BR112016005240A2

BR112016005240A2 - Composição compreendendo extrato de guaçatonga e extrato de aroeira, uso da mesma e método para prevenção e/ou tratamento dos sinais ocasionados pelo envelhecimento da pele

Info

Publication number: BR112016005240A2
Application number: BR112016005240A
Authority: BR
Inventors: Passero Alan; Paula Pedroso De Oliveira Ana; Iatesta Domenico Carolina; Rosa Ferrari Cintia; Zimbardi Daniela; De Assis Santos Icaro; Carvalhães Lago Juliana; Fabiola Arroteia Kelen; Araujo Rodrigues Muchiutti Pamela; Hannel BUELONI Renata; Thaís Paulineli Navas Rhaisa; Maria Teixeira Tage Biaggio Rosa; Baione De Moura Soraya
Original assignee: Natura Cosmeticos Sa
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2014-09-08
Publication date: 2020-04-28
Also published as: FR3010313A1; MX2016003091A; BR112016005240B1; AU2014317742A1; WO2015031971A2; WO2015031971A3; WO2015031971A8; MX370166B; AR097599A1; EP3038715B1; US10966917B2; US20160220476A1; CL2016000544A1; EP3038715A2

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição cosmética compreendendo extrato de guaçatonga (casearia silvestres), extrato de aroeira (schinus terebinthifolius raddi) e adjuvantes cosmeticamente aceitáveis direcionada à prevenção e/ou tratamento de sinais ocasionados pelo envelhecimento da pele. a invenção refere-se ainda ao uso de extrato de guaçatonga (casearia silvestres) e de extrato de aroeira (schinus terebinthifolius raddi), na preparação de uma composição cosmética para prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele, bem como o uso desta composição para simultaneamente aumentar a tropoelastina, aumentar a enzima lisil-oxidase (lox) e reduzir da atividade de elastase na derme. a invenção refere-se a um método de prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele que compreende a aplicação na pele da dita composição cosmética. por fim, a invenção refere-se a um método de preparação da dita composição de acordo com a presente invenção.

Description

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO EXTRATO DE GUAÇATONGA E EXTRATO DE AROEIRA, USO DA MESMA E MÉTODO PARA PREVENÇÃO E/OU TRATAMENTO DOS SINAIS OCASIONADOS PELO ENVELHECIMENTO DA PELE.

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao uso de uma tecnologia vegetal da biodiversidade brasileira para incremento da formação do sistema elástico funcional da pele compreendendo uma combinação de extrato de guaçatonga (Casearia sylvestris) e de aroeira (Schinus terebinthifolius raddi). A presente invenção se refere também a um múltiplo mecanismo de ação, isto é, deposição de elastina, através do aumento de elastina e lisil-oxidase (LOX), e redução de sua degradação através da inibição da enzima elastase. A presente invenção se refere particularmente ao uso da referida tecnologia em composições cosméticas para o tratamento dos sinais de envelhecimento cutâneo. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A pele recobre a superfície do corpo humano e é constituída por uma porção epitelial, a epiderme, e uma porção conjuntiva, a derme. A pele é um dos maiores órgãos do corpo humano e desempenha múltiplas funções como proteção do organismo contra a perda de água e contra o atrito, transmissão de informações sobre o ambiente para o sistema nervoso central, colabora na termorregulação do corpo e excreção de várias substâncias, entre outras.

[003] A epiderme é constituída por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado.

[004] A derme, por sua vez, é constituída por tecido conjuntivo onde se apoia a epiderme e une a pele ao tecido subcutâneo. A derme apresenta espessura variável de acordo com a região observada, atingindo um máximo de 6 mm.

[005] A derme é constituída essencialmente por duas camadas: a

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2/20 papilar, superficial, e a reticular, mais profunda.

[006] A camada papilar é delgada, constituída por tecido conjuntivo frouxo, formando as papilas dérmicas. Aqui estão presentes fibrilas especiais de colágeno, que se inserem por um lado na membrana basal e pelo outro penetram profundamente na derme. Essas fibrilas ajudam na fixação da derme à epiderme.

[007] A camada reticular é, por sua vez, mais espessa, e é constituída por tecido conjuntivo denso. Ambas as camadas contêm muitas fibras do sistema elástico, responsáveis pela elasticidade da pele.

[008] As fibras elásticas ou fibras de elastina são os principais componentes do sistema elástico da pele. Essas fibras são formadas pela polimerização (junção ou reticulação) de monômeros chamados de tropoelastina, sendo este, portanto, um precursor da elastina. Este processo de polimerização não é espontâneo e depende da atuação da enzima lisil-oxidase (LOX), que ajuda na polimerização de tropoelastina em elastina. Em contrapartida, a enzima elastase é a enzima que degrada as fibras de elastina da pele.

