BR112019028149A2 - anticorpos químicos para tratamento de doenças de deposição amilóide - Google Patents
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Abstract
Anticorpo quimérico de camundongo e humano para tratamento de doenças de deposição de amilóide, composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo, métodos e materiais para a produção do anticorpo e métodos para o tratamento de uma doença de deposição de amilóide utilizando o anticorpo e a composição farmacêutica.
Description
[0001] O conteúdo do texto de arquivo da listagem de sequência intitulada "8441 -0004-1 ST25", que tem 15,6 kb de tamanho, foi criada em 4 de junho de 2018, e submetida eletronicamente via EFS-Web, está incorporado inteiramente com este pedido neste documento por referência.
[0002] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos 62/526,835, depositado em 29 de junho de 2017, o qual está incorporado inteiramente neste documento por referência.
[0003] Esta invenção foi feita com suporte do Governo dos Estados Unidos sob Contrato 20XS094A, concedido pelo Science Applications International Corporation - Frederick. Assim, o Governo dos Estados Unidos tem certos direitos à invenção descrita e reivindicada neste documento.
[0004] A presente invenção relata para anticorpos quiméricos de camundongo e humano útil para o tratamento de doenças de deposição de amiloide, particularmente amiloidose primária (AL), composições farmacêuticas, compreendendo tais anticorpos, métodos e materiais para preparação de tais anticorpos, e métodos de tratamento de doenças de deposição de amiloide, usando os referidos anticorpos e composições farmacêuticas.
[0005] Os anticorpos nativos são usualmente glicoproteínas heterotetramérica de cerca de 150.000 daltons composta de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto, enquanto o número de ligações de dissulfeto adicionais entre as cadeias pesadas varia com diferentes isotipos de anticorpo. O mais simples isotipo é IgG, o qual compreende somente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que as duas cadeias pesadas são ligadas por duas ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (V.) em uma extremidade com um número de domínios constantes adjacentes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (V1,) em uma extremidade e um domínio constante e outra extremidade. Cada domínio variável da cadeia leve e pesada em um anticorpo compreende três segmentos chamados de regiões de determinação de complementariedade ("CDR" - Complementarity-Determining Regions) ou regiões hiper variáveis. Cada CDR em uma cadeia leve, junta com a correspondente CDR na cadeia pesada adjacente, forma um local de ligação antígena do anticorpo. As cadeias leves são de dois maiores tipos, K Ee À, dependendo de suas regiões constantes. Ambas cadeias leves K e A podem combinar com qualquer dos diferentes tipos de cadeias pesadas.
[0006] A amiloidose de cadeia leve de amiloide (AL amiloidose), também chamada amiloidose primária, é a forma mais comum de amiloidose sistêmica nos Estados Unidos. O termo "amiloidose" refere-se a um conjunto de doenças que compartilham uma característica comum, isto é, a deposição extracelular de proteínas fibrilares insolúveis patológicas em órgãos e tecidos (Rodney, et al. - NEJM, 25:898). A amiloidose é anticorpos de uma pessoa causando a produção de fibras de proteínas anormais que agregam para formar deposição de amiloides insolúveis em órgãos e tecidos. O tipo de amiloidose é determinada pela natureza das proteínas precursoras que formam o depósito de fibrila. Em amiloidose primária (AL), as fibrilas compreendem fragmentos de cadeia leves de imunoglobulina e em amiloidose secundárias, as fibrilas compreendem proteína amiloide A. A classificação moderna de amiloidose é baseada na natureza das proteínas precursoras de plasma que formam a deposição de fibrila.
[0007] As proteínas precursoras de plasma são diversas e não relacionadas. No entanto, todos os depósitos precursores produzem depósitos de amiloides, os quais compartilham uma configuração típica comum de folhas plissadas RB, que são responsáveis pelas propriedades típicas de coloração das deposições fibrilares. O estágio final no desenvolvimento de amiloidose é o depósito de fibrilas de amiloides nos órgãos do doente. A mortalidade por Amiloidose é alta, com taxas atuais de sobrevivência de cinco anos de cerca de 28%.
[0008] Até a presente data, o tratamento de AL tem sido direcionado no sentido da redução da síntese de cadeias leves precursoras amiloidogênicas pelo ataque às células com mau funcionamento por meio de quimioterapia citotóxica convencional ou em altas doses. Este tratamento sofre duas desvantagens. Primeiro, as deposições fibrilares são frequentemente assintomáticas até depois de uma deposição significativa já ter ocorrido. Portanto, é improvável que o tratamento seja empreendido antes que ocorram depósitos significativos. Segundo uma vez que este tratamento é, efetivamente melhor somente para parar a produção de proteína anormal, mas não para remover os depósitos existentes, prognóstico para pacientes AL permanece extremamente pobre devido à persistência (ou progressão) das deposições patológicas (Solomon, et al. - Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:269)
[0009] Estudos de animal recentes mostrou que a administração do anticorpo “murino 11-1F4 e outros anticorpos específicos de murino anti-humano de cadeia leve direcionado contra um epitope comum para as estruturas de folhas plissadas B presente nas fibrilas de AL resulta em completa degradação dos depósitos de amiloide ALK e ALA em humanos. Alguns destes anticorpos de murino estão descritos na Patente dos Estados dos 8, 105,594, que está incorporada inteiramente neste documento por referência.
[0010] Os anticorpos de murino são geralmente inadequados para administração para outras espécies de animais (como humanos), porque as espécies que recebem reconhecerão o anticorpo murinho como antigênico e produzirá anticorpos contra eles. A antigenicidade de um anticorpo de uma espécie, quando injetada em outras espécies, é normalmente causada por uma porção de um domínio constante. Tal resposta antigênica impedirá ou prevenirá o efeito terapêutico desejado do anticorpo murino. Em humanos, esta resposta antigênica é chamada anticorpo anti-camundongo humano (HAMA - Human Anti-Mouse Antibody). Os anticorpos descritos na Patente '594 tem o potencial para ser altamente imunogênico em humanos via a reposta de anticorpo anti-rato humano (HAMA). Uma vez que a resposta de HAMA usualmente resulta na liberação rápida de um anticorpo de camundogo a partir do recipiente humano, HAMA limitará severamente qualquer potencial de benefício terapêutico humano que um anticorpo murinho possa ter. Além disso, estes anticorpos murino são inadequados para administração em um paciente para parar ou reverter a deposição de fibrilas de amiloide em um paciente e existe uma necessidade para um anticorpo de tratamento para doenças de deposição de amiloide que tenha baixa imunogenicidade em humanos.
[0011] Uma concretização da invenção é anticorpos quiméricos de camundongo e humano útil para o tratamento de doenças de deposição de amiloide, particularmente amiloidose primária (AL).
[0012] Outra concretização da invenção é uma composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo quimérico e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0013] Outra concretização da invenção são métodos e materiais para produção de tais anticorpos, incluindo poli nucleotídeo sequências e construção do vetor.
[0014] Outra concretização da invenção são métodos para tratamento ou melhora de sintomas de doenças de deposição de amiloide, tais como amiloidose primária (AL), em um humano na necessidade de tal tratamento pela administração para um paciente humano na necessidade de tal tratamento ou melhora de uma quantidade efetiva de pelo menos um de tais anticorpos para o tratamento ou melhora dos sintomas da referida doença de deposição de amiloide, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0015] Outra concretização da invenção é um método de detecção de doença de deposição de amiloide em um paciente suspeito de ter tal doença pela administração de um anticorpo marcado da invenção e a detecção da presença da etiqueta no paciente. A etiqueta pode ser uma radioetiqueta, tal como I, mas outros tipos de etiquetas podem ser prontamente entendidos por um experiente na matéria. Incluindo nesta concretização a etiqueta do próprio anticorpo.
[0016] A Figura 1 esboça a estratégia usada para clonar o murino Vx, e genes Vx de uma linha de células hibridoma.
