BR112018005905B1 - Composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto - Google Patents
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Abstract
COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA EVITAR OU TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO, LESÕES DE ÓRGÃO, HEPATOTOXICIDADE E FÍGADO GORDUROSO, E, USO DE UM COMPOSTO. A presente invenção refere-se a compostos eficazes no tratamento de hepatotoxicidade e doenças de fígado gorduroso e usos dos mesmos.
Description
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US n° 62/222.959, depositado em 24 de setembro de 2015, Pedido Provisório US n° 62/257.697, depositado em 19 de novembro de 2015, e Pedido no Tratado de Cooperação de Patentes: PCT/CN2016/078039, depositado em 31 de março de 2016, cujo conteúdo é incorporado por referência em sua totalidade.
[0002] A presente invenção refere-se a compostos eficazes no tratamento da hepatotoxicidade e doenças do fígado gorduroso e usos dos mesmos.
[0003] As lesões nos órgãos podem ser causadas por agentes tóxicos, tais como, um fármaco terapêutico, quando administrados em sobredosagem, o que conduz frequentemente a lesões em órgãos, especialmente fígado ou rim. O acetaminofeno (também conhecido como Panadol) também é chamado de paracetamol ou N-acetil-para-aminofenol (APAP) e é o fármaco mais amplamente usado no alívio da dor e da redução da febre no mercado. A cada ano, inúmeros casos de intoxicação ou suicídio com fármacos são relatados devido ao uso inadequado da APAP, e a lesão hepática causada por APAP é a principal causa de doenças graves e morte. Álcoois ou solventes orgânicos, tais como tetracloreto de carbono (CCl4), também podem causar hepatotoxicidade. Uma série de estudos clínicos demonstraram que a hepatotoxicidade induzida por APAP é evitável e o diagnóstico precoce, juntamente com a administração em tempo real do antídoto N-acetilcisteína (NAC), pode evitar a ocorrência de hepatotoxicidade.
[0004] A detecção precoce de sobredosagem com acetaminofeno é necessária porque o melhor prognóstico pode ser alcançado se o antídoto for administrado dentro de 8 horas após o envenenamento. Os primeiros sinais de intoxicação por fármacos incluem desconforto, náusea e vômito. No entanto, alguns pacientes podem não apresentar sinais de intoxicação no estágio inicial (estágio 1), mesmo se suas concentrações sanguíneas de acetaminofeno estiverem nos níveis de envenenamento e sua função anormal do fígado estiver aparentemente anormal. Os sinais de hepatotoxicidade, como dor abdominal, vômitos persistentes, icterícia, dor no quadrante superior direito, geralmente se tornam aparentes 24-48 horas após a ingestão de uma quantidade significativa de acetaminofeno (estágio 2). A aminotransferase sérica geralmente começa a aumentar 16 horas após a administração com sintomas clínicos. O estágio 3 geralmente ocorre 3-4 dias após a administração e o grau de dano hepático, bem como o prognóstico, podem ser bem previstos na ocasião. Os sinais de hepatotoxicidade progridem de sintomas leves com valores de função hepática elevados (AST > 1.000UI/L) a hepatite fulminante aguda grave acompanhada por acidose metabólica, icterícia, hiperglicemia, AST > 1.000UI/L, coagulação sanguínea anormal e lesões hepáticas/cerebrais. O estágio 4 causará oligúrica, insuficiência renal ou morte em casos graves.
[0005] Alguns pacientes com intoxicação por acetaminofeno apresentam apenas leve dano hepático, mas com toxicidade renal grave, que é causada principalmente pelo metabolismo direto de APAP em P-450s (citocromo P450s, CYPs) do túbulo renal. No entanto, insuficiência renal aguda também pode resultar de síndrome hepato-renal causada por insuficiência hepática aguda e a fração de excreção de Na (FeNa) pode ser usada para diferenciar dano renal primário (FeNa > 1) da síndrome hepatorrenal (FeNa > 1). A fórmula de cálculo para FeNa é (sódio urinário ^ creatinina urinária) ^ (sódio do plasma ^ creatinina do plasma) x 100.
[0006] A concentração máxima de acetaminofeno no sangue é atingida 1-2 horas após a administração oral e uma quantidade significativa é eliminada pelo fígado, mais de 90% é conjugado com glucuronídeo e sulfato e forma metabólitos não tóxicos e apenas menos de 5% é eliminado por diferentes CYPs, incluindo CYP2E1, CYP1A2 e CYP3A4, e entre os quais CYP2E1 e CYP1A2 são as principais enzimas do metabolismo. O metabólito produzido por essas enzimas, a N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), é um eletrófilo muito ativo. Em condições normais, NAPQI reagirá imediatamente com a glutationa na célula e formará mercapteto não tóxico. A superdosagem de acetaminofeno torna a taxa de consumo de glutationa maior que sua taxa de síntese e quando o nível de glutationa da célula é menor que a faixa normal de 30%, NAPQI se ligará a moléculas grandes ou ácidos nucleicos contendo cisteína e levará a danos no fígado. A partir de manchas histoquímicas, o NAPQI se ligará ao grupo tiol da cisteína e formará uma ligação covalente nas áreas centrolobulares antes da ocorrência de necrose das células do fígado.
[0007] Os pacientes com doença hepática, alcoolismo ou que estejam tomando fármacos que possam induzir a atividade de P450, tais como carbamazepina, etanol, isoniazida, fenobarbital (podem ser outros barbitúricos), fenitoína, sulfimpirazona, sulfonilureias, rifampicina e primidona são os susceptíveis grupos de desenvolvimento de hepatotoxicidade grave causada por APAP e pode facilmente morrer se o paciente também desenvolver complicações, tais como síndrome do desconforto respiratório do adulto, edema cerebral, sangramento incontrolável, infecção ou síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (MODS). Tomar álcool, por exemplo, o álcool é eliminado principalmente pelo CYP2E1 do fígado e seu mecanismo de intoxicação por APAP é dividido em três estágios: no primeiro estágio, o álcool compete os receptores para CYP2E1 com APAP no fígado e a concentração de NAPQI será reduzida durante o estágio, no segundo estágio o álcool prolonga a meia-vida do CYP2E1 de 7 horas para 37 horas, o que aumenta o nível de CYP2E1 no fígado e a concentração de NAPQ1 aumentará lentamente durante esse estágio e, no terceiro estágio, durante a abstinência de álcool, mais CYP2E1 é encontrado no fígado para eliminar o acetaminofeno e, consequentemente, os metabólitos tóxicos do acetaminofeno aumentam significativamente e levam a danos no fígado. Estudos recentes têm demonstrado que o sulfato de dialila pode evitar eficazmente a hepatotoxicidade causada pelo acetaminofeno em camundongos e que o sulfato de dialila pode ainda inibir a atividade do CYP2E1. Especula-se que o mecanismo de proteção do sulfeto de dialila contra a hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno é por inibição da produção do intermediário NAPQI a partir do acetaminofeno. Estudos anteriores sugeriram, por inibição do consumo de glutationa reduzida nas células do fígado, que a ativação da oxidação, a disfunção mitocondrial e os danos no DNA causados pelo NAPQI podem ser reduzidos e, subsequentemente, minimizam o dano hepático induzido por acetaminofeno. Por exemplo, Panax notoginseng, adenosina e seus derivados adenosina monofosfato, adenosina difosfato e adenosina trifosfato podem evitar danos no fígado induzidos por acetaminofeno através deste mecanismo de proteção.
[0008] O fígado gorduroso é considerado outro fator que leva a danos no fígado. Em circunstâncias normais, a gordura é responsável por 3% do peso do fígado. Clinicamente, “doença do fígado gorduroso (FLD)” significa que a gordura no fígado excede 5% em peso do fígado, ou mais de 10% das células do fígado apresentam alterações gordurosas vesiculares nas secções do tecido hepático. De acordo com as causas das doenças, o fígado gorduroso pode ser dividido em doenças do fígado gorduroso alcoólico (AFLD), doenças do fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD), ou outras doenças do fígado alcoólico derivadas de outros fatores, tais como fármacos. As doenças de fígado gorduroso são caracterizadas patologicamente pelo aparecimento de metamorfose gordurosa ou esteatose, esteato-hepatite ou semelhantes. Pela porcentagem de células hepáticas que sofrem de esteatose, o fígado gorduroso é categorizado como leve (<33%), moderado (33-66%) e grave (> 66%). Anteriormente, o fígado gorduroso era considerado uma condição benigna e reversível, e, portanto, menos levado a sério, mas estudos recentes descobriram que ele levaria a fibrose hepática grave e cirrose e até câncer de fígado. Como a população de pessoas obesas aumenta, a prevalência de FLD também aumenta.
[0009] A principal causa de doenças do fígado em países europeus e americanos é devido ao consumo excessivo crônico de bebidas, portanto, a grande maioria das doenças do fígado são causadas por lesões por álcool. Mas, nos últimos 15 a 20 anos, NAFLD se tornou a primeira causa de doenças a serem consideradas para disfunção hepática em países europeus e americanos. Thaler já havia descrito NAFLD em 1962. Em 1980, Ludwig propôs “Esteato-hepatite não-alcoólica (NASH)” de NAFLD conjunta que ele encontrou em um grupo de pacientes femininas obesas com diabetes e hiperlipidemia. Posteriormente, em 1986, Schaffner enfatizou novamente que NASH desempenhou um papel importante no mecanismo de derivação da fibrose no curso de NAFLD. Até 1998, Day descobriu que 15-50% dos pacientes com NASH eram acometidos por diferentes graus de derivação de fibrose, então os médicos começaram a prestar atenção à NAFLD. Hoje, além da AFLD, a NASH não é apenas um estágio na progressão natural da NAFLD na prática clínica. Devido à presença de NASH, a NAFLD não é mais considerada uma doença hepática benigna.
[00010] Com relação ao mecanismo DE NAFLD, Day e James no Reino Unido propuseram a hipótese de múltiplas mutações baseada em um grande número de pesquisas clínicas e experimentos com animais. O fígado gorduroso ocorre na primeira mutação, e a esteato-hepatite ocorre no segundo mutação. A primeira mutação é causada pelo acúmulo excessivo de gordura no fígado, que é causado pela obesidade, hiperlipidemia, etc. A segunda mutação é devido ao estresse oxidativo e o efeito de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mitocôndria, resultando em peroxidação lipídica na membrana celular do fígado, liberação de citocinas inflamatórias originais e radicais livres, e fibrose devido à ativação das células estreladas, e levando à necrose das células do fígado. O mecanismo de NASH envolve a peroxidação de triglicerídeos, estresse oxidativo, resposta a ROS, aumento da peroxidação de lipídios nas células hepáticas, ou aumento de citocinas e enzimas hepáticas, levando a uma série de interações autoimunes.
[00011] As causas do fígado gorduroso estão principalmente associadas à ingestão excessiva a longo prazo de gordura animal, proteína, carboidratos, excesso de calorias transformando-se em gordura acumulada no corpo, conduzindo à obesidade e ao fígado gorduroso. Pacientes com esteatose hepática podem apresentar valores normais de GOT/GPT no sangue. Portanto, um diagnóstico correto de fígado gorduroso deve usar a ultrassonografia abdominal, que atualmente fornece mais de 97% de precisão.
[00012] Atualmente, não existe um fármaco ideal que proporcione efeitos terapêuticos específicos para FLD, cujas diretrizes de tratamento visam melhorar os potenciais fatores de risco ou controlar o progresso de doenças crônicas usando fármacos. Recomenda-se a aplicação de tratamentos sintomáticos de acordo com as causas do fígado gorduroso. Por exemplo, aqueles que sofrem de fígado gorduroso causado pelo excesso de peso devem perder peso moderadamente. Qualquer um com fígado gorduroso alcoólico precisa parar de beber e comer uma dieta equilibrada para melhorar as condições. Substâncias químicas ou fármacos que danificam o fígado e levam a doenças de fígado gorduroso através de contato de longo prazo devem ser imediatamente parar de usar. O fígado gorduroso causado por doenças, tal como hepatite C, alto teor de gordura no sangue, etc., deve ser tratado por tratar doenças originais, tais como, tratar hepatite C ou o controle dos lipídios sanguíneos. No entanto, se triglicerídeos excessivos são devido a fatores físicos, é difícil melhorar as doenças do fígado gorduroso, perdendo peso.