[009] Durante o envelhecimento da pele e com a constante incidência de radiação UV à que é exposta ao longo do tempo, existe uma redução dos mecanismos formadores de elastina, dessa forma reduzindo a quantidade de elastina na pele. Concomitantemente, ocorre um aumento da degradação dessas proteínas devido ao aumento da enzima elastase, responsável por esta degradação.

[0010] Os produtos direcionados ao retardamento e/ou melhora dos sintomas do envelhecimento na pele já existentes no mercado não possuem uma composição que leve ao mecanismo de ação proposto pela presente invenção. Além disso, não existe qualquer descrição no estado da técnica de um produto compreendendo especificamente os extratos vegetais de guaçatonga e aroeira que tenha como finalidade o retardamento e/ou melhora dos sitomas do envelhecimento da pele de

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3/20 acordo com a presente invenção. Existem alguns produtos que têm por objetivo o aumento da produção de elastina na pele. Entretanto, não há qualquer comprovação de que haja efetivamente um aumento na deposição de elastina - comprova-se, por exemplo, somente aumento de tropoelastina solúvel, sem comprovação da deposição de fato. Algumas vezes, fala-se inclusive do aumento de colágeno ou redução de colagenase na pele e que isso, de alguma forma, aumentaria a elasticidade da pele. Tal conceito é equivocado, uma vez que as fibras de colágeno estão relacionadas à firmeza da pele e não com a elasticidade da mesma. Há ainda alguns produtos que prometem o aumento da enzima LOX e, dessa forma, um aumento da elastina funcional na pele. No entanto, não há qualquer comprovação do aumento da proteína tropoelastina e da elastina funcional. Alguns produtos trabalham apenas com o mecanismo antielastase de forma isolada, enquanto outros não comprovam mecanismo de ação em sistema elástico.

[0011] Existem ainda os produtos que são usados com o objetivo de serem antielastase ou, na maior parte das vezes, a proteção da elastina, porém de forma isolada, sem concomitante aumento da quantidade de elastina e do depósito da mesma. Há ainda aqueles produtos que contêm hidrolisados de elastina em sua composição e, dessa forma, prometem um aumento da elasticidade da pele e de sua capacidade de regenerar e produzir elastina. Este conceito é equivocado, uma vez que a elastina não penetra na pele e, dessa forma, o efeito prometido não é alcançado.

[0012] Por fim, existem ainda produtos que prometem uma melhora na funcionalidade da fibra elástica através do extrato de semente de Dill, extrato este que aumentaria a concentração de LOX. No entanto, apenas o aumento da concentração de LOX não garante um aumento de elastina.

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[0013] Diante disso, é possível notar que nenhum produto disponível no mercado possui uma abordagem multifocal que atua em múltiplos mecanismos do sistema elástico para deposição de elastina funcional tal como a composição compreendendo os extratos vegetais de guaçatonga e aroeira proposta pela presente invenção.

[0014] No que tange a documentos do estado da técnica no campo tecnológico da presente invenção, observa-se que o documento norte-americano US 2004/0258676 refere-se a composições para regulação de elastogênese em casos de elastogênese anormal ou patológica compreendendo uma isoforma da enzima LOX, bem como uma metodologia de screening para selecionar composições capazes de atuar na elastogênese (formação de elastina). O referido documento, diferentemente da presente invenção, refere-se à estimulação da atividade da enzima LOX apenas nos casos em estados patogênicos ou anormais ou deficientes de elastogênese, tais como fibrose ou elastose solar. Já a presente invenção refere-se a uma combinação específica de guaçatonga e aroeira que trabalham conjuntamente em três mecanismos biológicos especificamente voltados para o sistema elástico da pele, quais sejam, aumento de tropoelastina (precursor de elastina), aumento da enzima LOX em células sadias e normais e redução da atividade de elastase. Apesar de descrever a atuação em uma das enzimas relacionadas ao sistema elástico da pele, não há qualquer menção ou sugestão no referido documento sobre o uso combinado da guaçatonga e da aroeira, muito menos para atuação no sistema elástico como um todo. O referido documento tampouco descreve a estimulação da atividade da enzima LOX em outro estado que não patogênico ou anormal.

[0015] O documento US 2002/064538, por sua vez, revela um método para controle de elasticidade da pele compreendendo uma etapa de utilização de um composto que inibe ou induz a expressão de tro

