TWI691719B - 半乳糖快速定量檢測系統及其應用 - Google Patents

Abstract

一種半乳糖快速定量檢測系統，其包括：一半乳糖組合物，包含半乳糖、緩衝劑及抗氧化劑，進入體內經代謝後，產生一體液樣品；一測片或一濾紙，包含酵素，該酵素會與該體液樣品反應產生一電化學訊號；以及一測量儀，包含：一電源單元，提供一訊號；一連接器，接收該電源單元所提供的該訊號並將該訊號傳送到該測片或該濾紙上，該訊號與該電化學訊號產生一相應的反應訊號後，將該相應的反應訊號傳送到該測量儀；一計算單元，計算該相應的反應訊號；一類比數位轉換器，接收由該計算單元計算過的該相應的反應訊號，將計算過的該相應的反應訊號轉換成一數位化反應訊號；一處理器，處理該數位化反應訊號；一顯示器，顯示該數位化反應訊號；及一數位終端機，接收該數位化反應訊號。

Description

半乳糖快速定量檢測系統及其應用

本發明提供一種快速檢測體內中半乳糖含量的系統，特別是以此“測量半乳糖濃度”及評估肝功能損傷程度。

肝臟與許多藥品的清除(clearance)有關，其可經由不同的代謝途徑或經由膽汁***的途徑清除原藥品或其代謝物，而肝功能不全所引起藥品***或代謝速率的改變會造成藥品蓄積或阻礙藥品形成活性代謝物。由於血中半乳糖與肝功能異常有靈敏的相關性，且由以下指導手冊(ref.1~2)、教科書(ref.3~4)與研究文獻(ref.5~8)證據顯示，血中半乳糖的數值與肝功能異常的程度有顯著關係，因此可藉由血中半乳糖的數值來評估其肝功能剩餘功能。

(1) Guidance for Industry-Pharmacokinetics in Patients with Impaired Hepatic Function: Study Design, Data Analysis, and Impact on Dosing and Labeling, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration 2003 May.

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習用的檢測方法為空腹8小時後，靜脈注射0.5g/kg的半乳糖，並於60分鐘後，測量血漿中的半乳糖濃度(Hung-Shang Tang and Oliver Yoa-Pu Hu(胡幼圃)(1992)Digestion,52：222-231；Ranek L.et al(1983)Clin.Physiol.3：173-178)。其量測方式係以不同半乳糖標準溶液濃度與其吸光值的關係，製作檢量線；同時抽取之血液添加HClO₄震盪混合後，離心取上清 液，於上清液中加入KOH震盪混合後，再離心取上清液，並於上清液中再加入半乳糖去氫酶(galactose dehydrogenase)後，為免顏色反應不準確而置於暗室60分鐘以製備檢體，測其吸光值，對照檢量線找出濃度值。惟其檢測過程繁複耗時，需使用多種藥劑種類，因此受試者得知檢測結果的時間非常冗長。

台灣專利號I292478揭示肝功能測定之檢體製作方法及採樣試紙。該方法亦須注射半乳糖進入受測者體內，等待60分鐘，測量血液中半乳糖的濃度。其測量方式係以不同半乳糖標準溶液濃度與其吸光值的關係，製作檢量線；於檢體試紙加入三氯乙酸並震盪30分鐘，取出溶劑後加入含有半乳糖去氫酶之溶劑並震盪30分鐘，再添加呈色劑，最後測量其吸光值。但是該方法係以注射半乳糖進人體，且須製作檢體，檢測過程繁複且耗時，因此本領域需提供一個快速且簡便之半乳糖檢測方法，以供需要檢測半乳糖之患者使用。

台灣專利M488635揭示可檢測血糖的生物試片；美國專利US971995則是揭露以電化學方式作血容性測試的檢測系統，該系統包含電化學試片及測量儀，由此可知，以電化學方法監控身體狀態為現有普遍的技術，然而以電化學方式檢測半乳糖存在許多困難，其原因為由於酵素的蛋白質不穩定，無法在酸性溶液以外的環境中保存，且保存時間非常短，因此提供一以固態方式而且長時間保存的試紙並同時保有檢測準確度為本領域欲解決之另一問題。

為解決前述之問題，本發明提供一種半乳糖快速定量檢測系 統，其包括：一半乳糖組合物，包含半乳糖、緩衝劑及抗氧化劑，進入體內經代謝後，產生一體液樣品；一測片，包含一酵素，該酵素會與該體液樣品反應產生一電化學訊號；以及一測量儀，包含：一電源單元，提供一訊號；一連接器，接收該電源單元所提供的該訊號並將該訊號傳送到該測片或上，該訊號與該電化學訊號產生一相應的反應訊號後，將該相應的反應訊號傳送到該測量儀；一計算單元，計算該相應的反應訊號；一類比數位轉換器，接收由該計算單元計算過的該相應的反應訊號，將計算過的該相應的反應訊號轉換成一數位化反應訊號；一處理器，處理該數位化反應訊號；一顯示器，顯示該數位化反應訊號；其中該數位化反應訊號可被傳送至一數位終端機。