[00013] No entanto, os fármacos atuais que são comumente usados na clínica para baixar os triglicerídeos e o colesterol no soro são frequentemente acompanhados de efeitos colaterais, por exemplo, hepatotoxicidade, miopatia, tal como, mialgia, miosite, rabdomiólise e semelhantes. Em relação a fármacos hipolipemiantes, a toxicidade muscular é o efeito colateral mais notável. Especialmente, as estatinas mostram a maior ocorrência de toxicidade muscular, e o ácido fíbrico segue. Além disso, os fármacos hipolipemiantes têm um efeito “direcionador de gordura”, que “direciona” os lipídeos sanguíneos para o fígado, onde o acúmulo de gordura já existe e o influxo de lipídios é difícil de ser processado, levando ao acúmulo excessivo de gordura no fígado e tornando o fígado gorduroso pior. Pode ser visto que os fármacos hipolipemiantes não são adequados para o tratamento de FLD.
[00014] Em um aspecto, a presente invenção fornece novos compostos, cuja estrutura é representada pela fórmula (I) a seguir
s em que L é um grupo alifático saturado ou insaturado; R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo poliol e um grupo sacarídeo de (G)p, em que G é um resíduo de monossacarídeo e p é um número inteiro de 1 a 100, em que pelo menos um dos grupos hidroxila em (G)p é substituído por um átomo de halogênio; e Q é um número inteiro de 2 a 4, e cada um de R é o mesmo ou diferente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00015] Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção são representados pela fórmula (II) da seguinte forma:
em que X é C=O; R1 e R2 são iguais ou diferentes, selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo poliol e um grupo sacarídeo de (G)p, em que G é um resíduo de monossacarídeo e p é um número inteiro de 1 a 100, em que pelo menos um dos os grupos hidroxila em (G)p é substituído por um átomo de halogênio, em que quando R1 é hidrogênio, então R2 não é hidrogênio; e m é um inteiro de 1 a 40.
[00016] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos compostos como aqui descritos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00017] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento administrando a um indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de pelo menos um dos compostos como descritos aqui ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00018] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar uma doença ou condição distinguida pelo aumento das atividades do citocromo P450 ou níveis de radicais livres aumentados em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00019] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar lesões de órgãos em um indivíduo em necessidade.
[00020] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar hepatotoxicidade em um indivíduo em necessidade.
[00021] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar o fígado gorduroso, proteger a função do fígado ou melhorar doenças do fígado causadas por fígado gorduroso ou outros distúrbios associados.
[00022] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece o uso dos compostos como aqui descritos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para a fabricação de um medicamento. Em particular, o medicamento é útil na prevenção ou no tratamento (i) de uma doença ou uma condição distinguida pelo aumento das atividades do citocromo P450 ou aumento do nível dos radicais livres, (ii) lesões de órgãos e/ou (iii) hepatotoxicidade e/ou (iv) evitar ou tratar fígado gorduroso, proteger a função do fígado ou melhorar doenças do fígado causadas por fígado gorduroso ou outros distúrbios associados.
[00023] Os detalhes de uma ou mais formas de realização da invenção são apresentados na descrição abaixo. Outras características ou vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias formas de realização, e também das reivindicações anexas.
[00024] O sumário anterior, bem como a descrição detalhada a seguir da invenção, será melhor compreendido quando lido em conjunto com os desenhos anexos. Com a finalidade de ilustrar a invenção, são mostrados nos desenhos formas de realização que são presentemente preferidas. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não está limitada aos arranjos e instrumentos precisos mostrados.
[00025] Nos desenhos:a Fig. 1 mostra a percentagem de pró-fármaco que permanece ou a sua formação de metabólitos relacionados no sangue (in vitro).
[00026] A Fig. 2 mostra o perfil de concentração plasmática vs. tempo para pró-fármaco e sucralose após administração oral de pró-fármaco em ratos SD.
[00027] A Fig. 3 mostra o perfil de concentração plasmática vs. tempo para manitol após administração oral de pró-fármaco em ratos SD.
[00028] A Fig. 4 mostra os resultados da coloração H & E dos tecidos do fígado em animais. (A) o controle normal, (B) o grupo de controle de lesões hepáticas induzidas por APAP, (C) o grupo de controle positivo de tratamento com NAC, (D) o grupo experimental de tratamento com manitol (1,67 mg/kg), (E) o grupo experimental de tratamento com sucralose (1,67 mg/kg), (F) o grupo experimental de tratamento com manitol (2,51 mg/kg) mais sucralose (2,51 mg/kg), (G) o grupo experimental de tratamento com manitol (3,34 mg/kg) mais sucralose (3,34 mg/kg) e (H) o grupo experimental de tratamento com NAC e uma combinação de manitol (3,34 mg/kg) e sucralose (3,34 mg/kg).
[00029] A Fig. 5 mostra secções de tecido de fígado retiradas de camundongos que foram induzidas a fígado gorduroso, e depois tratadas com diferentes compostos de teste por grupos por quatro semanas.
[00030] A Fig. 6 mostra um esquema geral do processo de síntese do composto da presente invenção.
[00031] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como é comumente entendido por um habilitado na técnica ao qual esta invenção pertence.
[00032] Como usado aqui, os artigos “um” e “uma” referem-se a um ou mais do que um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento. I. Compostos
[00033] Em um aspecto, a presente invenção fornece novos compostos, cuja estrutura é representada pela fórmula (I) a seguir:
em que L é um grupo alifático saturado ou insaturado; R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo poliol e um grupo sacarídeo de (G)p, em que G é um resíduo de monossacarídeo e p é um número inteiro de 1 a 100 em que pelo menos um dos grupos hidroxila em (G)p é substituído por um átomo de halogênio; e Q é um número inteiro de 2 a 4, e cada um de R é igual ou diferente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00034] O termo “grupo alifático” ou “grupo alifático”, como usado aqui, denota uma porção de hidrocarboneto que pode ser de cadeia linear (isto é, não ramificada), ramificada ou cíclica (incluindo policíclica fundida, em ponte e fundida em espiro) e pode ser completamente saturada ou pode conter uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromática. Em geral, os grupos alifáticos contêm 1-40 átomos de carbono. Em algumas formas de realização, os grupos alifáticos contêm 1-20 átomos de carbono, ou 1-12 átomos de carbono, 1-8 átomos de carbono, ou 1-4 átomos de carbono. Em algumas formas de realização, os grupos alifáticos contêm 3-20 átomos de carbono, ou 3-12 átomos de carbono, 3-8 átomos de carbono, ou 3-4 átomos de carbono. Grupos alifáticos adequados incluem, mas não estão limitados a, grupos alquila, alquenila, e alquinila lineares ou ramificados, e híbridos dos mesmos, tais como, (cicloalquil)alquila, (cicloalquenil)alquila ou (cicloalquil)alquenila.
[00035] Em certas formas de realização, o grupo L na Fórmula (I) é selecionado a partir de (a) um grupo alquila linear, (b) um grupo alquila ramificado, (c) um grupo alquila linear substituído com um anel benzeno, (d) um grupo alquila ramificado substituído com um anel benzeno, (e) um grupo benzenila em que o anel benzeno contém um grupo alifático de cadeia linear, e (f) um grupo benzenila em que o anel benzeno contém uma cadeia ramificada do grupo alifático.
[00036] O termo “grupo poliol”, como usado aqui, indica um álcool contendo múltiplos grupos hidroxila (dois ou mais grupos hidroxila) por molécula. Em particular, o grupo poliol pode ser linear ou circular, substituído ou não substituído, ou misturas dos mesmos, desde que o complexo resultante seja solúvel em água e farmaceuticamente aceitável.
[00037] Em algumas formas de realização, o grupo poliol é um poliol C3-24, particularmente, um poliol C3-20, mais particularmente, um poliol C3-12, ou um poliol C3-12, contendo 2 ou mais grupos hidroxila.
[00038] Em formas de realização mais particulares, o grupo poliol é representado por -CH(CHOH)nCH2OH, em que n é 1-22, 1-18, 1-10 ou 1-6. Em um certo exemplo, n é 4.
[00039] Os polióis preferidos são álcoois de açúcar. Exemplos de poliós incluem, mas não se limitam a, polióis de 3 carbonos (por exemplo, glicerol, eritritol e treitol); polióis de 5 carbonos (por exemplo, arabitol, xilitol e ribitol); polióis de 6 carbonos (por exemplo, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol, iditol e inositol); polióis de 12 carbonos (por exemplo, volemitol, isomalte, maltitol e lactitol); polióis de 18 carbonos (por exemplo, maltotriitol); e polióis de 24 carbonos (maltotetraitol).
[00040] Na Fórmula (I), G representa um resíduo de monossacarídeo. O monossacarídeo, como aqui usado, é de preferência um monossacarídeo de 6 carbonos tendo a fórmula química C6H12O6 (isto é, hexose). A hexose pode estar na configuração D, na configuração L ou em uma combinação das mesmas. As hexoses são tipicamente classificadas por grupos funcionais. Por exemplo, as aldohexoses possuem um aldeído na posição 1, tal como, alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose e talose; e cetohexoses possuem uma cetona na posição 2, tal como, psicose, frutose, sorbose e tagatose. Uma hexose também contém 6 grupos hidroxila e o grupo funcional aldeído ou cetona na hexose pode reagir com grupos funcionais hidroxila vizinhos para formar hemiacetais ou hemicetais intramoleculares, respectivamente. Se o açúcar cíclico resultante é um anel de 5 membros, é uma furanose. Se o açúcar cíclico resultante é um anel de 6 membros, é uma piranose. O anel abre e fecha espontaneamente, permitindo que a rotação ocorra em torno da ligação entre o grupo carbonila e o átomo de carbono vizinho, produzindo duas configurações distintas (α e β). A hexose pode estar na configuração S ou na configuração R.
[00041] De acordo com a presente invenção, pelo menos um dos grupos hidroxila no um ou mais resíduos monossacarídeos na fórmula (I) é substituído por um átomo de halogênio. Exemplos do átomo de halogênio incluem cloro, bromo e iodo. Especificamente, o átomo de halogênio é cloro.
[00042] Como usado aqui, o termo “S” ou “R” é uma maneira de nomear um isômero óptico por sua configuração, sem envolver uma molécula de referência, que é chamada de sistema R/S. Ele rotula cada centro quiral R ou S de acordo com um sistema pelo qual seus ligantes recebem uma prioridade, de acordo com as regras de prioridade de Cahn Ingold Prelog, com base no número atômico. Este sistema rotula cada centro quiral em uma molécula (e também tem uma extensão para moléculas quirais que não envolvem centros quirais). Se o composto tem dois centros quirais, pode ser marcado, por exemplo, como um isômero (S,S) versus um isômero (S,R).
[00043] Como usado aqui, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” inclui sais de adição de ácido. “Sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis” referem-se aos sais que retêm a eficácia biológica e propriedades das bases livres, que são formadas com ácidos inorgânicos, tais como, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes e ácidos orgânicos, tais como, ácido acético, ácido propiônico, ácido pirúvico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido trifluoroacético e semelhantes.
[00044] Em algumas formas de realização, na Fórmula (I), q é 2, 3 ou 4, pelo menos, um do grupo R é diferente de outro R.
[00045] Em certas formas de realização, na fórmula (I), q é 2.
[00046] Em tais formas de realização, o composto da presente invenção pode ser representado pela fórmula (II) a seguir:
em que X é C=O; R1 e R2 são iguais ou diferentes, selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo poliol e um grupo sacarídeo de (G)p, em que G é um resíduo de monossacarídeo e p é um número inteiro de 1 a 100 em que pelo menos um dos os grupos hidroxila em (G)p são substituídos por um átomo de halogênio, em que quando R1 é hidrogênio, então R2 não é hidrogênio; e m é um inteiro de 1 a 40. ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00047] Em certas formas de realização, na fórmula (II), R1 é o grupo poliol e R2 é o grupo sacarídeo de (G)p. Nesse caso, o composto de Fórmula (II) é considerado como um conjugado da porção poliol ligada à porção açúcar por um ligante através de ligações éster. Em particular, o ligante é representado por -O-X-(CH2)m-X-O- (Fórmula (L)), em que X é C=O e m é 140, 1-20, 1-12, 1-8 ou 1-4, mais particularmente, m é 3-20, 3-12, 3-8 ou 3-4. Em um certo exemplo, m é 4.
[00048] Em algumas formas de realização, p é 2. O grupo sacarídeo é representado por - G1-O- G2, em que G1 e G2 são iguais ou diferentes, selecionados do grupo que consiste em uma aldoexose e uma cetohexose, e pelo menos um dos grupos hidroxila em G1 ou pelo menos um dos grupos hidroxila em G2 é substituído por um átomo de halogênio.
[00049] Em algumas formas de realização, G1 é glicose em que um dos grupos hidroxila é substituído por cloro; e G2 é frutose em que dois dos grupos hidroxila são substituídos por cloro.
