KR20200022479A - 아밀로이드 침착 질환의 치료를 위한 키메라 항체 - Google Patents
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Abstract
아밀로이드 침착 질환의 치료를 위한 키메라 마우스-인간 항체, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 상기 항체의 생산을 위한 방법 및 재료, 및 상기 항체 및 약학적 조성물을 사용하여 아밀로이드 침착 질환을 치료하는 방법.
Description
EFS-WEB에 의해 제출된 서열목록에 대한 언급
크기가 15.6 kb인 "8441-0004-1_ST25"라는 명칭의 서열목록의 ASCII 텍스트 파일의 내용은 2018년 6월 4일에 작성되었으며 본 출원과 함께 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었고, 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다.
우선권 청구
본 출원은 2017년 6월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/526,835호의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다.
정부의 권리
본 발명은 사이언스 어플리케이션즈 인터네셔날 코오포레이션-프레더릭 (Science Applications International Corporation-Frederick)에 의해 수여된 Contact 20XS094A 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 따라서, 미국 정부는 본 명세서에 설명되고 청구된 본 발명에 대한 특정 권리를 가질 수 있다.
발명의 분야
본 발명은 아밀로이드 침착 질환, 특히 원발성(AL) 아밀로이드증을 치료하는 데 유용한 키메라 마우스-인간 항체, 이러한 항체를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 항체의 생산을 위한 방법 및 재료, 및 상기 항체 및 약학적 조성물을 사용하여 아밀로이드 침착 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
천연 항체는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 중쇄 사이의 추가 이황화 결합의 수는 상이한 항체 이소타입(isotype)에 따라 다양하다. 가장 간단한 이소타입은 단지 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 포함하는 IgG이며, 여기서 2개의 중쇄는 2개의 이황화 결합에 의해 연결된다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)과 함께 다수의 인접한 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 항체 내의 경쇄 및 중쇄의 각 가변 도메인은 상보성 결정 영역("CDR") 또는 초가변 영역이라 불리는 3개의 세그먼트를 포함한다. 경쇄의 각 CDR은 인접한 중쇄의 상응하는 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성한다. 경쇄에는 이의 불변 영역에 따라 2가지 주요 유형, κ 및 λ이 있다. κ 경쇄와 λ 경쇄 둘 다는 상이한 중쇄 유형 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
원발성 아밀로이드증으로도 불리는 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증(AL 아밀로이드증)은 미국에서 가장 흔한 형태의 전신 아밀로이드증이다. 용어 "아밀로이드증"은 공통의 특징, 즉 장기 및 조직 내의 병리학적 불용성 원섬유 단백질의 세포외 침착을 공유하는 질환의 군집을 지칭한다(Rodney, et al. - NEJM, 25: 898). 아밀로이드증은 응집되어 장기와 조직 내에 불용성 아밀로이드 침착물을 형성하는 비정상적인 단백질 섬유의 생성을 유발하는 사람의 항체-생산 세포의 기능장애에 의해 유발된다. 아밀로이드증의 유형은 원섬유 침착물을 형성하는 전구체 단백질의 성질에 의해 결정된다. 원발성 아밀로이드증(AL)에서 원섬유는 면역글로불린 경쇄의 단편을 포함하고, 2차 아밀로이드증에서 원섬유는 아밀로이드 A 단백질을 포함한다. 아밀로이드증의 현대적 분류는 원섬유 침착물을 형성하는 전구체 혈장 단백질의 성질에 기초한다.
전구체 혈장 단백질들은 다양하고 관련이 없다. 그럼에도 불구하고, 모든 전구체 침착물은 공통의 전형적인 β-플리티드 쉬트(β-pleated sheet) 입체배치를 공유하는 아밀로이드 침착물을 생성하는데, 이는 원섬유 침착물의 전형적인 염색 특성을 담당한다. 아밀로이드증 발병의 마지막 단계는 환자의 장기에 아밀로이드 원섬유가 침착되는 것이다. 아밀로이드증의 사망률은 높으며 현재 5년 생존율은 약 28%이다.
현재까지, AL의 치료는 종래의 또는 고용량 세포독성 화학요법을 통해 기능장애 세포를 공격함으로써 아밀로이드생성(amyloidogenic) 전구체 경쇄의 합성을 감소시키는 것을 지향하였다. 이러한 치료에는 두 가지 단점이 있다. 첫째, 원섬유 침착물은 상당한 침착이 일어날 때까지 종종 무증상성이다. 따라서, 상당량의 침착물이 이미 발생하기 전에는 치료가 수행되지 않을 수 있다. 둘째, 이러한 치료는 기껏해야 전구체 비정상 단백질의 생성을 정지시키는데만 효과적이고 기존 침착물을 제거하지 않기 때문에, AL 환자에 대한 예후는 병리학적 침착물의 지속성(또는 진행성)으로 인해 매우 열악하게 남아있다(Solomon, et al. - Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:269).
최근의 동물 연구는 AL 원섬유에 존재하는 β-플리티드 쉬트 입체배치에 공통적인 에피토프에 대한 뮤린(murine) 11-1F4 항체 및 다른 뮤린 항-인간 경쇄 특이적 항체의 투여가 인간 ALκ 및 ALλ 아밀로이드 침착물의 완전한 분해를 야기한다는 것을 보여주었다. 이들 뮤린 항체 중 일부는 그 전문이 본 명세서에 참조로 인용되는 미국 특허 제8,105,594호에 기재되어 있다.
수용하는 종이 뮤린 항체를 항원성으로서 인식하고 이에 대한 항체를 생성 할 것이기 때문에, 뮤린 항체는 일반적으로 다른 동물 종(예컨대 인간)에 투여하기에 부적합하다. 다른 종에 주사될 때 한 종으로부터의 항체의 항원성은 정상적으로는 불변 도메인의 일부분에 의해 야기된다. 이러한 항원 반응은 뮤린 항체의 원하는 치료 효과를 방해하거나 방지할 것이다. 인간에서 이러한 항원 반응은 인간 항-마우스 항체(HAMA)라 불린다. '594 특허에 기재된 항체는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 통해 인간에서 면역원성이 높을 잠재성을 갖는다. HAMA 반응은 일반적으로 인간 수용자로부터 마우스 항체의 신속한 제거(clearance)를 초래하기 때문에, HAMA는 뮤린 항체가 가질 수 있는 임의의 잠재적인 인간 치료 이점을 심각하게 제한할 것이다. 따라서, 이들 뮤린 항체는 환자에서 아밀로이드 원섬유의 침착을 정지시키거나 역전시키기 위해 환자에게 투여하기에 적합하지 않으며, 인간에서 낮은 면역원성을 가지는 아밀로이드 침착 질환에 대한 항체 치료법이 필요하다.
본 발명의 일 실시형태는 아밀로이드 침착 질환, 특히 원발성(AL) 아밀로이드증의 치료에 유용한 키메라 마우스-인간 항체이다.
본 발명의 다른 실시형태는 키메라 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 폴리뉴클레오티드 서열 및 벡터 작제물을 포함하는 이러한 항체를 생산하기 위한 방법 및 재료이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 원발성(AL) 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 침착 질환의 증상의 치료 또는 개선이 필요한 인간 환자에게 상기 아밀로이드 침착 질환의 증상을 치료 또는 개선하기에 유효한 이러한 항체 중 적어도 하나의 유효량을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여함으로써, 원발성(AL) 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 침착 질환의 증상의 치료가 필요한 인간에서 원발성(AL) 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 침착 질환의 증상을 치료하거나 개선하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 표지된 항체를 투여하고 아밀로이드 침착 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 표지의 존재를 검출함으로써 상기 환자에서 아밀로이드 침착 질환을 검출하는 방법이다. 표지는 124I와 같은 방사성 표지일 수 있지만, 다른 종류의 표지가 당업자에 의해 쉽게 구상될 수 있다. 이러한 실시형태에는 표지된 항체 자체가 포함된다.