為達前述目的，其中該緩衝液係選自於抗壞血酸鹽緩衝劑(ascorbic acid buffer)、檸檬酸緩衝劑(citrate buffer)、磷酸緩衝劑(phosphate buffer)、醋酸緩衝劑(acetate buffer)、碳酸緩衝劑(carbonate buffer)及三乙醇胺緩衝劑(triethanolamine buffer)所組成的群組。

為達前述目的，其中該抗氧化劑係選自於由維生素C或/和亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、維生素A、維生素E、類黃酮、多酚、乙二胺四乙酸((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙[羧甲基]甘胺酸(NTA)所組成的群組。

為達前述目的，其中該半乳糖包含D-(+)-半乳糖、L-(-)-半乳糖、安定同位素半乳糖、環狀半乳糖或半乳糖衍生物。

為達前述目的，其中該半乳糖組合物係以口服、注射、噴霧吸入及***、直腸、栓劑或其他臨床適合方式給予。

為達前述目的，其中該口服方式係透過讓使用者先使用該半乳糖組合物，接著檢測體液中之半乳糖含量之方式測量體內中之半乳糖含量。

為達前述目的，其中該注射係透過讓使用者先將該半乳糖組合物注射入體內，接著檢測體液中之半乳糖含量之方式測量體內中之半乳糖含量。

本發明提供另一發明目的，一種半乳糖快速定量檢測系統之測片，包括：一絕緣基板；一電極單元，配置於該絕緣基板上；一第一絕緣隔片，覆蓋部分的該電極單元且包括位於該第一絕緣隔片的一第一邊緣的一反應區流道，其中部分的該電極單元露出於該反應區流道；以及一第二絕緣隔片，包含一第二絕緣隔片，該第二絕緣隔片覆蓋於該第一絕緣隔片的該反應區流道上，與該第一絕緣隔片的該第一邊緣及該絕緣基板的同側邊緣呈現外凸的弧形，該絕緣基板相對該反應區流道前段位置呈現內凹結構，其中該反應區流道內含有一反應層，該反應層覆蓋位於該反應區流道中的該電極單元且包含一酵素與一導電介質，用以與體液樣品產生電化學反應；其中該測片係利用該第二絕緣隔片的該第二邊緣的外凸的弧形與該絕緣基板相對該反應區流道前段位置的內凹結構破壞體液的內聚力，搭配毛細現象以達到快速進體液樣品；其中該酵素可氧化、還原、分解或代謝半乳糖。

為達前述目的，其中該測片之半乳糖測試範圍為50-2000μg/ml。

為達前述目的，其中該絕緣基板係選自於由聚氯乙烯(PVC)、玻璃纖維(FR-4)、聚酯(polyester suphone)、電木板、聚對苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板及陶瓷所組成之群組。

為達前述目的，其中該電極單元係選自於鈀膠、鉑膠、金膠、鈦膠、碳膠、銀膠、銅膠、金銀混合膠及碳銀混合膠所組成之群組。

為達前述目的，其中該反應層係由選自於酵素、輔酶、導電介質、緩衝劑與保護劑所組成之群組。

為達前述目的，其中該導電介質係由選自於由二茂鐵(Ferrocene)、二茂鐵鹽(ferrocenium)、亞甲藍(methylene blue)、三乙腈基三氯化釕(tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羥基苯醌(2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎諾二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺藍(toluidine blue)、5,6-二胺基-1，10-鄰二氮雜菲(5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M=Ru or Os；BPY=2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))所組成之群組。

為達前述目的，其中該導電介質可為金屬離子化合物，該金屬離子化合物係選自於由MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂或其組合所組成之群組。

為達前述目的，其中該緩衝劑係選自於由Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures(CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine、TAPS組成之群組。

為達前述目的，其中該安定劑係選自於由木糖醇、甘露醇、聚木糖、***木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纖維素(Methocel)、瓊脂糖(agarose)、溶膠凝膠(sol-gel)、膠原(collagen)、殼聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neo protein)，胺基酸或其任一組合所組成之群組。