[00050] Em certas formas de realização, o grupo sacarídeo é representado pela fórmula (Ia)
[00051] Alguns exemplos do composto da presente invenção são os seguintes: ((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6-penta-hidroxi-hexil)adipato de ((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-bis(clorometil -3,4-di-hidroxitetra- hidrofurano-2-il)oxi)-3-cloro-4,5-di-hidroxitetra-hidro-2H-piran-2-il)metila
C6-manitol de Fórmula 2
[00052] Em outro aspecto, a presente intermediário de fórmula C da seguinte forma:
em que Ph é fenila e Bn é benzila.
[00053] O composto de Fórmula (I) pode ser quimicamente sintetizado, por exemplo, por um processo como mostrado no esquema geral da Fig. 6.
[00054] Em particular, é fornecido um agente ligante que pode fornecer um ou mais grupos -COOH para realizar a esterificação com um álcool. Na etapa 1, o agente ligante fornecendo um primeiro grupo -COOH (outros, se disponíveis, são protegidos) reage com R tendo um primeiro grupo hidroxila livre (outros, se disponíveis, são protegidos) para prosseguir com a primeira esterificação, produzindo o composto de Fórmula (I) onde q é 1. Na etapa 2, o agente de ligação que fornece um segundo grupo -COOH (outros, se disponíveis, são protegidos) reage com R tendo um segundo grupo hidroxila livre (outros, se disponíveis estão protegidos) para prosseguir com a segunda esterificação, produzindo o composto de fórmula (I) em que q é 2. Na etapa 3, o agente ligante que proporciona um terceiro grupo -COOH (outros, se disponíveis, são protegidos) reage com R tendo um terceiro grupo hidroxila livre (outros, se disponíveis estão protegidos) para prosseguir com a terceira esterificação, produzindo o composto de Fórmula (I) onde q é 3. Na etapa 4, o agente ligante fornecendo um quarto grupo -COOH (outros se disponíveis são protegidos) reage com R tendo um quarto grupo hidroxila livre (outros se disponíveis são protegidos) para prosseguir com a terceira esterificação, produzindo o composto de Fórmula (I) onde q é 4.
[00055] Em algumas formas de realização, o agente de ligação para realizar a esterificação é representado pela fórmula (La)
em que X e m são como definidos acima, e P1 e P2 são iguais ou diferentes e são um grupo protetor ou H.
[00056] Em algumas formas de realização, o agente de ligação para realizar a esterificação é representado pela fórmula (La)
[00057] Como aqui usado, um “grupo protetor” é um grupo químico que está afixado a uma porção funcional (por exemplo ao oxigênio em um grupo hidroxila ou ao nitrogênio em um grupo amino, substituindo o hidrogênio) para proteger o grupo funcional de reagir de maneira indesejada. Um grupo protetor inclui, por exemplo, um grupo t-butila, um grupo cicloalquila (por exemplo, grupo ciclo-hexila), um grupo arila (por exemplo, grupo 2,4-dinitrofenila), um grupo aralquila (por exemplo, grupo benzila, grupo 2,6-diclorobenzila, grupo 3-bromobenzila, grupo 2-nitrobenzila, grupo 4-dimetilcarbamoilbenzila e grupo trifenilmetila), um grupo tetra- hidropiranila, um grupo acila, um grupo alcoxicarbonila (por exemplo, grupo t-butoxicarbonila), um grupo aralquiloxicarbonila (por exemplo, grupo benziloxicarbonila), grupo 2-bromobenziloxicarbonila), um grupo dialquilfosfinotioil (por exemplo, grupo dimetilfosfinotioil) e um grupo diarilfosfinotioil (por exemplo, grupo difenilfosfinotioil). Um grupo protetor preferido inclui um grupo acila e semelhantes.
[00058] Em um certo exemplo, o esquema 1 é fornecido no Exemplo 1, mostrando o processo de síntese particular do composto da presente invenção.
[00059] Os compostos da invenção podem ser usados como um medicamento para métodos de tratamento. Em geral, o composto de Fórmula (I) atua como um pró-fármaco que, após administração, pode transformar-se em metabólitos, proporcionando efeitos terapêuticos, conforme necessário, como aqui descrito. Em um exemplo, o composto de Fórmula (I) é o composto F, que após administração pode ser transformado em manitol, sucralose e C6-manitol, os quais podem atuar como inibidores de P450 e proporcionar efeitos anti-hepatotoxicidade, por exemplo. Veja os exemplos abaixo.
[00060] A presente invenção proporciona um método de tratamento administrando a um indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de pelo menos um dos compostos como aqui descritos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00061] Verifica-se que os compostos da invenção são eficazes como inibidores de P450, por exemplo.
[00062] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar uma doença ou condição distinguida pelo aumento das atividades do citocromo P450 em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00063] Exemplos de tais doenças ou condições estão listados na Tabela A.Tabela A
[00064] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar uma doença ou condição distinguida por níveis aumentados de radicais livres em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[00065] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar lesões de órgãos em um indivíduo em necessidade.
[00066] Em exemplos particulares, as lesões orgânicas são no fígado ou nos rins.
[00067] Em exemplos particulares, lesões de órgãos ou hepatotoxicidade são causados por um fármaco terapêutico, CCl4 ou acúmulo de lipídeos.
[00068] Em exemplos particulares, o fármaco terapêutico é acetaminofeno.
[00069] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar hepatotoxicidade em um indivíduo em necessidade.
[00070] Em algumas formas de realização, o método da presente invenção é fornecido para evitar ou tratar o fígado gorduroso, protegendo a função do fígado ou melhorando doenças do fígado causadas por fígado gorduroso ou outros distúrbios associados.
[00071] Como aqui usado, o termo “teor de gordura no fígado” refere- se ao teor de gordura que é acumulado no fígado de um indivíduo e inclui lipídios amplamente definidos, tais como triglicerídeos (TG) e colesterol. Como aqui usado, o termo “redução do teor de gordura no fígado” refere-se geralmente à redução do teor de gordura hepática anormal em um indivíduo, ou seja, para diminuir o teor de gordura hepática anormal e, mais particularmente, para diminuir o teor de gordura hepática anormal para o nível normal. Por exemplo, sob circunstâncias normais, a gordura é responsável por 3% do peso do fígado. Se a gordura no fígado excede 5% do peso do fígado, ela é determinada como acúmulo anormal de gordura (o teor de gordura hepática descrito acima é uma porcentagem relativa para exemplificação e pode variar devido à etnia e outros fatores). Em um aspecto específico, o termo “redução do teor de gordura do fígado” aqui usado pode significar que o teor de gordura hepática anormal em um indivíduo é reduzido, por exemplo, de 5% em peso do fígado ou mais para 3% em peso do fígado. O teor de gordura hepática pode ser avaliado por métodos analíticos padrão, incluindo, mas não se limitando a, ultrassonografia, imagem por ressonância magnética (MRI), espectroscopia por ressonância magnética (MRS), tomografia computadorizada (TC) e biópsia hepática.
[00072] Como aqui usado, o termo “função hepática” refere-se a uma ou mais funções fisiológicas realizadas pelo fígado. A função hepática pode ser analisada por vários ensaios convencionais, como a análise de alanina aminotransferase (ALT) ou a aspartato transaminase (AST). De acordo com a presente invenção, o composto aqui descrito pode ser usado para manter a função hepática, incluindo a melhoria da função hepática e a prevenção do dano do fígado.
[00073] Como usado aqui, o termo “doenças do fígado” refere-se a lesão de células do fígado ou danos causados por certos fatores, que então potencialmente levam à disfunção do fígado. De acordo com a presente invenção, o composto aqui proposto pode ser usado para melhorar doenças do fígado causadas por fígado gorduroso em algumas formas de realização. Mais particularmente, “dano no fígado” aqui usado refere-se a fígado com disfunção histológica ou bioquímica, em comparação com o fígado normal. Em uma forma de realização específica, “danos no fígado” refere-se a lesões no fígado causadas por fatores alcoólicos ou não alcoólicos, tais como, dieta rica em gordura ou obesidade, ou fármacos terapêuticos ou solventes orgânicos. Em uma forma de realização específica, “danos no fígado” podem ser danos no tecido do fígado com uma ou mais características selecionadas de esteatose, inflamação lobular, balonização hepatocelular e gotículas de gordura vesicular produzidas pelas células do fígado. Em uma forma de realização específica, “danos no fígado” pode ser uma disfunção bioquímica do fígado, que pode ser determinada a partir da atividade da alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato transaminase (AST). Maior atividade de ALT ou AST indica disfunção grave da função bioquímica do fígado.
[00074] Como usado aqui, o termo “atividade antioxidante do fígado” refere-se à atividade ou capacidade contra o estresse oxidativo. A melhoria da atividade antioxidante do fígado de um indivíduo pelo composto de acordo com a presente invenção refere-se a, inclui, mas não está limitada, à redução do estresse oxidativo ou à intensificação da atividade enzimática ou ao aumento do teor dos membros de sistemas antioxidantes. Os membros de sistemas antioxidantes podem ser glutationa peroxidase (GPx), glutationa (GSH), glutationa redutase (GRd) e/ou superóxido dismutase (SOD).
[00075] De acordo com a presente invenção, o composto aqui descrito inclui excipientes e bioflavonóides comuns, que podem ser usados para reduzir o teor de gordura no fígado e melhorar distúrbios associados. O termo “distúrbios associados” aqui descrito inclui os distúrbios causados pelo acúmulo anormal de gordura hepática e incluindo, mas não se limitando a doenças do fígado, doenças do fígado alcoólico agudas e crônicas, doenças do fígado gorduroso não alcoólico agudas e crônicas, hepatite alcoólica aguda e crônica, esteato-hepatite não alcoólica aguda e crônica, cirrose não alcoólica e cirrose alcoólica (Códigos de Diagnóstico CID-9-CM: 571,8; 571,0; 571,1; 571,2; 571,3; 571,4; 571,5; 571,9).
[00076] Como usado aqui, o termo “prevenção” refere-se a medidas preventivas para uma doença ou sintomas ou condições de uma doença. As medidas preventivas incluem, mas não se limitam a, aplicar ou administrar um ou mais agentes ativos a um indivíduo que ainda não tenha sido diagnosticado como um paciente que sofre da doença ou de sintomas ou condições da doença, mas pode ser suscetível ou propenso à doença. A finalidade das medidas preventivas é prevenir, evitar ou adiar a ocorrência da doença ou de sintomas ou condições da doença.
[00077] Como usado aqui, o termo “tratar” refere-se a medidas terapêuticas para uma doença ou sintomas ou condições de uma doença. As medidas terapêuticas incluem, mas não se limitam a, aplicar ou administrar um ou mais agentes ativos a um indivíduo que sofre a doença ou possui os sintomas ou as condições da doença ou exacerbação da doença. A finalidade das medidas terapêuticas é tratar, curar, reduzir, aliviar, alterar, remediar, melhorar, melhorar ou afetar a doença, os sintomas ou condições da doença, a incapacidade causada pela doença ou a exacerbação da doença.
[00078] Como usado aqui, um “inibidor de CYP2E1” é qualquer composto, substância ou material que possa inibir a atividade de CYP2E1.Estão disponíveis vários ensaios para análise da atividade de CYP2E1, tal como um ensaio com microssomas de fígado humano ou de rato.
[00079] Como usado aqui, um indivíduo em necessidade do tratamento de acordo com a invenção inclui mamíferos humanos e não humanos. Os mamíferos não humanos incluem, mas não estão limitados a, animais de estimação, tais como, gatos, cães e semelhantes, e animais de fazenda, tais como, gado, cavalos, ovelhas, cabras, suínos e semelhantes.
[00080] O termo “quantidade eficaz” ou similar refere-se àquela quantidade de um agente ativo suficiente para alcançar um efeito terapêutico, profilático e/ou biológico desejado em um indivíduo, tal como reduzir os efeitos colaterais induzidos pelo fármaco, ou proibir, melhorar, aliviar, reduzir ou evitar um ou mais sintomas ou condições ou progressão de uma doença. A quantidade eficaz real pode variar dependendo de várias razões, tais como, a via e frequência de administração, peso corporal e espécies do indivíduo que recebe o referido fármaco, e finalidade da administração. Pessoas habilitadas na técnica podem determinar a dosagem em cada caso com base na descrição aqui, métodos estabelecidos e sua própria experiência.