도 1은 하이브리도마 세포주로부터 뮤린 VH 및 VK 유전자를 클로닝하는데 사용된 전략을 요약한 것이다.
도 2는 각각 뮤린 11-1F4 항체 VH 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열의 목록, 서열번호 39 및 서열번호 35이다.
도 3은 각각 뮤린 11-1F4 항체 VK 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열의 목록, 서열번호 40 및 서열번호 36이다.
도 4는 면역글로불린 카파 경쇄 발현 벡터 pKN100의 지도이다. 이것은 SV40 조기 및 불완전(crippled) SV40 후기 프로모터, SV40 오리진 및 Co1E1 오리진을 갖는 pSV2 벡터 단편으로 이루어진다. 이것은 또한 암피실린 내성 유전자 및 neo 유전자를 갖는다. 불완전 SV40 후기 프로모터는 neo 유전자를 구동한다. 이것은 또한 HCMVi 프로모터, 면역글로불린 가변 영역 유전자의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(BamHI 및 HindIII 제한 부위를 함유), 및 카파 경쇄 발현 카세트와 동일한 배향으로 있는 spaC2 종결 신호 서열("Arnie")로 종결되는 인간 카파 불변 영역 유전자에 대한 cDNA를 갖는다.
도 5는 면역글로불린 감마 1 중쇄 발현 벡터 pG1D200의 지도이다. 이것은 SV40 조기 및 불완전 SV40 후기 프로모터, SV40 오리진 및 Co1E1 오리진을 갖는 pSV2dhfr 벡터 단편으로 이루어진다. 이것은 또한 암피실린 내성 유전자 및 dhfr 유전자를 갖는다. 불완전 SV40 후기 프로모터는 dhfr 유전자를 구동한다. 결과적으로, 발현이 열악하여, 비교적 낮은 수준의 메토트렉세이트를 사용하여 다중 유전자/고 발현 수준 클론을 선택할 수 있다. 이것은 또한 HCMVi 프로모터 단편, 다중 클로닝 부위, 인간 감마 1 불변 영역 유전자(인트론 마이너스)에 대한 cDNA를 가지며 그 뒤에 spaC2 종결 신호 서열("Amie")이 이어진다.
도 6은 변형된 뮤린 11-1F4 항체 VK 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열(각각 서열번호 42 및 서열번호 47) 및 VK 유전자를 변형시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열(각각 서열번호 41 및 서열번호 43)뿐만 아니라 리더를 갖는 DNA 서열(서열번호 37)의 목록이다.
도 7은 변형된 뮤린 11-1F4 항체 VH 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 45 및 서열번호 48) 및 VH 유전자를 변형시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열(각각 서열번호 44 및 서열번호 46)뿐만 아니라 리더를 갖는 DNA 서열(서열번호 38)의 목록이다.
도 8은 아밀로이드 원섬유 결합 ELISA 분석 결과의 그래프 표현이다. 키메라 11-1F4 항체를 함유하는 cos 세포 상청액을 정제된 뮤린 11-1F4 항체와 함께 동일한 ELISA 플레이트에서 개별적으로 시험하였다. 흡광도는 OD405에서 판독하였다.
새로운 sv = pG1KD200-11-1F4.
새로운 공동형질감염 = 11-1F4VHpG1D200 + 11-1F4VK.pKN100.
도 2는 각각 뮤린 11-1F4 항체 VH 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열의 목록, 서열번호 39 및 서열번호 35이다.
도 3은 각각 뮤린 11-1F4 항체 VK 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열의 목록, 서열번호 40 및 서열번호 36이다.
도 4는 면역글로불린 카파 경쇄 발현 벡터 pKN100의 지도이다. 이것은 SV40 조기 및 불완전(crippled) SV40 후기 프로모터, SV40 오리진 및 Co1E1 오리진을 갖는 pSV2 벡터 단편으로 이루어진다. 이것은 또한 암피실린 내성 유전자 및 neo 유전자를 갖는다. 불완전 SV40 후기 프로모터는 neo 유전자를 구동한다. 이것은 또한 HCMVi 프로모터, 면역글로불린 가변 영역 유전자의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(BamHI 및 HindIII 제한 부위를 함유), 및 카파 경쇄 발현 카세트와 동일한 배향으로 있는 spaC2 종결 신호 서열("Arnie")로 종결되는 인간 카파 불변 영역 유전자에 대한 cDNA를 갖는다.
도 5는 면역글로불린 감마 1 중쇄 발현 벡터 pG1D200의 지도이다. 이것은 SV40 조기 및 불완전 SV40 후기 프로모터, SV40 오리진 및 Co1E1 오리진을 갖는 pSV2dhfr 벡터 단편으로 이루어진다. 이것은 또한 암피실린 내성 유전자 및 dhfr 유전자를 갖는다. 불완전 SV40 후기 프로모터는 dhfr 유전자를 구동한다. 결과적으로, 발현이 열악하여, 비교적 낮은 수준의 메토트렉세이트를 사용하여 다중 유전자/고 발현 수준 클론을 선택할 수 있다. 이것은 또한 HCMVi 프로모터 단편, 다중 클로닝 부위, 인간 감마 1 불변 영역 유전자(인트론 마이너스)에 대한 cDNA를 가지며 그 뒤에 spaC2 종결 신호 서열("Amie")이 이어진다.
도 6은 변형된 뮤린 11-1F4 항체 VK 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열(각각 서열번호 42 및 서열번호 47) 및 VK 유전자를 변형시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열(각각 서열번호 41 및 서열번호 43)뿐만 아니라 리더를 갖는 DNA 서열(서열번호 37)의 목록이다.
도 7은 변형된 뮤린 11-1F4 항체 VH 영역 유전자의 DNA 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 45 및 서열번호 48) 및 VH 유전자를 변형시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열(각각 서열번호 44 및 서열번호 46)뿐만 아니라 리더를 갖는 DNA 서열(서열번호 38)의 목록이다.
도 8은 아밀로이드 원섬유 결합 ELISA 분석 결과의 그래프 표현이다. 키메라 11-1F4 항체를 함유하는 cos 세포 상청액을 정제된 뮤린 11-1F4 항체와 함께 동일한 ELISA 플레이트에서 개별적으로 시험하였다. 흡광도는 OD405에서 판독하였다.
새로운 sv = pG1KD200-11-1F4.
새로운 공동형질감염 = 11-1F4VHpG1D200 + 11-1F4VK.pKN100.
본 발명에 따르면, 아밀로이드 침착 질환의 증상을 치료 또는 개선하기 위해 아밀로이드 침착 질환을 앓고 있는 인간에게 투여하기에 유용한 키메라 마우스-인간 항체가 제공된다. 본 발명의 키메라 항체는 아밀로이드 침착물에 결합하고 HAMA 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않으면서 환자의 면역계를 활성화시켜 결합된 물질을 제거한다. 본 발명은 또한 상기 키메라 항체 중 적어도 하나 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물, 이들 항체를 생산하기 위한 방법 및 재료, 및 아밀로이드증을 앓는 환자에게 상기 환자의 장기로부터 아밀로이드 침착물의 적어도 일부를 제거하여 아밀로이드중의 증상을 치료 또는 개선하기에 유효한 양의 키메라 항체를 투여함으로써 상기 환자의 증상을 치료하거나 개선하는 양의 방법을 제공한다.
본 발명에서, 적어도 하나의 키메라 항체는 아밀로이드증을 앓고 있는 인간 환자에게 투여되어 상기 환자의 장기에 침착된 아밀로이드 원섬유의 적어도 일부의 분해 및 제거를 촉진한다. 치료적 유효량의 항체는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에게 익히 공지되어 있다. 의료 분야의 숙련가들이 잘 이해하는 바와 같이, 전형적인 투여 경로는 비경구(예를 들어, 정맥내)이다. 다른 투여 경로도 물론 가능하다. 투여는 단일 또는 다중 용량에 의한 것일 수 있다. 투여되는 항체의 양 및 투약 빈도는 의사에 의해 특정 환자에 맞게 최적화될 수 있다.