為達前述目的，其中該界面活性劑選自於由陽離子界面活性劑、陰離子界面活性劑，中性離子界面活性劑，非離子界面活性劑所組成之群組。

為達前述目的，其中該酵素可被固定化及乾燥化，並保存於酸鹼中性環境。

本發明提供另一發明目的，一種半乳糖快速定量檢測系統之應用，其中該半乳糖快速定量檢測系統可用於判斷體內半乳糖濃度，以測量新生兒半乳糖血症。

為達前述目的，其中該半乳糖快速定量檢測系統提供監控半乳糖值及肝能不全患者或專業人員測量。

為達前述目的，其中該半乳糖快速定量檢測系統係以半乳糖濃度判斷肝臟剩餘功能。

100:測片

110:絕緣基板

120:電極單元

122:第一端

124:第二端

130:第一絕緣隔片

132:第一邊緣

134:反應區流道

140:第二絕緣隔片

142:第二邊緣

144:通氣孔

150:反應層

200:測量儀

210:連接器

211:計算單元

212:類比數位轉換器

213:處理器

214:顯示器

215:電源單元

300:數位終端機

圖1係半乳糖快速檢測系統外觀圖； 圖2係半乳糖快速檢測系統示意圖；圖3係半乳糖快速檢測系統準確度測試曲線圖；圖4係半乳糖快速檢測系統精密度測試；圖5係測片構造示意圖；圖6係濾紙檢驗體積檢測；圖7係半乳糖快速檢測系統檢驗體積檢測；圖8係檢驗測片存放天數測試；圖9係血容性檢測；圖10係重複性檢測；圖11、圖12係靜脈注射半乳糖的GSP結果與口服半乳糖的OGSP相關性結果；圖13係半自動化機械手臂完成之濾紙檢驗結果。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所使用之材料，除有特別指明者，皆為市售易於取得之材料。

本發明之半乳糖快速定量檢測系統係利用酵素電化學感測技術(Electrochemical Sensing Technology)，其外觀示意圖如圖1所示，該系統主要採用可拋棄乾式酵素電極儀技術，利用經人體肝臟代謝的半乳糖或其代謝物與酵素發生電化學反應而產生微電流，再藉由微電流的量測，測得半乳糖數值，並藉由該數值評估該肝功能剩餘情形，惟本案之半乳糖快速定量檢測系統不限於評估肝功能，還可測量有關於半乳糖之相關疾病， 例如新生兒之半乳糖血症(galactosemia)，且本發明所述之半乳糖進一步包括半乳糖及其衍生物。

實施例1半乳糖快速定量檢測系統使用方法

1-1 半乳糖檢測測片之使用

半乳糖檢測測片分別封裝於鋁箔包中，並儲存在4℃~10℃(39.2℉~51.2℉)溫度下冷藏。使用前需回溫20分鐘，開封後的半乳糖檢測測片需要在30分鐘內使用完畢，逾時之測片不得再使用，需丟棄。

1-2 樣品採集及準備

使用者須先注射或使用半乳糖組合物，其中該半乳糖組合物內容為半乳糖含量為總量之1%至80%，較佳含量狀態為總量之4%或40%，不添加或添加緩衝劑量之0或是0.001%~5%，不添加或添加抗氧化劑含量為總量之0或是0.001~5%，以上含量係指重量百分比。選用緩衝劑與抗氧化劑，添加以下含量可調配成適當之配方；0.01M~1M抗氧化劑選自於由維生素C、亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、維生素A、維生素E、類黃酮、多酚、乙二胺四乙酸((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙[羧甲基]甘胺酸(NTA)所組成的群組，或選用0.01M~1M抗壞血酸鹽緩衝劑(ascorbic acid buffer)、檸檬酸緩衝劑(citrate buffer)、磷酸緩衝劑(phosphate buffer)、醋酸緩衝劑(acetate buffer)、碳酸緩衝劑(carbonate buffer)及三乙醇胺緩衝劑(triethanolamine buffer)所組成的群組，調整酸鹼度值為4.0至9.0。而添加0.01%檸檬酸緩衝劑(citrate buffer)，0.5%亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)酸鹼度值為4.5獲得安定之配方。在使用上述半乳糖組合物60分鐘後，先以肥皂和溫水清洗手指並擦乾，採體液前用酒精棉片擦試指 尖，需等指尖完全乾燥後，使用體液採集裝置取得體液樣品，且應避免過度擠壓體液採集部分。

1-3 使用程序

(1)密碼卡校正

為了測得正確的半乳糖值，在每一次使用新的一盒半乳糖測片時，應重新校正測量儀。校正時，只許使用附於該盒的密碼卡。並確認密碼卡密碼及所用的測片盒上的密碼相同，之後將密碼卡的接觸電極***測量儀密碼卡插槽。將測片***測量儀的測片插槽後，測量儀會自動開機， 且在螢幕顯示出“

”範例。使用者須確認此密碼與密碼卡相同，隨 後取出密碼卡，如此校正即完成，便可進行半乳糖測試。

(2)檢測半乳糖

取將測片***測量儀之測片***孔處後，測量儀即自動開 機，並於螢幕顯示“

”範例，使用者確認螢幕密碼與測片盒之密碼相 同，待螢幕閃爍滴血符號“

”即可採血。

採集體液前需用酒精棉片擦拭指尖，待完全乾燥後，以體液採集裝置，取得體液樣品。將體液輕觸測片之吸體液口，測片即自動吸入體液至反應區，待看見測片反應區透明試窗完全呈現體液顏色並聽見“嗶”聲，即可移開指尖體液樣品。量測完畢時(約1分鐘)，即會在螢幕顯示出半乳糖值。測試完畢後，取出測片，並妥善丟棄；若不連續測試，三分鐘後測量儀會自動關機。