[00081] O termo “uma dose padrão”, como aqui usado, refere-se a uma dose eficaz de um agente terapêutico que é recomendada por fontes autorizadas na comunidade farmacêutica, incluindo a Food and Drug Administration e frequentemente usada na prática rotineira. O termo “dose reduzida”, como é usado no presente documento, refere-se a uma dose que é mais baixa que uma dose padrão, mas ainda retém substancialmente os mesmos efeitos terapêuticos do mesmo agente terapêutico. Especificamente, de acordo com a invenção, uma dose reduzida de um fármaco terapêutico é de cerca de 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 50% ou menos, da dose terapêutica padrão do fármaco terapêutico.
[00082] Em algumas formas de realização, uma quantidade eficaz de ingredientes ativos, como usado aqui, pode ser formulado com um carreador farmaceuticamente aceitável em uma composição farmacêutica de uma forma apropriada para a finalidade de ministração e absorção.
[00083] Como aqui usado, “farmaceuticamente aceitável” significa que o carreador é compatível com o ingrediente ativo na composição e, de um modo preferido, pode estabilizar o referido ingrediente ativo e é seguro para o indivíduo que recebe o tratamento. O referido carreador pode ser um diluente, veículo, excipiente ou matriz para o ingrediente ativo. A composição pode adicionalmente compreender lubrificantes; agentes umectantes; agentes emulsionantes e de suspensão; conservantes; adoçantes; e agentes flavorizantes. A composição da presente invenção pode proporcionar o efeito de liberação rápida, continuada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao paciente.
[00084] De acordo com a presente invenção, a forma da referida composição pode ser comprimidos, pílulas, pó, pastilhas, pacotes, trociscos, elixires, suspensões, loções, soluções, xaropes, cápsulas de gelatina moles e duras, supositórios, fluido de injeção esterilizado, e pó acondicionado.
[00085] A composição da presente invenção pode ser ministrada através de qualquer via fisiologicamente aceitável, tal como os métodos oral, parentérico (tal como intramuscular, intravenoso, subcutâneo e intraperitoneal), transdérmico, supositório e intranasal. Em relação à administração parentérica, é de preferência usado na forma de uma solução aquosa estéril, o que pode compreender outras substâncias, tais como sais ou glucose, suficientes para tornar a solução isotônica para o sangue. A preparação de uma composição parentérica apropriada sob condições estéreis pode ser realizada com técnicas farmacológicas convencionais bem conhecidas pelos habilitados na técnica, e não é necessário trabalho criativo extra.
[00086] Em certas formas de realização, o composto de Fórmula (I) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser usado na prevenção ou no tratamento de lesões em órgãos, por exemplo, no fígado ou rim, que pode ser causada por superdosagem de fármacos terapêuticos (por exemplo, paracetamol) ou exposição ao álcool, um agente químico, uma biomolécula ou qualquer substância que possa causar efeitos tóxicos nesses órgãos.
[00087] Especificamente, lesões no fígado podem incluir lesões, danos ou perda de células ou tecidos hepáticos, levando a funções anormais do fígado ou conteúdo de proteínas do fígado. Em algumas formas de realização, as lesões hepáticas, como aqui descritas, são lesões hepáticas agudas que significam lesões hepáticas de início relativamente rápido, por exemplo, menos de 12 semanas, particularmente menos de 6 semanas de duração do tempo de início dos sintomas. Em algumas formas de realização, os pacientes com lesões hepáticas agudas não têm antecedentes de doenças hepáticas crônicas.
[00088] Especificamente, lesões no rim podem incluir lesões, danos ou perda de células ou tecidos renais, levando a funções renais anormais. Tais lesões renais podem ser identificadas, por exemplo, por uma diminuição na taxa de filtração glomerular, uma redução na produção de urina, um aumento na creatinina sérica, um aumento na cistatina C sérica, etc. Em algumas formas de realização, as lesões renais como descritas aqui são lesões renais agudas, que podem significar um declínio abrupto ou rápido na função de filtração renal, por exemplo, dentro de 14 dias, preferivelmente dentro de 7 dias, mais preferivelmente dentro de 72 horas, e ainda mais preferencialmente dentro de 48 horas.
[00089] Em uma forma de realização particular, o composto de Fórmula (I) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é capaz de evitar ou tratar uma condição indesejada causada por NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imina).
[00090] Por conseguinte, a presente invenção proporciona o uso do composto de fórmula (I) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para a fabricação de um medicamento para evitar ou tratar uma condição indesejada causada por NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imina). A presente invenção proporciona também um método para evitar ou tratar uma condição indesejada causada por NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imina) em um indivíduo em necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo o composto de Fórmula (I) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em uma quantidade eficaz para evitar ou tratar a condição indesejada.
[00091] O composto da presente invenção e/ou seus metabólitos podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais, particularmente aqueles que atuam como inibidores de P450 e/ou proporcionam atividades anti-hepatotoxicidade e/ou aqueles com atividade anti-gordura do fígado, de modo a proporcionar um efeito sinergísitco, por exemplo.
[00092] Alguns agentes ativos atuando como inibidores de P450 (denominados “um primeiro agente(s) ativo(s)”) são descritos em PCT/CN2013/087049 (USSN 14/441.317, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Exemplos particulares de tais inibidores do P450 incluem, mas não se limitam a, monolaurato de polietileno glicol sorbitano (Tween 20), celulose microcristalina, fosfato dicálcico di-hidratado, Brij 35, sacarina, manitol, Cremophor RH40, sucralose, crospovidona, glicolato de amido de sódio, Eudragit S100, croscarmelose sódica, Pluronic F68, mentol, hidroxipropil celulose de baixa substituição, amido pré- gelatinizado, Dextratos NF hidratado, ácido cítrico, Cremophor EL, Aerosil 200, Myrj 52, ácido sórbico, óleo de limão, hidroxipropil celulose, Sorbitol, acessulfame potássico, hidroxipropil metilcelulose, lactose mono-hidratada, maltodextrina, Brij 58, Brij 76, Tween 80 , Tween 40, PEG 400, PEG 4000, PEG 8000, Span 60, benzoato de sódio, hidroxi etilmetilcelulose, metilcelulose, Span 80, ciclamato de sódio, beenato de glicerila, vermelho óxido, monoestearato de glicerina, Copovidona K28, acetato de amido, estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, Providona K30, PEG 2000 e N- acetilcisteína (NAC) e qualquer combinação dos mesmos.
[00093] Em certas formas de realização, o um ou mais primeiros agentes ativos a serem usados em combinação com o composto de Fórmula (I) da presente invenção são selecionados a partir do grupo que consiste em fosfato dicálcico desidratado, mentol, manitol, sucralose, N- acetilcisteína (NAC) e qualquer combinação dos mesmos.
[00094] Alguns agentes ativos com atividade anti-gordura do fígado (denominados “um segundo agente ativo”) são descritos em PCT/CN2016/078039, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Exemplos particulares de agentes ativos com atividade anti- gordura do fígado incluem mas não estão limitados (ii) um segundo agente ativo selecionado do grupo que consiste em: lauril sulfato de sódio, mentol, sucralose, manitol, sorbitol, sacarina, glicerina, benzoato de sódio, vermelho óxido, amido pré-gelatinizado, ciclamato de sódio, ácido sórbico, óleo de limão, ácido cítrico, hidroxianisol butilado, poncirin, isovitexina, eriodictiol, ergosterol, β-mirceno, hiperosídeo, (+)-catequina, galangina, morina, esciadopitisina, didimina, gossipina, luteolin-7-glicosídeo, (+)-taxifolina, ácido transcinâmico, diosmina, linarina, xilitol, luteolina, swertiamarina, puerarina, florizina, sinensetina, (-)-epigalocatequina, kaempferol, ácido ursólico, silimarina, (+)-limoneno, hesperidina, (-)-epicatequina-3-galato, silibina, formononetina, éster etílico do ácido mirístico, ácido eicosapentaenoico (EPA), wongonina, povidona K-30, ácido protocatecuico, umbeliferona, hesperitina, ácido nordi-hidroguaiaretico, neo-hesperidina, naringina, (-)-epicatequina, glicirrizina, baicalina, quercitrina, baicaleína e quaisquer combinações dos mesmos.
[00095] Em certas formas de realização, o um ou mais segundo(s) agente(s) ativo(s) a ser(em) usado(s) em combinação com o composto de Fórmula (I) da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em lauril sulfato de sódio, mentol, sucralose, manitol, sorbitol, sacarina, glicerina, benzoato de sódio, vermelho óxido, amido pré-gelatinizado, ciclamato de sódio, ácido sórbico, óleo de limão, ácido cítrico, hidroxianisol butilado, poncirina, isovitexina, eriodictiol, ergosterol, β-mirceno, hiperosídeo, (+)- catequina, galangina, morina, esciadopitisina, didimina, gossipina, luteolin-7- glucosídeo, (+)- taxifolina, ácido transcinâmico, diosmina, linarina, xilitol, luteolina, swertiamarina e quaisquer combinações dos mesmos.
[00096] Em certas formas de realização, o um ou mais segundo(s) agente(s) ativo(s) a ser(em) usado(s) em combinação com o composto de Fórmula (I) da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em puerarina, florizina, sinensetina, (-)-epigalocatequina, kaempferol, ácido ursólico, silimarina, (+)-limoneno, hesperidina, (-)-epicatequina-3-galato, silibina, formononetina, éster etílico do ácido mirístico, ácido eicosapentaenoico (EPA), wongonina, povidona K-30, ácido protocatecuico, umbeliferona, hesperitina, ácido nordi-hidroguaiarético, neo-hesperidina, naringina, (-)-epicatequina, glicirrizina, baicalina, quercitrina, baicaleína e quaisquer combinações dos mesmos.
[00097] Em certas formas de realização, um ou mais segundo(s) agente(s) ativo(s) a ser(em) usado(s) em combinação com o composto de Fórmula (I) da presente invenção é(são) selecionado(s) do grupo que consiste em eriodictiol, manitol, mentol, sucralose, sacarina e qualquer combinações dos mesmos.
[00098] Em certas formas de realização, um ou mais segundo(s) agente(s) ativo(s) a ser(em) usado(s) em combinação com o composto de Fórmula (I) da presente invenção é(são) selecionado(s) do grupo que consiste em (1) uma combinação de sacarina e manitol, (2 ) uma combinação de mentol e manitol, (3) uma combinação de sucralose e manitol, (4) uma combinação de eriodictiol e manitol, (5) uma combinação de eriodictiol e sucralose, (6) uma combinação de mentol, manitol e eriodictiol e (7) uma combinação de sucralose, manitol e eriodictiol.
[00099] Especificamente, o composto de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e o um ou mais agentes adicionais podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente.
[000100] Na presente invenção, é ainda desde que o composto de fórmula (I) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo seja capaz de evitar ou tratar uma condição indesejada causada por NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imina).
[000101] Como uma forma de realização particular, a presente invenção fornece uma combinação do composto de fórmula (I) e/ou seus metabólitos com N-acetilcisteína (NAC). A presente invenção também proporciona um método para administrar N-acetilcisteína (NAC) em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de NAC em combinação com o composto de Fórmula (I) e/ou seus metabólitos. Em uma forma de realização, a combinação ou o método da presente invenção é eficaz na prevenção ou no tratamento de uma doença ou um distúrbio para a(o) qual a NAC é eficaz. Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio a ser tratada(o) ou prevenida(o) pela NAC é selecionada do grupo que consiste em epilepsia mioclônica, síndrome do desconforto respiratório agudo, envenenamento por metais pesados, infecção por influenza, doença cardíaca, síndrome de Sjogren, bronquite crônica, epilepsia (tipo Unverricht-Lundborg) e infecção por HIV.
[000102] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que são fornecidos para fins de demonstração, em vez de limitação.
[000103] A estratégia sintética para a síntese da Fórmula 1 (Composto F) é mostrada no Esquema 1.Esquema 1
HMDS = hexametildissilazano TMSOTf = Trifluorometanossulfonato de trimetilsilila TBAF = Fluoreto de tetrabutilamônio THF = tetra-hidrofurano TMS = trimetilsilila DCC = diciclo-hexilcarbodiimida DMAP = 4-Dimetilaminopiridina DCM = diclorometano DMF = N,N’-dimetilformamida DIBAL = Di-isobutilalumínio Bn = éter benzílico
[000104] Todos os produtos químicos foram obtidos a partir de fontes comerciais e usados como recebidos, salvo indicação em contrário.