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5/20 poelastina mRNA ou proteína em queratinócitos. Tal documento pleiteia apenas a modulação da tropoelastina. O referido documento não descreve a redução de atividade de elastase, tampouco o aumento de deposição de elastina na pele. Além disso, os extratos vegetais utilizados na presente invenção não são utilizados ou sequer sugeridos como possíveis componentes da composição revelada no estado da técnica. O referido documento tampouco descreve o uso combinado de guaçatonga e aroeira na atuação no sistema elástico como um todo. [0016] Já o documento WO 2006/053415 revela o fornecimento de extratos vegetais listados em suas Tabelas 1 a 5 e seus usos dermatológicos com efeito inibidor das proteases MMP1, 3, 9 e elastase de leucócitos humanos. Entretanto, o referido documento está voltado apenas para a inibição de proteases. Diferentemente, a presente invenção, como já mencionado acima, apresenta uma abordagem multifocal do sistema elástico, visando aumentar o depósito de elastina na pele e, ao mesmo tempo, evitar a sua degradação com o uso combinado de aroeira e guaçatonga. O documento em questão não cita o aumento de deposição de elastina na pele e a composição e os extratos vegetais utilizados naquela invenção não são os compreendidos na combinação da presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] A presente invenção refere-se a uma composição cosmética compreendendo de 0,0001 a 10% em peso da composição total de extrato de guaçatonga (Casearia sylvestris), de 0,00005 a 10% em peso da composição total, extrato de Aroeira (Schinus terebinthifolius raddi) e adjuvantes cosmeticamente aceitáveis, direcionada à prevenção e/ou tratamento de sinais ocasionados pelo envelhecimento da pele.

[0018] A presente invenção compreende ainda o uso de extrato de Guaçatonga (Casearia sylvestris) e de extrato de Aroeira (Schinus te

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6/20 rebinthifolius raddi) na preparação de uma composição cosmética para prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele, bem como o uso desta composição para simultaneamente aumentar a tropoelastina, aumentar a enzima lisil-oxidase (LOX) e reduzir da atividade de elastase na derme.

[0019] É ainda parte do escopo da presente invenção um método de prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele que compreende a aplicação na pele da dita composição cosmética.

[0020] A presente invenção compreende ainda um método de preparação da dita composição cosmética de acordo com a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0021] A Figura 1 representa uma análise comparativa da expressão gênica relativa de LOX entre um grupo controle e um grupo tratado com diferentes concentrações da amostra de extrato de Guaçatonga. [0022] A Figura 2 representa uma análise da expressão gênica relativa de tropoelastina entre um grupo controle e um grupo tratado com diferentes concentrações da amostra de extrato de Guaçatonga. [0023] A Figura 3 representa o resultado da análise de atividade da elastase através do seu IC-50 na presença do extrato de Aroeira comparado com um inibidor específico de elastase.

[0024] A Figura 4 representa o resultado de uma análise de deposição de elastina em explantes de pele humana na presença dos extratos de guaçatonga e aroeira isoladamente e em misturas frente a um controle não tratado.

[0025] A Figura 5 representa o efeito do extrato de Guaçatonga sobre a produção de tropoelastina (mg/mL) em células RFL-6, após 48 horas de incubação. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

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[0026] A Figura 6 representa o efeito do extrato de Guaçatonga sobre a produção de Fibrilina-1 (ng/mL) em células RFL. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0027] A Figura 7 representa efeito do extrato de Guaçatonga sobre a produção de Fibulina-5 (ng/mL) em fibroblastos humanos. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0028] A Figura 8 representa efeito do extrato de Guaçatonga sobre a produção de LOX (pg/mL) em células RFL. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,05 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0029] A Figura 9 representa efeito do extrato de Guaçatonga sobre a redução da produção de MMP-12 induzida por IL-1 b (pg/mL). Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 e * p<0,05 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0030] A Figura 10 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e das Misturas de Guaçatonga e Aroeira sobre a produção de tropoelastina (mg/mL) em células RFL-6, após 48 horas de incubação. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (**p<0,01 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0031] A Figura 11 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e das misturas de Guaçatonga e Aroeira (Verde escuro), sobre a produção de Fibrilina-1 (ng/mL) em células RFL. Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0032] A Figura 12 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e das misturas de Guaçatonga e Aroeira, sobre a produção de Fibulina-5 (ng/mL) em fibroblastos humanos. Os dados representam a média +/desvio-padrão (** p<0,05 em relação ao grupo controle) (Anova, Dun

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8/20 net).

[0033] A Figura 13 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e de Misturas de Guaçatonga e Aroeira sobre a produção de LOX (pg/mL) em células RFL. Os dados representam a média +/- desviopadrão (** p<0,05 em relação ao grupo controle) (Anova, Dunnet).

[0034] A Figura 14 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e misturas de Guaçatonga e Aroeira, sobre a redução da produção de MMP-12 induzida por IL-1 b (pg/mL). Os dados representam a média +/- desvio-padrão (** p<0,01 e * p<0,05 em relação ao grupo controle) (Anova,Dunnet).

[0035] A Figura 15 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e misturas de guaçatonga e aroeira na síntese de colágeno tipo 1 em células fibroblásticas humanas primárias de monocamada.

[0036] A Figura 16 representa o efeito do extrato de Guaçatonga e misturas de guaçatonga e aroeira na síntese de ácido hialurônico em células fibroblásticas humanas primárias de monocamada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A presente invenção refere-se à utilização de extratos vegetais para aumentar a formação de elastina e reduzir sua degradação, revertendo assim o quadro gerado pelo envelhecimento da pele. Como já mencionado acima, durante o envelhecimento há a redução da formação da elastina na pele e, ao mesmo tempo, o aumento da degradação dessa proteína, causando redução da elasticidade da pele e propensão à formação de rugas e flacidez. A presente invenção provê uma composição compreendendo extratos vegetais que aumentam a formação da elastina e reduzem a sua degradação, melhorando assim a aparência da pele tratada com a tecnologia de acordo com a presente invenção.