實施例2檢測系統原理與測試

本發明主要提供一種藉由半乳糖快速定量檢測系統量測體 液半乳糖含量，係讓受試者使用前述之半乳糖組合物，該半乳糖組合物經由人體肝臟代謝後，於血液中產生半乳糖或其代謝物，受試者以指尖採血得到一樣品，將該樣品滴入本發明之測片，由於該測片中含有酵素，可與血液中半乳糖或其代謝物產生電化學反應而產生電流，將測片***本發明之測量儀，測量儀透過檢測測片的電流訊號測量受試者體內的半乳糖含量，藉此監控受試者的健康狀況，因為該方法檢測過程簡單，可大幅降低以往檢測半乳糖所耗的時間，亦不失其準確度。

圖2係顯示根據本發明之實施例而繪示的半乳糖檢測系統方塊示意圖，此系統包含本發明之一測片100以及一測量儀200。測量儀200包含用以對外連接的連接器210、用於換算濃度的計算單元211、一類比數位轉換器212、一處理器213及一顯示器214。當電源單元215通過連接器210施加一訊號(較佳訊號為方波訊號，其頻率為1KHz~22KHz；電壓為50mV~5V，較佳的該電壓為300mV~800mV)到測片100後，樣品中半乳糖或其代謝物與測片中的酵素發生電化學反應產生一電化學訊息，該訊號會與該電化學訊號作用產生一相應的反應訊號，通過連接器210傳送該相應的反應訊號到測量儀200的計算單元211。然後，計算單元211會計算該相應的反應訊號，並將該相應的反應訊號輸出到類比數位轉換器(analog to digital converter，簡稱ADC)212，類比數位轉換器212會將該相應的反應訊號轉換為一數位化的反應訊號，此數位化的反應訊號經由處理器213進行進一步處理及/或經由顯示器214將顯示測量結果。此外，該數位化反應訊號可傳送至一數位終端機300，像是透過藍芽、無線訊號等方式將半乳糖濃度訊號傳送至手機或是電腦。

2-1 準確度測試

首先準備5種不同濃度之半乳糖樣品(分別為200μg/mL,500μg/mL,900μg/mL,1200μg/mL及1500μg/mL)，各自取24組，並將靜脈血液作為體液樣品之具體實施例分別加入其中，再以本發明所請之測量儀測試其濃度數值，並計算其平均(μg/mL)、標準差(standard deviation,S.D)及變異係數(coefficient of variation,%C.V.)做成迴歸分析圖(見圖3)。其中檢測環境為室溫(25±5℃)，相對溼度為20%至60%。如圖3所示，本發明之測量儀讀取數值與實際半乳糖濃度有高達0.98之高度相關係數，代表本發明之測量儀有高度準確性。

2-2 精密度測試

首先於檢測環境為室溫(25±5℃)，相對溼度為20%至60%準備5種不同濃度之半乳糖樣品(分別為200μg/mL,500μg/mL,900μg/mL,1200μg/mL及1500μg/mL)，各自取3組，並將靜脈血液作為體液樣品之具體實施例分別加入其中，再以本發明所請之測量儀測試其濃度數值，然後重複做8天，並且計算其及變異係數(coefficient of variation,%C.V.)之平均(如圖4所示)，由圖4數據可知，5種濃度8天之變異係數平均值介於6.5-7.5之間，代表該測量儀有高度精密度。

綜上所述，本發明之半乳糖檢測系統使用過程簡便且快速，是因為透過本發明的半乳糖組合物配方，使半乳糖快速經由人體肝臟代謝，使血液或體液中含有半乳糖或其代謝物，再以指尖採血，又當採集的樣品與測片中的酵素發生電化學反應，並以本發明之測量儀檢測，僅需花費1分鐘之讀取時間，不需要再行製作檢體，大幅的減少使用者的測量半乳 糖的步驟，進而縮短測量時間，因此本發明提供本領域一個快速、簡便又有高準確性的半乳糖測量方法，以供需要檢測半乳糖的患者使用。

實施例3 檢驗測片

圖5是依照本發明的一實施例的測片示意圖。測片100包括一絕緣基板110、一電極單元120、一第一絕緣隔片130及一第二絕緣隔片140，測片中內含酵素可與樣品中的半乳糖或其代謝物產生電化學反應。

絕緣基板110為具有平整的表面、具有電絕緣性以及可耐40℃~120℃的耐熱能力之基材，其材料可包含聚氯乙烯(PVC)、玻璃纖維(FR-4)、聚酯(polyester suphone)、電木板、聚對苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板、陶瓷或上述材料之任意組合。

電極單元120配置於絕緣基板110上，並包括相對的一第一端122與一第二端124。電極單元120可由多個彼此之間相互絕緣的電極所組成，其材料可為任何導電物質，例如鈀膠、鉑膠、金膠、鈦膠、碳膠、銀膠、銅膠、金銀混合膠、碳銀混合膠、或上述導電材料之任意組合。在一實施例中，電極單元120係由一導電碳粉層或是金屬層所構成。又一實施例中，電極單元120係由一導電銀膠層及位於其上的一導電碳粉層所組成，其中該導電碳粉層的阻抗一般遠大於導電銀膠層或其他金屬膠層。