환자에게 투여되는 치료적 유효량의 항체는 (단일 용량으로 투여되든 다중 용량으로 투여되든) 환자에서 침착된 아밀로이드 원섬유의 양을 감소시키기에 충분해야 한다. 이러한 치료적 유효량은 환자의 증상 변화를 평가하거나 침착된 아밀로이드 원섬유의 양의 변화를 평가함으로써(예를 들어, 124I 태그된 항체를 사용하여 침착된 아밀로이드 침착물의 방사면역 검출에 의해) 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 표지된 항체는 질환을 앓는 것으로 의심되는 환자에서 아밀로이드 침착 질환의 존재를 검출하고 치료 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 항체를 생산하기 위해, 미국 특허 8,105,594에 기재된 뮤린 11-1F4 모노클로날 항체 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 유전자를 포유동물 세포에서 키메라 11-1F4 항체의 발현을 촉진시키기 위해 PCR 변형시켰다. 변형된 가변 영역 유전자의 상세한 서열 분석을 수행하였다. 변형된 가변 영역 유전자를 적절한 포유동물 발현 벡터에 클로닝하여 작제물 11-1F4VHpG1D200 및 11-1F4VK.pKN100을 생성하였다. EcoRI 제한 효소 분해 및 연결에 의해 11-1F4VHpG1D200 및 11-IF4VK.pKN100 작제물로부터 단일 수퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4를 제조하였다. 마지막으로, 키메라 11-1F4 항체를 공동형질감염 및 단일 슈퍼벡터 형질감염 둘 다에 의해 COS 세포에서 일시적으로 발현시켰다. COS 세포가 편의상 공동형질감염 또는 형질감염을 위해 선택되었지만, 당업자는 다른 포유동물 세포주가 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 아밀로이드 원섬유에 대한 키메라 11-1F4 항체의 결합 능력의 특성규명은 직접 결합 ELISA에 의해 결정하였다. 예상치 못하게 그리고 유리하게도, 키메라 11-1F4 항체는 뮤린 11-1F4 항체보다 높은 친화도로 아밀로이드 원 섬유에 결합하였다.
본 발명의 항체는 서열번호 47의 VK 영역 및 서열번호 48의 VH 영역을 포함하는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 아밀로이드 원섬유의 β-플리티드 쉬트 입체배치에 의해 발현된 에피토프에 결합한다. 더욱이, 놀랍게도 상기 항체는 서열번호 36의 VK 영역 및 서열번호 35의 VH 영역을 포함하는, 이것이 유래된 11-1F4 마우스 항체보다 높은 친화도로 이 에피토프에 결합한다. 본 발명은 아밀로이드 침착 질환의 치료가 필요한 인간 환자에서 아밀로이드 침착 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 약학적으로 허용되는 담체 중의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 투여되는 항체의 양은 환자의 조직에 침착된 아밀로이드 원섬유의 양을 감소시키는 데 효과적이어야 한다. 항체 조성물은 임의의 통상적인 투여 경로에 의해 투여될 수 있지만, 비경구 투여(예컨대 정맥내)가 바람직하다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 적합한 것은 의료 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 아밀로이드 침착 질환은 바람직하게는 원발성(AL) 아밀로이드증이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하기 위한 방법 및 재료를 포함한다. 본 발명의 항체를 생산하는 데 유용한 재료는 각각 도 5 및 6에 도시된 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200으로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터 작제물 및 상기 2가지 작제물로부터 제조된 슈퍼작제물(superconstruct) pG.1KD20011-1F4를 포함한다. 다른 유용한 재료는 변형된 뮤린 11-1F4 항체 VK 영역 유전자(서열번호 42) 및 변형된 11-1F4 항체 VH 영역 유전자(서열번호 45)뿐만 아니라 각각의 프라이머 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 46을 포함한다. 본 발명의 항체는 COS(중국 햄스터 난소) 세포와 같은 적합한 포유동물 숙주 세포에서 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200 또는 슈퍼작제물 pG.1KD20011-1F4을 공동형질감염시켜 제조할 수 있다.
약어
둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium: DMEM), 소 태아 혈청(FBS), 리보핵산(RNA); 메신저 RNA(mRNA); 데옥시리보핵산(DNA); 카피 DNA(cDNA); 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); 분(min); 초(sec); Tris-보레이트 완충액(TBE).
아미노산은 다음과 같이 IUPAC 약어로 표시된다: 알라닌(Ala A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 발린(Val; V). 뉴클레오티드에 대해 유사하게: 아데닌(a), 시토신(c), 구아닌(g), 티민(t), 우라실(u) ,아데닌 또는 구아닌(r), 시토신 또는 티민(y), 구아닌 또는 시토신(s), 아데닌 또는 티민(w), 구아닌 또는 티민(k), 아데닌 또는 시토신(m), 시토신 또는 구아닌 또는 티민(b), 아데닌 또는 구아닌 또는 티민(d), 아데닌 또는 시토신 또는 티민(h), 아데닌 또는 시토신 또는 구아닌(v) 및 임의의 염기(n).
실시예 1
마우스 11-1F4 항체의 PCR 클로닝 및 DNA 시퀀싱
뮤린 11-1F4 단클론 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 PCR 클로닝하고 단리된 모든 가변 영역 유전자(위(pseudo) 및 기능성)의 상세한 서열 분석을 수행하였다. 뮤린 11-1F4 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 상세한 DNA 및 아미노산 서열을 수득하였다.
재료
배지 성분 및 다른 모든 조직 배양 재료는 Life Technologies(UK)로부터 입수하였다. RNA 용액 키트는 Stratagene(미국)에서 입수한 한편, 제1 가닥 cDNA 합성 키트는 Pharmacia(영국)에서 구입하였다. AmpliTaq® DNA 폴리머라제를 포함하여 RCR 반응을 위한 모든 성분과 장비는 Perkin Elmer(미국)에서 구입하였다. TOPO TA Cloning® 키트는 Invitrogen(미국)에서 구입하였다. 아가로스(UltraPure™)는 Life Technologies(영국)에서 입수하였다. ABI PRISM® Big Dye™ 터미네이터 사이클 시퀀싱 준비 반응 키트 사전혼합 사이클 시퀀싱 키트 및 ABI PRISM® 310 시퀀싱 기기는 모두 PE Applied Biosystems(미국)에서 구입하였다. 다른 모든 분자생물학적 생성물은 New England Biolabs(미국) 및 Promega(미국)에서 입수하였다.
방법
뮤린 단클론 항체 11-1F4를 생성하는 하이브리도마 세포주로부터 뮤린 VH 및 VK 유전자를 PCR 클로닝하는 데 사용된 전략은 도 1에 요약되어 있다.
α- 인간 경쇄 단클론 항체 11-1F4를 생성하는 SP2/0 하이브리도마 세포주의 2가지의 클론(B2C4 및 B2D6)은 Alan Solomon, MD(테네시주 녹스빌 대학교 테네시 메디컬 센터 대학)에 의해 친절하게 제공되었다. 하이브리도마 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC 수탁번호 PTA-105)으로부터 이용가능하다. 세포주는 20%(v/v) FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 108개 세포의 총 생존 세포 계수에 도달할 때까지 세포를 배양하였다.
세포를 다음과 같이 각 클론으로부터 개별적으로 수거하였다. 마우스 하이브리도마 세포주를 적절한 배양 배지에서 약 108개 세포의 총 생존 세포 계수를 제공하기에 충분한 양으로 현탁액 중에서 성장시켰다. 배양 상청액을 수거하고 하이브리도마 세포를 벤치탑 원심분리기(250 g, 5분)에서 펠릿화하였다. 세포를 20 ml PBS에 온화하게 재현탁시키고 생존 세포 계수에 대해 100 ㎕ 분취량을 취하였다. 분취량 중의 세포를 1회 더 펠렛화하고, 200㎕의 PBS 및 200㎕의 트리판 블루를 100㎕의 세포에 첨가하고 온화하게 혼합하였다. 이 혼합물 10 ㎕를 1회용 세포-계수 슬라이드에 피펫팅하고 9개의 작은 정사각형 내의 백색 세포의 수를 현미경 하에 계수하였다. 청색 세포(즉, 사멸된 세포)는 계수하지 않았다. 계수 과정을 반복하고, 결과의 평균을 내고, 평균 결과에 9×105를 곱하여 20ml PBS 중의 세포에 대한 생존 세포 계수를 수득하였다. 충분한 세포가 수거되면, 이 세포를 RNA 단리를 위해 10 ml의 용액 D에 재현탁시켰다(하기 참조, Stratagene RNA Isolation Kit).