[0038] A tecnologia de acordo com a presente invenção atua em três mecanismos biológicos intimamente relacionados ao sistema elás

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9/20 tico da pele: aumento da tropoelastina (precursor de elastina), aumento da enzima LOX (enzima responsável pela ligação cruzada das tropoelastinas para formar a elastina) e redução da atividade de elastase (enzima que degrada a elastina). Com isso, é fornecida uma abordagem multifocal do sistema elástico, visando aumentar o depósito de elastina na pele e ao mesmo tempo, evitar a sua degradação.

[0039] De acordo com a presente invenção, dois extratos vegetais com mecanismos de ação distintos e complementares são utilizados: o extrato de guaçatonga (Casearia sylvestris) e o extrato de aroeira ou pimenteira rosa (Schinus terebinthifolius raddi).

[0040] O primeiro atua aumentando a expressão do gene que produz os monômeros de tropoelastina e também do gene que produz a enzima lisil-oxidase (LOX). Dessa forma, o extrato de guaçatonga aumenta a expressão de genes. Este aumento da expressão gênica leva ao aumento das proteínas tropoelastina e LOX. A LOX formada atua ligando as tropoelastinas formadas levando à deposição efetiva da fibra de elastina na pele..

[0041] A obtenção do extrato de guaçatonga é feita através de autoclavação. A sua rota de obtenção é aquosa onde, inicialmente, as folhas são secas em estufa e trituradas com moinho de facas. Em uma concretização preferida, as folhas são colocadas em autoclave com água na proporção de 1:10 (1 parte de planta para 10 partes de água). A extração ocorre a uma temperatura de 121 °C, por um período de tempo de 1 hora. A solução extratora resultante é então filtrada em filtro prensa utilizando elemento filtrante tipo lona crua, por exemplo, à temperatura ambiente. Após a filtragem, são acrescentados silica (20%) e conservantes. O extrato aquoso é então seco por aspersão (spray dryer). O resultado é um extrato refinado (em pó) de folha de guaçatonga de cor marrom.

[0042] O segundo extrato, por sua vez, atua inibindo a atividade da

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10/20 enzima elastase. Mais especificamente, na presença da elastase, o extrato inibe o funcionamento desta enzima, impedindo que se ligue ao seu substrato-padrão (elastina). Desta forma, a atividade da enzima é reduzida, isto é, o dito extrato contribui para a redução da degradação da elastina (resultado da atividade da elastase).

[0043] Um processo de preparação do extrato de aroeira útil para a presente invenção está descrito no pedido de patente WO 2011/020167. A obtenção do extrato de aroeira ocorre sob pressão de vapor d’água a partir de folhas de aroeira. Ocorre então uma extração aquosa sob pressão de vapor na proporção de 1:7 (1 parte de planta para 7 partes de solvente extrator (água) a uma temperatura de 85° C a 150⁰ C, sob pressão de 1,60 a 2,40 Kgf/cm²). A solução resultante é então filtrada em filtro prensa, na temperatura de 85⁰ C a 95⁰ C e concentrada até redução em 3 volumes. Em seguida, ocorre o refino/precipitação com etanol na proporção de 1:3, seguido de um resfriamento (0 ⁰ C a 10 ⁰ C) e evaporação do etanol. Por fim, o filtrado é seco por secagem por aspersão (spray dryer), resultando em um extrato refinado de Schinus terebinthifolius. O extrato obtido está na forma de um pó, seco, de cor marrom, contendo proteínas, flavonoides, cumarinas, açúcares (20%), taninos condensados (20%) e ácido gálico (12%).

[0044] A presente invenção refere-se, dessa forma, a uma composição cosmética para prevenção e/ou tratamento de sinais ocasionados pelo envelhecimento da pele compreendendo de 0,0001 a 10% em peso da composição de extrato de guaçatonga, 0,00005 a 10% em peso da composição de extrato de aroeira e adjuvantes cosmeticamente aceitáveis.

[0045] Preferencialmente, a composição de acordo com a presente invenção compreende 0,005 a 5%, mais preferencialmente, 0,01 a 1%, em peso da composição de extrato de guaçatonga e 0,0005 a 5%,

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11/20 mais preferivelmente, 0,00125 a 1% em peso da composição de extrato de aroeira.