而第一絕緣隔片130材料可包含但不限於聚氯乙烯絕緣膠帶、乙烯對苯二甲酸酯絕緣膠帶、熱乾燥型絕緣漆或紫外光固化型絕緣漆，其覆蓋部分的電極單元120(也就是部分的第一端122)且包括位於第一絕緣隔片130的一第一邊緣132的一反應區流道134。其中第一端122露出於反應 區流道134，體液樣品(例如是血液)能夠透過毛細作用填入反應區流道134，以進行後續的電化學反應。反應區流道134的兩長邊呈階梯狀，並且在靠近第一邊緣132處的寬度大於遠離第一邊緣132處的寬度。

配置於第一絕緣隔片130的反應區流道134內至少具有一反應層150，其至少覆蓋位於反應區流道134中的電極單元120且包含至少含有半乳糖酵素與導電介質之成分，用以與體液樣品(例如是血液)產生化學反應。其中反應層150更含有半乳糖酵素及導電介質測量區。

反應層150之組成可以但不限於酵素、輔酶、導電介質、緩衝劑、安定劑或界面活性劑。其中導電介質係用以接收活化物質與體液樣品反應後所產生之電子，並將該電子經由電極單元120傳導到測量儀200，其包含但不限於二茂鐵(Ferrocene)、二茂鐵鹽(ferrocenium)、亞甲藍(methylene blue)、三乙腈基三氯化釕(tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羥基苯醌(2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎諾二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺藍(toluidine blue)、5,6-二胺基-1，10-鄰二氮雜菲(5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M=Ru or Os；BPY=2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))。又導電介質可為金屬離子化合物該金屬離子化合物包含以金屬離子藉由電子及電荷吸引關係而成為的金屬鹽類並可以於水溶液中解離，可為但不限於MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂或其組合；該緩衝劑包含但不限於Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures(CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine、TAPS之中性及鹼性緩衝劑；該安定劑 係包含但不限於木糖醇、甘露醇、聚木糖、***木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纖維素(Methocel)、瓊脂糖(agarose)、溶膠凝膠(sol-gel)、膠原(collagen)、殼聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neo protein)，胺基酸或其任一組合；該界面活性劑，包含但不限於陽離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、中性離子界面活性劑或非離子界面活性劑。

另外，本發明的測片的第二絕緣隔片140是覆蓋於第一絕緣隔片130、部分的電極單元120及部分的絕緣基板110。由於第二絕緣隔片140完全覆蓋在第一絕緣隔片130的反應區流道134上，使得反應區流道134的上、下、左、右分別被第二絕緣隔片140、絕緣基板110、第一絕緣隔片130在反應區流道134旁的三壁面包圍而形成五面封閉的管形。當體液樣品透過測片100的採體液樣品口進入反應區流道134時，體液樣品在反應區流道134內的附著力會大於體液樣品的內聚力，而使得體液樣品持續前進。

更進一步地來說，第一絕緣隔片130的第一邊緣132、第二絕緣隔片140的一第二邊緣142及絕緣基板110的同側邊緣呈現一個外凸的弧形，絕緣基板110的此邊緣相對反應區流道134前段位置呈內凹結構，測片100利用第二邊緣142的外凸結構及絕緣基板110相對反應區流道134前段位置的內凹結構破壞體液的內聚力，並搭配毛細現象以達到快速進體液樣品的功能。還有，第二絕緣隔片140更包含一通氣孔144，其位於較遠離第二邊緣142的位置，也就是位於第一絕緣隔片130的反應區流道134的末端。通氣孔144用以排出反應區流道134內的氣體，以避免體液樣品被氣泡堵住而無法在反應區流道134內順利前進。

其中，由於測片內半乳糖酵素的蛋白質不穩定，無法在鹼性環境及乾燥的狀態下保存，據此，半乳糖酵素皆以酸性的狀態並以溶液保存，但在酸性的硫酸胺溶液下保存時間非常短，一旦乾燥即失去活性，故無法成為固態方式存在，然而透過本發明之測片的上述配方與其結構，使測片中的酵素不只可於酸性環境下保存，亦可在中性及鹼性環境方式固化及保存，同時可使酵素於乾燥狀態下仍然保持活性，長期保存其中，是故，本發明的測片藉由上述之配方突破以往限制，使酵素可被固定化及乾燥化，有效將酵素乾燥於試片上並仍保有活性。

3-1 測片檢驗體積檢測

圖6為一般濾紙體液體積分析，並以血液作為體液樣品之具體實施例，由結果可知使用濾紙至少需取30μL之指尖血體積方能確保誤差小於15%。而本案之測片則可以較小體積做檢測，實驗方法為先準備3種濃度之半乳糖(分別為200μg/mL,900μg/mL及1500μg/mL)，每個濃度各自會以1,2,5,7及10μL容量檢測其數據值(見圖7)，並各自重複3次，並計算其平均(μg/mL)、標準差(standard deviation,S.D)及變異係數(coefficient of variation,%C.V.)。其中濃度在250μg/mL以下之半乳糖，可接受之平均C.V為小於20%；而濃度在251至1500μg/mL，可接受之平均C.V.為小於15%。由圖7結果可知，濃度200μg/mL之半乳糖各體積之平均C.V為3.03~8.15%，小於15%；而900μg/mL及1500μg/mL之半乳糖各體積之平均C.V為3.14~6.54%，皆小於20%，故本檢測測片可檢測體積≧1μL之半乳糖。