이어서, 제조업체의 지침서에 따라 Stratagene RNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 각 클론의 세포로부터 개별적으로 단리하였다. 1 ml의 2M 나트륨 아세테이트(pH 4.0)를 샘플에 첨가하고 튜브를 반복적으로 뒤집어 튜브의 내용물을 철저하게 혼합하였다. 상기 튜브에 10.0 ml의 페놀(pH 5.3 내지 5.7)을 첨가하고 내용물을 다시 뒤집어서 철저히 혼합하였다. 상기 혼합물에 2.0 ml의 클로로포름-이소아밀 알코올 혼합물을 첨가하고, 튜브를 캡핑하고 10초 동안 격렬하게 진탕시키고, 튜브를 얼음에서 15분 동안 항온배양하였다. 샘플을 얼음 위에서 미리 냉각시킨 50 ml 두께 벽의 환저 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 원심분리기에서 10,000×g에서 20분 동안 4℃에서 회전시켰다. 원심분리 후 튜브에서 2개의 상이 가시적이었다. 상단 수성 상은 RNA를 함유하였고, 하단 페놀 상 및 중간상은 DNA 및 단백질을 함유하였다. 상단의 RNA-함유 수성 상을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고 하단 페놀 상을 버렸다. 동일 용적의 이소프로판올을 수성 상에 첨가하고, 내용물을 뒤집어서 혼합한 후, 튜브를 -20℃에서 1시간 동안 항온배양하여 RNA를 침전시켰다. 튜브를 원심분리기에서 10,000×g에서 20분 동안 4℃에서 회전시켰다. 원심분리 후, RNA를 함유하는, 튜브의 바닥에 있는 펠렛을 제거하고 상청액을 버렸다. 펠렛을 3.0 ml의 용액 D에 용해시키고, 3.0 ml의 이소프로판올을 튜브에 첨가하고 내용물을 잘 혼합 하였다. 튜브를 -20℃에서 1시간 동안 항온배양한 후, 이를 다시 원심분리기에서 10,000×g에서 10분 동안 4℃에서 회전시키고, 상청액을 튜브로부터 꺼내어 버렸다. (주: 이 시점까지 RNA는 구아니딘 이소티오시아네이트의 존재에 의해 리보뉴 클레아제로부터 보호되었지만, 이제는 더 이상 보호되지 않았다.) 펠렛을 75%(v/v) 에탄올(DEPC-처리된 물(25 %))로 세척하고, 펠렛을 2 내지 3분 동안 진공하에 건조시켰다. RNA 펠릿을 0.5 내지 2 ml의 DEPC-처리된 물에 재현탁시켰다.
제조업체의 지침서에 따라, 키트와 함께 제공된 Not I-d(T)18 프라이머를 사용하여 11-1F4 하이브리도마 mRNA의 단일 가닥 DNA 카피를 생산하기 위해 Amersham Pharmacia Biotech 제1 가닥 cDNA 합성 키트를 사용하였다. 단리된 2개의 RNA 샘플 각각에 대해 다음과 같이 하나의 반응을 수행하였다. 사용된 성분은 다음과 같다: 대규모 제1 가닥 cDNA 반응 혼합물, 클로닝된 FPLCpure™ 뮤린 역전사효소, RNAguard™, BSA, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 200 mM DIT 수용액, Not Id(T)18 프라이머: 5'-d[AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA18]-3' 및 DEPC 처리된 물.
20 ㎕ DEPC 물 중 대략 5 ㎍의 총 RNA를 100분 동안 65℃로 가열한 다음, 얼음 위에서 냉각시켰다. 대규모 제1 가닥 cDNA 반응 혼합물을 온화하게 피펫팅하여 균일한 현탁액을 수득하고, 반응을 하기와 같이 0.5 ml 미세원심분리 튜브에 설정 하였다. 33 ㎕ 총 용적에 대해 20 ㎕ 변성 RNA 용액, 11 ㎕ 대규모 제1 cDNA 반응 혼합물, 1 ㎕ Not I-d(T)18 프라이머 및 1 ㎕ DTT 용액. 반응물을 피펫팅에 의해 온화하게 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다.
이어서, 뮤린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 유전자(각각 VH 유전자 및 VK 유전자)를 존스(Jones) 및 벤딩(Bendig)(Bio/Technology 9:88)에 의해 설명된 방법을 사용하여 ssDNA 주형으로부터 PCR 증폭시켰다.
적절한 불변 영역 프라이머(VH의 경우 MHCI-MHC3의 등몰 혼합물 및 VK의 경우 MKC)를 사용하여 각 축퇴 리더 서열 특이적 프라이머(VH의 경우 MHVI-MHV12 및 VK의 경우 MKVI-MKV11)에 대해 별개의 PCR 반응물을 제조하였다. 표 1 및 2는 각각 VH 영역 유전자 및 VK 영역 유전자를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머를 상세히 설명한다. 총 12개의 중쇄 반응 및 11개의 카파 경쇄 반응을 수행하였다. AmpliTaq® DNA 폴리머라제를 사용하여 모든 경우에 주형 cDNA를 다음과 같이 증폭시켰다.
완성된 cDNA 제1 가닥 합성 반응물을 90℃에서 5분 동안 가열하여 RNA-cDNA 이중체를 변성시키고 역전사효소를 불활성화시키고 얼음 위에서 냉각시켰다. 11개의 GeneAmp™ PCR 반응 튜브는 MKV1-11로 표지하였다. 각 튜브마다 100 ㎕ 반응 혼합물을 제조하였으며, 각각의 반응 혼합물은 69.3 ㎕의 멸균수, 10 ㎕의 10×PCR 완충액 II, 6 ㎕의 25 mM MgCl2, dNTP의 10 mM 스톡 용액 각각 2 ㎕, 2.5㎕의 10 mM MKC 프라이머, 10 mM MKV 프라이머 중 하나 2.5 ㎕ 및 1 ㎕의 RNA-cDNA 주형 혼합물을 함유한다. 이어서, 각각의 튜브에 0.7 ㎕의 AmpliTaq® DNA 폴리머라제를 첨가하고, 완성된 반응 혼합물을 50 ㎕의 미네랄 오일로 덮었다.
마우스 중쇄 가변 영역 유전자를 PCR-클로닝하기 위해 유사한 일련의 반응 혼합물을 상기 설명한 바와 같이 제조하였다. 그러나, 이번에는 12개의 반응 튜브를 표지하고 12개의 MHV 프라이머 중 하나 및 적절한 MHC 프라이머를 각각에 첨가하였다. 즉, 마우스 γ1 중쇄의 가변 도메인 유전자를 PCR 증폭시키기 위해, 예를 들어 MHC G1 프라이머를 사용하였다.
반응 튜브를 DNA 열 사이클러에 로딩하고, 25회 사이클에 걸쳐 94℃에서 1분 동안, 50℃에서 1 분 동안 및 7℃에서 1분 동안 사이클링하였다(94℃에서 1.5분 동안 초기 용융 후). 마지막 사이클에 이어서, 4℃로 냉각하기 전에 72℃에서 10분 동안 최종 연장 단계를 수행하였다. 2.5분의 연장된 램프 시간(ramp time)이 사용된 어닐링(50℃) 단계와 연장(72℃) 단계 사이를 제외하고는 30초의 램프 시간을 사이클의 각 단계 사이에 사용하였다. 각각의 PCR 반응으로부터 10 ㎕ 분취량을 0.5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드를 함유하는 1%(w/v) 아가로스/1×TBE 완충제 겔에서 작동시켜 리더 프라이머 중 어느 것이 PCR 생성물을 생성하였는지를 결정하였다. 양성 PCR-클론의 크기는 약 420 내지 500 bp였다.
