JP6436488B2 - クニフォフィア・ウバリア種子の抽出物、それを含有する化粧用又は皮膚用組成物、並びにそれらの使用 - Google Patents
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Description
(特にUVにより惹起又は加速される)皮膚老化の徴候の出現を阻止する又は遅延させるための薬剤としての、及び/又は
抗炎症剤としての、及び/又は
皮膚の弾力性又はハリを改善するための薬剤としての、及び/又は
保湿剤としての、
本発明の少なくとも1種の植物抽出物の使用を対象とする。
メタロプロテイナーゼ及びPro−MMP1の分泌を阻害するための薬剤として、及び/又は
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)アゴニストとして、
使用することもできる。
(特にUV照射により加速される)分解から細胞外マトリックスを保護するための薬剤として、
(特に表皮脂質の合成を刺激することによって)角質層を強化するための薬剤として、
内因性フリーラジカル若しくはUV照射により生成されたフリーラジカルによりストレスを与えられた細胞及び/又は老化細胞の分泌物に関連する、皮膚に有害な慢性炎症のプロセスを制限するための薬剤として、
皮膚のバリア機能の崩壊に寄与する、脂質の産生の減少を伴う(老化に関連する可能性がある)皮膚障害(特に皮膚の乾燥の問題)を処置するための薬剤として、
(特に剥脱又は剥離の際に)(例えばUV照射又はアルファ−ヒドロキシ酸の使用の影響で)ヒリヒリする皮膚を鎮静させるための薬剤として、
さらに使用することができる。
非極性溶媒を用いた本発明の抽出物の調製:
クニフォフィア・ウバリア種の植物から採取された種子を乾燥させ、次いで粉砕した。
この粉砕から得られた植物性物質を、共溶媒の非存在下、超臨界状態のCO2を用いて抽出した。
抽出プロセスの条件は次の通りであった。
圧力=29×106Pa(290bar)/温度=60℃(このような圧力及び温度条件下において、二酸化炭素は超臨界状態にある。)
得られた抽出物を、エタノール(抽出物に対して5重量%)の存在下、減圧下50℃で、ロータリエバポレータでの蒸留によって乾燥させた。
乾燥後の得られた抽出物(抽出物1)は清澄な橙色の油状物であった。抽出収率は、使用された植物性物質に対して25重量%であった。
予備乾燥された種子をそのまま、この目的に適したプレスを用いて機械的に低温圧搾する。
採取した油を濾過する。
油の官能特性を改善するために、これを蒸気脱臭ステップに付す。
1)MMP−2、MMP−9、pro−MMP−1マーカー
1.1)生物活性
処理に先立ち、溶媒1ml当たり6.25及び12.5mgの抽出物の濃度となるようDMSOに溶解した実施例1の抽出物又は対照の原液を調製した。
本発明の抽出物による細胞の処理の際に、所望の濃度になるように培養培地に原液を1/1000希釈する。
アノゲイスス・レイオカルプス(Anogeissus leiocarpus)の抽出物及びレスベラトロール(これらは、培養下の線維芽細胞による上記タンパク質の合成を阻害する能力が知られている。)を陽性対照として使用する。
正常ヒト線維芽細胞(NHF)に対して試験を行う。
96ウェルマイクロプレート(Flacon)において、グルタミン(Gibco Invitrogen)(終濃度2mM)及び10%のFCS(ウシ胎仔血清)が添加された200μl/ウェルのMEM培養培地(Gibco Invitrogen)に、5000細胞/ウェルの密度でNHFを播種する。インキュベータ内に培養プレートを24時間置いて80%細胞コンフルエンスを得る。
細胞を25μg/mlのアノゲイスス・レイオカルプス及び溶媒対照(DMSO)で処理する。線維芽細胞をUV−B照射に付すことによってUV−B対照も調製して、この因子の影響下の細胞によるMMPの分泌の刺激を検証する。
種々の濃度の抽出物、陽性対照及び溶媒対照をそれぞれ、4ウェルのNHFについて評価する。
48時間の処理後、培養上清を取り出し、−20℃で貯蔵する。サンドイッチ型酵素免疫測定法(これは、それぞれの量のMMP−2、MMP−9及びpro−MMP−1を450nmでの分光光度測定により上清中でアッセイすることを可能にする。)を使用する。クワンティキン(Quantikine)キット(R&D Systems)に記載のプロトコールに従ってMMP−2、MMP−9及びpro−MMP−1アッセイを行う。
結果を下表に示す。
表の説明:
T DMSO = 溶解溶媒対照(DMSO)
T+UVB = MMP−9レベルの増加を生じるUVB照射による刺激の陽性対照