[0046] A seguir, alguns exemplos - de maneira não restritiva, mas apenas demonstrativa - de adjuvantes e constituintes inertes compatíveis com as propriedades da composição aqui descrita e que, adicionalmente, podem ser empregados na presente composição cosmética: [0047] - Água: água é a base de diversas concretizações preferidas da composição cosmética da presente invenção, atuando como o veículo para os demais componentes. As composições da presente invenção compreendem água preferencialmente desmineralizada ou destilada em um percentual adequado (q.s.p.) para atingir 100% da fórmula com base no peso total da presente composição. Naturalmente, podem-se utilizar outros veículos cosmeticamente aceitáveis na presente invenção.

[0048] - Agentes antioxidantes: BHT, BHA, tocoferol e/ou seus derivados, catequinas, taninos e/ou seus derivados, compostos fenólicos, entre outros;

[0049] - Agentes conservantes: metilparabenos, propilparabenos, isotiazolinônicos, fenoxietanol;

[0050] - Agentes formadores de filme: goma ágar, goma carragenina, alginatos, goma arábica, gelatina;

[0051] - Agentes quelantes: EDTA, ácido cítrico, ácido etidrônico.

[0052] - Agentes formadores de rede microcristalina de sustentação: dextranos, metil-acrilatos, PHB, PHA;

[0053] - Agentes poliméricos e/ou agentes copoliméricos: copolímeros de silicone, polímeros de siloxano e/ou silicone modificado, copolímeros de acrilato;

[0054] - Agentes desnaturantes: benzoato de denatônio;

[0055] - Agentes de consistência: ceras vegetais, hidrocarbonetos minerais, parafina, cera de abelha, cera branca, espermacete de baPetição 870160008455, de 09/03/2016, pág. 22/49

12/20 leia, manteiga de cacau, manteiga de karité, cera de cana-de-açúcar; [0056] - Emolientes: parafina líquida, óleo de palma, manteiga de cupuaçu, lecitina, aminoácidos do leite, proteína de trigo, proteínas vegetais, óleos vegetais, fosfolipídeos, ceramidas, ceramida de maracujá, esfingolipídeos, lanolina, óleo de amêndoa, carbonato de dicaprila, elastômeros de silicona, ciclometicona;

[0057] - Agentes umectantes e/ou agentes hidratantes: glicerina, propilenoglicol, ácido hialurônico, ureia, PCA;

[0058] - Agentes condicionantes: sais quaternários de amônio, silicones, siloxanos;

[0059] - Outros ativos cosméticos, por exemplo, extratos vegetais, polissacarídeos, que tenham função de tratamento do envelhecimento da pele; e

[0060] - agentes de proteção contra a radiação UV (filtros solares):

metoxicinamato de octila, benzofenonas, etc. A dita composição é preparada através da incorporação simultânea dos dois extratos na fração aquosa da composição. A composição de acordo com a presente invenção pode estar na forma de diversas formas farmacêuticas como, por exemplo, na forma de creme, gel, suspensão ou de sabonete.

[0061] A presente invenção prevê ainda um método para prevenir e/ou tratar os sinais ocasionados pelo envelhecimento da pele através da aplicação tópica da composição de acordo com a presente invenção.

[0062] É ainda parte do escopo da presente invenção o uso de extratos de guaçatonga e de aroeira na preparação de uma composição cosmética para prevenir e/ou tratar os sinais de envelhecimento da pele.

[0063] De forma a avaliar o efeito de aumento da expressão gênica de tropoelastina e LOX em células da pele tratada com o extrato de Guaçatonga em concentrações não citotóxicas, foi realizada a quantifi

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13/20 cação dos genes pela técnica de rt-PCR (reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa) em tempo real. Os resultados são comparados relativamente a um controle não tratado. As células utilizadas são fibroblastos da linhagem RFL.

[0064] O extrato de guaçatonga produzido pelo processo acima referido foi pesado e diretamente solubilizado em meio de cultura Ham-F12 + 2% Soro Fetal Bovino. As concentrações testadas foram 0,1; 0,05 e 0,01 mg/mL para amostra aquosa.

[0065] A linhagem celular RFL foi incubada com TGF-? conhecido indutor da expressão de LOX e, ácido elágico, conhecido indutor de tropoelastina, que são os genes de interesse para a presente invenção. Simultaneamente, outras células nas mesmas condições acima foram incubadas com o extrato de Guaçatonga. O período de incubação foi de 18 horas. Em seguida, o material celular foi coletado para extração de RNA das células e síntese de cDNA. Para as reações de PCR em tempo real, foram utilizados sistemas de amplificação Taqman, específicos para LOX e tropoelastina, além do gene GAPD como controle endógeno.

[0066] Análise da expressão relativa de LOX está representada na Figura 1. Ali é apresentada uma comparação entre o grupo controle e o grupo tratado com diferentes concentrações da amostra de extrato de Guaçatonga. O extrato a 0,1 mg/mL teve um aumento relativo de 2 CTs na expressão gênica de LOX em relação ao controle, o que significa um aumento de 200%.

[0067] Foi também realizada uma análise de expressão relativa à tropoelastina entre o grupo controle e o grupo tratado com diferentes concentrações da amostra de extrato de Guaçatonga (vide Figura 2). O extrato a 0,1 mg/mL teve um aumento relativo de 4 CTs na expressão gênica de tropoelastina em relação ao controle, o que significa um aumento de 400%.

