaac 19
<210> 73
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ucugaaggga agagcaugu 19
<210> 74
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acaugcucuu cccuucaga 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gggaagagca uguuugcgg 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ccgcaaacau gcucuuccc 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ccaccaugcg ugagagcuc 19
<210> 78
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gagcucucac gcauggugg 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ccaaacagua caugcagcu 19
<210> 80
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
agcugcaugu acuguuugg 19
<210> 81
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gggucuugcu gguucugau 19
<210> 82
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
aucagaacca gcaagaccc 19
<210> 83
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
uccagaacau cgugggcac 19
<210> 84
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gugcccacga uguucugga 19
<210> 85
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ccagaacauc gugggcaca 19
<210> 86
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ugugcccacg auguucugg 19
<210> 87
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gggcacagcu cugaugauu 19
<210> 88
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
aaucaucaga gcugugccc 19
<210> 89
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ggcacagcuc ugaugauuu 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
aaaucaucag agcugugcc 19
<210> 91
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gcacagcucu gaugauuuu 19
<210> 92
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
aaaaucauca gagcugugc 19
<210> 93
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gcucuuugcc aucaacgua 19
<210> 94
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
uacguugaug gcaaagagc 19
<210> 95
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ucuuugccau caacguaua 19
<210> 96
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
uauacguuga uggcaaaga 19
<210> 97
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
acguauauuu caacgccuu 19
<210> 98
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
aaggcguuga aauauacgu 19
<210> 99
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ggaccauucc agucuacaa 19
<210> 100
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
uuguagacug gaauggucc 19
<210> 101
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ucuacaagcc caugcauga 19
<210> 102
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ucaugcaugg gcuuguaga 19
<210> 103
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
caugcaugac uuccugaaa 19
<210> 104
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
uuucaggaag ucaugcaug 19
<210> 105
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
aaauacgacu ucuuccaga 19
<210> 106
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
ucuggaagaa gucguauuu 19
<210> 107
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
acgacuucuu ccagaccau 19
<210> 108
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
auggucugga agaagucgu 19
<210> 109
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
uuccagacca ugucgguga 19
<210> 110
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ucaccgacau ggucuggaa 19
<210> 111
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
uggaugagaa gaagaagga 19
<210> 112
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
uccuucuucu ucucaucca 19
<210> 113
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
augagaagaa gaaggagug 19
<210> 114
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cacuccuucu ucuucucau 19
<210> 115
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gaagaagaag gagugguaa 19
<210> 116
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
uuaccacucc uucuucuuc 19
<210> 117
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
caacaaaacu gccagcuuu 19
<210> 118
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
aaagcuggca guuuuguug 19
<210> 119
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ugguaaaggc acagauguu 19
<210> 120
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aacaucugug ccuuuacca 19
<210> 121
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gguaaaggca cagauguuu 19
<210> 122
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
aaacaucugu gccuuuacc 19
<210> 123
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gcacagaugu uuugagaac 19
<210> 124
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
guucucaaaa caucugugc 19
<210> 125
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
acagauguuu ugagaacuu 19
<210> 126
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
aaguucucaa aacaucugu 19
<210> 127
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gagcagacgc auugguauu 19
<210> 128
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
aauaccaaug cgucugcuc 19
<210> 129
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
acgcauuggu auuaucauu 19
<210> 130
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
aaugauaaua ccaaugcgu 19
<210> 131
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
agcggaaacu acuaaauua 19
<210> 132
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
uaauuuagua guuuccgcu 19
<210> 133
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gcggaaacua cuaaauuau 19
<210> 134
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
auaauuuagu aguuuccgc 19
<210> 135
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
caguuaaucu cccugguuu 19
<210> 136
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
aaaccaggga gauuaacug 19
<210> 137
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
aguuaaucuc ccugguuua 19
<210> 138
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
uaaaccaggg agauuaacu 19
<210> 139
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gcauuguauu uuauaggaa 19
<210> 140
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
uuccuauaaa auacaaugc 19
<210> 141
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
uuuuauagga auagugaaa 19
<210> 142
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
uuucacuauu ccuauaaaa 19
<210> 143
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
ggaauaguga aaacauuua 19
<210> 144
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
uaaauguuuu cacuauucc 19
<210> 145
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gugaaaacau uuagggaca 19
<210> 146
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
ugucccuaaa uguuuucac 19
<210> 147
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
acauuuaggg acacccaaa 19
<210> 148
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
uuuggguguc ccuaaaugu 19
<210> 149
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