T+ = 試験用陽性対照(アノゲリン(anogelline))
MMP−2は、組織発生及び再生の際に線維芽細胞により発現される。MMP−9により、このタンパク質は、基底膜及びゼラチン(変性コラーゲン)の主要化合物であるIV型コラーゲンを分解する。これは、エラスチン及びフィブロネクチンと同様に他のコラーゲン型(V、VII及びX)を分解することもできる。MMP−9の基質は、天然型IV、V、VII、X及びXIコラーゲン並びにフィブロネクチンとなり得る。MMP−1は、細胞外マトリックス分解に関与する主要酵素である。MMP−2とは異なり、MMP−1の産生は、皮膚老化を加速する環境ストレス(例えばUV照射)に直接的に影響されるAP−1転写因子に支配される。
2.1)プロトコール
酵母転写因子GAL−4のDNA結合ドメイン(DBD)と融合したヒトPPARβ/δのリガンド結合ドメインを含有するキメラタンパク質を発現する、PPARβ/δレポーター系を有する安定的な遺伝子導入細胞株(Seimandi et al., Analytical Biochemistry,2005, 344, 8−15)に対して試験を行った。
実施例1のクニフォフィア・ウバリア抽出物に関して、試験で得られた活性値は下記の通りである。
・10μg/ml(培養培地中)において、応答は陽性対照(100%アゴニスト)の効果の14%である。
・30μg/ml(培養培地中)において、応答は陽性対照の効果の37%である。
・50μg/ml(培養培地中)において、応答は陽性対照(100%アゴニスト)の効果の43%である。
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)は、核受容体スーパーファミリーに属する転写因子である。PPARは、主に脂質代謝に関与する標的遺伝子の調節領域に位置するDNAの特定の領域に結合する。PPARβ/δは、ヒト表皮における優勢なアイソタイプを表し、ケラチノサイトにおいて高レベルで存在する(Girroir et al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,2008, 371, 456−461)。
本試験の目的は、単層で培養した正常ヒト線維芽細胞(NHF)の培養物における、皮膚老化又は皮膚の保湿状態に関連する生物学的プロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現に対する本発明の抽出物の生物活性について検討することであった。
細胞培養:
コーカサス人種の成人ドナー由来の正常ヒト線維芽細胞(NHF)を、6ウェルプレートにおいて、下記組成の培地1中、2.5×104細胞/ウェルの比率で播種した。
培地1:
サプライヤー 終濃度
FCS Biowest 10%
DMEM Fisher qs
培養条件毎に3ウェルのNHFを播種した。
処理前の24時間、コンフルエンス状態で下記組成を用いて細胞からウシ胎仔血清を枯渇させた(培地2)。
培地2:
サプライヤー
DMEM Fisher
ウシ胎仔血清なしの24時間の培養後、培地2中、0.1重量%の本発明の抽出物1で細胞を処理した。24時間の処理後、細胞を回収し、細胞から全RNAを抽出した。
無処理対照についても同一条件で試験した。
3.1 全RNAの取得
細胞培養培地を除去し、250μlの溶解バッファーRLT(ヌクレオスピン(Nucleospin)RNAトレースキットに含まれている。)を添加した。細胞スクレーパーを用いて細胞を擦り取り、次いで、1.2mlディープウェル(キットに含まれている。)に細胞溶解物を回収した。ヌクレオスピンRNAトレースキット(Macherey Nagel)によるエピモーション(Epimotion)5075(Eppendorf)を用いて全RNAを抽出した。
使用した逆転写(RT)キットは大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosytems)であった。100ngの全RNAを、最終容量50μlとなるよう水に希釈した。次に、この希釈物を25℃で10分間インキュベートし、次いで、予め調製した下記の50μlの2×大容量逆転写キット反応ミックスとともに37℃で2時間インキュベートした。
反応物 容量
RTバッファー 10μl
dNTPバッファー 4μl
ランダムプライマー 10μl
RNAse out 1μl
RT 5μl
H2O 20μl
50μlの各RTをサンプリングし、50μlの「タックマン遺伝子発現マスターミックス」と混合した。ホモジナイゼーション後、100μlをマイクロ流体カードに置き、これを遠心分離し、次いで密封した。