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[0068] De forma a comprovar a atividade do extrato de Aroeira presente na composição de acordo com a presente invenção, a atividade de elastase (de neutrófilo humano) foi medida através de um kit, o EnzChek Elastase Kit Assay. Esse kit possui elastina bovina de ligamento de pescoço marcada com o fluoróforo BODIPY FL. A divagem desse composto pela enzima elastase gera fragmentos fluorescentes que absorvem a 485nm e emitem fluorescência a 535 nm. Isso permite que, com o uso de um espectrofotômetro, a atividade da elastase seja monitorada por um período de tempo. Quanto maior a intensidade de fluorescência mensurada, maior a divagem da elastina (portanto, maior a atividade da enzima elastase).

[0069] O potencial de inibição da elastase do extrato de aroeira foi comparado ao potencial do inibidor específico de elastase, a Nmetoxissuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometil cetona.

[0070] As análises foram feitas com 500 minutos de reação, ou seja, 8 horas e 20 minutos e a elastase foi utilizada na concentração de 0,25 U/ml.

[0071] O extrato de Aroeira apresentou 30% de inibição da enzima na concentração de 0,5 mg/mL. Concentrações superiores interferem no ensaio e não puderam ser testadas. O IC 50 é 0,31 mg/mL (vide Figura 3).

[0072] Os extratos de Guaçatonga e Aroeira foram testados isoladamente ou em misturas visando demonstrar o aumento da quantidade ou deposição da elastina em tecido humano. Este teste foi realizado através do tratamento de explantes de pele humana com os referidos extratos. Foram selecionados fragmentos de pele de abdômen de mulheres caucasianas entre 20 e 55 anos, e cada condição foi testada em triplicatas biológicas (três doadores diferentes). Os extratos foram diluídos no meio de cultura e aplicados aos explantes pelo período de 14 dias, com 5 trocas neste período (24 + 72 + 48 + 48 + 72 + 72 ho

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15/20 ras). Cada condição foi testada em triplicates biológicas (três doadores diferentes). Após o período de incubação, as amostras foram preparadas em procedímento-padrão para análise histológica e coloração com Orceína. A quantificação de elastina foi feita por análise de imagens (24 imagens por tratamento). A mistura de Guaçatonga e Aroeira nas concentrações de 0,025 mg/mL, respectivamente, promoveram um aumento de 36% na quantidade de elastina da pele, em relação ao controle (explantes não tratados). O extrato de aroeira isoladamente promoveu aumento de 29% em elastina (inferior à mistura). O aumento de elastina depositada promovido pelo extrato de guaçatonga isoladamente não foi significativo, porém a mistura de ambos os extratos gerou o maior aumento de elastina obtido no teste (36%) (vide Figura 4). [0073] Por fim, foram ainda realizados ensaios de expressão proteica (tropoelastina, LOX, fibulina, fibrilina, e MMP-12) em monocamada de células.

[0074] Os extratos de guaçatonga e aroeira foram testados em culturas de monocamadas de células para a expressão de elastina, LOX, Fibrilina-1 (utilizando as linhagens RFL), MMP12 e Fibulina-5 (em fibroblastos humanos de pele). As células RFL são mantidas em meio HAM-F12 (Invitrogen, 11765) e os fibroblastos em meio RPMI 1640 (Gibco, 61870-010), ambos suplementados com 10% de soro fetal bovino. O fator TGF- β1 (10 ng/mL) foi utilizado como padrão para o teste de produção protéica de Elastina, LOX, Fibrilina-1 e Fibulina-5; a interleucina-ΐβ (30 ng/mL) e Dexametasona (5 uM), em conjunto, foram utilizados como padrões para estímulo e redução de MMP-12. Adicionalmente, o ácido elágico (10 ng/mL) também foi utilizado no teste de produção de elastina.

[0075] O extrato de guaçatonga foi testado a 0,01, 0,05 e 0,1 mg/mL nos testes com fibroblastos (MMP-12 e Fibulina-5), e 0.01, 0.1, e 0.2 mg/mL nos testes com células RFL (elastina, LOX, Fibrilina-1),

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16/20 respeitando as respectivas citotoxicidades no modelo, (vide Figuras 5 a 9)

[0076] As misturas de guaçatonga (A) e aroeira (B) foram testadas, respectivamente, nas concentrações de 0,1 mg/mL (A) + 0,025 mg/mL (B), 0,05 mg/mL (A) + 0,0125 mg/mL (B) e 0,01 mg/mL (A) + 0,01 mg/mL (B), em todos os testes (elastina, LOX, Fibrilina-1, MMP12 e Fibulina-5) (vide Figuras 10 a 14).