[000105] A pureza cromatográfica dos produtos foi avaliada em uma condição como a seguir: Composição da fase móvel A: Metanol: H2O = 5/95 (v/v), Contém NH4OH a 0,05% B: Metanol: H2O = 95/5 (v/v), Contém NH4OH a 0,05% Sistema de cromatografia:
[000106] A análise de MS foi realizada em uma condição a seguir: Configurações do espectrômetro de massa:Espectrômetro de Massa Triplo Quadrupolo MS (API Qtrap5500) Applied Biosystem, Inc. Detecção Modo negativo de MRM Pró-fármaco: m/z 688,9 → m/z 180,9
[000107] Espectrômetro de RMN Bruker AMX-500 em MeOH-d4 (δH 3,30; δC 49,0) ou CDCl3 (δH 7,24; δC 77,0) usando o programa de pulsos padrão de Bruker; nos experimentos HMQC e HMBC, Δ = 1 s e J = 140, 8 Hz, respectivamente, os mapas de correlação consistiram em 512 x 1 K pontos de dados por espectro, cada composto de 16 a 64 transientes.1.1 manitol (composto (i)) para composto (B) 1.1.1 manitol (composto (i)) para composto (i)-1
[000108] A uma solução de D-manitol (25g, 0,137 mol) em DMF (250 ml) foi adicionado benzaldeído (30 ml, 0,345 mmol) em t.a. sob Ar. À mistura foi adicionado ácido sulfúrico concentrado (10 mL) em gotas a 0°C. Depois de se deixar aquecer gradualmente até a temperatura ambiente, a mistura foi agitada por 3 dias. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada (250 mL) e n-hexano (200 mL) sob agitação vigorosa. Depois de aquecer a mistura até a temperatura ambiente, o precipitado foi filtrado e lavado com n-hexano. O precipitado foi colocado em suspensão em clorofórmio e aquecido sob refluxo por 15 min sob agitação vigorosa. Quando a mistura atingiu a t.a., o precipitado não dissolvido foi coletado e a recristalização a partir de EtOH obteve o produto desejado como um sólido branco (9,86 g, 20%), Rf = 0,45 (EA/Hex = 1/1).1.1.2 composto (i)-1 para composto (i)-2
[000109] A uma solução de 1,3,4,6-dibenzilideno (10 g, 27,9 mmol) em DMF (100 mL) foi adicionado brometo de benzila (7,96 mL, 66,96 mmol) em t.a. sob Ar. A mistura foi resfriada a 0°C, em seguida NaH a 60% (2,68 g, 66,96 mmol) foi adicionado em pouco tempo. Depois de se deixar aquecer gradualmente até a t.a., a mistura foi agitada durante a noite. Em seguida a reação foi extinta com água (em gotas) e extraída com NaHCO3(aq) e diclorometano. A camada orgânica foi seca com MgSO4, concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para proporcionar o produto desejado. (10,39 g, 69%). Rf = 0,2 (EA/Hex = 1/6).1.1.3 composto (i)-2 para composto (B)
[000110] Uma solução de 2,5-dibenzil-1,3,4,6-dibenzilideno (1,5 g, 2,78 mmol) em tolueno (12,5 mL) foi resfriada a -18°C (banho de gelo-sal). DIBAL a 1,2 M foi adicionado (18,5 mL, 22,3 mmol) em gotas e aquecido até a t.a. Após 1,5 h, a reação foi resfriada a 0°C, depois extinta por MeOH e KOH (aq) a 15%. A mistura foi extraída com DCM, a camada orgânica foi seca com MgSO4 e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para proporcionar o produto desejado. (709 mg, 47%). Rf = 0,1 (EA/HEX = 1/5).1.2 Sucralose (composto (ii)) para composto (D) 1.2.1 composto (ii) para composto (ii)-1
[000111] A uma solução de sucralose (1 g, 2,5 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado HMDS (2,6 mL, 12,57 mmol) e TMSOTf (45 L, 0,25 mmol). A reação foi agitada durante a noite em t.a. A reação foi concentrada em vácuo e passada através do algodão, lavada com hexano. O filtrado foi novamente concentrado em vácuo para obter o produto em quant. (1,9 g, quant.). Rf = 0,9 (EA/HEX = 1/8). 1.2.2 composto (ii)-1 para composto (D)
[000112] A uma solução de penta-TMS sucralose (5g, 6,6 mmol) em piridina (150 ml) foi adicionada solução de piridina-TsCl a 0,1 M (6,6 ml) e agitada por 3 dias com balão aberto. A reação foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em coluna em sílica gel para proporcionar o produto desejado (1,4 g 30%). Rf = 0,5 (EA/HEX = 1/8).1.3 Síntese de ácido 6-oxo-6-((2R,3R,4R)-2,3,4-tris(benziloxi)-4-(2-fenil-1,3-dioxolan-4-il)butoxi)hexanoico (composto (C))
[000113] Em um balão de R.B. seco em chama, o composto A (165 mg, 1 eq.) foi dissolvido em DCM (5 mL) a 0°C, a seguir adicionou-se piridina (0,2 mL) e DMAP (50 mg). A mistura reacional foi então agitada por 10 min, depois de B Comp. (59 mg, 1,5 eq.) foi adicionado. A mistura reacional foi então agitada em temperatura ambiente por 5 h. TLC confirmou a conclusão da reação. A mistura reacional foi evaporada até a secura do rotavapor sob pressão reduzida. O composto em bruto foi ainda purificado por cromatografia em coluna para proporcionar o composto desejado como um óleo incolor (136 mg, 67%).1.4 Síntese de ((2R,3R,4R)-2,3,4-tris(benziloxi)-4-(2-fenil-1,3-dioxolan-4- il)butil)adipato de ((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-bis(clorometil)-3,4- bis((trimetilsilil)oxi)tetrahidrofurano-2-il)oxi)-3-cloro-4,5- bis((trimetilsilil)oxi)tetra-hidro-2H-piran-2-il)metila
[000114] A solução gelada do composto C (100 mg, 1,0 eq.) Em DCM foi adicionado DCC (35 mg, 1,15 eq.) e agitada por 10 min. Em seguida, adicionou-se a este composto D (112 mg, 1,2 eq.) e DMAP (5 mg, 0,25 eq. catalítico). A mistura reacional foi deixada aquecer até a t.a. e agitada por 4 horas. TLC confirmou a conclusão da reação. A mistura reacional foi evaporada até à secura em rotavapor sob pressão reduzida. O composto bruto foi então purificado por cromatografia em coluna usando sílica gel neutra de 5 a 15% de acetato de etilo em Hexano com 1% de trietil amina como um eluente para proporcionar o composto desejado E como um óleo incolor (84 mg, 42%).1.5 Síntese de ((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6-penta-hidroxi-hexil)adipato de ((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-bis(clorometil)-3,4-di-hidroxitetra- hidrofurano-2-il)oxi)-3-cloro-4,5-di-hidroxi-tetra-hidro-2H-piran-2- il)metila (composto F)
[000115] Em chama seca, um frasco de balão R.B. de gargalo único (500 mg, 1 eq.) foi dissolvido em MeOH seco (20 mL), a solução foi então desgaseificada por nitrogênio gasoso (seringa de gás nitrogênio estava dentro da solução e Nitrogênio foi purgar por 15 min.). Em seguida, 10% de Pd-C (200 mg, 33% p/p) foram adicionados cuidadosamente à mistura reacional. Finalmente, a mistura de reação foi agitada sob pressão de balão de hidrogênio por 6 horas. TLC confirmou a conclusão da reação. A mistura reacional foi então filtrada através de leito de celite e o leito foi lavado com metanol seco. O filtrado foi evaporado até à secura do rotavapor sob pressão reduzida. O composto final foi então mantido sob alto vácuo para proporcionar o composto final F desejado como sólido branco ou semissólido incolor (190 mg, 73%). A estrutura do composto F foi identificada por espectrofotometria de massa de alta resolução e RMN 13C.
[000116] Sangue integral humano fresco foi usado para estudos de hidrólise de fármacos. O fármaco (10 mg, composto F) foi dissolvido em 1 mL de solução (metanol a 20%). A hidrólise do fármaco (n = 3) foi realizada em 20 mL de alíquotas de sangue integral fresco contendo 1,0 mg de fármaco em um termostato de frasco de 50 mL a 37°C em um banho de água com agitação. No tempo 0, o fármaco foi adicionado, e após vários períodos de incubação, as amostras de sangue foram coletadas em 0,25; 0,5; 0,33; 0,75; 1; 2; 4; 6; 12 e 24 horas. A amostra de sangue foi usada 1 mL de acetonitrila para extinguir a hidrólise enzimática do fármaco, como amostras foram obtidas. O pró-fármaco e os seus metabólitos relacionados, tais como, manitol-C6, manitol e sucralose no sangue foram determinados por espectrômetro de massa de triplo quadrupolo QTrap5500 API An equipado com uma fonte de pulverização iônica (ESI). A interface de ESI foi usada no modo de íon negativo.
[000117] O pró-fármaco foi monitorado em uma transição de m/z 688,9^180.9, A sucralose foi monitorada em uma transição de m/z 395^359; o manitol foi monitorado em uma transição de m/z 452,3^273,3; o C6-manitol foi monitorado com uma transição de m/z 309^101.1. Todos os compostos foram identificados por espectrofotometria de massa de alta resolução e RMN13C. A estrutura do C6-manitol (fórmula (2)) é a seguir:
[000118] A hidrólise do pró-fármaco no sangue foi expressada por representação gráfica da percentagem de pró-fármaco remanescente e da percentagem de sucralose, manitol e manitol-C6 aumentando versus em relação ao tempo após a incubação do pró-fármaco no sangue (Fig. 1). Os resultados mostram que o composto F atua como um pró-fármaco que se transforma nos seus metabólitos incluindo sucralose, manitol e manitol-C6 após incubação com sangue in vitro.
[000119] Os ratos SD foram administrados por via oral pró-fármaco a uma dose de 3,67 mg/kg de peso corporal. As amostras de sangue foram coletadas em tubos de microcentrífuga heparinizados em intervalos de 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h. Amostras de plasma foram imediatamente obtidas por centrifugação das amostras de sangue a 8.000 rpm por 10 min. As amostras de plasma foram então armazenadas a -80°C até o uso. As amostras de plasma foram analisadas quanto ao pró-fármaco e seus metabólitos relacionados, tais como, manitol e sucralose pelo espectrômetro de massas triplo-quadrupolo API QTrap5500 equipado com uma fonte de spray iônico (ESI). A interface ESI foi usada no modo de íon negativo.
[000120] O pró-fármaco foi monitorado em uma transição de m/z 688,9^180.9, a Sucralose foi monitorada em uma transição de m/z 395^359; o manitol foi monitorado em uma transição de m/z 452,3^273,3; O C6-manitol foi monitorado com uma transição de m/z 309^101.1.
[000121] A Fig. 2 e a Fig. 3 mostram as curvas de tempo de concentração plasmática de pró-fármaco e seus metabólitos relacionados, tais como, sucralose e manitol em ratos SD com dosagem oral única de 3,67 mg/kg de pró-fármaco, respectivamente. Os resultados mostram que o composto F atua como um pró-fármaco que se converte em seus metabólitos incluindo sucralose, manitol e manitol-C6 após administração em animais in vivo.
[000122] Este exemplo é a preparação de microssomas de fígado humano para a triagem in vitro de inibidores da isoenzima CYP450. Inibidores eficazes da isoenzima hepática humana CYP450 foram testados e o princípio para testar os inibidores da isoenzima CYP450 é baseado na reação da isoenzima microssomal CYP450 preparada a partir do fígado de origem diferente e seu substrato específico clorzoxazona (CZX). Após a adição da amostra, a quantidade de 6-OH-CZX (6-hidroxi-clorzoxazona) padrão do metabólito de isoenzima CYP450 é específica para o cálculo da razão de inibição (CYP2E1) da isoenzima CYP450 da amostra testada, usando a quantidade de 6 -OH-CZX do grupo de controle como linha de base.
[000123] Todas as amostras foram testadas em triplicado. Para determinar a percentagem de inibição, cada composto de teste foi dissolvido em 1, 2, 4 μg/mL para três concentrações diferentes. Os níveis de atividade de CYP2E1 na presença dos compostos de teste foram comparados com as incubações de controle. A mistura de reação de 500 μL, contendo 0,5 mg de proteína microssomal, foi incubada com CZX a 320 μM na presença de MgCl2 5 mM e NADPH a 1 mM em tampão fosfato a 50 mM com pH 7,4 a 37°C por 30 min. A reação foi terminada por acetonitrila gelada e, depois, 4- hidroxil-tolbutamida foi adicionado como um padrão interno. A fase orgânica foi evaporada até a secura e reconstituída na fase móvel (metanol:água = 1:1) antes da análise por espectrometria de massa em tandem com cromatografia líquida (LC-MS/MS). Um espectrômetro de massa quadrupolo triplo API 3000 equipado com uma fonte de pulverização iônica (ESI) foi usado para determinar 6-OH-CZX nos microssomas do fígado humano. A interface de ESI foi usada no modo de íon positivo. 6-OH-CZX foi monitorado em uma transição de m/z 284,5^185,9.