상기 PCR-증폭 과정을 2회 더 반복하고 전장 가변 도메인 유전자를 증폭시키는 것으로 나타난 PCR-반응을 선택하였다. 각각의 잠재적인 PCR-생성물의 6 ㎕ 분취량을 제조업체의 지침서에 설명된 바와 같이 TA Cloning® 키트에 의해 제공된 pCR™II 벡터에 직접 클로닝하였다. 형질전환된 이. 콜라이 세포의 10.0%(v/v), 1.0%(v/v) 및 0.1%(v/v)의 분취량을 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 개별 90 mm 직경 LB 한천 플레이트에 피펫팅하고, 25 ㎕의 X-Gal 스톡 용액 및 40 ㎕의 IPTG 스톡 용액으로 덮고, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 양성 콜로니를 PCR-스크리닝으로 동정하였다.
각각의 PCR 반응으로부터의 5㎕ 분취량을 1% 아가로스/TBE(pH 8.8) 겔에서 작동시켜 어느 것이 정확한 크기(약 450 bp)의 PCR 생성물을 생성했는지를 결정하였다. 이렇게 동정된 추정상의 양성 PCR 생성물을 TA Cloning® 키트에 의해 제공된 pCR2.1 벡터에 직접 클로닝하고 제조업체의 프로토콜에 설명된 바와 같이 TOP10 적격 세포로 형질전환시켰다. 정확한 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드를 함유하는 콜로니는 귀소(Gussow) 및 클락슨(Clackson)의 방법에 따라 1212 및 1233 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 3)를 사용하여 콜로니를 PCR-스크리닝함으로써 동정하였다(Nucleic Acids Res. 17:4000). 이렇게 동정된 추정상의 양성 클론은 ABI PRISM 310 유전자 분석기 및 ABI PRISM BigDye™ 터미네이터를 사용하여 시퀀싱된 이중 가닥 플라스미드 DNA였다. B2C4 하이브리도마 세포주 클론으로부터의 VH 유전자 및 VK 유전자 각각의 3개의 양성 클론을 B2D6 하이브리도마 세포주 클론으로부터의 VK 유전자의 4개 양성 클론 및 VH 유전자의 6개처럼 시퀀싱하였다.
뮤린 11-1F4 중쇄 가변 영역 유전자를 증폭시키기 위해 각각의 하이브리도마 클론(B2C4 및 BCD6)에 대해 수행된 12개의 PCR 반응의 결과가 표 4(a)에 제시되어있다.
축퇴 리더 서열 프라이머 MHV7은, MHCG1-3 불변 영역 프라이머들(표 1)의 혼합물과 조합되어, B2C4 하이브리도마 세포주와 B2D6 하이브리도마 세포주 둘 다로부터 유래된 주형 cDNA로부터 약 600 bp의 PCR 생성물을 산출하였다. 이 밴드는 평균 VH 유전자의 예상 크기(450 bp)보다 크기 때문에 더 이상 조사하지 않았다. 반대로, 축퇴 리더 서열 프라이머 MHV6은 MHCG1-3 불변 영역 프라이머들(표 1)의 혼합물과 조합되어, B2C4 하이브리도마 세포주와 B2D6 하이브리도마 세포주 둘 다로부터 유래된 주형 cDNA로부터 VH 유전자에 대해 예상되는 크기(450 bp)의 PCR 생성물을 산출하였다.
B2C4 유래의 PCR 생성물로부터의 3개 클론 및 B2D6 유래의 PCR 생성물로부터의 5개 클론의 서열 분석은 단일 중쇄 가변 영역 서열을 나타냈다(도 2).
사용된 클로닝 전략(이 영역에 플랭킹(flank)된 프라이머, 즉 리더 서열 및 불변 영역 서열 특이적 프라이머를 사용한 전체 가변 영역 유전자의 증폭)은 완전한 FR1 서열이 동정되게 하였다. 시퀀싱된 8개의 클론 모두가 이 영역에 동일한 서열을 가졌다(도 2).
뮤린 11-1F4 카파 경쇄 가변 영역 유전자를 증폭시키기 위해 각각의 하이브리도마 클론(B2C4 및 BCD6)에 대해 수행된 11개의 PCR 반응의 결과가 표 4(b)에 제시되어 있다.
축퇴 리더 서열 프라이머 MKV6은 MKC 불변 영역 프라이머(표 2)와 조합되어, B2C4 하이브리도마 세포주로부터만 유래된 주형 cDNA로부터 약 200 bp의 PCR 산물을 생성하였다. 이 밴드는 VK 유전자의 예상 크기(450 bp)보다 훨씬 작았기 때문에, 더 조사하지 않았다.
축퇴 리더 서열 프라이머 MKV2는 MKC 불변 영역 프라이머(표 2)와 조합되어, B2C4 하이브리도마 세포주와 B2D6 하이브리도마 세포주 둘 다로부터 유래된 주형 cDNA로부터 예상된 450 bp 밴드(아가로스 겔상에서 볼 때)보다 작은 PCR 생성물을 생성하였다. 또한, 이전의 VK 클로닝은 MKV2 프라이머가 잘 알려진 카파 경쇄 위유전자(pseudogene)를 증폭시켰다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 이 생성물이 뮤린 11-1F4 VK 유전자가 아닌 위유전자임을 확인하기 위해 각 PCR 생성물의 하나의 클론의 서열 분석을 수행하였다. 이러한 서열 분석은 이 PCR 클론이 실제로 위유전자였음을 밝혀냈다.
마지막으로, 축퇴 리더 서열 프라이머 MKV1은 MKC 불변 영역 프라이머(표 1)와 조합되어, B2C4 및 B2D6 하이브리도마 세포주 둘 다로부터 유래된 주형 cDNA로부터 VK 유전자에 대한 대략적 예상 크기(450 bp)의 PCR 산물을 생성하였다.
B2C4 유래의 PCR 생성물의 3개 클론 및 B2D6 유래의 PCR 생성물의 4개 클론의 서열 분석은 위유전자로서 동정될 수 없는 단일 카파 경쇄 가변 영역 서열이 밝혀냈다.
따라서, 11-1F4 중쇄 가변 영역 유전자를 (불변 영역 특이적 프라이머 및 리더 서열 특이적 프라이머를 사용하여) 하이브리도마 mRNA로부터 클로닝하고 시퀀싱하였다.
서열은 번역될 때 TVSS 펩티드 서열을 제공하였다. 카뱃(Kabat) 데이터베이스(Kabat et al. - Sequences of Proteins of Immunological Interest)에 기록된 122개의 재배열된 인간 VH 유전자의 분석은 이들 서열의 84%가 TVSS 펩티드 서열을 가졌다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 단리된 VH 유전자는 정확한 11-1F4 유전자 서열이였다는 결론이 내려졌다.
뮤린 11-1F4 가변 영역 카파 경쇄 유전자도 비기능적 VK 위유전자처럼 성공적으로 클로닝 및 시퀀싱하였다. 이러한 위유전자는 캐롤(Carroll) 등(Molecular Immunology (1988) 25:991)에 의해 처음 동정되었다. 서열은 원래의 MOPC-21 종양(SP2/0을 포함)으로부터 유래된 모든 표준 융합 파트너에 존재하는 비정상 mRNA 전사체로부터 발생한다. 비정상 mRNA의 결과로서, 위치 23의 불변 시스테인은 티로신 잔기로 대체되고, VJ 접합부는 프레임을 벗어나 있어서 위치 105에서 정지 코돈을 초래한다.