3-2 測片長期安定度測試

為評估測片於嚴酷環境下，推估其於4℃環境下保存天數。 準備5種濃度之半乳糖檢體(分別為200μg/mL,500μg/mL,1200μg/mL,900μg/mL及1500μg/mL)，個別分成3組，分別是30℃、40℃與45℃之存放環境，並逐一測量其半乳糖讀值，其中濃度在250μg/mL以下之半乳糖，可接受之平均C.V為小於20%；而濃度在251至1500μg/mL，可接受之平均C.V.為小於15%；而相關係數(R)需大於0.9。由圖8之結果可知，於4℃可存放最久(545.32天)，30℃則是30天，40℃為11天，45℃則是7天，本發明之測片較佳之存放環境可存放於4℃~10℃。由此可知，本測片現已可儲存4℃下180天安定，室溫60天安定；加速性試驗預估4℃下545天安定。

3-3 血容性測試(Hematocrit Evaluation Test)

為檢測測片能否在正常範圍內檢測不同紅血球體積比例Hematocrit,HCT)之血液樣品。先準備5種不同濃度之半乳糖血液樣品(分別為200μg/mL,450μg/mL,800μg/mL,1150μg/mL及1500μg/mL)，並各自準備20%,30%,40%,50%及60%範圍之HCT之樣品，並逐一測量其半乳糖讀值，其中濃度在250μg/mL以下之半乳糖，可接受之平均C.V為小於20%；而濃度在251至1500μg/mL，可接受之平均C.V.為小於15%；而相關係數(R)需大於0.9。結果如圖9所示，450~1500μg/mL之平均C.V.皆小於15%；200μg/mL之平均C.V小於20%，因此本試驗測片至少可測試20%~60%血容性範圍之血液檢體。

3-4 重複性測試(Repeatability test)

為評估半乳糖快速定量檢測系統之結果是否具有重複性，進行重複性測試，該測試會準備5種不同濃度之半乳糖(分別為200μg/mL, 500μg/mL,900μg/mL,1200μg/mL及1500μg/mL)加入體液樣品中，每種濃度將會被3台測量儀測試，而每一種測量儀會重複測量6次。濃度250μg/mL以下之半乳糖平均C.V.需在20%以下，251-1500μg/mL之半乳糖平均C.V.需在15%以下。圖10顯示500~1500μg/mL之平均CV在7.12~9.83%之間，小於15%；200μg/mL之平均CV為14.58%，小於20%，故本發明之半乳糖快速定量檢測系統之結果具有重複性。

綜上所述，本發明之測片可檢測最小體積為1μL之體液樣品，且由於前述之酵素與其配方，使本發明之測片可於室溫下存放60天，於4℃下存放180天，克服習知半乳糖測片保存不易的技術障礙，且因本發明測片可檢驗體積最小為1μL，可讓受試者免於每次檢測造成大傷口的不適，又同時保有檢測結果的高度準確性，提供半乳糖受試者一較佳之使用工具。

實施例4 以半乳糖快速定量檢測系統判斷肝功能

4-1 口服半乳糖OGSP結果與靜脈注射半乳糖的GSP結果比較

圖11、圖12為127位受試者(56位肝功能正常與71位肝功能受損)以靜脈注射半乳糖的GSP(Galactose Single Point，半乳糖單點法)結果與口服半乳糖的OGSP(Oral galactose single point，口服半乳糖單點法)相關性，依據Digest 1992；52：222-231建議，將受試者以靜脈注射半乳糖的GSP數值(GSP)將受試者分為3組，以GSP<280μg/ml定義受試者為肝功能正常，GSP介於280~480μg/ml定義受試者為肝功能中度受損，GSP>480μg/ml定義受試者為肝功能嚴重受損，根據圖10、11結果，口服半乳糖的OGSP 數值比靜脈注射半乳糖的GSP數值更高，且口服半乳糖的OGSP數值隨著肝功能受損的嚴重度而增加，且，OGSP與GSP呈正相關性，肝功能正常組的受試者口服半乳糖OGSP數值為318±27μg/ml(平均值±標準誤SE)，最低值為18μg/ml，最高值為887μg/ml；肝功能輕度或中度受損的受試者口服半乳糖OGSP數值為590±40μg/ml(平均值±標準誤SE)，最低值為294μg/ml，最高值為1282μg/ml；肝功能嚴重受損的受試者口服半乳糖OGSP數值約為777±48μg/ml(平均值±標準誤SE)，最低值為293μg/ml，最高值為1499μg/ml。表5結果顯示3組受試者以靜脈注射半乳糖的GSP結果與口服半乳糖的OGSP結果，結果顯示口服半乳糖的OGSP數值隨著肝功能受損的嚴重度而增加，特別的是，口服半乳糖的OGSP數值比靜脈注射半乳糖的GSP數值更高，根據圖11、圖12與表5結果可以判斷，肝功能正常組的受試者口服半乳糖OGSP數值主要範圍(平均值±2倍標準誤SE)約為264~372μg/ml，肝功能輕度或中度受損的受試者口服半乳糖OGSP主要範圍(平均值±2倍標準誤SE)約為510~670μg/ml，肝功能嚴重受損的受試者口服半乳糖OGSP主要範圍(平均值±2倍標準誤SE)約為介於681μg/ml與873μg/ml之間。即使受試者結果因個體差異有所不同，肝功能正常組的受試者口服半乳糖OGSP數值通常不超過670μg/ml，肝功能受損受試者的OGSP數值會大於370μg/ml，因此受試者的OGSP數值大於370μg/ml應接受進一步的肝臟功能檢測。除了上述靜脈注射方式，以其他注射方式或是投藥方式也可獲得相似結果。