[0017] A Figura 2 é uma listagem de sequências de DNA e aminoácido do gene da região V, de anticorpo 11-1F4 de murino, SEQ ID NO: 39 e NO: 35, respectivamente.
[0018] A Figura 3 é uma listagem de sequências de DNA e de aminoácido do gene da região V, de anticorpo 11-1F4, SEQ ID NO: 40 e NO: 36, respectivamente.
[0019] A Figura 4 é um mapa do vetor de expressão da cadeia leve de imunoglobulina kappa PpKN100. Consistindo de um fragmento de vetor pSV2, que tem um promotor inicial e inutilizado SV40 e tardio SV40, a origem SV40 e a origem Col El. Também possui resistência à ampicilina e neo genes. O promotor final SV40 inutilizado dirige os neo genes.
Também tem o promotor HCMVi, uma localização de clonagem múltipla (contendo as localizações de restrição de BamHI e HindIII) para a inserção de um gene de região variável de imunoglobulina, e cDNA para o gene de região constante de kappa terminada por uma sequência de terminação de spaC2 ("Arnie"), que tem a mesma orientação como a expressão cassete da cadeia leve kappa.
[0020] A Figura 5 é um mapa do vetor de expressão de cadeia pesada pGl D200 de imunoglobulina gama 1. Consiste em um fragmento de vetor pSV2dhfr, que tem um promotor precoce e inutilizado SV40 e o tardio SV40 e a origem Col El. Também possui resistência à ampicilina e genes dhfr. O promoter final e inutilizado SV40 dirige o gene dhfr. Consequentemente, a expressão é fraca, permitindo a seleção de clones de multigene/alto nível de expressão usando níveis comparativamente baixos de metotrexato. Também possui o fragmento do promotor HCMVi, um local de clonagem múltipla, cDNA para um gene da região constante gama 1 (intron menos) que é seguido por uma sequência de sinal terminal spaC2 ("Amie").
[0021] A Figura 6 é uma lista das sequências de DNA e de aminoácido do gene da região Vx de anticorpo 11-1F4 de murinho modificado (SEQ ID NO: 42 e NO: 47, respectivamente) e as sequências dos primares oligonucleotídeo utilizados para modificar o gene Vx (SEQ ID NO: 41 e NO: 43, respectivamente), bem como a sequência de DNA com o líder (SEQ ID NO: 37).
[0022] A Figura 7 é a lista das sequências de DNA e aminoácidos do gene da região Vx de anticorpo 11-1F4 de murino modificado (SEQ ID NO: 45 e NO: 48, respectivamente) e as sequências dos primeres oligonucleotídeo usados para modificar o gene Vg (SEQ ID NO: 44 e NO: 46, respectivamente), bem como a sequência de DNA com o líder (SEQ ID NO: 38).
[0023] A Figura 8 é uma representação gráfica do resultado do ensaio ELISA de ligação de fibrila de amiloide. Os supernadantes de célula COS de anticorpo quimérico, contendo 11-1F4 foram testados separadamente na mesma placa ELISA com anticorpo 11-1F4 de murinho purificado. A absorvância foi lida a OD405. Novo sv = pGl KD200-11-1F4. Nova cotransfecção = 11-1F4VHpG1l D200 mais 11-1F4VK.pKN
100.
[0024] De acordo com a presente invenção, anticorpos quiméricos de camundongo e humano são previstos que são úteis para a administração para humanos que sofrem de doenças de deposição de amiloide para o tratamento ou melhora dos sintomas da doença. Os anticorpos quiméricos da invenção ligam para a deposição de amiloide e ativa o sistema imune do paciente para evidenciar os materiais ligados, enquanto produz pouca ou nenhuma reação de HAMA. A invenção também fornece composições farmacêuticas, compreendendo pelo menos um dos referidos anticorpos quiméricos e um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos e materiais para a produção de anticorpos e métodos de tratamento ou melhora dos sintomas de um paciente sofrendo de amiloidose pela administração para o paciente de uma quantidade efetiva de anticorpo quimérico para remover pelo menos algumas das deposições de amiloide de órgãos do paciente e assim tratar ou melhorar os sintomas da amiloidose.
[0025] Na presente invenção, pelo menos um anticorpo quimérico é administrado a um paciente humano que sofre de amiloidose para promover a degradação e remover pelo menos algumas fibrilas de amiloide que começou a ser depositada nos órgãos do paciente. Uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo é administrada juto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na matéria. Uma rota típica de administração é parenteralmente (exemplo, intravenosamente), como é bem entendida pelos experientes nas matérias médicas. Outras rotas de administração são de possíveis meios. A administração pode ser por doses simples ou múltiplas. A quantidade de anticorpo administrado e a frequência da dosagem pode ser optimizada pelo médico para o paciente particular.
[0026] A dose terapeuticamente efetiva de anticorpo administrada para o paciente (quando administrado de uma dose simples ou doses múltiplas) pode ser suficiente para reduzir a quantidade de depósito de fibrilas de amiloides em um paciente. Tal quantidade terapeuticamente efetiva pode ser determinada pela avaliação de mudanças sintomáticas no paciente ou pela avaliação da alteração na quantidade de deposição de fibrilas de amiloides (exemplo, pela detecção radioimune de deposição de amiloide depositada usando anticorpo marcado VP). Assim, os anticorpos marcados da invenção podem ser usados para detectar a presença da doença de deposição de amiloide em um paciente suspeito de ter a doença bem como para determinar a afetividade do tratamento.
[0027] Para produzir os anticorpos quiméricos da invenção, os genes da região variável de cadeia leve kappa e cadeia pesada 11-1F4 do anticorpo monoclonal de murino descritos na Patente dos Estados Unidos 8,105,594 foram modificados por PCR para facilitar a expressão do anticorpo 11-1F4 quimérico em células de mamíferos. Foi realizada uma análise detalhada da sequência dos genes de região variável modificada foram clonados em apropriadas expressões de vetor de mamíferos, criando os construtores 11-1F4VHpG1l D200 e 11-1F4VK.pKN100. Um único construtor de supervetor simples, pGl KD200-11-1F4, foi feita a partir de 11- 1F4VHPpG1D200 e 11-IF4VK.pKN100 por digestão e ligação da enzima de restrição EcoRI. Finalmente, o anticorpo quimérico 11-1F4 foi expresso transientemente em células COS por ambas cotransfecção e transfecção por supervetor único. Enquanto células COS foram escolhidas para a cotransfecção ou transfecção por uma questão de conveniência, os experientes na matéria reconhecerão que outras linhas de células de mamíferos podem ser usadas. A caracterização da capacidade de ligação do anticorpo quimérico 11-1F4 com fibrilas de amiloides foi determinada por ELISA de ligação direta. Inesperadamente e beneficamente, o anticorpo quimérico 11-1F4 liga com fibrilas de amiloides com maior afinidade do que o anticorpo murino 11-1F4.
[0028] O anticorpo da invenção compreende um anticorpo monoclonal quimérico humano-rato, compreendendo a região Vx de SEQ ID NO: 47 e a região V, da SEQ ID NO: 48. Este anticorpo liga para um epitope expressado pela configuração de folha plissada de fibrilas B- de amiloides. Além disso, surpreendentemente o anticorpo liga a estes epitopes com maior afinidade que o anticorpo 11-1F4 de camundongo a partir do qual foi derivado, o qual compreende a região Vx de SEQ ID NO: 36 e a região V, de SEQ ID NO: 35. A invenção inclui métodos de tratamento de uma doença de deposição de amiloide em um paciente humano na necessidade de tal tratamento que compreende administrar para o paciente o anticorpo acima em um veículo farmaceuticamente aceitável. A quantidade do anticorpo administrado deve ser efetiva para reduzir a quantidade de fibrilas de amiloides depositada nos tecidos do paciente. A composição de anticorpo pode ser administrada por qualquer rota de administração convencional, mas a administração parenteral (tal como intravenosa) é preferida. os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na matéria e um adequado pode ser selecionado por um experiente no campo médico. A doença de deposição de amiloide é preferivelmente primária (AL).