[000124] Análise dos resultados: converter os valores de sinal detectados obtidos de LC/MS/MS na quantidade (pmol) do 6-hidroxi- clorzoxazona padrão de metabólito de isoenzima CYP450 usando o grupo de controle como linha de base, ou seja, a razão de inibição da isoenzima CYP450 do grupo de controle é 0%. Os níveis de atividade da isoenzima CYP450 na presença dos compostos de teste foram comparados com as incubações de controle.
[000125] O ácido dietilditiocarbâmico (DDTC) é um inibidor bem conhecido de CYP2E1. A uma concentração de 100 μM, o tratamento com DDTC resultou em 90,9% de inibição de CYP2E1 em microssomas de fígado humano (medido usando CZX como um substrato de CYP2E1). Com base na atividade inibitória observada de DDTC, foi testado o novo composto (pró- fármaco) e seus metabólitos relacionados à inibição do CYP2E1 nas concentrações de 4, 2 e 1 μg/mL. Os resultados resumidos na Tabela 1.Tabela 1. Razão de inibição dos inibidores de CYP2E1 da triagem in vitro de microssomas de fígado humano
[000126] As razões de inibição de CYP 2E1 do composto de teste detectado nos microssomas de fígado humano são mostradas na Tabela 1. A partir dos resultados, os compostos de teste, incluindo o pró-fármaco (composto F) e seus metabólitos, ou seja, manitol, sucralose e C6-manitol com grupo protetor (Fórmula C), demonstraram ser eficazes como inibidores de P450 2E1, entre os quais 4 μg/mL de metabólito intermédio de pró- fármaco (isto é, manitol-C6 com grupos protetores, Fórmula C) demonstrou o melhor efeito de inibição (70,3 ± 2,8%).
[000127] Todos os solventes orgânicos são grau HPLC e são adquiridos da Tedia (Fairfield, OH, EUA). APAP é adquirido da Sigma (St. Louis, MO EUA), a solução injetável de galactose é fabricada pela Southern Photochemical Co. e é preparada dissolvendo 400 g de galactose (Sigma) em 1 L de solução tampão contendo sais isotônicos para injeções.
[000128] Ratos machos SD (Sprague-Dawley) pesando 175-280 g foram adquiridos do National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. O estudo foi conduzido de acordo com as Diretrizes para Condução de Estudos em Animais do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde e todos os ratos foram colocados em ambiente com ar/umidade controlados nas 12 horas do dia/12 horas do ciclo noturno e com abastecimento ilimitado de água e alimentos. Durante o curso do estudo, os pesos dos ratos foram monitorados continuamente com abastecimento de água normal.
[000129] Manitol e sucralose foram usados para realizar o teste em animais (rato) em vista das lesões no fígado induzidas por APAP.
[000130] No controle normal (Grupo 1), os animais não foram alimentados com APAP. No grupo de controle de lesões hepáticas induzidas por APAP (Grupo 2), os animais foram alimentados com uma dose única de APAP na quantidade de 2.000 mg por quilograma de peso corporal para induzir hepatotoxicidade. No grupo de controle positivo de tratamento com NAC (Grupo 3), os animais foram alimentados com uma dose única de APAP na quantidade de 2.000 mg por quilograma de peso corporal para induzir hepatotoxicidade, e 4 horas depois, um período de tratamento de 24 horas iniciou-se a alimentação por tubo, incluindo a primeira administração de 140 mg de NAC (por quilograma de peso corporal) e posterior administração de 70 mg de NAC (por quilograma de peso corporal) a cada 4 horas por cinco vezes. No grupo experimental (Grupo 4), os animais foram alimentados com uma dose única de APAP na quantidade de 2.000 mg por quilograma de peso corporal para induzir hepatotoxicidade e, 4 horas depois, foi iniciado um período de tratamento de 24 horas com alimentação por tubo, incluindo seis dosagens com os ingredientes da presente invenção a cada 4 horas, como a seguir: (a) (grupo 4.1): administração de manitol em uma dose menor que ou igual a 100 mg por pessoa, a cada 4 horas, por 24 horas, (b) (grupo 4.2): administração de dose dupla de manitol, tal como no grupo 4.1, a cada 4 horas, por 24 horas, (c) (grupo 4.3): administração de sucralose em uma dose menor que ou igual a 100 mg por pessoa, a cada 4 horas, por 24 horas, (d) (Grupo 4.4): administração de dose dupla de sucralose do Grupo 4.3 a cada 4 horas por 24 horas, (e) (grupo 4.5): administração de uma combinação de 0,5 vezes a dose de manitol, como no grupo 4.1, e 0,5 vezes a dose de sucralose, como no grupo 4.3 por quilograma de peso corporal, a cada 4 horas, por 24 horas, (f) (Grupo 4.6): administração de uma combinação da dose de manitol, como no Grupo 4.1, e a dose de sucralose, como no Grupo 4.3, a cada 4 horas, por 24 horas, (g) (Grupo 4.7): administração de uma combinação de 1,5 vezes a dose de manitol como no Grupo 4.1 e 1,5 vezes a dose de sucralose como no Grupo 4.3 a cada 4 horas por 24 horas, (h) (Grupo 4.8): administração de uma combinação de dose dupla de manitol como no Grupo 4.1 e dose dupla de sucralose, como no Grupo 4.3, a cada 4 horas, por 24 horas, e (i) (Grupo 4.9): primeira administração de 140 mg de NAC por quilograma de peso corporal e posterior administração de uma combinação de 70 mg de NAC e dose dupla de manitol, como no Grupo 4.1 e dose dupla de sucralose, como no Grupo 4.3; a cada 4 horas por cinco vezes.
[000131] Após o período de tratamento de 24 horas, o sangue foi coletado da artéria da cauda dos ratos para ensaios AST/SLT. Subsequentemente, os ratos foram submetidos a testes de GSP. Finalmente, os ratos foram sacrificados e a análise histológica foi realizada.
[000132] O manitol e a sucralose foram escolhidos a partir dos ingredientes ativos, como aqui descrito, para realizar o teste em animais (camundongos), tendo em vista as lesões no fígado induzidas por CCl4.
[000133] No controle normal, foi administrada aos animais solução salina normal por injeção intraperitoneal. No grupo de controle das lesões hepáticas induzidas por CCl4, foram administrados aos animais intraperitonealmente 10 ml/kg de CCl4 (40% em óleo de milho) para induzir hepatotoxicidade. No grupo experimental, foram administrados aos animais intraperitonealmente 10 ml/kg de CCl4 (40% em óleo de milho) para induzir hepatotoxicidade, e 4 horas depois, diferentes ingredientes da presente invenção foram administrados por alimentação por tubo. O sangue foi coletado dos camundongos antes da administração com os ingredientes da presente invenção ou 24 horas após a administração com os ingredientes da presente invenção para ensaios AST/ALT. Finalmente, os animais foram sacrificados no dia 2 e o sangue foi coletado para o teste AST/ALT e a análise histológica foi realizada.
[000134] Por outro lado, outros grupos experimentais de camundongos foram alimentados com os ingredientes da presente invenção por 12 semanas e os camundongos foram submetidos a testes de GSP.
[000135] Após a conclusão dos tratamentos, os ratos foram sacrificados sob anestesia com éter, e o sangue foi coletado da artéria da cauda dos ratos e colocado em um tubo de ensaio contendo EDTA. O plasma foi centrifugado a 13.000 a 4°C por 15 minutos e o plasma isolado foi transferido para tubos Eppendorf em alíquotas e armazenado a -80°C.
[000136] O dano no fígado é quantificado medindo a atividade de AST e ALT no plasma. AST e ALT são indicadores comuns de hepatotoxicidade e são medidos usando o sistema Synchron LXi 725 (Beckman Instruments, E.U.A.).
[000137] Após a escarificação dos ratos, a análise histológica foi realizada. As amostras de fígado foram fixadas com 10% de formalina tamponada com fosfato, desidratadas e embebidas em parafina. As secções foram preparadas em 5 μm de espessura e depois coradas com hematoxilina e eosina e submetidas à coloração com ácido periódico-Schiff (PAS). As secções coradas foram observadas sob o microscópio óptico.
[000138] Após o estudo ter sido concluído, todos os ratos foram submetidos a teste GSP. Foram injetados i.v. aos ratos 0,4 g/ml de solução de galactose BW, 0,5 g/kg em 30 segundos e uma amostra de sangue foi coletada aos 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos após a injeção da veia da cauda. A galactose desidrogenase colorimétrica é usada para quantificar a concentração de galactose e a concentração de teste varia de 50 a 1.000 μg/ml. A variação dentro do dia de cada concentração é calculada usando o desvio padrão e o coeficiente de variação (CV) e o coeficiente de variação máximo permitido é CV de 10%, enquanto a variação diária é examinada comparando a inclinação e a intercepção das curvas de calibração. GSP é a concentração de galactose no sangue obtida 60 segundos após parar a injeção de 30 segundos.
[000139] Todos os dados são representados em média ± desvio padrão (SD) e os resultados são calculados usando ANOVA para determinar a significância. O pacote estatístico do programa de Ciências Sociais (versão 13, SPSS Inc.) é usado para cálculos, seguido por teste post hoc para examinar a diferença menos significativa para comparações múltiplas, de modo a confirmar as diferenças significativas entre grupos e a diferença média entre grupos foi significativa p <0,05.
[000140] Os resultados são mostrados na Tabela 2.Tabela 2
[000142] Os resultados mostram que lesões hepáticas ocorreram no grupo de hepatotoxicidade da APAP. Em contraste, essas lesões hepáticas e taxa de sobrevivência podem ser melhoradas pelo uso de manitol e/ou sucralose, de um modo dependente da dose. Especialmente, uma combinação de manitol e sucralose atinge um efeito sinergísitco; os resultados são semelhantes aos do controle normal e até melhores do que o controle positivo do tratamento padrão com NAC. Além disso, outros ingredientes, incluindo Aerosil 200, amido glicolato de sódio, crospovidona, celulose microcristalina e povidona K-30 foram verificados eficazes no tratamento das lesões hepáticas, também melhor do que o controle positivo do tratamento padrão com NAC.
[000143] Os resultados melhorados são também refletidos nos tecidos hepáticos correspondentes.
[000144] A figura 4 mostra os resultados da análise histológica. As secções de tecido hepático dos ratos no grupo de hepatotoxicidade de APAP mostraram que os hepatócitos ao redor da veia central são quebrados com vacuolização visível e número reduzido de núcleos, alguns hepatócitos mostraram até os sinais de necrose e dano hepático é mais grave quando comparado com os hepatócitos dos ratos no grupo de controle normal (Fig. 4B). Ao contrário, a estrutura hepática de ratos no grupo de controle é normal, os hepatócitos estão intactos e arranjados em ordem sem vacuolização (Fig. 4A). Quanto às secções de fígado dos grupos experimentais com tratamento com manitol e/ou sucralose, os hepatócitos estão relativamente intactos com núcleo visível e menor vacuolização (Fig. 4D, E, F, G, H). Especialmente, uma combinação de manitol e sucralose atinge o melhor efeito protetor (Fig. 4G); os resultados são ainda melhores do que o controle positivo do tratamento padrão com NAC (Fig. 4C).
[000145] 5.2.2 Manitol é eficaz no tratamento de lesões hepaticas induzidas por CCl4
[000146] Os resultados são mostrados na Tabela 3.Tabela 3
Análise estatística: Testes Anova e de LSD. ***p <0,005, **p <0,01, *p <0,05, comparação dos grupos experimentais com o grupo de controle de CCl4.
[000147] Os resultados mostram que lesões no fígado ocorreram no grupo de controle CCl4. Em contraste, essas lesões hepáticas podem ser melhoradas pelo uso de manitol.
[000148] A atividade dos vários ingredientes como aqui descritos, incluindo manitol e sucralose e outros, na redução do teor de gordura foi analisada usando a linha celular de hepatoma humano Hep G2.
[000149] O Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) foi usado para preparar as culturas de DMEM Nos. A-F listadas na Tabela 4 para a realização de experimentos subsequentes.Tabela 4: Preparações de meios de cultura de DMEM Nos. A-F
[000150] As culturas de DMEM Nos. A-F foram preservadas a 2-8°C e aquecidas em banho-maria a 37°C antes dos experimentos.