[0077] Para estes testes, as células mantidas em estufa úmida a 37°C em presença de 5 % de CO₂ foram tripsinizadas em 80-90 % de confluência e semeadas em placas 96 poços (Nunc, USA). Uma hora antes dos tratamentos, o meio de cultura foi trocado para meio suplementado com 2 % de soro fetal bovino (controle basal) ou meio com 2% de soro fetal bovino contendo os padrões conforme acima descrito. Para os tratamentos, as amostras foram pesadas e diluídas em meio de cultura para atingirem as concentrações acima descritas, e aplicadas sobre as células por 48 horas. Após 48 horas, os sobrenadantes foram coletados para a respectiva análise. Os resultados foram analisados por Anova seguido de teste de Dunnet, empregado quando a análise de variância detectava diferenças significativas entre os grupos. Em todos os grupos estudados, foram considerados estatisticamente significativos aqueles cujos valores de P foram inferiores a 0,05.

[0078] Para a quantificação de tropoelastina, foi utilizado o kit de detecção de Elastina Fastin (Biocolor, Belfast, Irland), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O conteúdo de elastina das amostras foi precipitado em tubos de microcentrífuga após a adição de 1 mL de reagente de precipitação (ácido tricloroacético e arginina) e incubação a 0Ό por 24 horas. Após a centrifugação dos tu bos (10.000 x g) por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o botão de elastina foi ressuspenso em 1 mL de TPPS (5,10,15,20-tetrafenil-21,23-porfina sulfonato) e 200 uL de sulfato de amônio saturado 90% para a forma

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17/20 ção do complexo elastina-corante. Após 60 minutos de agitação, os tubos foram novamente centrifugados (10.000 x g) por 10 minutos, o sobrenadante descartado e o complexo ressuspenso em 1 mL do reagente de dissociação (HCI guanidina e 1-propanol) que permitiu a formação do complexo colorido, cuja absorbância foi medida em 513 nm. A concentração de elastina foi realizada com base na curva de calibração utilizando o padrão de tropoelastina fornecido pelo fabricante do kit.

[0079] Para quantificação de Fibrilina-1, foi utilizado o kit de ensaio imunoenzimático (ELISA intercalado) disponível comercialmente (USCN Life Science, E90593Ra). Amostras de sobrenadante das culturas celulares foram adicionadas à placa de 96 poços e incubadas a 37 Ό por 2 horas. Em seguida, o anticorpo acoplado à biotina foi adicionado à placa, submetida a nova incubação a 37 O por 1 hora. A seguir, a placa foi lavada, adicionou-se avidina conjugada a HRP e novamente incubou-se a placa a 37 Ό por 30 minutos. Após 20 minutos de reação, a mesma foi interrompida pela adição de H₂SO₄2N e a leitura foi realizada em leitor de microplacas a 450nm. Os níveis de fibrilina-1 foram expressos em ng/mL, calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva-padrão construída com concentrações conhecidas da citocina recombinante.

[0080] Para quantificação de Fibulina-5, foi utilizado o kit de ensaio imunoenzimático (ELISA intercalado) disponível comercialmente (USCN Life Science, E93153Hu). O protocolo do ensaio é o mesmo descrito para Fibrilina-1. Os níveis de Fibulina-5 foram expressos em ng/mL, calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva-padrão construída com concentrações conhecidas da citocina recombinante.

[0081] Para quantificação de LOX, foi utilizado o kit de ensaio imunoenzimático (ELISA intercalado) disponível comercialmente (USCN

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Life Science, C92580Ra). O protocolo do ensaio é o mesmo descrito para Fibrilina-1 e Fibulina-5. Os níveis de LOX foram expressos em ng/mL, calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva-padrão construída com concentrações conhecidas da citocina recombinante.

[0082] Para quantificação de MMP-12, os fibroblastos humanos de pele foram pré-incubados com IL-1 ?, pelo período de 6 horas, e em seguida incubados com os ativos e matérias-primas por mais 24 horas, previamente a coleta dos sobrenadantes. Para quantificação de MMP12, foi utilizado o kit de ensaio imunoenzimático (ELISA intercalado), disponível comercialmente (USCN Life Science, E90402Hu). Os níveis de MMP-12 foram expressos em ng/mL, calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva-padrão construída com concentrações conhecidas das citocinas recombinantes.

[0083] Os resultados dos testes in vitro acima mencionados demonstram que o extrato de guaçatonga apresenta eficácia em todos os tempos finais avaliados e relacionados ao mecanismo de deposição da fibra elástica na pele, ou seja, o extrato induz o aumento da produção das proteínas tropoelastina, Fibulina-5, Fibrilina-1 e da enzima LOX (vide Figuras 5 a 8. Ainda, o extrato também atua na redução da produção protéica da MMP-12 (elastase) induzida por injúria de IL-1, mecanismo que evita a degradação da fibra elástica (não confirmando os dados de expressão gênica que sugeriam aumento da produção da elastase) (vide Figura 9).