[0029] A invenção também inclui métodos e materiais para fazer o anticorpo em questão. Os materiais úteis para fazer o anticorpo em questão inclui construção do vetor selecionado a partir do grupo consistindo de 11- 1F4VK.pKN100 e 11-F4VH.pGl D200, mostrados nas Figuras 5 e 6, respectivamente, e o superconstrutor pG.l KD20011-1F4 feito a partir das duas construção do vetor acima. Outros materiais úteis incluem o gene da região Vx do anticorpo 11-1F4 de murino modificado (SEQ ID NO: 42) e o gene da região Vx do anticorpo 11-1F4 modificado (SEQ ID NO: 45), bem como os respectivos primeres de SEQ ID NO: 41 , 43, 44 e 46. O anticorpo em questão pode ser feito por cotransfecção da construção do vetor 11-1F4VK.pKN100 e 11- F4VH.pGl1 D200 ou o superconstrutor pG.l1 KD20011-1F4 em uma adequada célula de hospedeiros mamíferos, tais como células COS (ovário de hamster chinês). Abreviações
[0030] Meio Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM —- Dulbecco's Modified Eagles Medium), Soro Fetal Bovino (FBS - Fetal Bovine Serum), ácido ribonucleico (RNA - ribonucleic acid); RNA mensageiro (mMRNA - messenger RNA); ácido desoxirribonucléico (DNA - deoxyribonucleic acid); cópia de DNA (cDNA - copy DNA); reação em cadeia da polimerase (PCR - polymerase chain reação); minuto (min - minuto); segundo (sec - second); Tampão tris-borato (TBE - Tris-borate buffer).
[0031] Os aminoácidos são representados pelas abreviações l1UPAC, como segue: Alanina (Ala A - Alanine), Arginina (Arg; R - Arginine), Asparagina (Asn; N - Asparagine), Ácido aspártico (Asp; D - Aspartic acid), |Cisteína (Cys; C - Cysteine), Glutamina (Gin; Q - Glutamine), Ácido glutâmico (Glu; E - Glutamic acid), Glicina (Gly; G - Glycine), Histidina (His; H - Histidine), Isoleucina (lie; I - Isoleucine), Leucina (Leu; L - Leucine), Lisina (Lys; K - Lysine), Metionina (Met; M - Methionine), Fenilalanina
(Phe; F - Phenylalanine), Prolina (Pro; P - Proline), Serina (Ser; S - Serine), Treonina (Thr; T - Threonine), Triptofano (Trp; W - Tryptophan), Tirosina (Tyr; Y - Tirosina), Valina (Val; V - Valine). Similarmente para nucleotídeos: Adenina (a - Adenine), Citosina (c - Cytosine), Guanina (g - Guanine), Timina (t - Thymine), Uracil (u - Uracil. Adenina ou Guanina (r - Adenine ou Guanine), Citosina ou Timina (y - Cytosine ou Thymine), Guanina ou Citosina (s - Guanine ou Cytosine), Adenina ou Timina (w - Adenine ou Thymine), Guanina ou Timina (k - Guanine ou Thymine), Adenina ou Citosina (m - Adenine ou Cytosine), Citosina ou Guanina ou Timina (b - Cytosine ou Guanine ou Thymine), Adenine ou Guanine ou Thymine (d), Adenina ou Citosina ou Timina (h - Adenine ou Cytosine ou Thymine), Adenina ou Citosina ou Guanina (v - Adenine ou Cytosine ou Guanine), e qualquer base (n). EXEMPLO 1 Clonagem por PCR e Sequenciamento de DNA de Anticorpo 11- 1F4 de camundongo
[0032] Os genes da região variável de cadeia pesada e leve de anticorpo monoclonal 11-1F4 de murino foram clonados por PCR e foi realizada uma análise detalhada da sequência de todos os genes de região variável isolados (ambos pseudo e funcional). Foram obtidas sequências detalhadas de DNA e de aminoácido de genes de região variável 11-1F4 de murino. Materiais
[0033] Os componentes do meio e todos os outros materiais de cultura de tecido foram obtidos de Life Technologies (UK). O kit de solução de RNA foi obtido de Stratagene
(USA), enquanto o kit de síntese de cDNA da primeira fita cCcDNA foi adquirido de Pharmacia (UK). Todos os constituintes e equipamentos para a reação RCR, incluindo AmpliTago DNA polimerase, foram adquiridos de Perkin Elmer (USA). O kit de Clonagem TOPO TA & foi obtido de Invitrogen (USA) . A agarose (UltraPure”"") foi obtida de Life Technologies (UK - Reino Unido). O kit de reação preparada para sequenciamento do ciclo terminador ABI PRISMEO Big Dye", o kit de sequenciação de ciclo pré-misturado e a máquina de sequenciação ABI PRISMGO 310 foram ambas adquiridas da PE Applied Biosystems (EUA). Todos os outros produtos de biológicos moleculares foram obtidos de New England Biolabs (EUA) e Promega (EUA). Métodos
[0034] A estratégia usada para clonar por PCR os genes V', e Vx de murinos das linhas de célula hibridoma que produzem o anticorpo monoclonal 11-1F4 de murino está esboçada na Figura 1.
[0035] Dois clones (B2C4 e B2D6) da linha de células hibridoma SP2/0 que produzem anticorpo monoclonal de cadeia leve 11-1F4 humano, foram gentilmente fornecidos por Alan Solomon, MD (Centro Médico da Universidade de Tennessee em Knoxville, TN). A linha de células hibridoma está disponível da American Type Culture Collection (acesso ATCC PTA-105). As linhas de células foram cultivadas usando meio DMEM suplementado com 20% (v/v) FBS, penicilina/estreptomicina e L-Glutamina. As células foram cultivadas até que uma contagem de célula viável total de 10º células foi atingida.
[0036] As células foram colhidas separadamente de cada clone como segue.
A linha de célula hibridoma de murinho cresceu em suspensão em um meio de cultura apropriado e em quantidade suficiente para fornecer uma contagem de célula viável total de cerca de 10º células. O subrenadante da cultura foi colhido e as células de hibridoma granulada em uma centrífuga de bancada (250 gq, 5 min). As células foram vagarosamente ressuspensas em 20 ml PBS e uma alíquota de 100 ul foi obtida para a contagem de células viável. As células na alíquota foram granuladas uma vez mais e 200 nl de PBS e 200 pl de azul de tripano foram adicionados aos 100 17nl de células e misturados vagarosamente. Pipetaram-se 10 pl desta mistura para uma lâmina descartável de contagem de célula e o número de células brancas 9 quadrados pequenos foi contado em um microscópio. As células azuis (isto é, células mortas) não foram contadas. O processo de contagem foi repetido, a média dos resultados e os resultados médio multiplicados por 9 x 10º para obter uma contagem de células viável para as células em 20ml de PBS. Uma vez colhidas células suficientes, elas foram ressuspensas em 10 ml de Solução D para isolamento de RNA (ver abaixo, kit de Isolamento de RNA Stratagene).
[0037] O RNA total foi então isolado separadamente das células de cada clone usando um kit de isolamento de RNA Stratagene, de acordo com as instruções de uso do fabricante. Um ml de acetato de sódio 2 M (pH 4,0) foi adicionado para a amostra e o conteúdo do tubo foi cuidadosamente misturado, invertendo repetidamente o tubo.
Ao tubo foi adicionado 10,0 ml de fenol (pH 5,3-5,7) e o conteúdo outra vez misturado cuidadosamente por inversão.
Para a mistura foi adicionado 2,0 ml de mistura de clorofórmio de álcool isoamílico, o tubo foi tampado e misturado vigorosamente por 10 segundos, e o tubo foi incubado em gelo por 15 minutos.