agggacaccc aaagaauga 19
<210> 150
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
ucauucuuug ggugucccu 19
<210> 151
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
cccaaagaau gaugcagua 19
<210> 152
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
uacugcauca uucuuuggg 19
<210> 153
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ccaaagaaug augcaguau 19
<210> 154
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
auacugcauc auucuuugg 19
<210> 155
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
caaagaauga ugcaguauu 19
<210> 156
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
aauacugcau cauucuuug 19
<210> 157
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
aaagaaugau gcaguauua 19
<210> 158
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
uaauacugca ucauucuuu 19
<210> 159
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
agaaugaugc aguauuaaa 19
<210> 160
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
uuuaauacug caucauucu 19
<210> 161
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
guauuaaagg ggugguaga 19
<210> 162
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ucuaccaccc cuuuaauac 19
<210> 163
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
ugguagaagc ugcuguuua 19
<210> 164
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
uaaacagcag cuucuacca 19
<210> 165
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
gguagaagcu gcuguuuau 19
<210> 166
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
auaaacagca gcuucuacc 19
<210> 167
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
caaguguuuu auuggguaa 19
<210> 168
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
uuacccaaua aaacacuug 19
<210> 169
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
gguaacaccc ugggaguuu 19
<210> 170
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
aaacucccag gguguuacc 19
<210> 171
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
gaggcaaggu ggaggggca 19
<210> 172
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
ugccccucca ccuugccuc 19
<210> 173
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
gugggaaggg cuagugaga 19
<210> 174
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
ucucacuagc ccuucccac 19
<210> 175
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
gggaagggcu agugagacc 19
<210> 176
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
ggucucacua gcccuuccc 19
<210> 177
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
gcucagacca gcuugcaga 19
<210> 178
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ucugcaagcu ggucugagc 19
<210> 179
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
ugaucuuaau ccuguauuu 19
<210> 180
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
aaauacagga uuaagauca 19
<210> 181
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
cgucugcacc auaguaaau 19
<210> 182
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
auuuacuaug gugcagacg 19
<210> 183
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
aguaaaugcc acaagggua 19
<210> 184
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
uacccuugug gcauuuacu 19
<210> 185
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
guaaaugcca caaggguag 19
<210> 186
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
cuacccuugu ggcauuuac 19
<210> 187
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
ccacaagggu agucgaaca 19
<210> 188
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
uguucgacua cccuugugg 19
<210> 189
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
cauaagugcu uuuggaagu 19
<210> 190
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
acuuccaaaa gcacuuaug 19
<210> 191
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
gagcaauggc uucaggaca 19
<210> 192
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
uguccugaag ccauugcuc 19
<210> 193
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
agcaauggcu ucaggacau 19
<210> 194
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
auguccugaa gccauugcu 19
<210> 195
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
caucaaauga ccuuggcca 19
<210> 196
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
uggccaaggu cauuugaug 19
<210> 197
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
aucaaaugac cuuggccaa 19
<210> 198
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
uuggccaagg ucauuugau 19
<210> 199
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
ggucaagguu gguuggcug 19
<210> 200
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
cagccaacca accuugacc 19
<210> 201
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
gcugauuggu ggaaaguag 19
<210> 202
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
cuacuuucca ccaaucagc 19
<210> 203
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
ggaaaguagg guggaccaa 19
<210> 204
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
uugguccacc cuacuuucc 19
<210> 205
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
accaauugau ucuggcaaa 19
<210> 206
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
uuugccagaa ucaauuggu 19
<210> 207
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
ccaauugauu cuggcaaaa 19
<210> 208
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
uuuugccaga aucaauugg 19
<210> 209
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
uggaaacaca ucaaaauaa 19
<210> 210
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
uuauuuugau guguuucca 19
<210> 211
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
caaaauaaau aauggcguu 19
<210> 212
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
aacgccauua uuuauuuug 19
<210> 213
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
aauaauggcg uuuguugua 19
<210> 214
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
uacaacaaac gccauuauu 19
Claims (10)
1.长度为8-30个核苷酸的短反义寡核苷酸，其靶向编码SURF4的核苷酸。
2.权利要求1的短反义寡核苷酸，其包含15-25个核苷酸，优选19-23个。
3.权利要求1的短反义寡核苷酸，其包含选自表1的反义链的序列或与其相差1或2个核苷酸的序列，或由选自表1的反义链的序列或与其相差1或2个核苷酸的序列组成。
4.用于抑制SURF4基因的表达的RNAi试剂，其包含权利要求1-3中任一项所述的短反义寡核苷酸，和与所述短反义寡核苷酸至少部分互补的正义链。
5.权利要求4的RNAi试剂，其中所述正义链在所述短反义寡核苷酸的长度范围内与所述短反义寡核苷酸至少85％互补。
6.权利要求4的RNAi试剂，其包含选自表1的正义链和/或反义链。
7.组合物，包含(a)权利要求1-3中任一项的短反义寡核苷酸或权利要求4-6中任一项的RNAi试剂，和(b)药学上可接受的赋形剂。
8.权利要求1-3中任一项的短反义寡核苷酸或权利要求4-6中任一项的RNAi试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗或预防与血脂异常相关的疾病，如心脑血管疾病或与血脂异常相关的代谢疾病，优选地所述疾病选自下组：高血脂症如家族性高血脂症、高甘油三酯血症、胆固醇代谢异常、脂质代谢异常、高LDL-C血症、动脉粥样硬化性心脑血管疾病如心肌梗死、脑卒中、动脉粥样硬化。
9.权利要求1-3中任一项的短反义寡核苷酸或权利要求4-6中任一项的RNAi试剂在制备药物中的用途，所述药物用于降低受试者血液中的低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和甘油三酯中的一种、两种或全部三种。
10.权利要求8或9的用途，所述受试者为基因缺陷如LDLR表达缺陷的家族性高血脂症患者。
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