表一、受試者以靜脈注射GSP結果與口服半乳糖的OGSP結果(平均值±標準誤SE)

***P<0.005(ANOVA & LSD分析)

實施例5 新生兒之半乳糖血症(Galactosemia)篩檢

半乳糖血症為遺傳性疾病，歸因於病患沒有足夠的半乳糖分解酶，因此半乳糖堆積於體內，導致病患產生嗜睡、嘔吐、腹瀉、不能正常生長以及黃疸等症狀。經由新生兒篩檢可以在嬰兒食用母乳前確定不會有不良影響，本發明之測量儀亦可用於新生兒之半乳糖血症篩檢，由於新生兒篩檢的檢驗不依賴蛋白質或是乳糖的消化，而是採用嬰兒的第一個血液樣品，因此做此篩檢不須先服用本發明之半乳糖組合物，且係採腳尖採血，當血液樣品結果偵測出半乳糖數值大於100μg/ml即代表該新生兒有半乳糖血症之風險，需做進一步檢查。

實施例6 半自動化手臂操作分析

圖13為半乳糖單點法使用半自動化機器手臂分析傳統酵素濾紙方法與半乳糖快速定量檢測系統進行比較，並分別以靜脈注射半乳糖組合物與口服半乳糖組合物兩種方式進行，其中靜脈注射半乳糖組合物以傳統酵素濾紙方法與本案半乳糖快速定量檢測系統的相關係數為0.963，而口服半乳糖組合物之相關係數為0.927。總體來說，不論是以口服或是靜脈注射都具有高度相關性，其相關係數皆達0.9以上，故本發明之半乳糖快速定量檢測系統可供業者量產。

綜上所述，本發明所提供之一種半乳糖快速定量檢測系統，係經過準確度及精密度測試，且可用於判斷肝功能以及半乳糖相關疾病，例如，例如新生兒之半乳糖血症篩檢，以供專業人員或是病患判斷其身體狀態，並依此判斷是否需做進一步檢查。

100:測片

200:測量儀

210:連接器

211:計算單元

212:類比數位轉換器

213:處理器

214:顯示器

215:電源單元

300:數位終端機

Claims (24)