A amostra foi transferida para um tubo de centrífuga d 50-ml de fundo redondo, parede grossa que foi ré resfriado em gelo e o tubo foi girado em uma centrífuga a 10.000 x g por 20 minutos a 4ºC.
Duas fases eram visíveis no tubo depois da centrifugação.
A superior, fase aquosa continha o RNA, enquanto a fase fenol inferior e a interfase continham DNA e proteínas.
A fase aquosa superior, contendo RNA, foi transferida para um tubo de centrífuga novo e a fase fenol inferior foi descartada.
Um volume igual de isopropanol foi adicionado à fase aquosa e o conteúdo misturado por inversão, após o que o tubo foi incubado por 1 hora a -20ºC para precipitar o RNA.
O tubo foi girado em uma centrífuga a 10.000 x g por 20 minutos a 4ºC.
Após a centrifugação, o sedimento no fundo do tubo, que continha o RNA, foi removido e o sobrenadante descartado.
O sedimento foi dissolvido em 3,0 ml de solução D, 3,0 ml de isopropanol foi adicionado ao tubo e o conteúdo bem misturado.
Após o tubo ser incubado por 1 hora a -20ºC, foi girado outra vez na centrífuga a 10.000 x g por 10 minutos a 4ºC e o sobrenadante removido do tubo e descartado. (Nota: Até este ponto, o RNA foi protegido de ribonucleases pela presença de isotiocianato guanidina, mas a partir deste ponto não está mais protegido.) O sedimento foi lavado com 75% (v/v) etanol (DEPC-água tratada (25%)) e o sedimento foi secado sob vácuo por 2-3 minutos. O sedimento de RNA é ressuspenso em 0,5-2 ml de DEPC-água tratada.
[0038] Seguindo as instruções do fabricante, um kit de síntese da primeira fita de cDNA da Amersham Pharmacia Biotech foi empregado para produzir uma cópia de fita simples de DNA do 11-1F4 hibridoma mMRNA usando o não primer 1-a(T)** fornecido com o kit. Uma reação foi realizada para cada uma das duas amostras de RNA amostras isoladas, como segue. Os componentes usados foram: Massa da mistura da reação da primeira fita cDNA, Clonado da Transcriptase Reversa de FPLCpure" Murino, RNAguard", BSA, dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, 200 mM de solução aquosa DIT, não primer 1- a(r)* : 5' -d [AACTG G AAGAATTC G CGGCCGCAG GAAiL &]- 3' , e DEPC água tratada.
[0039] Aproximadamente 5 g de RNA total em 20 1pl de DEPC água foi aquecida para 65ºC por 10 minutos e depois resfriada em gelo. A massa da mistura da reação da primeira fita cDNA foi colocada gota a gota vagarosamente para obter uma suspensão uniforme e a reação configurada em um microtubo de centrifuga de 0,5 ml como segue. Solução de RNA desnaturado 20 nl, 11 pl massa da mistura da reação da primeira fita cDNA, 1 ul de não primer 1-d(T)18, e solução de 1 ul DTT para 33 pul de volume total. Os reagentes foram misturados vagarosamente por conta gota e incubados a 37ºC por 1 hora.
[0040] Os genes de região variável cadeia leve kappa e pesada de murino (V; genes e Vx genes, respectivamente) foram então amplificados por PCR a partir de ssDNA modelo usando o método descrito por Jones e Bendig (Bio/Technology 9:88) .
[0041] As reações de PCR foram preparadas para cada um dos primer específicos da sequência líder degenerada (MHVI - MHV12 para Vx e MKVI - MKVl 1 para Vx«) com o primer de região constante apropriado (uma mistura equimolar de MHCI -MHC3 para Vx, e MKC para Vx). As Tabelas 1 e 2 detalham os primeres usados para amplificar os genes de região Vx e Vx, respectivamente. No total, foram realizadasas reações de 12 cadeias pesadas e 11 reações de cadeia leve kappa. Polimerase AmpliTago DNA foi usada para amplificar o modelo CDNA em todos os casos, como segue.
[0042] A reação de síntese completada da primeira fita de CDNA foi aquecida a 90ºC por 5 minutos para desnaturar o duplo RNA-CDNA e inativar a transcriptase reversa e resfriada em gelo. Onze tubos de reação GeneAmp"" PCR foram marcados como MKV1-11. Para cada tubo foi preparada uma mistura de reação de 100 1nl, cada mistura de reação contendo 69,3 ul de água estéril, 10 pl de 10 X tampão II PCR, 6 ul de 25 mM MgCI,, 2 ul de cada um dos 10 mM soluções estoque de dNTPs, 2,5 pl de 10 mM MKC primer, 2,5 pl de um dos 10 mM de primer MKV e 1 ul de mistura modelo de RNA-CDNA. Para cada um dos tubos foi então adicionado 0,7 pl de DNA polimerase AmpliTagoê e mistura da reação completada sobreposta com 50 ul de óleo mineral.
[0043] Uma série similar de misturas de reação foi preparada como descrito acima para clonar por PCR o gene da região variável da cadeia pesada de camundongo. No entanto, desta vez doze tubos de reação foram marcados e um dos doze primeres MHV e o primer MHC apropriado foram adicionados a cada um. Isto é, para amplificar por PCR o gene de domínio variável de uma cadeia pesada yl de camundongo, por exemplo, foi utilizado o primer MHC.
[0044] Os tubos de reação foram carregados em uma cicladora térmica de DNA para ciclagem (após uma fusão inicial a 94ºC por 1,5 minutos) a 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto ao longo de 25 ciclos. O último ciclo foi seguido por uma etapa final de extensão a 72ºC por 10 minutos antes de resfriar para 4ºC. Exceto entre as etapas de anelamento (50ºC) e extensão (72ºC), quando um tempo de rampa prolongada de 2,5 minutos foi usado, um tempo de rampa de 30 segundos foi usado entre cada etapa do ciclo. Uma alíquota de 10 nl de cada reação PCR foi executada um gel tampão de agarose a 1% (p/v) /1 X TBE contendo 0,5 pg/ml de brometo de etídio para determinar qual dos primeres líderes produziu um produto PCR. Os clones de PCR positivo tinham cerca de 420-500 bp de tamanho.
[0045] O processo de amplificação por PCR acima foi repetido duas vezes mais e estas reações de PCR que pareciam amplificar o gene de domínio variável de tamanho completo foram selecionados. Uma alíquota 6 1pl de cada produto potencial de PCR foi clonado diretamente no vetor pCcR"" II fornecido pelo kit TA Cloningê, como descrito nas instruções do fabricante. Alíquotas de 10,0% (v/v), 1,0% (v/v) e 0.1 % (v/v) das células E.coli transformadas foram pipetadas em placas individuais de ágar LB de 90 mm de diâmetro contendo 50 pg/ml ampicilina, revestida com 25 ul da solução estoque X-Gal e 40 ul da solução estoque IPTG e incubada durante a noite a 37ºC.
Colônias positivas foram identificadas por triagem de PCR.