[000151] Células mortas ocupariam 0,4% de azul de tripano e então teriam uma cor; enquanto que as células vivas excluem certos corantes devido às membranas celulares intactas e têm uma cor translúcida. 100 μL de suspensão de células e igual volume de azul de tripano a 0,4% foram misturados uniformemente para formar uma mistura. Parte da mistura (cerca de 20 μl) foi adicionada ao sulco acima da câmara do hemocitômetro, que foi então coberto com uma lâmina de cobertura para observação sob o microscópio óptico. As células vivas não foram coradas, e as células mortas eram azuis.
[000152] Linhas de células HepG2 (15 x 106 células) foram cultivadas em cultura de DMEM No. B, incubadas em uma incubadora com CO2 a 5% a 37°C por 24 horas, cultivadas em cultura de DMEM No. C (meio livre de soro) por 24 horas, e finalmente cultivadas em cultura de DMEM No. D (contendo complexo de oleato/albumina) por mais 48 horas para induzir linhas celulares de HepG2 para formar células de fígado gorduroso.
[000153] As linhas de células HepG2 foram divididas em seis grupos, incluindo: (1) branco: sem tratamento; (2) grupo DMSO: células de branco foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO); (3) Controle: indução com ácido oleico para formar células de fígado gorduroso; (4) Grupo veículo: células de fígado gorduroso formadas por indução com ácido oleico foram tratadas com DMSO; (5) Controle positivo: as células de fígado gorduroso foram tratadas com silimarina; e (6) Grupo de Teste: as células de fígado gorduroso foram tratadas com vários compostos da presente invenção.
[000154] Após incubação por 72 horas, as células tratadas de cada grupo foram sucessivamente lavadas duas vezes em PBS, e depois incubadas com 0,5 ml de tripsina/EDTA por 3 minutos. Depois, as células foram raspadas com 2 ml de PBS e depois transferidas para o tubo de centrifugação para serem cortadas em pedaços por ultra-sons. Um volume de 20 μl de extratos celulares foi coletado para determinar o conteúdo de proteína. A determinação de TG foi realizada usando uma combinação de agentes comercialmente disponíveis (Randox). O teor de TG obtido acima foi dividido pelo conteúdo de proteína para obter uma razão, que representou o teor relativo de TG nas células.
[000155] Os camundongos B6 recomendados na descrição “Método para avaliar a proteção do fígado e as eficácias dos cuidados com a saúde de alimentos saudáveis” anunciados pelo Departamento de Saúde de Taiwan foram escolhidos para testes em animais. Mais que quatro camundongos foram usados em cada grupo do pré-teste, enquanto mais que doze camundongos foram usados em cada grupo do teste de confirmação. Camundongos machos criados a 23±2°C em um ambiente de animais com 55 ± 15% de umidade relativa sob ciclo de luz/escuridão normal (7:00 AM- 7:00 PM com luz/7: 00 PM-7:00 AM sem luz) e pesa 18-23 g foram adquiridos da BioLASCO (Taipei) e alojados no Centro de Animais de Laboratório no Centro Médico de Defesa Nacional. O teste com animal foi realizado de acordo com a diretriz para experimentos em animais dos Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde. Os camundongos foram alimentados com ração normal de 3-5 g/dia e abastecimento ilimitado de água por 1 a 2 semanas e investigados quanto à condição de saúde.
[000156] Os animais testados foram agrupados aleatoriamente de branco, controle de dieta de alto teor de gordura (HFD), controle positivo (PS) e grupo de teste. Os animais em branco foram alimentados com ração normal. Os animais de HFD foram alimentados com ração rica em gordura. Os animais do PS foram alimentados com ração rica em gordura e, adicionalmente, alimentados com silimarina (5 mg/kg/dia) por um tubo. Os animais do grupo Teste foram alimentados com ração rica em gordura, e adicionalmente alimentados com compostos de teste por um tubo.
[000157] Os animais do branco foram alimentados casualmente com ração normal por 12 semanas, enquanto os animais dos grupos HFD, PS e de teste foram alimentados casualmente com ração rica em gordura por 12 semanas. Após 8 semanas de alimentação, os animais do branco e HFD foram alimentados com água deionizada por um tubo uma vez por dia; os animais do PS foram alimentados com silimarina por um tubo uma vez ao dia; e os animais do Grupo de Teste foram alimentados com compostos de teste por um tubo uma vez por dia durante 4 ou 8 semanas.
[000158] Antes de testar e na oitava, décima segunda e décima sexta semana após o teste, o sangue foi coletado da bochecha ou do coração. No final do teste, todos os camundongos foram pesados e depois sacrificados, e o sangue foi coletado da bochecha ou do coração simultaneamente. Os espécimes de sangue dos camundongos ficaram em repouso em temperatura ambiente por uma hora para coagularem, e depois o soro foi separado por centrifugação em uma centrífuga de refrigeração a 15.700 x g a 4°C por 5 minutos. Posteriormente, os índices bioquímicos da função hepática, incluindo aspartato transaminase (AST), alanina aminotransferase (ALT), triglicerídeo (TG), colesterol total (TCHO/TC), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e colesterol de alta densidade de lipoproteína (HDL-C), foram detectados pelo analisador bioquímico de sangue.
[000159] Além disso, amostras de gordura abdominal e fígado foram retiradas do abdômen de camundongos sacrificados e ponderados para comparar o peso de gordura e do fígado e obter a razão entre peso do fígado e o peso corporal. Dois blocos de tecido com um volume de aproximadamente 1 cm3 foram cortados do maior lobo direito do fígado, fixados em solução de formalina neutra a 10% e, em seguida, incorporados em parafina para seccionamento. As secções de corte prosseguiram com coloração H & E para observação histopatológica. Além disso, o restante do fígado foi congelado para preservação e detecção dos teores de triglicerídeos e colesterol total no fígado. Além disso, a função hepática dos animais de cada grupo foi analisada pelo Método de Ponto Único de Galactose, que foi reconhecido e recomendado para a quantificação da função hepática remanescente em uso clínico pela FDA dos EUA e Ministro da Saúde e Bem-Estar, Taiwan. No final dos testes, 0,5 g de galactose (G.S.P.® 0,4 g/mL) por kg de animal foram administrados por via intravenosa. Uma hora após a administração, foram coletados cerca de 0,5 ml de sangue integral usando um papel de filtro para avaliar a função hepática de camundongos. Quanto maior o valor do GSP, pior seria a função hepática restante. (FDA: “Orientação para a Indústria: Farmacocinética em Pacientes com Deficiência. Projeto de Estudo da Função Hepática, Análise de Dados e Impacto na Dosagem e Rotulagem. 2003.
[000160] No final do teste, todos os ratos foram sacrificados. Um bloco de tecido com um volume de aproximadamente 1 cm3 foi cortado do maior lobo direito do fígado, fixado em formalina neutra a 10%, e depois desidratado e hialinizado em várias concentrações de etanol (30x 50x 70x 95x 99,5%) e xileno. Posteriormente, o xileno foi substituído por solução de parafina quente. Por fim, o tecido foi embebido em solução de parafina. O espécime de parafina acabado foi cortado em secções de parafina de 5 μm de espessura pelo micrótomo. As secções foram coladas em lâminas limpas, secas a 37°C e depois coradas por coloração com H & E.
[000161] As secções de tecido do fígado foram desparafinizadas em xileno por 30 minutos, e depois sucessivamente re-hidratadas duas vezes em 99,5%, 95%, 70%, 50% e 30% de etanol aquoso por 30 minutos, respectivamente. Depois de ser embebido em água destilada por 10 minutos, as secções podem ficar manchadas. As secções foram primeiro imersas em hematoxilina por 30 segundos para corar os núcleos das células, depois lavadas com água destilada durante alguns minutos, coradas com eosina por 2-5 minutos e lavadas com água destilada por alguns minutos novamente. Após o processo de coloração ter terminado, as secções foram desidratadas sucessivamente em 50%, 70%, 95% e 100% de etanol aquoso duas vezes por 30 segundos, respectivamente, hialinizadas duas vezes em xileno, e finalmente seladas e armazenadas com meio de montagem.
[000162] A fim de observar as alterações de lesão, acúmulo de gordura, necrose ou fibrose em células do fígado, quando houve um dano hepático em curso, os tecidos do fígado foram corados com H&E para avaliar o grau de acúmulo de gordura no fígado. Todas as secções histopatológicas foram cortadas da mesma posição no maior lobo direito do fígado para eliminar o viés na observação subjetiva, e depois submetidas a coloração patológica. Quanto à avaliação da análise semi-quantitativa em patologia, teve que ser confirmada por um médico ou um patologista veterinário que realizou uma análise duplo- cego para classificação (classificação NAS) e comparar todas as secções sem conhecer o desenho do teste. Por fim, a análise diferencial de cada grupo foi realizada por métodos estatísticos.
[000163] Cerca de 0,1 g de tecido hepático foi retirado do animal sacrificado e homogeneizado por centrífuga com um biomisturador por 10 minutos. Um peso de 9 vezes (p/p) de tampão (pH 7,4, Tris-HCl 50 mmol/L, KCl 180 mmol/L) foi adicionado ao tecido homogeneizado, que foi então bem misturado por um misturador Vortex para uso. As amostras de solução de homogeneização resultantes do tecido do fígado foram usadas para analisar os vários membros dos sistemas antioxidantes do fígado, incluindo glutationa peroxidase (GPx), glutationa (GSH), glutationa redutase (Grd) e superóxido dismutase (SOD). Os métodos de análise relacionados podem ser encontrados nas literaturas conhecidas, por exemplo, o esboço do “Método para avaliar a proteção do fígado e a eficácia dos cuidados com a saúde dos alimentos saudáveis”, anunciado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar, Taiwan.
[000164] Todos os dados foram expressados como média ± desvio padrão (DP). A diferença estatisticamente significativa dos resultados do teste foi determinada pelo cálculo de ANOVA de um Pacote Estatístico do programa de Ciência Social, Versão 13, SPSS Inc. Posteriormente, múltiplas comparações foram realizadas usando o método da diferença menos significativa no teste post hoc para confirmar a diferença significativa entre os grupos. A diferença média entre os grupos é considerada significativa quando p <0,05.
[000165] Em experimentos com células, os resultados da redução do conteúdo de TG em células de gordura HepG2 determinados em Controle Positivo (silimarina) foram listados na Tabela 5.Tabela 5: Eficácia da silimarina na redução do teor de TG em células de gordura HepG2 de Controle Positivo
[000166] Os resultados da redução do teor de TG em células de gordura HepG2 determinados usando concentração constante de compostos de teste foram mostrados na Tabela 6. Pode ser visto a partir dos resultados que os compostos de teste exibiram diferentes graus de efeitos de redução do conteúdo de TG em células de fígado gorduroso formadas de células HepG2 induzidas sob a condição de concentração de teste constante, em comparação com o Controle. A equação para calcular a taxa de redução (%) de TG foi a seguinte: [1 - (Teor de TG do Grupo de Teste - Teor de TG do branco)/(Teor de TG do Grupo de Indução de Ácido Oleico - Teor de TG do branco)] x 100%.
[000167] Tabela 6: Teor de TG em células de fígado gorduroso reduzidas por compostos de teste
[000168] Tabela 6-1: Uma porção de compostos de teste da Tabela 6 que reduziu o teor de TG em células de fígado gorduroso
[000169] Tabela 6-2: Uma porção de compostos de teste (Bioflavonóides) da Tabela 6 que reduziu o conteúdo de TG em células de fígado gorduroso
[000170] Tabela 6-3: Uma porção dos compostos de teste (excipientes) da Tabela 6 que reduziu o teor de TG nas células de fígado gorduroso
[000171] Nos experimentos com animais, todos os animais foram tratados para induzir fígado gorduroso, exceto os animais do Branco que foram alimentados com ração normal. Após oito semanas, os animais de cada grupo receberam tratamento diferente por quatro ou oito semanas, além da ração original. Os animais do Branco e HFD foram alimentados com água deionizada; os animais do PS foram alimentados com silimarina; e os animais do Grupo de Teste foram alimentados com diferentes compostos de teste, incluindo puerarina, florizina, eriodictilol, sucralose, manitol, sacarina, hesperitina, mentol e combinações dos mesmos.
[000172] A partir dos resultados de experimentos com animais, o peso do fígado, peso da gordura corporal e aumento do peso corporal dos animais de cada grupo foram listados na Tabela 7-1 e 7-2.Tabela 7-1: Os resultados da análise do peso do fígado e peso da gordura corporal devido a compostos de teste
[000173] Tabela 7-2: Os resultados da análise do aumento do peso corporal devido a compostos de teste
[000174] Foi demonstrado a partir dos resultados que o peso da gordura abdominal aumentou em animais induzidos com esteatose hepática. Entre os compostos de teste administrados separadamente, o manitol, o mentol e a sucralose podem reduzir significativamente o peso da gordura abdominal nos animais.