[0084] O extrato de aroeira, apesar de induzir a expressão gênica de tropoelastina e LOX, não induz a produção das respectivas proteínas. Contudo, o extrato apresenta eficácia nos demais mecanismos avaliados que levam à produção da fibra elástica, como a produção das proteínas Fibrilina-1 e Fibulina-5. Além disso, este extrato apresenta o diferencial de inibir a atividade da enzima elastase (ensaio bio

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19/20 químico) em até 89% (1 mg/mL). Adicionalmente, para esse extrato foi possível observar um aumento da quantidade de fibras elásticas em explante de pele, refletindo possivelmente o potencial de proteção de degradação da elastina.

[0085] Os extratos de guaçatonga e de aroeira foram testados em culturas de células de monocamada para expressão de colágeno Tipo 1 e de ácido hialurônico. As misturas de guaçatonga (A) e de aroeira (B) foram testados, respectivamente, a concentrações de 0,025 mg/mL (A) + 0,005 mg/mL (B) em comparação com extrato de guaçatonga a concentração de 0,1 mg/mL (vide Figuras 15 e 16).

[0086] Como pode ser visto, a mistura de guaçatonga e de aroeira induziu o aumento na síntese tanto de colágeno quanto de ácido hialurônico nas células. Estes resultados demonstram que a combinação de acordo com a presente invenção em um potencial de melhoramento da pele através do estímlo da síntese de colágeno tipo 1 e de ácido hialurônico.

[0087] Em resumo, os resultados demonstram que o extrato de guaçatonga é a única amostra, dentre as testadas, com potencial de ação em todos os mecanismos avaliados (aumento de elastina, fibulina-5, fibrilina-1, LOX e redução de MMP-12. Interessantemente, o extrato de aroeira apresenta o diferencial de reduzir a atividade da enzima elastase, além de reduzir a produção da mesma, sugerindo que a utilização conjunta das amostras podería modular a deposição e a degradação das fibras elásticas.

Exemplos de formulação de acordo com a presente invenção: EXEMPLO 1 - EMULSÃO % em peso da composição final

ÁGUA DESMINERALIZADA-qsp 100

BHT-0,1-1%

EDTA DISSÓDICO - 0,05-0,15 %

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BENZOATO DE SÓDIO - 0,1-0,5%

EXTRATO DE AROEIRA - 0,0001 a 10%

HOMOPOLÍMERO DE ÁCIDO ACRÍLICO DE SÓDIO 0,02-0,04%

GOMA DE XANTANO C1911 B - 0,3-3,5%

EXTRATO DE GUAÇATONGA - 0,0001 a 10%

ACETATO DE TOCOFERILA (VITAMINA E) - 0,5-3%

EXEMPLO 2 - EMULSÃO

EXTRATO DE GUAÇATONGA - 0,0001 a 10%

PROPILENO GLICOL- 10-40%

GOMA DE XANTANO C1911 B - 0,3-3,5%

HIDRÓXIDO DE SÓDIO - 0,01-0,3%

BENZOATO DE SÓDIO - 0,0001 -10%

EXTRATO DE AROEIRA - 0,0001 a 10%

HOMOPOLÍMERO DE ÁCIDO ACRÍLICO DE SÓDIO 0,02-0,04%

GLUTATIONA -0,03-0,04%

ÁCIDO ETIDRÔNICO 0,02-0,04%

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende 0,0001 a 10 % em peso da composição total de extrato de guaçatonga (Casearia syilvestris), 0,00005 a 10 % em peso da composição total de extrato de aroeira (Schinus terebinthifolius raddi) e adjuvantes cosmeticamente aceitáveis.
2. Composição cosmética de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de guaçatonga está presente em uma concentração de 0,005 a 5% em peso da composição e o extrato de aroeira está presente em uma concentração de 0,0005 a 5% em peso da composição.
3. Composição cosmética de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o extrato de guaçatonga está presente em uma concentração de 0,01 a 1% em peso da composição e o extrato de aroeira está presente em uma concentração de 0,00125 a 1% em peso da composição.
4. Composição cosmética de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que está na forma de creme, gel, suspensão ou sabonete.
5. Composição cosmética de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é para o uso na prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele.
6. Uso de extrato de Guaçatonga (Casearia silvestres) e de extrato de Aroeira (Schinus terebinthifolius raddi), caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição cosmética como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele.
7. Uso de extrato de Guaçatonga (Casearia silvestres) e de extrato de Aroeira (Schinus terebinthifolius raddi), caracterizado pelo

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2/2 fato de que é na preparação de uma composição cosmética como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para simultaneamente aumentar a tropoelastina, aumentar a enzima lisil-oxidase (LOX) e reduzir a atividade de elastase na derme.
8. Uso de uma composição cosmética como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é simultaneamente no aumento da tropoelastina, aumento da enzima lisil-oxidase (LOX) e na redução da atividade de elastase na derme.
9. Método de prevenção e/ou tratamento de sinais resultantes do envelhecimento da pele, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação na pele de uma composição cosmética como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.