Tabela 1. Primeres PCR para clonagem de genes da região variável de cadeia leve kappa de camundongo Nome Sequência (5'->3') SEQ ID MICV1 (30mer) ATGAAGATTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG 1 MKV2 (30mer) ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG 2 MKV3 (30mer) ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGCGTTG 3 MKV4 (33mer) ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG 4 MKV5 (30mer) ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC 5 MKV6 (27mer) ATGAGGTKCYYTGYTSAYCTYCTCTGRGG 6 MKV7 (31lmer) ATGGGCWTCAAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG 7 MKV8 (25mer) ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATG 8 MKV9 (25mer) ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG 9 MKV10 (27mer) ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT 10 MKV11 (28mer) ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC 11 MKC (20mer) ACTGGATGGTGGGAAGATGG 12 Tabela 2. Primeres PCR para clonagem de genes da região variável de cadeia pesada de camundongo Nome Sequência (5'->3') SEQ ID MHVI (27mer) ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC 13 MHV2 (26mer) ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 14 MHV3 (27mer) ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT 15 MHV4 (25mer) ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT 16 MHV5 (30mer) ATGGGACTCCAGGCTTCAATTTAGTTTTCCTT 17 MHV6 (27mer) ATGGCTTGTCYTTRGSGCTRCTCTTCTGC 18 MHV7 (26mer) ATGGRATGGAGCKGGRGTCTTTMTCTT 19 MHV8 (23mer) ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 20 MHV9 (30mer) ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTTATTCCTG 21
MHV10 (27mer) ATGGGCAGACTTACCATTCTCATTCCTG 22 MHV11 (28mer) ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 23 MHV12 (27mer) ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 24 MHCG1 (21 mer) CAGTGGATAGACAGATGGGGG 25 MHCG2a (21 mer) CAGTGGATAGACCGATGGGGG 26 MHCG2b (21 mer) CAGTGGATGAGCTGATGGGGG 27 MHCG3 (21 mer) CAAGGGATAGACAGATGGGGC 28
[0046] Alíquotas de 5pl de cada reação de PCR foram executadas e um gel de agarose a 1% /TBE (pH 8,8) para determinar qual havia produzido um produto de PCR do tamanho correto (cerca de 450 bp). Os supostos produtos positivos de PCR identificados foram clonados diretamente no vetor pCR2.1 fornecido pelo kit TA Cloningê kit e transformados em células competentes TOP10 como descrito no protocolo do fabricante. As colônias que contém o plasmídeo com uma inserção de tamanho correto foram identificadas por rastreamento por PCR das colônias, utilizando os primeres oligonucleotídeo 1212 e 1233 (Tabela 3), de acordo com o método de Gussow e Clackson (Nucleic Acids Res. 17:4000). Estes supostos clones positivos identificados foram o DNA do plasmídeo de fita dupla sequenciado usando o ABI PRISM 310 Genetic Analyzer e o terminador ABI PRISM BigDye *. Três clones positivos foram sequenciados, cada um dos genes Vx e Vx do clone da linha de célula hibridoma B2C4, assim como quatro clones positivos do gene Vx e e seis do gene Vx do clone da linha de célula hibridoma B2D6.
Tabela 3. Primeres para triagem de PCR e sequenciamento colônias transformadas. Nome — Sequência(5'->3') SEQID
1212 (17mMer) — GTTTTCCCAGICACGEAC 29 1233 (21 mer) AGCGGATAATTTCACACAGGA 30
[0047] Os resultados das 12 reações PCR realizadas para cada clone hibridoma (B2C4 e BCD6) para amplificar o gene de região variável de cadeia pesada 11-1F4 de murino são apresentadas na Tabela 4(a).
[0048] O degenerado primer da sequência líder MHV7, em combinação com uma mistura dos primeres de região constante MHCGI-3 (Tabela 1), rendeu um produto de PCR de cerca de 600 bp a partir de cDNAs de modelo derivado de ambas as linhas de células hibridomas B2C4 e B2D6. Como essa banda tinha tamanho maior que o esperado para um gene Vx médio (450 bp), ele não foi mais investigado. Por outro lado, o iniciador degenerado da sequência primer MHV6, em combinação com uma mistura dos primeres da região constante MHCGI-3 (Tabela 1), rendeu um produto PCR do tamanho esperado (450 bp) para um gene V; do modelo derivado de CDNA a partir de ambas as linhas de células hibridomas B2C4 e B2D6.
Tabela 4. Resultados das amplificações de PCR realizadas para clonar os genes de região variável de cadeia pesada (a) e leve (b) do anticorpo monoclonal murino 11-1F4 a partir de SP2/0 linha de célula hibridomas B2C4 e B2D6. A coluna três contém um registro dos resultados reais da PCR. Onde uma banda foi observada para uma combinação particular de primeres, seu tamanho em pares de bases (bp) foi registrada no espaço apropriado.
(a)
MHCG1-3
MKV1 (mistura) MHCG1-3
MKV2 (mistura) MHCG1-3
MKV3 (mistura) MHCG1-3
MKV4 (mistura) MHCG1-3
MKV5 (mistura) MHCG1-3 450 450
MKV6 (mistura) MHCG1-3
MKV7 (mistura) MHCG1-3
MKV8 (mistura) MHCG1-3
MKV9 (mistura) MHCG1-3
MKV10 (mistura) MHCG1-3
MKV11 (mistura)
(b)
Ls | Lo = o | 2 | Lo j|
LEE Eos IO Eos Io Eos Ia Ecos Io Eos IO
LE Lo dj
[0049] A análise de sequência de três clones do produto PCR derivado de B2C4 e cinco clones do produto PCR derivado de B2D6 revelou uma única sequência de região variável de cadeia pesada (Figura 2).
[0050] A estratégia de clonagem usada (amplificação de todo o gene de região variável usando primeres que flanqueiam esta região, isto é, sequência líder e iniciadores específicos de sequência de região constante) permitiu que a sequência FR1l completa fosse identificada. Todos os oitos clones sequenciados tinham sequências idênticas nessa região (Figura 2).
[0051] Os resultados das reações de 11 PCR realizadas para cada clone de hibridoma (B2C4 e BCD6) para amplificar o gene de região variável da cadeia leve kappa 11-1F4 de murino são apresentados na Tabela 4(b).
[0052] O primer degenerado da sequência líder MKV6 em combinação com o primer da região constante MKC (Tabela 2), produziu um produto PCR de cerca de 200 pb a partir do modelo derivado apenas da linha de célula hibridoma B2C4. Uma vez que essa banda foi muito menor que o tamanho esperado para um gene Vx gene (450 bp), ela não foi mais investigada.
[0053] O primer degenerado da sequência líder MKV2, em combinação com o primer de região constante MKC (Tabela 2), produziu um produto PCR que foi menor que a banda esperada 450 bp, quando vista em um gel de agarose) a partir do modelo cDNA derivado a partir de ambas as linha de célula hibridomas B2C4 e B2D6. Em adição, a clonagem de Vx prévia encontrou-se que o primer MKV2 amplificava um pseudogene bem conhecida da cadeia leve kappa. Portanto, a análise da sequência de um clone de cada produto PCR foi realizada de modo a confirmar que este produto foi um pseudogene e não o gene 11-1F4 Vx murino. Esta análise de sequência revelou que este clone PCR era de fato o pseudogene.
[0054] Finalmente, o primer degenerado da sequência líder MKV1, em combinação com o primer região constante MKC (Tabela 1), produziu um produto PCR com cerca do tamanho esperado (450 bp) para um gene Vx, do modelo derivado do CDNA de ambas as linhas de células hibridomas B2C4 e B2D6.
[0055] A análise da sequência de três clones do produto PCR derivado de B2C4 e quatros clones do produto PCR derivado de B2D6 revelou uma única sequência de região variável de cadeia leve kappa que não pode ser identificada como um pseudogene.
[0056] Assim, o gene de região variável de cadeia pesada 11-1F4 foi clonado (usando primeres específicos da região constante e da sequência líder) a partir do mRNA do hibridoma e sequenciado.
[0057] Quando transladada, a sequência deu uma sequência de peptídeo TVSS. A análise de 122 genes V;x humanos reorganizados, registrados no banco de dados Kabat (Kabat et al. - Sequences of Proteins of Immunological Interest) revelou que 84% dessas sequências tinham uma sequência de peptídeo TVSS. Portanto, concluiu-se que o gene Vx isolado foi o da sequência correta do gene 11-1F4.
[0058] O gene da cadeia leve kappa da região variável 11-1 F4 de murino também foi clonada e sequenciada com sucesso, como sendo um gene pseudogene Vx não-funcional. Este pseudogene foi identificado pela primeira vez por Carroll et al (Molecular Immunology (1988) 25:991). A sequência surge a partir de um transcrito aberrante mRNA que está presente em todos os parceiros de fusão padrão derivado a partir do tumor original está fora do quadro, resultando em um códon de parada na posição 105.