림프구 또는 하이브리도마 세포가 하나 이상의 재배열된 경쇄 면역글로불린 mRNA를 합성하는 것은 일반적이다. 이들 mRNA는 일반적으로 기능성 VK 유전자에서 보이지 않는 종결 코돈 또는 프레임 시프트(frame shift)의 존재로 인해 비생산적이다. 이러한 가성(pseudo) 메신저들은 이들이 기능성 폴리펩티드를 암호화하지 않는다는 사실에도 불구하고 V 영역 PCR에 대한 매우 우수한 기질이기 때문에 하이브리도마로부터 면역글로불린 유전자를 클로닝할 때 종종 주요 문제를 나타낸다.
2개의 상이한 PCR 생성물로부터 단리된 7개의 별개의 PCR 클론의 상세한 서열 분석후에 11-1F4 VK 유전자 서열이 동정되어 서열번호 35를 산출하였다. 모든 서열이 동일하였기 때문에, 이것은 정확한 11-1F4 카파 경쇄 가변 영역 서열로서 받아들여졌다.
클로닝된 VH 및 VK 영역 유전자를 사용하여 키메라 마우스-인간 11-1F4 단클론 항체를 제조한 다음, 이를 분석하여 AL 원섬유에 대한 특이적인 결합을 확인하였다.
실시예 2
키메라 마우스-인간 11-1F4(c11-1F4) 항체의 작제
키메라 마우스-인간 항체의 일부로서 포유동물 세포에서 상기 기재된 11-1F4 VH 및 VK 가변 영역 유전자의 일시적인 발현을 허용하기 위해, 특수하게 설계된 PCR 프라이머(표 5)를 사용하여 5'- 및 3'-말단을 변형시킬 필요가 있었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 F39836 및 F39837을 사용하여 11-1F4 VK 유전자를 PCR 변형시키는 한편, 프라이머 F39835 및 F58933을 사용하여 11-1F4 VH 유전자를 PCR 변형시켰다. 후방(BAK) 프라이머 F39836 및 F39835는 각각 HindIII 제한 부위, 코작(Kozak) 번역 개시 부위 및 면역글로불린 리더 서열을 각각 VK 및 VH 유전자의 5' 말단에 도입하였다. 전방(FOR) 올리고뉴클레오티드 프라이머 F39837은 VK 유전자의 3 '말단에 스플라이스 공여 부위 및 BamHI 제한 부위를 도입한 반면, 전방(FOR) 올리고뉴클레오티드 프라이머 F58933은 VH 유전자의 3' 말단에 ApaI 제한 부위를 포함하는 감마-1CH1 유전자의 처음 22개 염기쌍을 추가하였다.
코작 컨센서스 서열은 가변 영역 서열의 효율적인 번역에 중요하다((Kozak - J Mol Bio 196:947). 이것은 리보솜이 번역을 시작하는 정확한 AUG 코돈을 규정하고, 가장 중요한 단일 염기는 AUG 시작의 상류 위치 -3에 있는 아데닌(또는 덜 바람직하게는 구아닌)이다.
면역글로불린 리더 서열은 발현된 항체가 배지로 분비되고 따라서 쉽게 수거되고 정제되는 것을 보장한다. 이러한 경우에 사용된 리더 서열은 VH 및 VK 클로닝 과정 동안 하이브리도마 cDNA로부터 클로닝된 뮤린 11-1F4 VK 및 VH 리더 서열이었다.
스플라이스 공여 서열은 경쇄 가변 영역을 이의 적절한 불변 영역에 정확하게 프레임내 부착하여 130 bp VK:CK 인트론을 잘라내기 위해 중요하다. 중쇄 가변 영역은 Apal 부위를 통해 이의 적절한 불변 영역 유전자에 직접 부착되고, 따라서 스플라이스 공여 부위의 필요성을 제거하였다.
서브클로닝 제한 부위 HindIII 및 BamHI 및 HindIII 및 Apal은 각각 변형된 VK 및 VH 가변 영역 유전자를 묶어서 다루는 반면, 상이한 독특한 제한 부위의 사용은 적절한 포유동물 발현 벡터 내로의 방향성 서브클로닝을 보장하였다.
11-1F4 경쇄 가변 영역 유전자를 먼저 조심스럽게 분석하여 임의의 원치않는 스플라이스 공여 부위, 스플라이스 수용 부위 및 코작 서열을 동정하였다(표 6 참조). 중쇄 가변 영역 유전자와 경쇄 가변 영역 유전자 둘 다를 이후에 기능적 전체 항체(whole antibody)의 서브클로닝 및/또는 발현을 방해할 수 있는 임의의 추가 서브클로닝 제한 부위의 존재에 대해 분석하였다. 어떤 것도 발견되지 않았다.
볼드체로 표시된 염기는 각 컨센서스 서열 내에서 불변인 것으로 간주된다.
별개의 PCR 반응물을 각각의 가변 영역 유전자마다 하나씩, 다음과 같이 제조하였다. 상기 설명한 플라스미드 11-1F4 VH.pCR2.1 및 11-1F4 VK.pCR2.1을 주형으로서 사용하였다. 100㎕ 반응 혼합물을 각 PCR 튜브에서 제조하였으며, 각각의 혼합물은 최대 41 ㎕의 멸균수, 10 ㎕의 10×PCR 완충액 I, 10mM의 dNTP 스톡 용액 8 ㎕, 10mM의 5' 전방향 프라이머 1 ㎕, 10 mM 3' 역방향 프라이머 1 ㎕ 및 주형 DNA의 1/10 희석액 1 ㎕를 함유한다. 마지막으로, 완성된 반응 혼합물을 50 ㎕의 미네랄 오일로 덮기 전에 0.5 ㎕의 AmpliTaq® DNA 폴리머라제(2.5 단위)를 첨가하였다. 반응 튜브를 DNA 열 순환기(thermal cycler)에 로딩하고, 25회 사이클에 걸쳐 94℃에서 30초 동안, 68℃에서 30초 동안 및 72℃에서 50초 동안(94℃에서 1분 동안 초기 용융 후) 사이클링하였다. 마지막 사이클을 완료한 후, 4℃로 냉각하기 전에 72℃에서 7분 동안 최종 연장 단계를 수행하였다. 각각의 PCR 반응 튜브로부터 10 ㎕ 분취량을 0.5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드를 함유하는 1.2%(w/v) 아가로스/1×TBE 완충제 겔에서 작동시켜 PCR-생성물의 크기 및 존재를 결정하였다. 양성 PCR-클론의 크기는 약 420 bp였다. 이렇게 동정된 추정상의 양성 PCR 산물을 Topo TA Cloning® 키트에 의해 제공된 pCR2.1 벡터에 직접 클로닝하고, 제조업체의 프로토콜에 설명된 바와 같이 TOP10 적격 세포로 형질전환시켰다. 정확한 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드를 함유하는 콜로니는 귀소(Gussow) 및 클락슨(Clackson)의 방법에 따라 1212 및 1233 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 3)를 사용하여 콜로니를 PCR-스크리닝함으로써 동정되었다. 이렇게 동정된 추정상의 양성 클론은 ABI PRISM 310 유전자 분석기 및 ABI PRISM BigDye™ 터미네이터를 사용하여 시퀀싱된 이중 가닥 플라스미드 DNA였다. Topo TA 클로닝된 VH 및 VK 유전자 각각의 2개의 양성 클론을 시퀀싱하였다.