1. 一種半乳糖快速定量檢測系統，其包括：一半乳糖組合物，包含一已知濃度的半乳糖、一0~99%的抗氧化劑及一緩衝劑，該半乳糖組合物進入體內經肝臟代謝後，產生一體液樣品；一測片(strip)，包含一酵素及一安定劑，該酵素會與該體液樣品反應產生一電化學訊息，該酵素對該體液樣品中的半乳糖具有專一性，該安定劑可穩定該酵素；以及一測量儀，包含：一電源單元，提供一訊號；一連接器，接收該電源單元所提供的該訊號並將該訊號傳送到該測片上，該訊號與該電化學訊號作用產生一相應的反應訊號後，將該相應的反應訊號傳送到該測量儀；一計算單元，計算該相應的反應訊號；一類比數位轉換器，接收由該計算單元計算過的該相應的反應訊號，將計算過的該相應的反應訊號轉換成一數位化反應訊號；一處理器，處理該數位化反應訊號；及一顯示器，顯示該數位化反應訊號；其中該數位化反應訊號可被傳送至一數位終端機。
2. 如申請專利範圍第1項之半乳糖快速定量檢測系統，其中該緩衝劑係選自於抗壞血酸鹽緩衝劑(ascorbic acid buffer)、檸檬酸緩衝劑(citrate buffer)、磷酸緩衝劑(phosphate buffer)、醋酸緩衝劑(acetate buffer)、碳酸緩衝劑 (carbonate buffer)及三乙醇胺緩衝劑(triethanolamine buffer)所組成的群組。
3. 如申請專利範圍第1項之半乳糖快速定量檢測系統，其中該抗氧化劑係選自於由維生素C或/和亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、維生素A、維生素E、類黃酮、多酚、乙二胺四乙酸((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙[羧甲基]甘胺酸(NTA)所組成的群組。
4. 如申請專利範圍第1項所述之半乳糖快速定量檢測系統，其中該半乳糖至少包含D-(+)-半乳糖、L-(-)-半乳糖、安定同位素半乳糖、環狀半乳糖或半乳糖衍生物。
5. 如申請專利範圍第1項所述之半乳糖快速定量檢測系統，其中該半乳糖組合物係以口服或是注射、噴霧吸入及***、直腸、栓劑或是其他臨床適合方式給予。
6. 如申請專利範圍第1項所述之半乳糖快速定量檢測系統，其中該半乳糖組合物係口服半乳糖組合物；該檢測系統係透過讓使用者先使用該口服半乳糖組合物，接著檢測該體液樣品中之半乳糖含量之方式測量體內中之半乳糖含量。
7. 如申請專利範圍第5項所述之半乳糖快速定量檢測系統，其中該注射方式係透過讓使用者先注射該半乳糖組合物進體內，接著檢測體液中之半乳糖含量之方式測量體內中之半乳糖含量。
8. 一種如申請專利範圍第1項所述之半乳糖快速定量檢測系統之測片，包括：一絕緣基板； 一電極單元，配置於該絕緣基板上；一第一絕緣隔片，覆蓋部分的該電極單元且包括位於該第一絕緣隔片的一第一邊緣的一反應區流道，其中部分的該電極單元露出於該反應區流道；以及一第二絕緣隔片，包含一第二邊緣，該第二絕緣隔片覆蓋於該第一絕緣隔片的該反應區流道上，該第二絕緣隔片的該第二邊緣與該第一絕緣隔片的該第一邊緣及該絕緣基板的同側邊緣呈現外凸的弧形，該絕緣基板相對該反應區流道前段位置呈現內凹結構，其中該反應區流道內含有一反應層，該反應層覆蓋位於該反應區流道中的該電極單元且包含一酵素、一安定劑與一導電介質，用以與體液樣品產生電化學反應；其中該測片係利用該第二絕緣隔片的該第二邊緣的外凸的弧形與該絕緣基板相對該反應區流道前段位置的內凹結構破壞體液的內聚力，搭配毛細現象以達到快速進體液樣品；其中該酵素對半乳糖具有專一性；該安定劑可穩定該酵素。
9. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該絕緣基板係由選自於由聚氯乙烯(PVC)、玻璃纖維(FR-4)、聚酯(polyester suphone)、電木板、聚對苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板及陶瓷所組成之群組。
10. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該電極單元係由選自於鈀膠、鉑膠、金膠、鈦膠、碳膠、銀膠、銅膠、金銀混合膠及碳銀混合膠所組成之群組。
11. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該反應層係選自於酵素、輔酶、導電介質、緩衝劑、安定劑與界面活性劑所組成之群組。
12. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該導電介質係選自於由二茂鐵(Ferrocene)、二茂鐵鹽(ferrocenium)、亞甲藍(methylene blue)、三乙腈基三氯化釕(tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羥基苯醌(2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎諾二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺藍(toluidine blue)、5,6-二胺基-1，10-鄰二氮雜菲(5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M=Ru or Os；BPY=2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))所組成之群組。
13. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該導電介質可為金屬離子化合物，該金屬離子化合物係選自於由MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂及其組合所組成之群組。
14. 如申請專利範圍第11項所述之測片，其中該緩衝劑係選自於由Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures(CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine和TAPS組成之群組。
15. 如申請專利範圍第11項所述之測片，其中該安定劑係選自於由木糖醇、甘露醇、聚木糖、***木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纖維素(Methocel)、瓊脂糖(agarose)、溶膠凝膠(sol-gel)、膠原(collagen)、殼聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neo protein)，胺基酸或其任一組合所組成之群組。
16. 如申請專利範圍第11項所述之測片，其中該界面活性劑係選自於由陽離子界面活性劑、陰離子界面活性劑，中性離子界面活性劑和非離子界面活性劑所組成之群組。
17. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該測片之半乳糖測試範圍為50-2000μg/ml。
18. 如申請專利範圍第8項所述之測片，其中該酵素可被固定化及乾燥化，並保存於酸鹼中性環境。
19. 一種如申請專利範圍第1項之半乳糖快速定量檢測系統之應用，其中該半乳糖快速定量檢測系統可用於測量血中半乳糖濃度以檢測新生兒半乳糖血症。
20. 如申請專利範圍第19項所述之應用，其中該半乳糖快速定量檢測系統提供監控半乳糖值及肝能不全患者或專業人員測量。
21. 如申請專利範圍第19項所述之應用，其中該半乳糖快速定量檢測系統係以半乳糖濃度判斷肝臟剩餘功能。
22. 一種半乳糖快速定量檢測系統用於判斷肝功能之應用，其係包含使用如申請專利範圍第1項所述半乳糖快速定量檢測系統檢測口服半乳糖單點法(OGSP)數值，並依據該口服半乳糖單點法數值表示肝功能狀況。
23. 如申請專利範圍第22項所述之應用，其中該口服半乳糖單點法數值>345±10% μg/ml時，表示肝功能受損。
24. 如申請專利範圍第22項所述之應用，其中該口服半乳糖單點法數值為345±10%~630±10% μg/ml時，表示肝功能輕度或中度受損；該口服半乳糖單點法數值>630±10% μg/ml時，表示肝功能嚴重受損。

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