[0059] É comum que células de linfóides ou hibridoma sintetizam mais do que um mRNA de imunoglobulina leve reorganizada. Esses mRNAs usualmente não são produtivos devido à presença de códons de terminação ou trocas de quadro que normalmente não são observados nos genes Vx funcionais. Esses pseudos mensageiros costumam apresentar grandes problemas, quando clonam genes de imunoglobulina de hibridomas, porque eles são substratos muito bons para o PCR da região V, apesar do fato de não codificarem polipeptíos funcionais.
[0060] A sequência do gene Vx 11-1F4 foi identificada após análise detalhada da sequência de sete clones de PCR separados, isolados a partir de dois produtos PCR diferentes para produzir a SEQ. ID NO: 36. Como todas as sequências eram idênticas, foi aceita como a sequência correta de região variável de cadeia leve kappall1-1F4.
[0061] Os genes das regiões V; e Vxk clonados foram utilizados para produzir o anticorpo monoclonal quimérico 11-1F4 humano-rato, que foi então analisado para confirmar a ligação específica para às fibrilas AL. EXEMPLO 2 Construção do anticorpo quimérico 11-1F4 (cl 1-1F4) humano- rato
[0062] De modo a permitir a expressão transitória dos genes de região variável Vi, Ee Vx 11-1F4 descrito acima em células de mamíferos como parte de um anticorpo quimérico de camundongo e humano, foi necessário para modificar as extremidades 5'- e 3'- usando especificamente primeres PCR projetados (Tabela 5). Os primeres de oligonucleotídeos F39836 e F39837 foram utilizados para modificar o gene Vx 11-1F4 por PCR, enquanto os primeres F39835 e F58933 foram utilizados para modificar o gene Vó, 11-1F4 por PCR. Os primeres posteriores (BAK) F39836 e F39835 introduziram um local de restrição HindIII, a um local de iniciação da translação Kozak, e uma sequência líder de imunoglobulina nas extremidades 5' dos genes Vx e Vx respectivamente. O primer oligonucleotídeo direto (FOR - Forward Oligonucleotide Primer) F39837 introduziu um local doador de encaixe e um local de restrição BamHI na extemidade 3' do gene Vx, enquanto o primer oligonucleotídeo direto (FOR - Forward Oligonucleotide Primer) F58933 anexou os primeiros 22 pares de bases do gene gama-1CH, do gene Vm. Tabela 5. Primeres Oligonucleotídeo usados para PCR modificar os genes de região variável de cadeia pesada e cadeia leve kappa 11-1F4.
F39835V, AAGCTTGCCGCCATGGCTGTCCTGGGGCTEC 31 e oco F58933 CCGATGGGCCCTTGETGGAGGCTGAGGAGACÇ 32 E os = F39836Vx AAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTA 33 e comem | F58937 GGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGT 34 Em eee
[0063] A sequência de consenso de Kozak é crucial para a translação eficiente de uma sequência de região variável (Kozak - J Mol Bio 1 96:947). Define o códon AUG correto a partir do qual um ribosome inicia a translação, e a base mais crítica é a adenina (ou menos preferencial, uma guanina) na posição -3, upstream do início do AUG.
[0064] A sequência líder da imunoglobulina assegura que o anticorpo expresso é secretado no meio e, portanto, é facilmente colhido e purificado. As sequências líderes utilizadas neste caso foram as sequências líderes Vx e VH
11-1F4 de murino clonada a partir de cDNA de hibridoma durante o processo de clonagem de Vz e Vx.
[0065] A sequência doadora de emenda é importante para a fixação correta no quadro da região variável de cadeia leve para sua região constante apropriada, separando assim o intron 1 30 bp Vx: CK. A região variável da cadeia pesada foi ligada diretamente ao seu gene da região constante apropriada por meio do local Apa, assim eliminando a necessidade de um local de doador de emenda.
[0066] Os locais de restrição de subclonagem HindIII e BamHI, e HindIII e Apal, respectivamente, agruparam os genes de região variável Vx e Vs modificados, enquanto o uso de diferentes locais de restrição único garantiu a subclonagem direcional no vetor de expressão em mamíferos apropriado.
[0067] O gene de região variável de cadeia leve 11-1F4 foi primeiro analisado cuidadosamente para identificar quaisquer locais doadores de emenda indesejáveis, locais aceitáveis de emenda de sequências Kozak (ver Tabela 6). Ambos os genes de região variável de cadeia leve e pesada foram analisados para a presença de quaisquer locais de restrição de subclonagem extra que posteriormente interferissem com a subclonagem e/ou expressão de anticorpo funcional total. Nenhum foi encontrado. Tabela 6 Sequências importantes para a expressão eficiente de genes de imunoglobulina em células de mamíferos. Nome Sequências de DNA de CO e
[FF REA Local de doador de emenda de |AC::GTRAGT
PP Local doador de emenda de cadeia | AG: : GTRAGT Pt sv Local aceitador de emenda de|YYYYYYYYYYNCAG::G
PSP MA As bases mostradas em negrito são consideradas para ser invariante dentro de cada sequência de consenso.
[0068] As reações de PCR separadas foram preparadas como segue, uma para cada gene de região variável. Os plasmídeos 11-1F4 VE.pCR2.1 e 11-1F4 Vx.pCR2.1 descritos acima foram utilizados como templates. Uma mistura de reação de 100 ul foi preparada em cada tubo PCR, cada mistura contendo até 41 ul de água estéril, 10 ul de 10 x tampão I de PCR 1,8 ul da solução estoque 10 mM de dadNTPs, 1 1ul de 10 mM de 5' primer direto, 1 pl do 10 mM 3' primer reverso e 1 1ul de uma diluição 1/10 do DNA templete. Finalmente, foram adicionados 0,5 1pl de polimerase de DNA AmpliTago (2,5 unidades antes de sobrepor a mistura de reação completa com 50 pl de óleo mineral. Os tubos de reação foram carregados em um ciclador térmico de DNA e ciclado (após uma fusão inicial a 94º C por 1 minuto) a 94ºC por 30 segundos, 68ºC por 30 segundos e 72ºC por 50 segundos durante 25 ciclos. A conclusão do último ciclo foi seguida por uma etapa final extensão a 72 C por 7 minutos antes do resfriamento para 4ºC. Uma alíquota de 10 pl de cada tubo de reação PCR foi realizado em um gel de 1,2% (p/v) de agarose/ 1 X tampão TBE contendo 0,5 ug/ml brometo de etídio para determine o tamanho e a presença de um produto de PCR. Os clones positivos de PCR tinham cerca de 420bp de tamanho. Os supostos produtos positivos para PCR identificados foram clonados diretamente no vetor pCR2.1 vetor, fornecido pelo kit Topo TA Cloninge, e transformados em células competentes TOP10 como descrito no protocolo do fabricante. As colônias contendo o id do plasma com uma inserção de tamanho correto, foram identificadas por rastreamento de PCR das colônias utilizando os primeres oligonucleotídicos 1212 e 1233 (Tabela 3) de acordo com o método de Gussow e Clackson. os clones se positivos putativos assim identificados foram id de DNA de plasmídeo de fita dupla sequenciado usando o Analisador Genético ABI PRISM 310 e o terminador ABI PRISM BigDye"". Dois clones positivos de cada um dos genes Vn e Vx clonados no Topo TA foram sequenciados.