RT−PCR TLDA法において、ΔCt比較法を用いて定量化を行う。この方法は、遺伝子毎のバックグラウンドノイズを考慮するRQマネージャー(Manager)ソフトウェアを用いて、カードの各遺伝子のサイクル数(Ct)を決定する。このサイクル数(Ct)を、細胞において変動しないハウスキーピング遺伝子、GAPDHのCtに関して標準化した。
皮膚老化、皮膚の保湿或いは皮膚の弾力性及びハリの維持に関連するプロセスに関与する種々の遺伝子に対して行った解析について、下記の方法を用いて検討した。
メタロプロテイナーゼ1(MMP−1)は、コラーゲン、特にコラーゲン1及び3の分解において作用する。これは、皮膚老化の際に、また、UV曝露に応答して特に誘導される。それ故、このタンパク質の発現を阻害して、真皮細胞外マトリックスの分解を制御することは重要である。得られた結果は、本発明の抽出物によるNHFの処理が、対照と比較して、24時間の処理後、MMP−1の発現を顕著に低下させる(−84%)ことを可能にすることを示す。
このメタロプロテイナーゼの発現に対する本発明の抽出物の効果は、ECM分解を制限することによって皮膚老化を阻止する又は遅延させるために特に有利である。
本発明の抽出物によるNHFの処理は、対照と比較して、LRP−1遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を顕著に増加させる(+190%)ことを可能にする。
このLRP−1遺伝子はLDL受容体をコードする。LDL受容体は、細胞周囲空間における過剰なMMPの「エンドサイトーシス」において作用を有するとされている。
この遺伝子の発現に対する本発明の抽出物の効果は、ECM分解に正に作用することによって皮膚老化を阻止する又は遅延させるために特に有利である。
本発明の抽出物によるNHFの処理は、対照と比較して、ELN遺伝子にコードされるトロポエラスチンの発現を顕著に増加させる(+135%)ことを可能にする。
この遺伝子の発現に対する本発明の抽出物の効果は、エラスチン合成に正に作用することによって皮膚老化を阻止する又は遅延させるために特に有利である。
本発明の抽出物による処理は、COL A1A遺伝子の刺激によるコラーゲン1A1の発現を顕著に増加させる(+103%)ことを可能にする。
この遺伝子の発現に対する本発明の抽出物の効果は、細胞外マトリックスにおけるコラーゲン合成に正に作用することによって皮膚老化を阻止する又は遅延させるために特に有利である。
本試験の目的は、皮膚の老化又は保湿に関連するプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現に対する本発明の抽出物の効果を評価することであった。
コーカサス人種の成人ドナー由来の正常ヒトケラチノサイト(NHK)を、6ウェルプレートにおいて、培地1中、2.5×104細胞/ウェルの比率で播種した。8時間の処理のために、培養条件毎に3ウェルのNHKを播種した。
80%コンフルエンスにおいて、下記培地1中、0.1重量%の実施例1の本発明の抽出物で細胞を処理した。
サプライヤー
エピライフ(Epilife) Fisher
添加剤 Fisher
24時間の処理後、細胞を回収し、細胞から全RNAを抽出した。
プロトコールは、先の実施例に記載のプロトコールと同一である。
先の実施例と同様に、皮膚老化、皮膚の保湿或いは皮膚の弾力性及びハリの維持に関連するプロセスに関与するタンパク質の発現に関与する遺伝子に対して解析を行う。
得られた結果は、本発明の抽出物によるNHKの処理が、対照と比較して、24時間の処理後、メタロプロテイナーゼ2型を阻害するタンパク質の発現を顕著に増加させる(+30%)ことを可能にすることを示す。
このタンパク質は、基本的にメタロプロテイナーゼMMP−2及びMMP−9を阻害する。このメタロプロテイナーゼの発現に対する本発明の抽出物の効果は、細胞外マトリックス(ECM)の弾性線維の分解を制限することによって皮膚老化を阻止する又は遅延させるために特に有利である。
得られた結果は、本発明の抽出物によるNHKの処理が4型コラーゲンの発現を顕著に増加させる(+39%)ことを可能にすることを示す。このコラーゲンは、真皮表皮接合部の統合性の維持において必須の役割を果たす。
このコラーゲンの発現に対する本発明の抽出物の効果は、細胞外マトリックス(ECM)の統合性を維持し、それによって皮膚老化の効果に対抗するために特に有利である。
得られた結果は、本発明の抽出物によるNHKの処理がアクアポリン3型の発現を顕著に増加させる(+160%)ことを可能にすることを示す。このコラーゲンは、真皮−表皮接合部の統合性の維持において必須の役割を果たす。