올바르게 변형된 11-1F4 VH 및 11-1F4 VK 유전자를 함유하는 클론을 동정하였고, 포유동물 세포에서의 키메라 중쇄 및 카파 경쇄의 발현을 촉진하기 위해 이들 클론으로부터의 변형된 V 유전자를 이들의 각 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 변형된 11-1F4 VK 유전자를 HindIII-BamHI 단편으로서 발현 벡터 pKN100(도 4)에 서브클로닝하였다; 이 벡터는 인간 카파 불변 영역 유전자(알로타입: Km (3 Ala153, Ser191))를 함유한다. 변형된 11-1F4 VH 유전자도 HindIII-ApaI 단편으로서 발현 벡터 pG1D200에 서브클로닝하였다(도 5); 이 벡터는 인간 γ1 불변 영역 유전자(알로타입: G1m (-1 Glu377, Met38I, -2 Ala462, 3 Arg222, Ser229))를 함유하였다. 사용된 카파 및 γ1 불변 영역 알로타입은 백인 집단에서 흔히 발견된다. 이어서, 연결된 발현 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-1F4VH.pG1D200을 사용하여 DH5α 적격 세포를 형질전환시키고, 원래의 PCR 변형 프라이머와 함께 상기 논의한 PCR 스크리닝 방법을 사용하여 양성 클론을 동정하였다(표 4). 발현 벡터는 쉽게 이용가능하다.
실시예 3
COS 세포에서 키메라 11-1F4의 일시적 발현을 위한 단일 수퍼벡터의 작제.
키메라 11-1F4 항체의 두 면역글로불린 사슬 모두를 발현하는 단일 슈퍼벡터를 다음과 같이 작제하였다. 11-1F4 카파 경쇄 발현 카세트(HCMVi 프로모터, 11-1F4 카파 경쇄 가변 영역 유전자 및 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 함유함)를 11-1F4VK.pKN100 작제물로부터 제한 효소 분해시키고(위치 1 및 위치 2490의 EcoRI)(도 4) 이어서 독특한 EcoRI(위치 4297, 도 5)를 통해 11-1F4VHpG1D200 작제물에 연결시켰다. 이러한 연결로 인해 11-1F4 키메라 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 둘 다를 함유하는 수퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4가 생성되었다.
실시예 4
COS 세포에서 키메라 γ1/κ.11-IF4 전체 항체의 일시적 발현
키메라 11-IF4 항체는 2가지 방식으로 유럽피언 컬렉션 오브 셀 컬쳐스(European Collection of Cell Cultures: ECACC)로부터의 COS 세포에서 일시적으로 발현시켰다:
(i) 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-1F4VH.pG1D200 각각 10㎍의 공동형질감염에 의해. 공동형질감염은 2반복으로 수행하였다.
(ii) 13㎍의 단일 슈퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4의 형질감염에 의해. 슈퍼벡터 형질감염을 5회 수행하였다.
하기 형질감염 방법을 사용하였다. COS 세포주는 융합성(confluent)이 될 때까지 150 cm2 플라스크 내의 10%(v/v) FCS, 580 ㎍/ml L-글루타민 및 50 유닛/ml 페니실린/50 ㎍/ml 스트렙토마이신("배지")이 보충된 DMEM에서 성장시켰다. 세포를 트립신 처리하고, 벤치 탑 원심분리기에서 회전(250 g에서 5분 동안)시킨 다음, 이들을 각각 25ml의 새로운 예열된 배지를 함유하는 3개의 150 cm2 플라스크 사이에 동일하게 분배하기 전에 6ml의 배지에 재현탁시켰다. 세포를 5% COz에서 37℃에서 밤새 항온배양한 다음, 세포가 여전히 지수적으로(exponentially) 성장하는 동안 다음날 수거하였다. 각각의 플라스크는 대략 1×107 세포를 함유하였다. 세포를 다시 트립신 처리하고, 이전과 같이 펠렛화하고, 20 ml의 PBS로 세척한 후, 1×107 세포/ml의 세포 농도를 생성하기에 충분한 PBS에 재현탁시켰다. 이러한 세척된 COS 세포 700 ㎕를 Gene Pulser® 큐벳에 피펫팅한 다음, 여기에 1 ㎕의 중쇄 및 카파 경쇄 발현 벡터 DNA(각각 10 ㎍) 둘 다 또는 13 ㎍의 수퍼벡터 작제물을 첨가하였다. Bio-Rad Gene Pulser® 장치를 사용하여 1900V, 25μFarad 커패시턴스 펄스를 혼합물에 전달하였다. 각각의 실험적 형질감염 및 "DNA 부재" 대조군(COS 세포가 어떠한 DNA도 없이 전기천공되었음)에 대해 펄싱을 반복하였다. COS 세포의 효율을 시험하기 위해 이전에 발현된 항체의 양성 대조를 또한 수행하였다.
COS 세포를 실온에서 10분 동안 회복되게 한 다음, 10%(v/v) γ-글로불린 비함유 FBS, 580 ㎍/ml L-글루타민 및 50 유닛/ml 페니실린 / 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 8 ml의 예열된 DMEM을 함유하는 10 cm 직경의 조직 배양 접시에 온화하게 피펫팅하고, 분석을 위해 COS 세포 상청액을 수거하기 전에 37℃에서 72시간 동안 5% CO2에서 항온배양하였다. 72시간 동안 항온배양한 후, 배지를 수집하고, 회전시켜 세포 잔사를 제거하고, 키메라 항체 생산 및 c11-1F4 항체의 항원 결합에 대해 ELISA로 분석하였다.
실시예 5
포획 ELISA를 통한 키메라 γ1/κ 11-1F4 항체의 정량
발현 후, COS 세포 상청액에 존재하는 전체 IgG 분자를 포획 ELISA 분석법을 사용하여 정량하였다. IgG 분자를 Fcγ 단편-특이적 항체인 고정된 염소 항-인간 IgG를 통해 Nunc-Immuno MaxiSorb™ 플레이트상에 포획하고, 항-인간 카파 경쇄 퍼 옥시다제 접합 항체를 통해 검출하였다. 알려진 농도의 표준 IgG 항체를 다음과 같이 동일한 방식으로 동일한 플레이트에서 포획하고 검출하여 표준 곡선을 생성하였다. 96-웰 면역플레이트의 각 웰을 PBS에 희석된 0.4 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG 항체의 100 ㎕ 분취량으로 코팅하고 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 과량의 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 200 ㎕/웰의 세척 완충액(1×PBS, 0.1% TWEEN)으로 3회 세척하였다. 세로줄 2, 가로줄 B 내지 G 내의 웰을 제외한 모든 웰에 100㎕의 SEC 완충액을 분배하였다. SEC 완충액 중의 인간 IgG1/카파 항체의 1 ㎍/ml 용액을 표준으로서 작용하도록 제조하고 200 ㎕/웰을 세로줄 2, 가로줄 B 및 C의 웰에 피펫팅하였다. 형질감염된 cos 세포로부터의 배지를 원심분리하여(250 g, 5분) 상청액을 모았다. "DNA 부재" 대조군(COS 세포가 DNA의 부재하에 형질감염되었음)으로부터의 상청액 200 ㎕의 분취량을 세로줄 2, 가로줄 D의 웰에 피펫팅하고, 200 ㎕/웰의 실험적 상청액의 분취량을 세로줄 2, 가로줄 E, F 및 G의 웰에 피펫팅하였다. 세로줄 2, 가로줄 B 내지 G의 웰 내의 200 ㎕ 분취량을 혼합한 다음, 100 ㎕를 각 웰로부터 세로줄 3 내의 이웃 웰로 옮겼다. 이러한 과정을 표준, 대조군 및 실험 샘플의 2배 희석액의 시리즈를 이용하여 세로줄 11까지 지속하고, 그 후 모두를 37℃에서 1시간 동안 항온배양하고, 모든 웰을 세척 완충액의 200 ㎕ 분취량으로 6회 헹구었다. 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 접합체를 SEC 완충액에 5000배 희석하고, 100 ㎕의 희석된 접합체를 각 웰에 첨가한 후, 항온배양 단계 및 헹굼 단계를 반복하였다. 각각의 웰에 150㎕의 K-BLUE 기질을 첨가한 후, 암실에서 25℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 50㎕의 RED STOP 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고 광학 밀도를 655nm에서 판독하였다.