[0069] Os clones, contendo os genes 11-1F4 V,;, e 11-1F4 Vx modificados corretamente, foram identificados e os genes V modificados a partir desses clones foram subclonados em seus respectivos vetores de expressão para facilitar a expressão de cadeias leves kappa e pesada quimérica em células mamíferas. O gene 1K-F4 Vx, modificado foi subclonado no vetor de expressão pKN100 (Figura 4) como um fragmento HindIII-BamHI; este vetor contém um gene de região constante kappa humano (alótipo: Km (3 Alal53, Serl191)). O gene 11-1F4 V; modificado foi também subclonado como um fragmento HindIII-Apal no vetor de expressão pGl D200 (Figura 5); este vetor continha um gene da região constante yl humana e (alótipo: Glm (-1 Glu377, Met381, -
2Ala462, 3 Arg222, Ser229)). Ambos os alótipos de região constante kappa e yl usados são comumente encontrados na população Caucasiana. As construções de expressão ligadas, 11-1F4VK.pKN100 e 11-1F4VH.pGl D200, foram então usadas para transformar células competentes DH5a, e os clones positivos foram identificados usando o método de triagem por PCR discutido acima com os primeres de modificação de originais PCR (Tabela 4). Os vetores de expressão estão prontamente disponíveis. EXEMPLO 3 Construção de um único supervetor para expressão de transiente de 11-1F4 quimérico em células COS.
[0070] Um único supervetor que expressa as ambas cadeias de imunoglobulina do anticorpo quimérico 11-1F4 foi construída da seguinte maneira. O cassete de expressão da cadeia leve kappa 1-1F4 (que continha o primer HCMVi, o gene de região variável de cadeia leve kappa 11-1F4, e o gene região constante de cadeia leve kappa) foi digerida com enzima de restrição (EcoRI nas posições 1 e 2490) do construtor 11- 1F4VK.pKN100 (Figura 4) e subsequentemente ligado ao construtor 11-1F4VHpGl D200 por meio do EcoRI único (posição 4297, Figura 5). Esta ligação resultou na construção de um construtor de supervetor, pGl KD200-11- 1F4, contendo ambas as cadeias leves kappa e pesada do anticorpo quimérico 11-1F4. EXEMPLO 4 Expressão de transiente completo de anticorpo quimérico vl/x.11-1F4 em células COS
[0071] o anticorpo quimérico 11-I1F4 foi expresso transientemente em células COS da European Collection of Cell Cultures (ECACC) de duas maneiras: (1) Por cotransfecção de l0pg de cada um dos construtores de vetor 11-1F4VK.pKN100 e 11-1F4VH.pG1 D200. As cotransfecções foram realizadas em duplicidade. único pGl KD200-11-1F4. As transfecções do supervetor foram realizadas cinco vezes.
[0072] O seguinte método de transfecção foi utilizado. A linha de células COS foi cultivada em DMEM suplementado com FCS 10% (v/v), 580 pg/ml L-glutamina e 50 Unidades/ml penicilina/ 50 pg/ml estreptomicina ("meio") em um frasco de 150 cm? até confluência. As células foram tripsinizadas, giradas em uma centrífuga de bancada (250 g por 5 minutos), depois ressuspensas em 6 ml de meio antes dividi-las igualmente entre frascos de 150 em?, cada um contendo 25 ml de meio fresco, pré-aquecido. as células foram incubadas durante a noite a 37ºC em 5% CO, e depois colhidas no dia seguinte enquanto ainda cresciam exponencialmente. Cada frasco continha aproximadamente 1 x 10' células. As células foram tripsinizadas novamente, sedimentadas como antes, e lavadas em 20 ml de PBS, após o que elas foram novamente ressuspensas em PBS suficiente para criar uma concentração de célula de 1x10' células/ml. 700 ul dessas células COS lavado foram pipetadas em uma cubeta Gene Pulser6, na qual foi então adicionado 1 pl de do DNA do vetor de expressão de ambas as cadeias leve kappa pesada (cada uma 10 g) ou 13vg do construtor de supervetor. Um pulso de capacitância 1900
Volt, 25 Farad foi entregue para a mistura usando o aparelho Bio-Rad Gene PulserO. A pulsação foi repetida para cada transfecção experimental e um controle "sem DNA" (no qual as células COS foram eletroporadas na ausência de qualquer DNA). Um controle positivo de um anticorpo previamente expresso também foi realizado para testar a eficiência das células COS.
[0073] Deixou-se recuperar as células COS à temperatura ambiente por 10 minutos, depois pipetou vagarosamente para uma placa de cultura de tecido com 10 cm diâmetro contendo 8 ml de DMEM pré aquecido suplementado com 10% (v/v) y - FBS sem globulina, 580 pg/ml de L-glutamina e 50 Unidades/ml de penicilina / 50 pg/ml estreptomicina e incubadas em 5% CO, a 37ºC por 72 horas antes de colher o sobrenadante de célula COS para análise. Após incubação por 72 horas, o meio foi coletado, girado para remover os resíduos de célula e analisado por ELISA, quanto à produção de anticorpo quimérico e ligação ao antígeno do anticorpo C1l1-1F4. EXEMPLO 5 Quantificação do anticorpo quimérico vl /x 11-1F4 via captura de ELISA
[0074] Após a expressão, foram quantificadas todas as moléculas IgG presentes no sobrenadante de célula COS utilizando um ensaio ELISA de captura. As moléculas IgG foram capturadas em uma placa Nunc-lmmuno MaxiSorb" plate através de um IgCl anti-humano de cabra imobilizado, anticorpo específico - fragmento Fey, e detectado via um anticorpo conjugado de peroxidase da cadeia leve kappa anti-humano.
Uma curva padrão foi gerada capturando e detectando concentrações conhecidas de um anticorpo IgG padrão na mesma placa da mesma maneira como segue.
Cada poço de uma imunoplaca de 96 poços foi revestido com alíquotas de 100 ul de anticorpo IgG anti-humano de cabra de 0,4 pg/ml diluído em PBS e incubado durante a noite a 4ºC.
O excesso de solução de revestimento foi removido e a placa foi lavada três vezes com 200 nl/poço de tampão de lavagem (1xPBS, 0,1% TWEEN). Em todos os poços, exceto nos poços da coluna 2, as linhas B a G, foram distribuídos 100pul de tampão SEC.
Uma solução de 1 pg/ml do anticorpo 1gG1l / kappa humano em tampão SEC foi preparada para servir como um padrão e foi pipitado 200 u1nl/poço nos poços da coluna 2, linhas B e C.
O meio das células COS transfectadas foi centrifugado (2509, 5 minutos), salvando o sobrenadante.
Uma alíquota de 200 ul dos sobrenadantes do controle "sem DNA" (na qual células COS foram transfectadas na ausência de DNA) foi pipetado no poço na coluna 2, linha D, e alíquotas de 200 ul /poço de supernadantes experimentais foram pipetados nos poços na coluna 2, linhas E, F e G.
As alíquotas de 200 nl nos poços da coluna 2, linhas B a G foram misturadas e em seguida 100 ul foi transferido de cada poço para o poço vizinho na coluna 3. Esse processo foi continuado para a coluna 11 com uma série de diluições de duas vezes das amostras padrão, controle e experimental, após as quais todas foram incubadas a 37ºC por 1 hora e todos os poços foram enxaguados seis vezes com alíquotas de 200 pl de tampão de lavagem.
O conjugado de peroxidase de cadeia leve kappa anti-humano de cabra foi diluído 5000 vezes em tampão SEC e 100 nl do conjugado diluído adicionado a cada poço, seguido por uma repetição das etapas de incubação e enxague. Para cada poço foi adicionado 150pl de substrato de K-BLUE, seguido por incubação no escuro a 25ºC por lOminutos. A reação foi interrompida pela adição de 50 pl de solução RED STOP para cada poço e a densidade ótica foi lida a 655nm. EXEMPLO 6 Análise da ligação de anticorpo quimérico 11-1F4n
[0075] O anticorpo quimérico 11-1F4 foi testado quanto a ligação para fibrilas de amiloides, usando um ensaio ELISA de ligação direta. As fibrilas sintéticas foram formadas a partir de uma proteína de cadeia leve de imunoglobulina e usadas para monitorar a reatividade do anticorpo em um ensaio baseado em ELISA no estado sólido, usando placas de polietileno de "baixa ligação" (Costar, t 3474). Imediatamente antes do revestimento da placa, uma massa de 250 ug de fibrilas foi diluída para 1 ml com tampão de revestimento (Albumina sérica bovina a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato pH 7,5). A amostra foi então sonicada por 20 segundos usando uma sonda sonora Tekmar Sonic Disruptor, com a potência definida em 40% do máximo, resultando em uma solução de fibrilas curtas compostas de até 2-5 protofilimentos cada. Esta solução foi então diluída para 5 ml, bem misturada por vórtice e dividida em alíquotas nos poços da placa. Este processo rendeu 50 ul de solução de fibrila tendo uma concentração de 50 ug/ml em cada poço. A placa foi então secada durante a noite, colocada descoberta em uma incubadora a 37ºC.