ケラチノサイトにおけるこのアクアポリンの発現に対する本発明の抽出物の効果は、細胞水の移動を促進し、皮膚表層の保湿状態を改善することを可能にする。
得られた結果は、本発明の抽出物によるNHKの処理が、HAS3遺伝子にコードされるタンパク質の発現を顕著に増加させる(+240%)ことを可能にすることを示す。この酵素は、皮膚細胞の保湿状態の維持において重要な役割を果たすヒアルロン酸の合成に関与する。
得られた結果は、本発明の抽出物によるNHKの処理がこのヒアルロン酸受容体の発現を顕著に増加させる(+45%)ことを可能にすることを示す。この顕著な効果は、本発明の抽出物で処理された皮膚細胞の保湿状態を改善又は維持することを可能にする。
実施例1のプロセスを再現することによってクニフォフィア・ウバリア種子の抽出物を得た。下記化粧用組成物において使用される抽出物の官能特性を改善するために、抽出物1に対して水蒸気蒸留による追加的な脱臭ステップも行った。
相A:
フェノキシエタノール: 0.5
キサンタンガム: 0.2
アクリレート/C20〜30アルキルアクリレートクロスポリマー: 0.2
EDTA四ナトリウム: 0.1
水: qs
qs = 相Aの化合物を溶解するのに十分な量
相B:
本発明のクニフォフィア・ウバリア抽出物: 1
水素化ポリイソブテン: 4
スクアラン: 3
トリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル: 3
ペンチレングリコール: 3
ステアリン酸グリセリル: 3
ステアリン酸PEG−100: 2.5
蜜ろう: 1.5
炭酸ジカプリリル: 1.5
セチルアルコール: 1
ステアリルアルコール: 1
ジメチコン: 1
相C:
水酸化ナトリウム: 0.04
水: qs100
qs100 = 最終組成物の100%に十分な量
均一な相を形成するために、クニフォフィア・ウバリア抽出物を含む相Bの化合物を85℃に加熱した。
イストラル(Ystral)撹拌機を用いて相A中に相Bを乳化させた。
得られた水中油型エマルションを0.04%w/w水酸化ナトリウム水溶液(相C)で最後に中和し、次いで冷却した。
このクリームは、皮膚老化を阻止する又は遅延させる効果を得ることを可能にするが、皮膚に炎症効果を生じる実体に関して皮膚に対する緩和効果ももたらす。
Claims (5)
- クニフォフィア・ウバリア(Kniphofia uvaria)種子の抽出物を含む化粧用又は皮膚用組成物の調製方法であって、
前記抽出物が、
前記種子を機械的手段で圧搾することによって、或いは
前記種子を、共溶媒の非存在下、超臨界状態の二酸化炭素と接触させ、その後、前記二酸化炭素を除去することによって得られ、
前記組成物が、
皮膚老化の徴候の出現を阻止する又は遅延させるための薬剤として、或いは
抗炎症剤として、或いは
皮膚の弾力性又はハリを改善するための薬剤として、或いは
保湿剤として
使用するための組成物である、調製方法。 - 前記超臨界状態の二酸化炭素は、35℃〜80℃の温度及び7.4×106Paを上回る圧力を有する、請求項1に記載の調製方法。
- 圧搾は、先行するステップで粉砕されていない種子の全体を低温条件下で圧搾することによって行われる、請求項1に記載の調製方法。
- クニフォフィア・ウバリア(Kniphofia uvaria)種子の抽出物を含む化粧用又は皮膚用組成物の調製方法であって、
前記抽出物が、
前記種子を機械的手段で圧搾することによって、或いは
前記種子を、共溶媒の非存在下、超臨界状態の二酸化炭素と接触させ、その後、前記二酸化炭素を除去することによって得られ、
前記組成物が、
メタロプロテイナーゼ及びPro−MMP1の分泌を阻害するための薬剤として、或いは
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)アゴニストとして
使用するための組成物である、調製方法。 - クニフォフィア・ウバリア(Kniphofia uvaria)種子の抽出物を含む化粧用又は皮膚用組成物の調製方法であって、
前記抽出物が、
前記種子を機械的手段で圧搾することによって、或いは
前記種子を、共溶媒の非存在下、超臨界状態の二酸化炭素と接触させ、その後、前記二酸化炭素を除去することによって得られ、
前記組成物が、
細胞外マトリックスを分解から保護するための薬剤として、或いは
脂質の産生の減少を伴い、皮膚のバリア機能の崩壊に寄与する皮膚の乾燥を処置するための薬剤として
使用するための組成物である、調製方法。
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