실시예 6
키메라 11-1F4 항체의 결합 분석
키메라 11-1F4 항체를 직접 결합 ELISA 분석법을 사용하여 아밀로이드 원섬유에 대한 결합에 대해 시험하였다. 합성 원섬유를 면역글로불린 경쇄 단백질로부터 형성시키고, "저결합형" 폴리스티렌 플레이트(Costar, # 3474)를 사용하여 고체 상태 ELISA 기반 분석에서 항체의 반응성을 모니터링하는데 사용하였다. 플레이트를 코팅하기 직전에, 250 ㎍의 원섬유 덩어리를 코팅 완충액(포스페이트 완충 식염수 pH 7.5 중의 0.1% 소 혈청 알부민)을 이용하여 1 ml로 희석시켰다. 이어서, 샘플을 전력을 최대치의 40%로 설정한 Tekmar Sonic Disruptor 초음파 프로브를 사용하여 20초 동안 초음파 처리하여, 각각 최대 2 내지 5개의 프로토필라멘트로 이루어진 짧은 원섬유 용액을 생성하였다. 이어서, 상기 용액을 5 ml로 희석하고, 볼텍스에 의해 잘 혼합하고, 플레이트의 웰에 분취하였다. 이러한 과정은 각 웰 내의 농도가 50 /ml인 원섬유 용액 50 ㎕를 산출하였다. 이어서, 플레이트를 37℃ 항온배양기 내에서 덮지 않은채 밤새 건조시켰다.
이어서, 플레이트 준비 후 48시간 이내에 ELISA 분석법을 다음과 같이 수행하였다. PBS 중의 100 ㎕의 1% BSA를 첨가하여 웰을 차단하고, 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20(v/v)로 3회 세척하였다. 플레이트의 각 웰에 c11-1F4의 용액 50㎕(0.1% BSA/PBS 중 3㎍/ml 항체)를 첨가하고 플레이트를 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 다시 3회(이전과 같이) 세척하고 바이오티닐화된 염소 항-마우스 IgG 항체(Sigma # B-8774, 항-중쇄 및 경쇄)를 사용하여 결합된 항체의 검출을 달성하였다.
결과
성공적으로 변형된 VH 및 VK 유전자의 서열 분석은 정확한 서열이 존재하였음을 밝혀냈다. 변형된 11-1F4 VK 및 VH 유전자의 상세한 DNA 및 아미노산 서열은 도 3 및 도 4에 제시되어 있다. 변형된 VK 및 VH 유전자는 각각 포유동물 발현 벡터 pG1D200 및 pKN100에 성공적으로 클로닝되었고, 생성된 11-1F4VK.pKN100 및 11-1F4VHpG1D200 작제물은 포유동물 세포의 공동형질감염에 사용하였다.
11-1F4VK.pKN100 및 11-1F4VHpG1D200 작제물은 또한 포유동물 세포에서 키메라 11-1F4 항체를 발현한 단일 슈퍼벡터(pG1KD200-11-1F4)를 작제하는데 사용하였다. ECACC COS 세포의 공동형질감염 및 수퍼벡터 형질감염 둘 다로부터의 키메라 11-1F4 항체 발현 수준을 분석하였다. pG1KD200-11-1F4 슈퍼벡터 형질감염(10326 ng/ml)에서 관찰된 발현 수준은 11-1F4VK.pKN100 작제물 및 11-1F4VHpG1D200 작제물의 상응하는 공동형질감염에서 관찰된 수준(2820 ng/ml)보다 3.7배 높았다.
발현 및 정량 후, 키메라 11-1F4 항체를 직접 결합 ELISA에 의해 표적 항원(NCI에 의해 친절하게 공급된 아밀로이드 원섬유)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 결합 ELISA의 결과는 도 8에 제시되어 있다. 2개의 최고의 개별 pG1KD200-11-1F4 슈퍼벡터 형질감염으로부터의 상청액을 상응하는 공동형질감염으로부터의 하나의 상청액과 동시에 분석하였다.
결과는 키메라 11-1F4 항체가 이의 뮤린 등가물보다 높은 친화도로 아밀로이드 원섬유에 결합하였음을 나타냈다. 이러한 결과는 일반적으로 키메라 항체가 원래의 뮤린 항체와 유사한 결합 친화도를 가질 것으로 예상되었기 때문에 놀랍고 예상치 못한 것이다. 특정 메커니즘에 구애되지 않고, 본 발명자들은 11-1F4 뮤린 V 영역을 키메라 11-1F4 항체를 생성하는데 사용된 인간 γ1/κ C 영역과 조합하는 것의 순 효과가 높은 친화도의 항체를 생성하였을 수 있다고 믿고 있다.
본 명세서의 설명 및 청구범위에서, "포함하다(comprise)"란 용어 및 "포함한다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 상기 용어의 변형어는 다른 특징, 첨가물, 성분, 완전체 또는 단계를 배제하도록 의도된 것이 아니라, 오히려 명시적으로 달리 언급하지 않는 한, 이러한 용어들의 범위는 배타적 의미가 아니라 포괄적 의미를 갖도록 광의적으로 해석되어야 한다.
본 발명의 조성물 및 방법이 예시적인 예에 의해 본 개시내용에서 설명되었지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 교시로부터 벗어남이 없이 당업자에 의해 알려진 바와 같이 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Trustees of Columbia University in the City of New York
<120> CHIMERIC ANTIBODIES FOR TREATMENT OF AMYLOID DEPOSITION DISEASES
<130> 8441-0004WO
<150> US 62/526835
<151> 2017-06-29
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (22)
- 서열번호 47의 VK 영역 및 서열번호 48의 VH 영역을 포함하는 키메라 마우스-인간 항체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 36의 VK 영역 및 서열번호 35의 VH 영역을 포함하는 마우스 항체보다 더 높은 친화도로 아밀로이드 원섬유의 β-플리티드 쉬트(β-pleated sheet) 입체배치에 의해 발현된 에피토프에 결합하는 키메라 마우스-인간 항체.
- 제1항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 아밀로이드 침착 질환의 치료가 필요한 인간 환자에서 아밀로이드 침착 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제1항의 항체를 상기 아밀로이드 침착 질환을 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 아밀로이드 침착 질환이 원발성 아밀로이드증인 방법.
- 포유동물 세포에서 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200을 공동형질감염시키거나 포유동물 세포에서 수퍼벡터(supervector) 작제물 pG1KD200-11-1F4를 형질감염시키는 것을 포함하는, 키메라 항체의 생산 방법.
- 제6항에 있어서, 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200의 공동형질감염 또는 수퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4의 형질감염이 COS 세포에서 일어나는, 방법.
- 제6항에 있어서, 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200의 공동형질감염을 포함하는 방법.
- 제6항에 있어서, 슈퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4의 형질감염을 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 벡터 작제물 11-1F4VK.pKN100 및 11-F4VH.pG1D200의 공동형질감염을 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 슈퍼벡터 작제물 pG1KD200-11-1F4의 형질감염을 포함하는 방법.
- 11-1F4VK.pKN100, 11-1F4VHpG1D200 및 pG1KD200-11-1F4로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터 작제물.
- 제12항에 있어서, 11-1F4VK.pKN100인 벡터 작제물.
- 제12항에 있어서, 11-1F4VHpG1D200인 벡터 작제물.
- 제12항에 있어서, pG1KD200-11-1F4인 벡터 작제물.
- 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 의심되는 환자에서 아밀로이드 침착물의 존재를 검출하는 방법으로서, 검출가능한 표지가 부착된 제1항의 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 투여되는 상기 항체의 양이 아밀로이드 침착물이 존재할 경우 아밀로이드 침착물의 검출을 허용하기에 충분한, 방법.
- 제16항에 있어서, 검출가능한 표지가 124I인 방법.
- 제6항의 방법에 의해 생산된 키메라 마우스-인간 항체.
- 제8항의 방법에 의해 생산된 키메라 마우스-인간 항체.
- 제9항의 방법에 의해 생산된 키메라 마우스-인간 항체.
- 서열번호 47 및 서열번호 48로부터 선택된 폴리펩티드.
- 서열번호 42 및 서열번호 45로부터 선택된 폴리뉴클레오티드.
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