[000175] Além disso, nenhuma condição anormal foi observada em animais do grupo de teste após os compostos de teste foram administrados. Nenhum animal morreu durante o teste. Ocorrência de doenças ou sintomas clínicos causados pelos compostos de teste não foi observada em estudos de necropsia de animais sacrificados após os testes. Portanto, os compostos de teste eram seguros.
[000176] A figura 5 mostrou os camundongos que foram induzidos a exibir fígado gorduroso cujas células hepáticas próximas à área da porta hepática (incluindo o duto biliar, veia porta, artéria hepática) foram cobertas com muitas gotículas grandes de gordura vesicular e apareceu balonização hepatocelular, indicando que o modelo animal de fígado gorduroso foi estabelecido com sucesso por indução.
[000177] Os resultados de experimentos em animais mostraram que uma pluralidade de compostos de teste exibiu os efeitos da redução de lipídeos em fígados de animais após administração por um período de 4 ou 8 semanas. Os resultados foram apresentados nas Tabelas 8-1 e 8-2. Tabela 8-1: Os compostos de teste podem reduzir os lipídeos do fígado em animais (período de administração de 4 semanas)
[000178] Tabela 8-2: Compostos de teste poderiam reduzir lipídios de fígado em animais (período de administração de 8 semanas)
[000179] Os resultados mostraram que TG e TC aumentaram no fígado de camundongos induzidos com fígado gorduroso. Entre os compostos de teste administrados separadamente, a hesperitina, a puerarina, o eriodictilol, a florizina, o manitol, o mentol e a sucralose podem reduzir significativamente os TG no fígado. Em particular, um efeito excelente de cerca de 67% de redução no teor de TG no fígado (p <0,005) foi conseguido após 4 semanas de tratamento com eriodictiol. Além disso, a hesperitina, o eriodictiol, a florizina, o manitol, o mentol, a sucralose e a sacarina podem reduzir significativamente o CT no fígado. Especificamente, um efeito excelente de cerca de 56% de redução no teor de TC no fígado (p <0,005) foi conseguido após o tratamento de 4 semanas de sacarina.
[000180] Quando a combinação de dois compostos de teste foi administrada, a combinação de sacarina e manitol, a combinação de mentol e manitol, a combinação de sucralose e manitol, a combinação de eriodictil e manitol, ou a combinação de eriodictil e sucralose poderia reduzir TG no fígado significativamente. Em particular, um efeito excelente de cerca de 77% de redução no teor de TG no fígado (p <0,005) pode ser alcançado após 4 semanas de tratamento da combinação de mentol e manitol; e um efeito excelente de cerca de 78% de redução no teor de TG no fígado (p <0,005) poderia ser alcançado após 8 semanas de tratamento da combinação de eriodictiol e sucralose. Além disso, a combinação de sucralose e manitol, a combinação de eriodictiol e manitol, ou a combinação de eriodictiol e sucralose pode reduzir significativamente o teor de TC no fígado, em que um excelente efeito de cerca de 77% de redução no teor de TC no fígado (p <0,005) poderia ser alcançado após 8 semanas de tratamento da combinação de eriodictiol e sucralose.
[000181] Quando a combinação de três compostos de teste foi administrada, a combinação de mentol, manitol e eriodictilol ou a combinação de sucralose, manitol e eriodictilol pode reduzir significativamente o TG no fígado. Em particular, um efeito excelente de cerca de 79% de redução no teor de TG no fígado (p <0,005) pode ser alcançado após 8 semanas de tratamento da combinação de sucralose, manitol e eriodictilol. Além disso, a combinação de sucralose, manitol e eriodictiol pode reduzir significativamente o TC no fígado.
[000182] Os resultados de experimentos em animais mostraram que uma pluralidade de compostos de teste exibiu a eficácia da redução de danos no tecido hepático e na gordura no fígado durante o período de teste de 4 semanas. A Fig. 5 mostrou danos no tecido do fígado de animais tendo fígado gorduroso. O dano no tecido hepático incluiu muitas gotículas grandes de gordura vesicular cobrindo as células hepáticas perto da área da porta hepática (incluindo o duto biliar, a veia porta, a artéria hepática) e o balonismo hepatocelular. Em comparação, após serem tratados com silimarina, mentol, eriodictiol ou manitol por 4 semanas, grandes gotículas de gordura vesicular dentro das células hepáticas na secção do tecido hepático foram significativamente reduzidas. Uma porção de pequenas gotículas quebradas ainda foi observada em camundongos tratados com silimarina, mas o tipo de camundongo tratado com mentol, eriodictiol ou manitol foi semelhante ao dos animais do grupo do Branco, indicando doenças de fígado gorduroso leves. Além disso, o resultado da classificação de NAS foi mostrado na Tabela 9.Tabela 9: Os compostos de teste podem reduzir a condição de danos no fígado em animais
[000183] NAS (Classificação de atividade de doença do fígado gorduroso não alcoólico) indicou a classificação de atividade de doenças do fígado gorduroso não alcoólico [Hepatologia. junho de 2005; 41 (6): 131321], e avaliou de forma abrangente o grau de esteatose, inflamação lobular e balonização de hepatócitos. A ficha de classificação foi mostrada na Tabela 10. Uma classificação mais alta indicou danos hepáticos mais graves.Tabela10: Projeto de avaliação de NAS
[000184] Os resultados mostraram que o dano no tecido hepático ocorreu em camundongos induzidos com fígado gorduroso (NAS crescente). Entre os compostos de teste administrados separadamente, o eriodictiol e o manitol podem reduzir significativamente o dano hepático. É notável que quando a combinação de dois compostos foi administrada, a combinação de mentol e manitol alcançou um efeito excelente. Não havia quase nenhum dano no fígado aparecendo. O NAS foi o mesmo com o do Branco.
[000185] Os resultados de experimentos em animais mostraram que uma pluralidade de compostos de teste exibiu a eficácia da redução da disfunção do fígado em animais durante o período de administração de 4 ou 8 semanas. Os resultados foram apresentados na Tabela 11-1 e na Tabela 11-2.Tabela 11-1: Os compostos de teste podem reduzir a disfunção do fígado em animais (período de administração de 4 semanas)
[000186] Tabela 11-2: Os compostos de teste podem reduzir a disfunção do fígado em animais (período de administração de 8 semanas)
[000187] ALT e AST são mais comumente usados como indicadores de enzima para refletir a disfunção bioquímica do fígado. Sob circunstâncias normais, essas enzimas estão presentes nas células do fígado. No entanto, quando as células do fígado estão danificadas, elas vazam. Aumentos nos valores séricos de ALT e AST geralmente refletem inflamação hepática e disfunção hepática.
[000188] Os resultados mostraram que os animais induzidos com fígado gorduroso (aumento dos valores de ALT e AST) sofreram disfunção hepática. Entre os compostos de teste administrados separadamente, todos hesperitina, puerarina, eriodictilol, florizina, manitol, mentol, sucralose e sacarina podem reduzir significativamente os valores de ALT e AST. Em particular, excelentes efeitos de redução de cerca de 64% no valor de ALT (p <0,005) e cerca de 60% de redução no valor de AST (p <0,005) poderiam ser alcançados após 4 semanas de tratamento com manitol.
[000189] Quando a combinação de dois compostos de teste foi administrada, a combinação de mentol e manitol, e a combinação de eriodictiol e sucralose podem reduzir significativamente o valor de ALT. Além disso, a combinação de mentol e manitol, a combinação de sucralose e manitol, ou a combinação de sacarina e manitol pode reduzir significativamente o valor da AST. Em particular, efeitos excelentes de cerca de 76% de redução no valor de ALT (p <0,005) e cerca de 62% de redução no valor de AST (p <0,005) poderiam ser alcançados após 4 semanas de tratamento da combinação de mentol e manitol.
[000190] Quando a combinação de três compostos de teste foi administrada, a combinação de sucralose, manitol e eriodictilol pode reduzir significativamente o valor de ALT (p <0,005).
[000191] Os resultados de experimentos com animais mostraram que uma pluralidade de compostos de teste exibiu a eficácia da melhoria da atividade antioxidante do fígado em animais durante o período de teste de 4 semanas. Os resultados foram apresentados na Tabela 12-1 e na Tabela 12-2. Tabela 12-1: Os compostos de teste podem melhorar a atividade antioxidante do fígado em animais (Gpx e GSH)
[000192] Tabela 12-2: Os compostos de teste podem melhorar a atividade antioxidante do fígado em animais (Grd e SOD)
[000193] Gpx, GSH, Grd e SOD são membros comuns dos sistemas antioxidantes do fígado que podem reduzir o estresse oxidativo no fígado e evitar o fígado de danos causados pelo estresse oxidativo. Aumentos nos valores de GPx, GSH, Grd e SOD indicam que o fígado mantém uma melhor atividade antioxidante.
[000194] Os resultados mostraram que a atividade antioxidante de camundongos induzida com fígado gorduroso foi reduzida. Entre os compostos de teste administrados separadamente, todos os hesperitina, puerarina, eriodictilol, florizina, manitol e sucralose podem melhorar significativamente a atividade antioxidante. Em particular, excelentes efeitos de aumentos substanciais nos níveis de Gpx, GSH, Grd e SOD (p <0,005) foram alcançados após tratamento de 4 semanas com manitol.
[000195] Em resumo, os compostos testados incluindo manitol e sucralose e outros podem reduzir o teor de gordura no fígado, reduzir os danos no fígado, e melhorar a atividade antioxidante do fígado. Esses compostos foram confirmados como seguros por meio de experimentos em animais e verificados com potencial para serem desenvolvidos em alimentos saudáveis ou fármacos para reduzir a gordura hepática e melhorar distúrbios associados, tais como doenças do fígado gorduroso, doenças do fígado gorduroso não alcoólico agudas e crônicas (NAFLD), hepatite alcoólica aguda e crônica, esteato-hepatite não alcoólica aguda e crônica, cirrose não alcoólica e cirrose alcoólica (Códigos de diagnóstico CID-9-CM: 571,8; 571,0; 571,1; 571,2; 571,3; 571,4; 571,5; 571,9).
Claims (17)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela Fórmula (II), R1-O-X-(CH2)m-X-O-R2 Fórmula (II), em que X é C=O; R1 e R2 são iguais ou diferentes, selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo poliol e um grupo sacarídeo de (G)p, em que o grupo poliol é -CH2(CHOH)nCH2OH, em que n é um número inteiro de 2 a 18, em que G é um resíduo de monossacarídeo e p é um número inteiro de 1 a 4 em que pelo menos um dos grupos hidroxila em (G)p é substituído por um átomo de halogênio, em que, quando R1 é hidrogênio, R2 não é hidrogênio; em que R1 é um grupo poliol, n não é 1 com a condição de que R2 é também um grupo poliol; e m é um número inteiro de 3 a 40, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um de R1 e R2 é (G)p; p é 1 ou 2; e m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dois ou mais dos grupos hidroxila em (G)p são substituídos por átomos de halogênio.
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de monossacarídeo é uma hexose.
5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a hexose é selecionada a partir do grupo que consiste em uma aldohexose e uma cetohexose.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo sacarídeo R1 ou R2 é representado por -G1-O-G2, em que G1 e G2 são iguais ou diferentes, selecionados a partir do grupo que consiste em uma aldohexose e uma cetohexose e pelo menos um dos grupos hidroxila em G1 ou pelo menos um dos grupos hidroxila em G2 é substituído por um átomo de halogênio.
7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o átomo de halogênio é selecionado a partir do grupo que consiste em cloro, bromo e iodo.
8. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o átomo de halogênio é cloro.
9. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que G1 é glicose em que um dos grupos hidroxila é substituído por cloro; e G2 é frutose em que dois dos grupos hidroxila são substituídos por cloro.
10. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que RI ou R2 é representado pela Fórmula (Ia)
11. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que m e n são 4.
12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: adipato ((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-bis(clorometil)- 3,4-di-hidroxitetra-hidro furan-2-il)oxi)-3-cloro-4,5-di-hidroxitetra-hidro-2H- piran-2-il)metil ((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6-penta-hidroxihexil) da Fórmula 1
13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é C6-manitol da Fórmula 2
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável é um excipiente.
16. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para fabricar um medicamento para evitar ou tratar hepatotoxicidade.
17. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para fabricar um medicamento para evitar ou tratar fígado gorduroso, protegendo a função do fígado ou melhorando doenças de fígado causadas por fígado gorduroso.
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