[0076] O ensaio ELISA foi então realizado da seguinte maneira dentro de 48 horas após a preparação da placa. Os poços foram bloqueados pela adição de 100 pl de 1% BSA em PBS e incubada por ll hora a temperatura ambiente em um agitador. A placa foi lavada 3 vezes em PBS, Tween 20 a 0,05% (v/v). A cada poço da placa foi adicionado 50 ul de uma solução de Cl1-1F4 (anticorpo 3Mg/ml em 0,1% BSA/PBS) e a placa foi incubada á temperatura ambiente por 1 hora em um agitador. A placa foi novamente lavada três vezes (como antes) e a detecção do anticorpo ligado foi realizada, utilizando um anticorpo IgG biotinilatado anti-rato de cabra (Sigmat B-8774, cadeia leve e anti-pesada). Resultados
[0077] a análise de sequência dos genes V; e Vx modificados com sucesso revelou que a sequência correta estava presente. Sequências detalhadas de DNA e aminoácido dos genes Vk e Vx" 11-1F4 modificados são apresentados nas Figuras 3 e 4. Os genes Vx e V; modificados foram clonados com sucesso nos vetores de expressão de mamíferos pGl D200 e pKN100 respectivamente, e os construtores resultantes de 11-1F4VK.pKN100 e 11-1F4VHpGl D200 foram usados para cotransfecção de células de mamíferos.
[0078] Os construtores 11-1F4VK.pKN100 e 11-1F4VHpGl1 D200 também foram subsequentemente usados para construir um único supervetor (pGl KD200-11-1F4), que expressava oO anticorpo e quimérico 11-1F4 em células de mamíferos. Os níveis de expressão do anticorpo 11-1 F4 quimérico, tanto de cotransfecções como de transfecções de supervetores de células ECACC COS foram analisados. Os níveis de expressão observados nas transfecções do supervetor pGl KD200-11-1F4 (10326 ng/ml) foram 3,7 vezes superiores aos níveis observados nas cotransfecções correspondentes dos construtores 11-1F4VK.pKN1I00 e 11-1F4VHpGl D200 (2820 ng/ml).
[0079] Após expressão e quantificação, o anticorpo quimérico 11-1F4 foi testado, quanto à ligação ao antígeno alvo (fibrilas de amiloides gentilmente fornecidos pelo NCI) por ELISA de ligação direta. Os resultados do ELISA de ligação são apresentados na Figura 8. Os supernadantes das duas melhores transfecções individuais do supervetor pGl KD200-11-1F4 foram analisados em paralelo com um sobrenadante da correspondente cotransfecção.
[0080] Os resultados indicaram que o anticorpo quimérico 11-1F4 se ligavam às fibrilas de amiloides com uma afinidade mais alta do que seu equivalente murino. Este resultado é surpreendente e inesperado, porque normalmente seria esperado que um anticorpo quimérico tivesse uma afinidade de ligação comparável ao anticorpo murino original. Sem pretender ficar vinculado a um mecanismo particular, os inventores acreditam que é possível que o efeito líquido de combinar as regiões 11-1F4 murinas V com as regiões humanas yvl/xK C usadas para criar o anticorpo quimérico 11-1F4 produziu um anticorpo de maior afinidade.
[0081] Na descrição e reivindicações desta especificação, a palavra "compreender" e variações dessa palavra, tal como "compreende" e "compreendendo" não se destinam a excluir outras características, aditivos, componentes, número inteiro ou etapas, a menos que seja indicado de outra forma explicitamente, o escopo dessas palavras deve ser interpretada de maneira ampla, de modo que elas tenham um significado inclusivo e não exclusivo.
[0082] Embora as composições e métodos da invenção tenham sido descritos na presente divulgação por meio de exemplos ilustrativos, deve ser entendido que a invenção não está limitada a estas e que variações podem ser feitas como são conhecidas pelos experientes na matéria sem se afastar dos ensinamentos da invenção definidos pelas reivindicações anexas.
Claims (22)
1. Anticorpo quimérico de camundongo e humano caracterizado por: compreender a região VK da SEQ ID NO: 47 e a região VH da SEQ ID NO: 48.
2. Anticorpo quimérico de camundongo e humano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: o anticorpo se ligar a um epítopo expresso pela configuração em folha plissada B de fibrilas amilóides com maior afinidade do que o anticorpo de camundongo que compreende a região VK da SEQ ID NO: 36 e a região VH da SEQ ID NO: 35.
3. Composição farmacêutica caracterizado por compreender o anticorpo da reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Um método de tratamento de uma doença de deposição de amilóide em um paciente humano necessitado de tal tratamento caracterizado por por compreender administrar ao paciente o anticorpo da reivindicação 1 em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável, em uma quantidade eficaz para tratar a referida doença de deposição de amilóide.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por: a doença de deposição de amilóide é amiloidose primária.
6. Um método de produção de um anticorpo quimérico caracterizado por:
compreender a co-transfecção em células de mamífero do vetor constrói 111F4VK.pKN100 e 11-F4VH.pG1D200 ou transfecção em células de mamífero da construção supervetora pG1KD200-11-1F4.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por: a co-transfecção da construção do vetor 11- 1F4VK.pKN100 e 11F4VH.pG1D200 ou transfecção de uma construção supervetora pG1KD200-111F4 ocorrer em células COS.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por: compreender a co-transfecção das construções dos vetores 111F4VK.pKN100 e 11-F4VH.pG1D200.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por: compreender a transfecção da construção supervetora PG1IKD200-11-1F4.
10. O método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: compreender a cotransfecção das construções dos vetores 11-1F4VK.pKN100 e 11F4VH.pG1D200.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: compreender a transfecção da construção supervetora PGIKD200-11-1F4.
12. Uma construção vetorial selecionada do grupo caracterizada por:
consistir em 11-1F4VK.pKN100, 11-1F4VHpPG1D200 e PG1KD20011-1F4.
13. Construção de vetor de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por: ser 111F4VK.pKN100.
14. Construção de vetor da reivindicação 12, caracterizada por: ser 111F4VHpG1D200.
15. Construção de vetor de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por: ser pGl KD200-11-1F4.
16. Método para detectar a presença de depósitos amilóides em um paciente suspeito de ter esses depósitos, caracterizado por: compreender administrar ao paciente uma quantidade do anticorpo da reivindicação 1, com uma etiqueta detectável anexada ao mesmo, sendo a quantidade de anticorpo administrada suficiente para permitir a detecção de depósitos amilóides, se houver.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por: o rótulo detectável ser de 1241.
18. Anticorpo quimérico de camundongo e humano caracterizado por: ser produzido pelo método da reivindicação 6.
19. Anticorpo quimérico de camundongo e humano caracterizado por: ser produzido pelo método da reivindicação 8.
20. Anticorpo quimérico de camundongo e humano caracterizado por: ser produzido pelo método da reivindicação 9.
21. Polipeptídeo caracterizado por: ser selecionado de SEQ. ID NO: 47 e SEQ. ID NO: 48.
22. Polinucleotídeo caracterizado por: ser selecionado de SEQ. ID NO: 42 e SEQ ID NO: 45.
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